ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Chia sẻ: Lynh Kalynn | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:38

Thêm vào BST

Báo xấu

446
lượt xem 145
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và polysaccharide.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Định nghĩa elisa ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.
Nguyên lý của phương pháp ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên – kháng thể Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và polysaccharide. Chưa biết gắn trên bề mặt. Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin trong các protein máu. Kháng thể là những protein hòa tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó
Thêm vào một cơ chất (substance) của enzyme đó. Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra
Các bước tiến hành Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa Phương thức gắn đặc hiệu : KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Đo OD tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Kết quả
Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này.
Enzyme sử dụng thường là : + Peroxidase + Beta – galactoxidase + Alkaline phosphatase Cơ chất (subtrate) là: + ODP: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu vàng nhận bước sóng 492 nm ( bằng máy đọc elisa) + TMB: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu xanh bước sóng 370-652nm chuyển màu vàng 450nm
Enzyme sử dụng trong phương pháp elisa Enzyme ở đây được sử dụng để xác định hỗn hợp kháng nguyên – kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Ta có thể sử dụng máy so màu quang điện, huỳnh quang để xác định phản ứng. Enzyme alkaline phosphate Enzyme này được sử dụng trong phản ứng miễn dịch. Người ta thường sử dụng enzyme này với hoạt tính 2500UI/mg, ở nhiệt độ 37oC. Để xác định hoạt tính alkaline phosphate có thể sử dụng máy huỳnh quang với 4 – methylumbeliferyphosphate làm cơ chất
ß- galactosidase Người ta thường sử dụng enzyme này có hoạt tính riêng lớn hơn 250UI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl- ß-galactosidase, ở 37oC Hoạt tính của ß-galactosidase được đo bằng máy quang điện với 4-methylumbelliferyl- ß-galactosidase. Ngoài ra ta có thể sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ß-galactosidase
Horseral peroxidase Enzyme này chứa hai đến ba nhóm hoạt động amine trong phân tử và chứa 12-14.5% carbohydrate. Xác định hoạt tính enzyme này bằng máy quang điện. cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-sulfonate] (ABTS) và peroxidase có hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25oC Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là 3,3’;5,5’-tetramethyl benzidine
Thiết bị sử dụng Khay nhựa 96 giếng
Thiết bị sử dụng Máy đọc elisa (máy quang phổ có các bước sóng khác nhau
Thiết bị sử dụng Micropipette Micropipette tips
Thiết bị sử dụng Máy rửa khay nhựa Micropipette multi tips
Ưu điểm phương pháp elisa +Dễ thực hiện + Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu + Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE Nhược điểm + Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h) + Thiết bị mắc tiền
ELISA TRỰC TiẾP
định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng Bước “blockin” “Rửa” hêm kháng thể có gắn enzyme “Rửa” Ghi nhận sự thay đổi Thêm cơ chất ( màu, huỳnh quang, OD…)
1. Elisa trực tiếp
Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic hoặcVirus. Áp dụng: - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV. - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT không rõ ràng. - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác.