Bài 2
Ị
XÁC Đ NH PROTEIN THÔ CÓ TRONG TH C PH M
Ự
Ẩ
1. M c đích ụ
Xác đ nh hàm l ng protein t ng có trong th c ph m ị ượ ự ẩ ổ
2. Nguyên t c, nguyên lý ắ Vô c hóa m u th c ph m b ng H ẩ ẫ
ự ằ ơ ộ 2SO4 đ m đ c và ch t xúc tác. Dùng m t ấ ậ ặ
3 t
4)2SO4 hình thành ra th t
ki m m nh (NaOH ho c KOH) đ y NH do. ề ẩ ạ ặ ừ mu i (NH ố ể ự
2SO4 d b ng dung d ch NaOH, t
Đ nh phân l ng H đó xác đ nh đ c l ị ượ ư ằ ị ừ ị ượ ượ ng
1. Vô c hoá
c hàm l ng nit t ng có trong m u. H2SO4 đã ph n ng và tính đ ả ứ ượ ượ ơ ổ ẫ
2. Quá trình ch ng c t:
ơ
ư ấ
3 đ
2SO4.T đây cho phép chúng ta xác
Sau đó l ng NH c h i n c lôi cu n b ng máy ch ng c t đ m và đ ượ ượ ơ ướ ấ ạ ư ằ ố ượ c
d n đ n m t bình tam giác có ch a m t l ẫ ộ ượ ứ ế ộ ng th i H ờ ừ
3 phóng thích ra, có nghĩa là xác đ nh đ
ng NH ng đ m có trong đ nh đ ị c l ượ ượ ị c l ượ ượ ạ
3. Ch t xúc tác ấ
4. Quá trình chu n đ : ộ
m u nguyên li u ệ ẫ
ẩ
3. Hoá ch tấ 1. M u th c ph m ự ẫ 2. Dung d ch ị
ẩ
ơ
4. D ng cụ
ẫ ỉ ỉ
3. M u vô c hoá 4. Ch th MR 1% ị 5. Ch th Phenolphtalein 1% ị 6. Dung d ch NaOH 30% ị 7. N c c t ướ ấ 8. Gi y pHấ ụ
1. 1 b MicroKejedalt ộ 2. 1 pipet 10ml 3. 3 erlen 250 ml 4. 1erlen 100ml 5. 1 bình đ nh m c 100 ml ứ 6. 1 Becher 250 ml 7. 1 bóp cao su 8. 1 ph u thu tinh nh ỷ ễ
ị
5. Cách ti n hành
ỏ
ị 1. Chu n b hóa ch t ấ
4 : K2SO4 theo t
1:1 l ỷ ệ
ế ẩ ỗ ỉ 1. H n h p xúc tác CuSO ợ 2. Ch th MR 1% ị
2. Vô c hóa m u ơ ẫ
3. Ch ng c t: ư
ấ
ế ng nit Hàm l toàn ph n tính b ng công th c:
6. K t qu thí nghi m ả ơ
ệ ầ ượ ứ ằ
Trong đó:
ộ ẫ ộ ẫ
ẩ ẩ ủ ộ ươ ẩ
• T: s ml NaOH dùng đ chu n đ m u tr ng. ắ ể ố • B: s ml NaOH dùng đ chu n đ m u th . ử ể ố • N: n ng đ đ ng c a dd NaOH dùng chu n đ . ộ ượ ồ • m: kh i l ố ượ
ng m u vô c hóa (mg) ng l ẫ ơ
ố ử ụ
S ml NaOH s d ng 23.4 15,5 15 M u tr ng ắ ẫ L n 1ầ L n 2ầ
Vây: S ml NaOH trung bình dùng đ chu n đ m u th : ử ố ộ ẫ ể ẩ
toàn ph n)k ượ
ơ ầ %N sang protein. ng protein thô (%) = (nit Hàm l V i k là h s qui đ i t ệ ố ớ ổ ừ
ng protein thô (%) = 0,5708 = 3,5674%
Hàm l 7. Tr l ả ờ
t ph ng trình ph n ng x y ra trong quá trình ả ả ứ ươ ế ẫ vô c hoá m u ẫ ượ i câu h i ỏ Câu 1: Vô c hoá m u là gì ? Vi ơ ơ Vô c hoá m u là đ a các h p ch t h u c trong m u v d ng các h p ch t vô ấ ữ ơ ề ạ ư ẫ ấ ẫ ợ ơ ợ cơ Các ph n ng trong quá trình vô c hoá m u ẫ ả ứ ơ
Câu 2: Vi t ph ng trình ph n ng x y ra trong quá trình ch ng c t và chu n đ ế ươ ả ứ ư ấ ả ẩ ộ m uẫ Các ph n ng trong quá trình ch ng c t ấ ả ứ ư
Các ph n ng trong quá trình chu n đ ả ứ ẩ ộ
Câu 3
ng Protein thô ặ ể ệ ượ có ý nghĩ nh th noà đ i v i s n ph m th c ph m ẩ ự Câu 4: Protein thô có đ c tính chung là gì ? Vi c ki m tra hàm l ẩ ớ ớ ả ể : đ u có ch a hàm l ng nit ặ ể ủ ả c đ nh kho ng ơ ố ị ượ ứ ề
ế ế ả ọ ố ớ ả ả ự ể ẩ ẩ ả ị ủ ấ ượ Câu 5 : Tiêu chu n c a FAO/WHO v h s protein d i v i th c ph m ư ế đ c đi m c a Protein thô ủ ặ + Đ c đi m chung c a protein thô là 15% – 18 % + Đ u d b bi n tính trong quá trình ch bi n b o qu n ề ễ ị ế ả ng protein thô có ý nghĩa r t quan tr ng đ i v i s n ph m + Vi c ki m tra hàm l ẩ ượ ấ ể ệ ộ ạ ng th c ph m đ t t ch t l đó ta có th tăng gi m đ đ m th c ph m. nó cho bi ể ừ ẩ ự ấ ượ ế cho phù h p v i t ng lo i th c ph m đ đ m b o đ đ m b o giá tr dinh d ng, ạ ớ ừ ợ ưỡ ể ả ả ể ả ự ng c a th c ph m. ch t l ẩ ự ẩ ủ ố ớ ự ẩ
ng protein thô (%) = (Nit ề ệ ố tòan ph n) k ầ ơ
%N sang Protein:
ướ ắ ị
c m m, th t, cá… ố ả
Hàm l ượ k là h s qui đ i t ổ ừ ệ ố k = 6.25 ng v i m u là n ẫ ớ ứ k = 5.85 ng v i m u là ngũ c c, rau, qu … ẫ ớ ứ k = 6.38 ng v i m u là s a, fomat… ẫ ớ ứ ữ
Câu 6 trình bày m t s ph ộ ố ươ ự ng pháp xác đ nh Protein thô khác trong th c ị ph mẩ
ng pháp Dusma
1. Xác đ nh protein t ng theo ph
ổ ị ươ
Nguyên t cắ
oC.
2, H2O, O2, NOx và N2.
c đ t cháy hoàn toàn b ng khí oxi tinh khi nhi M u đ ẫ ượ ằ ố t ế ở ệ ộ t đ kho ng 950 ả
S n ph m khí sau quá trình đ t cháy bao g m ch y u là CO ố ủ ế ả ẩ ồ
Ngoài ra trong s n ph m đ t th khí còn có halogen, hiđro halogenua, các đioxit và ố ở ể ả ẩ
trioxit c a l u huỳnh. T t c các khí đó đ u cho qua đ ng kim lo i và đ ng oxit ủ ư ấ ả ề ạ ồ ồ
nóng đ . Các oxit c a nit b đ ng phân hu thành nit và oxy, đ ng th i oxy này ủ ỏ ơ ị ồ ỷ ơ ồ ờ
ấ cùng v i oxy n m trong các khí đ t t o v i đ ng kim lo i thành đ ng oxit. H p ch t ớ ồ ố ạ ạ ằ ớ ồ ợ
ủ cacbon oxit khi g p đ ng oxit s b oxy hoá thành cacbondioxit. Các s n ph m c a ẽ ị ả ẩ ặ ồ
thoát ra quá trình đ t cháy khi đi qua dung d ch ki m s b h p th , ch còn khí nit ị ẽ ị ấ ụ ề ố ỉ ơ
và đo đ c nit ượ k . ơ ế
Khi dùng ph ng nh ch t thì đi u đ c bi ộ ượ ề ặ ọ ươ ả ạ ể ơ ữ ề ơ ị quan tr ng là ph i t o ra nh ng đi u ki n đ các oxit nit ữ nit ị ấ c lo i hoàn toàn tr oxit) ph i đ ng pháp Dumas đ kh o sát m t l ệ t ể ả ỏ ấ chuy n hoàn toàn thành ệ ề ể , còn nh ng khí không b h p th b i dung d ch ki m ( ví d khí oxy và cacbon ụ ụ ở c khi đi vào bình thu ch a dung d ch ki m. Khí ứ ả ượ ướ ề ạ ị
2 vào nit
2 đi vào khí áp k , đ cho nhi ệ ộ
ằ ơ ẽ ượ ẩ ặ ượ ạ c nén s n ho c đ ẵ s đ ị k và sau đó CO ạ ơ ế ẩ ị ấ ả ồ ộ ở c t o ra b i 2 đ ượ 2 b ng cách cho axít HCl đ m đ c vào ặ ậ ằ ề 2 b h p th b i dung d ch ki m ị ụ ở t đ cân ệ ộ ế ể t đ , áp su t và th tích khí c a khí áp ủ ể ấ ả đó tính ra hàm l ng nit c đ y vào bình thu khí b ng khí CO nit dung d ch có tên là bình kip. Bình kip t o ra CO đá vôi. Khí CO2 đ y khí N KOH (n ng đ kho ng 50%). Sau khi khí N b ng kho ng 15 phút, sau đó đo l n l t nhi ằ k và t ế ầ ượ ơ ượ ừ Áp d ngụ
Ph ng pháp đ t là l a ch n thay th cho ph ươ ự ế ố ọ ươ ́ ng pháp Kjeldahl và thích h p đôi ợ
ng phap AOAC Method 992.15 và Method 992.23 v i tât ca th c ph m. Cac ph ớ ̉ ự ẩ ươ ́ ́ ́
đ ượ c áp d ng cho th t và h t ngũ c c. ị ụ ạ ố
u đi m Ư ể
Không s d ng hóa ch t nguy hi m ử ụ ể ấ
Có th hoàn thành phân tích trong 3 phút ể
Các thi t b t ế ị ự ộ ̉ đ ng hi n nay có th phân tích đ n 150 m u mà không đoi hoi ệ ể ế ẫ ̀
phai co ng i vân hanh theo theo dõi. ́ ườ ̉ ̣ ̀
Nh ượ c đi m ể
Thi t b đ t ti n ế ị ắ ề
Đo nit h u c tông, không ph i ch nit protein. ơ ữ ơ ̉ ả ỉ ơ
2. Xác đ nh protein b ng ph
ằ ị ươ ng pháp ph h ng ngo i ạ ổ ồ
Nguyên t cắ
D a trên kh năng h p thu b c x trong vùng t ngo i c a liên k t peptic có ứ ạ ự ả ấ ử ạ ủ ế
trong phân t protein. Ph ng phap ph h ng ngo i đo đ h p thu b c x trong vùng ử ươ ứ ạ ộ ấ ổ ồ ạ ́
c n và trung h ng ngo i. Các nhóm ch c khác nhau c a th c ph m h p th b c x ậ ụ ứ ạ ở ứ ủ ự ẩ ấ ạ ồ
protein có kh năng t n s sóng khác nhau. Trong vung trung h ng ngo i các phân t ầ ố ạ ồ ử ả ̀
m m. Trong vùng c n h ng ngo i có kh năng
c sóng kho ng 6,47 h p thu b c x có b ấ ứ ạ ướ ả ậ ồ ạ ả
c sóng 3300-3500 nm, 2080-2200 nm, 1560-1670 nm v.v… đ c tr ng cho h p thu ấ b ở ướ ư ặ
liên k t peptid. T đ h p thu này có th làm c s đ nh l ng đ xác đ nh hàm l ừ ộ ấ ơ ở ị ế ể ượ ể ị ượ ng
protein co trong th c ph m. Năng l ng b c x khi chi u qua m u có th đo b ng năng ự ẩ ượ ứ ạ ế ể ẫ ằ ́
ng truy n qua m u (có đ l n t l ngh ch v i năng l ượ ng ph n x ho c năng l ạ ả ặ ượ ộ ớ ỷ ệ ề ẫ ớ ị
l ượ ng h p th ). ấ ụ
c ap d ng trong thi Ph trung h ng ngo i đ ồ ạ ượ ́ ụ ổ ế ị t b phân tích s a Infrared Milk ữ
Analyzer đ xác đ nh l ể ị ượ ̉ ng protein co trong s a, trong khi ph c n h ng ngo i co thê ổ ậ ồ ữ ạ ́ ́
ng dung cho nhi u lo i th c ph m h n (ví d , các h t lúa, ngũ c c, th t, s n ph m t ứ ị ả ụ ự ề ẩ ạ ẩ ạ ơ ố ừ ̣
s a (AOAC Methods 997.06). ữ
u đi m Ư ể
M u đ c phân tích r t nhanh. ẫ ượ ấ
Ng i phân tích không đòi h i ph i hu n luy n nhi u. ườ ệ ề ấ ả ỏ
Nh ượ c đi m ể
Đây la thi t b đ t ti n và c n ph i l y chu n đúng. ế ị ắ ề ả ấ ầ ẩ ̀
ng pháp Bi uret
3. Ph
ươ
Nguyên t cắ
Trong môi tr ng ki m, ion đ ng (II) có kh năng t o ph c v i các liên k t peptid ườ ứ ớ ề ế ạ ả ồ
c đo c sóng 540 nm. T s t o màu tím h ng. Đ h p thu c a ph c t o thành đ ẽ ạ ứ ạ ộ ấ ủ ồ ượ b ở ướ ừ
c ng i ta có th xác đ nh hàm l đ h p thu đo đ ộ ấ ượ ườ ể ị ượ ằ ng protein có trong m u b ng ẫ
ph ng pháp đ ng chu n. ươ ườ ẩ
Áp d ngụ
Ph ng pháp biuret đ c dùng đ xác đ nh hàm l ươ ượ ể ị ượ ị ng protein co trong ngũ c c, th t, ố ́
ng th c ăn chăn nuôi (AOAC Method 935.11). đ u nành cũng nh đ đánh giá ch t l ư ể ậ ấ ượ ứ
u đi m Ư ể
Là ph ng pháp phân tích protein đ n gi n nh t. ươ ả ấ ơ
ng pháp Kjeldahl ít t n kém h n; nhanh h n (có th hoàn thành nhanh So v i ph ớ ươ ể ố ơ ơ
h n 30 phút). ơ
Ít co s chênh l ch v màu s c h n so v i các ph ng pháp Lowry, ph ng pháp ắ ơ ́ ự ệ ề ớ ươ ươ
đo h p th UV ho c đo đ đ c. ộ ụ ụ ấ ặ
R t ít các h p ch t khác có trong th c ph m gây nhiêu đ n ph n ng biuret. ả ứ ự ế ẩ ấ ấ ợ ̃
Gia tri đo đ c không tính nit các ngu n không ph i t ượ t ơ ừ ả ừ ồ peptid ho c protein. ặ ́ ̣
Nh ượ c đi m ể
ng pháp Lowry, đòi h i l ng protein t i thi u cho phân Không nh y nh ph ạ ư ươ ỏ ượ ố ể
tích 2-4 mg.
M t đ quang đo đ c có th b tăng lên do s có m t c a các s c màu khác. ậ ộ ượ ặ ủ ể ị ự ắ
N ng đ mu i amon cao nh h ng đ n ph n ng. ả ộ ố ồ ưở ả ứ ế
Màu s c khác nhau tùy lo i protein: gelatin cho màu h ng tím. ạ ắ ồ
Dung d ch tr c khi đo có th b đ c n u có m t lipit và carbohydrat n ng đ ị ướ ể ị ụ ế ặ ở ồ ộ
cao.
Không ph i là ph ả ươ ng pháp tuy t đ i: c n ph i xây d ng đ ầ ệ ố ự ả ườ ặ ố ng chu n ho c đ i ẩ
ng pháp Kjeldahl. chi u v i ph ế ớ ươ
ng pháp Lowry
4. Ph
ươ
Nguyên t cắ
Ph ng pháp Lowry k t h p ph n ng biuret v i ph n ng kh c a dung d ch ươ ế ợ ả ứ ả ứ ử ủ ớ ị
Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic/ phosphotungstic acid) v i các g c tyrosine và ớ ố
tryptophan c a phân t protein. Màu xanh da tr i t o ra đ c đo ủ ử ờ ạ ượ ở 750 nm ho c 500 nm. ặ
T quy trình ban đ u Miller và Hartree đa co nh ng c i ti n đ c i thi n đ tuy n tính ả ế ể ả ́ ữ ừ ệ ế ầ ộ ̃
c a quan h gi a m t đ quang v i n ng đ protein. ủ ệ ữ ậ ộ ớ ồ ộ
C ng đ màu c a h n h p ph n ng t l ủ ỗ ợ ả ứ ườ ỉ ệ ộ ộ thu n v i n ng đ protein trong m t ộ ớ ồ ậ
ph m vi nh t đ nh. D a vào m c đ h p th quang h c c a protein chu n, ta có th xác ụ ứ ộ ấ ọ ủ ấ ị ự ể ẩ ạ
c hàm l ng protein trong m u nghiên c u. đ nh đ ị ượ ượ ứ ẫ
Áp d ngụ
Do tính đ n gi n và đ nh y cao, ph ng pháp Lowry đ ạ ả ộ ơ ươ ượ ử ụ c s d ng r ng rãi trong ộ
phân tích hóa sinh. Tuy nhiên, đây không phai la ph ng phap đ c dùng r ng rãi đ xác ̀ ươ ́ ượ ể ộ ̉
đ nh protein trong th c ph m n u ch a chiêt tach protein ra khoi s n ph m. ư ị ̉ ả ự ế ẩ ẩ ́ ́
u đi m Ư ể
R t nh y: ấ ạ
ng pháp biuret 50-100 l n nh y h n so v i ph ạ ầ ơ ớ ươ
10-20 l n nh y h n so v i ph 280 nm. ầ ạ ơ ớ ươ ng pháp h p th UV ấ ụ ở
Đ nh y t ng đ ng pháp Nessler hóa, tuy nhiên ti n l ạ ươ ộ ươ ng v i ph ớ ươ i h n ệ ợ ơ
ng b i đ đ c c a m u. Ít b nh h ị ả ưở ở ộ ụ ủ ẫ
Có tính đ c hi u cao h n so v i các ph ng pháp khác ệ ặ ơ ớ ươ
T ng đ i đ n gi n; có th th c hi n trong vòng 1-1,5h. ươ ể ự ố ơ ệ ả
Nh ượ c đi m ể
Vì m t s lý do sau, quy trình Lowry đòi h i phai xây d ng đ ộ ố ự ỏ ườ ẩ ẩ ng chu n c n ̉
th n cho t ng áp d ng: ừ ụ ậ
ng pháp biuret. Màu s c thay đ i tùy lo i protein rõ h n so v i ph ạ ắ ổ ớ ơ ươ
C ng đ màu không t thu n nghiêm ng t theo n ng đ protein. ườ ộ l ỷ ệ ậ ặ ồ ộ
Ph n ng b nh h ng m c đ khác nhau b i đ ả ứ ị ả ưở ở ứ ở ườ ộ ệ ng sacaroza, lipit, đ m
phosphat, monosacarit và hexoamin.
- v i n ng đ cao nh ả
Đ ng kh , sulfat amon và các h p ch t có nhóm SH ườ ử ấ ợ ớ ồ ộ
ng đ n ph n ng. h ưở ả ứ ế
ng pháp nhu m màu Bradford
5. Ph
ươ ộ
Nguyên t cắ
ố Khi thu c nhu m Coomassie Brilliant Blue G-250 liên k t v i protein, màu thu c ế ớ ố ộ
đ nh t đ n xanh nh t và b c sóng h p th c c đ i c a màu nhu m d ch t đ i t ổ ừ ỏ ạ ế ạ ướ ụ ự ạ ủ ấ ộ ị ừ
465nm đ n 595nm. S thay đ i m t đ quang c sóng 595nm t ậ ộ ự ế ổ b ở ướ l ỷ ệ ớ ồ thu n v i n ng ậ
ng pháp nhu m màu khác, ph đ protein có trong m u. Cũng gi ng nh các ph ộ ư ẫ ố ươ ộ ươ ng
ng tính c a protein. Khi dung d ch có ch a protein pháp Bradford d a vào b n ch t l ự ấ ưỡ ả ủ ứ ị
đ c axit hóa đ n pH nh h n đi m đ ng đi n c a protein, thuôc nhu m s bám vào ượ ệ ủ ỏ ơ ế ể ẽ ẳ ộ ́
protein b ng t ng tác k n ằ ươ ng tác tĩnh đi n. Hi u qu nhu m màu tăng lên do t ả ệ ệ ộ ươ ỵ ướ c
gi a phân t ph m nhu m v i b khung polypeptit k bên các g c tích đi n d ữ ử ẩ ớ ộ ệ ươ ề ộ ố ủ ng c a
protein. Trong tr ng pháp Bradford, ph m nhu m sau khi bám vào ườ ng h p c a ph ợ ủ ươ ẩ ộ
protein s thay đ i ph h p th so v i lúc ch a liên k t. ổ ấ ụ ư ẽ ế ổ ớ
Áp d ngụ
Ph ng pháp Bradford s d ng Coomassie Brilliant Blue G-250 là ph ng pháp ươ ử ụ ươ
nhanh và nh y. Ph ng pháp này đã thay th hâu hêt các ph ng pháp nhu m màu s ạ ươ ế ươ ộ ử ̀ ́
d ng các ph m nhu m tích đi n âm v i g c axit sulfonic, nh acid orange 12, Orange G ụ ớ ố ư ệ ẩ ộ
và Amido Black.
Ph ng pháp Bradford đã đ ươ ượ ứ ủ c ng d ng thành công khi xác đ nh protein c a ụ ị
cháo, bia thành ph m trong s n xu t bia. ẩ ả ấ
Quy trình này cũng đ c c i ti n đ đ nh l ng protein hàm l ng m g. ượ ả ế ể ị ượ ở ượ
Do phép đo nhanh, nh y và ít b nhi u h n so v i ph ng pháp Lowry, nó đã ễ ạ ơ ớ ị ươ
đ c s d ng r ng rãi trong phân tích cac loai protein tinh s ch. ượ ử ụ ạ ộ ́ ̣
u đi m Ư ể
Th i gian ti n hành nhanh, ph n ng có th hoàn thành trong 2 phút. ả ứ ể ế ờ
Đ l p l i t t ộ ặ ạ ố
Nh y g p nhi u l n so v i ph ng pháp Lowry ạ ấ ề ầ ớ ươ
Không b nhi u b i sulfat amon, polyphenol, carbohydrat nh đ ng sacaroza ư ườ ễ ở ị
ho c các cation nh K ư +, Na+ và Mg2+ ặ
Đo protein và các peptit có phân t x p x ho c l n h n 4000 Da. ử ấ ỉ ặ ớ ơ
Nh ượ c đi m ể
B nhi u b i các ch t t y r a ion ho c phi ion nh Triton X-100 và sodium ặ ấ ẩ ử ư ễ ở ị
dodecylsulfat. Tuy nhiên, đây la các sai s nh (0.1%) có th hi u ch nh đ c băng các ể ệ ỏ ố ỉ ượ ̀ ̀
m u ki m tra phù h p. ể ẫ ợ
ả Ph c protein-ph m màu có th bam dính vào cuvet th ch anh. Phân tích c n ph i ể ́ ứ ạ ầ ẩ
th c hi n v i cuvet th y tinh ho c nh a. ệ ớ ự ự ủ ặ
Màu s c thay đ i tùy lo i protein; Ph i l a ch n c n th n protein chuân. ọ ẩ ả ự ậ ạ ắ ổ ̉
ng pháp Bicinchoninic Acid (BCA)
6. Ph
ươ
Nguyên t cắ
Protein kh ion đ ng (II) thành ion đ ng (I) trong môi tr ng ki m. Ph c t o ra ử ồ ồ ườ ứ ạ ề
ườ gi a ion đ ng (I) và dung d ch c ch t BCA màu xanh táo s có màu h ng nh t. C ng ơ ấ ữ ẽ ạ ồ ồ ị
l thu n v i n ng đ protein. đ màu t o ra s t ạ ộ ẽ ỷ ệ ớ ồ ậ ộ
Áp d ngụ
Ph ng pháp BCA đ c dùng cho protein đã đ ươ ượ ượ c tách và tinh s ch. Ch a có báo ạ ư
cáo nào cho th y có th áp d ng ph ng pháp này đ xác đ nh protein trong th c ph m. ụ ể ấ ươ ự ể ẩ ị
u đi m Ư ể
Đ nh y có th so sánh đ ng pháp Lowry; đ nh y c a ph ể ạ ộ ượ c v i ph ớ ươ ủ ạ ộ ươ ng
pháp micro BCA (0.5-1.0 m g) t t h n so v i ph ng pháp Lowry. ố ơ ớ ươ
ớ Vi c hòa tr n các dung d ch ph n ng 1 l n th c hi n d dàng h n so v i ả ứ ự ệ ệ ễ ầ ộ ơ ị
ph ng pháp Lowry. ươ
Các dung d ch c ch t ph n ng b n h n so v i ng pháp Lowry. ề ơ ơ ấ ả ứ ph ớ ở ươ ị
Không b nhi u b i các ch t t y r a phi ion và các mu i đ m. ấ ẩ ử ễ ở ố ệ ị
Các tác nhân gây bi n tính protein ế ở ̣ nông đô v a phai (guanidine-HCl 4M hoăc ̣ ừ ̀ ̉
ure 3M) không gây nhi u.ễ
Nh ượ c đi m ể
Màu s c không b n theo th i gian. Ng ề ắ ờ ườ ờ i phân tích c n chu y c n th n đên th i ́ ẩ ậ ầ ́ ́
gian đ c kêt qua đo m t đ quang. ậ ộ ọ ́ ̉
2+ thành Cu+ đ u góp ph n làm tăng
B t kỳ h p ch t nào có kh năng kh Cu ử ả ấ ấ ợ ề ầ
c ườ ng đ màu. ộ
ng pháp Lowry. Sulfat Đ ng kh gây nhi u ử ễ ở ứ ộ m c đ nhi u h n so v i ề ườ ph ớ ở ươ ơ
amon n ng đ cao cũng gây nhi u. ở ồ ễ ộ
S khác bi t màu s c gi a các protein cũng t ng t nh ph ng pháp Lowry. ự ệ ữ ắ ươ ự ư ở ươ
Ph ng pháp h p th t
7.
ươ ụ ử ấ ngo i ạ
Nguyên t cắ
Protein h p th b c x UV m nh ụ ứ ạ ạ ấ b ở ướ ố c sóng 280 nm, ch y u do các g c ủ ế
tryptophan và tyrosine c a phân t protein. Vì hàm l ng c a tryptophan và tyrosine ủ ử ượ ủ
trong phân t 280 nm có ử protein c a m i lo i th c ph m khá n đ nh, đ h p th UV ẩ ộ ấ ủ ụ ự ạ ỗ ổ ị ở
th dùng đ tính n ng đ protein d a vào đ nh lu t Lambert Beer. Vì m i protein có ự ể ể ậ ộ ồ ỗ ị
thành ph n axit amin có ch a s vòng th m khác nhau nên c n xác đ nh đ h p th phân ứ ố ộ ấ ụ ầ ầ ơ ị
(molar absorptivity hay extinction coeficient) cho t ng lo i protein. t ử ừ ạ
Áp d ngụ
Ph ươ ng pháp h p th UV đ ấ ụ ượ ả c dùng đ xác đ nh protein co trong s a và các s n ữ ể ị ́
ph m th t. Đây không phai la ph ẩ ị ươ ự ng phap co ng d ng r ng rãi đ i v i cac loai th c ố ớ ́ ứ ụ ộ ̉ ̀ ́ ́ ̣
ph m khac. No đ t h n đ i v i các h protein đã đ ́ ượ ẩ c áp d ng t ụ ố ơ ố ớ ệ ượ ặ c tinh s ch ho c ạ ́
protein đ c chi t tach nh ki m ho c các tác nhân gây bi n tính nh ure 8 M. ượ ế ́ ờ ề ư ế ặ
M c dù các liên k t peptit co trong protein h p th UV ụ ế ấ ặ ở ớ 190-220 nm m nh h n so v i ạ ơ ́
280 nm, tuy nhiên đo UV vùng b ở ở ướ c sóng ng n nh v y khó khăn h n. ư ậ ắ ơ
u đi m Ư ể
Nhanh và t ng đ i nh y ( 280 nm c n 100 ươ ạ ở ầ ố m g protein ho c h n đ phân tích; ơ ể ặ
nh y h n ph ng pháp biuret nhi u l n). ạ ơ ươ ề ầ
Không b nhi u b i sulfat amon và các mu i đ m khác. ễ ở ố ệ ị
M u không b phân h y; có th dùng cho các phân tích khác sau khi phân tích ủ ể ẫ ị
xong protein; đ c áp d ng r ng rãi đ xác đ nh protein ch y qua c t s c ký. ượ ộ ắ ụ ể ạ ộ ị
Nh ượ c đi m ể
Axit nucleic cũng h p th UV 280 nm. T s gi a đ h p th 280 nm và 260 ụ ấ ở ỷ ố ữ ộ ấ ụ ở
nm c a protein tinh s ch và axit nucleic t ủ ạ ươ ể ệ ng ng là 1.75 và 0.5. Do đó có th hi u ứ
ch nh ph n h p th c a axit nucleic 280 nm n u bi t các t s này. Có th hi u ch nh ụ ủ ầ ấ ỉ ở ế ế ỷ ố ể ệ ỉ
235 và 280 nm. đ h p th c a axit nucleic d a vào s chênh l ch đ h p th ộ ấ ộ ấ ụ ủ ụ ở ự ự ệ
Co s chênh lêch đang kê vê hàm l ng các axit amin th m trong thanh phân câu ́ ự ượ ơ ̣ ́ ̉ ̀ ̀ ̀ ́
tao cua protein t các ngu n khác nhau. ừ ồ ̣ ̉
Dung d ch đo c n ph i trong su t và không màu. Đ đ c do các h t có trong dung ộ ụ ạ ầ ả ố ị
d ch s làm sai lêch kêt qua đo m t đ quang. ị ậ ộ ẽ ̣ ́ ̉
Đòi hòi h protein cân xác đ nh ph i t ng đ i tinh s ch ả ươ ệ ị ạ ố ̀
