intTypePromotion=1

Xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
22
lượt xem
0
download

Xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou

XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN<br /> TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN<br /> ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHÔ B CỦA CHUỘT LOU<br /> Phan Ngọc Tiến*<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể<br /> đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP).<br /> Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm.<br /> Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng<br /> kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F,<br /> có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml. Nghiên cứu định lượng AFP trong 90 mẫu<br /> huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có<br /> HBsAg (+), 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân<br /> u gan. Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh<br /> nhân u gan là > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%).<br /> Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP được sản xuất từ chuột<br /> LOU có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTIALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT<br /> Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 208 - 212<br /> Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using<br /> monoclonal antibodies.<br /> Method: Experimental research.<br /> Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal<br /> antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml.<br /> In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples<br /> of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B<br /> hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8<br /> ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP<br /> < 500 ng/ml (24%), respectively.<br /> Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal<br /> antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml.<br /> nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận<br /> ĐẶTVẤNĐỀ<br /> diện và định lượng kháng nguyên.<br /> Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng<br /> được Georges Kohler và César Milstein trình<br /> bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng<br /> thể đơn dòng đã được ứng dụng trong rất<br /> <br /> Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có<br /> trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, được<br /> tổng hợp ở gan phôi thai và túi ối, vì vậy nồng độ<br /> AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh<br /> <br /> * Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP. Hồ Chí Minh<br /> 209<br /> <br /> bào thai người rất cao. Tuy nhiên AFP có trong<br /> huyết thanh người sau sinh và người trưởng<br /> thành rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml(7,9,11).<br /> Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên<br /> phát AFP tăng rất cao, và việc định lượng AFP<br /> trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh<br /> ung thư gan nguyên phát.<br /> Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, được<br /> sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã<br /> mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng<br /> tôi xây dựng hệ thống định lượng AFP trong<br /> huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA(5,10).<br /> <br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng<br /> kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế<br /> bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với<br /> AFP và dòng tế bào IR983.<br /> <br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Nghiên cứu thực nghiệm.<br /> <br /> Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu<br /> - Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể<br /> đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase.<br /> - Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại<br /> Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế<br /> và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh.<br /> Trong đó 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân<br /> có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan, trong<br /> đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của<br /> bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu vi B<br /> cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14<br /> mẫu huyết thanh có HBsAg (+) nhưng không<br /> có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam – 4 nữ,<br /> 35 mẫu huyết thanh của người bình thường<br /> khỏe mạnh, HBsAg (-).<br /> <br /> Phương pháp thu thập số liệu<br /> - Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai<br /> đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang<br /> tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA.<br /> <br /> 350, 400, 500 ng/ml. Chúng tôi sử dụng AFP tinh<br /> chế và chuẩn độ của Viện Pasteur Tp. HCM.<br /> - Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể<br /> định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ<br /> chuột LOU: dùng phương pháp ELISA<br /> - Xác định mật độ quang tương ứng của các<br /> nồng độ thấp của AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5<br /> ng/ml. Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có<br /> thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ<br /> chuột LOU với phương pháp ELISA.<br /> - Định lượng AFP trong các mẫu huyết<br /> thanh bằng hệ thống định lượng sử dụng<br /> kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng<br /> phương pháp ELISA.<br /> Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh<br /> số thứ tự từ 1 đến 90, trong đó 35 mẫu huyết<br /> thanh của người bình thường được đánh số từ<br /> 1 đến 35, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân<br /> có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến 49, 16<br /> mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu<br /> vi B cấp được đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu<br /> huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh<br /> số từ 66 đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định<br /> lượng không pha loãng, lần 2 những mẫu<br /> huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1<br /> sẽ được pha loãng với tỉ lệ 1:2. Những mẫu<br /> huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên<br /> 350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả<br /> cuối cùng là trên 500 ng/ml.<br /> <br /> Xử lý số liệu<br /> Chương trình Point To Point, chương trình<br /> dùng cho xử lý số liệu trong kỹ thuật Elisa để<br /> tính kết quả định lượng nồng độ AFP. Chương<br /> trình SPSS 11.5<br /> <br /> KẾTQUẢ<br /> Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng<br /> độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng<br /> Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy<br /> khi nồng độ AFP tăng thì DO cũng tăng theo.<br /> Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500<br /> ng/ml thì DO tăng không đáng kể.<br /> <br /> - Xác định mật độ quang tương ứng của các<br /> nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300,<br /> 210<br /> <br /> Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng<br /> nồng độ AFP trong huyết thanh đến mức cao<br /> nhất là 350ng/ml.<br /> <br /> + Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng:<br /> y = a + bx, trong đó:<br /> Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính<br /> là: y = 0,599 + 0,0055x<br /> <br /> Qua đường cong chuẩn của hệ thống định<br /> lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng<br /> kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng<br /> tôi nhận thấy hai đại lượng DO và nồng độ<br /> AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận.<br /> <br /> + P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan<br /> tuyến tính theo chiều thuận giữa hai đại lượng<br /> DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương<br /> quan có ý nghĩa thống kê.<br /> <br /> DO<br /> <br /> + r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và<br /> nồng độ AFP có mối liên hệ thuận rất chặt chẽ.<br /> 3,0<br /> <br /> 2,5<br /> <br /> 2,0<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 300<br /> <br /> 350<br /> <br /> 7<br /> <br /> 6<br /> 5<br /> <br /> 1,5<br /> 4<br /> 1,0<br /> 3<br /> ,5<br /> 2<br /> 1<br /> 0,0<br /> 0<br /> <br /> 50<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> 250<br /> <br /> 400<br /> <br /> 450<br /> <br /> 500<br /> <br /> AFP (ng/ml)<br /> <br /> DO<br /> <br /> Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou<br /> ,30<br /> <br /> ,25<br /> 8<br /> ,20<br /> <br /> 7<br /> <br /> ,15<br /> 6<br /> ,10<br /> <br /> 5<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3 4<br /> <br /> ,05<br /> <br /> 0,00<br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> AFP (ng/ml)<br /> <br /> Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP<br /> độ AFP giảm thì giá trị DO giảm theo, nhưng<br /> Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ<br /> khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn<br /> thống định lượng AFP dựa trên kháng thể<br /> đi ngang. Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống<br /> đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể<br /> định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng<br /> định lượng được (đồ thị 2)<br /> kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng<br /> Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng<br /> 211<br /> <br /> được là 0,5 ng/ml.<br /> <br /> KẾTLUẬN<br /> <br /> Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các<br /> mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng<br /> AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP<br /> của chuột LOU<br /> <br /> Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein<br /> bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn<br /> dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào<br /> lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP<br /> và dòng tế bào IR983, có thể định lượng nồng<br /> độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến<br /> 350ng/ml.<br /> <br /> Số thứ tự Số mẫu Giá trị Giá trị lớn<br /> Giá trị<br /> mẫu huyết huyết nhỏ nhất<br /> nhất<br /> trung bình<br /> thanh<br /> thanh<br /> 1-35<br /> 35<br /> 1,08<br /> 7,26<br /> 2,7780<br /> 36-49<br /> 14<br /> 0,91<br /> 6,08<br /> 3,7993<br /> 50-65<br /> 16<br /> 6,2<br /> 113,53<br /> 32,1806<br /> <br /> Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br /> bệnh nhân u gan (những mẫu huyết thanh từ<br /> số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6<br /> mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).<br /> <br /> BÀNLUẬN<br /> Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein<br /> trong huyết thanh người bằng phương pháp<br /> Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản<br /> xuất từ tế bào lymphô B của chuột Lou và<br /> dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ<br /> đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở<br /> nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml so với hệ thống<br /> định lượng của các hãng khác là Abbott<br /> 0,4ng/ml(2) và Maxim Biotech 2ng/ml(6), và<br /> AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao<br /> nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là<br /> 350ng/ml(2) và Maxim Biotech là 300mg/ml(6).<br /> Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các<br /> thử nghiệm đặc tính và định lượng không có<br /> phản ứng chéo với các protein của huyết thanh<br /> nhất là với albumin, protein có trọng lượng<br /> phân tử và cấu trúc gần giống với AFP.<br /> Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90<br /> mẫu huyết thanh có kết quả tương đồng với<br /> các nghiên cứu trong và ngoài nước(2,6,8).<br /> Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng<br /> kháng thể đơn dòng được sản xuất từ chuột<br /> Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết<br /> thanh từ 0,5-350ng/ml, và chúng tôi hy vọng<br /> góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ<br /> thống định lượng AFP.<br /> <br /> Mật độ quang và nồng độ AFP có mối<br /> quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p =<br /> 0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x:<br /> nồng độ AFP chuẩn).<br /> Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ<br /> thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn<br /> dòng kháng AFP của chuột LOU<br /> Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br /> người bình thường là 2,8 ng/ml.<br /> Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br /> bệnh nhân có HBsAg(+) là 3,8 ng/ml.<br /> Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br /> bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp là 32,1 ng/ml.<br /> Giá trị trung bình nồng độ AFP của những<br /> bệnh nhân u gan đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6<br /> mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).<br /> Cám ơn: GS.TS. Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp. HCM,<br /> BS. Cao Đức Trùng Dương và BS. Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ<br /> Dũ Tp. HCM đã giúp thực hiện nghiên cứu này.<br /> <br /> TÀILIỆUTHAMKHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> 3.<br /> 4.<br /> 5.<br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> Abbas AK., Lichtman AH., Jordan S.poder (1994), Cellular<br /> snd Molecular Immunology, W.B. Sauders Company, A<br /> division of Harcourt Brace Company, USA.<br /> Abbott laborarories Dignostics division (1992), In tumor<br /> marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8.<br /> Bazin H (1990), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal<br /> Antobody, CRC Press, USA.<br /> Harrison’s (1993), Principles of internal medicine, 12th<br /> Edition, Vol 2, pp.1381-1383.<br /> Kemeny D.M. (1991), A practiceal guide to Elisa, Department<br /> of Allergy Guy’s Hospital, London.<br /> Maxim Biotech (2006), “Alpha-fetoprotein Enzyme<br /> Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA,<br /> USA.<br /> Nguyễn Cao Cương (2000), “Tầm sóat ung thư gan<br /> nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4),<br /> tr.24-28.<br /> Nguyễn Kim Lữ Hiếu, Lê Văn Đôn (1996), “Nồng độ<br /> Alpha-fetoprotein ở 37 bệnh nhân được chẩn đoán lâm<br /> sàng là viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr.<br /> 1-3.<br /> <br /> 212<br /> <br /> 9.<br /> 10.<br /> 11.<br /> <br /> Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học<br /> tập 1, nhà xuất bản tự điển bách khoa, Hà Nội, tr. 303-306.<br /> Tijssen P. (1985), Practice and Theory of enzyme<br /> immunoassays, Elsevier, The Netherlands.<br /> Trần Thị Chính, Phan Thị Phi Phi, Trương Mộng Trang<br /> (1993), “Đánh giá khả năng chẩn đoán ung thư gan của<br /> Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35.<br /> <br /> 213<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản