Báo cáo thực hành môn Virus học

TR NG Đ I H C AN GIANG ƯỜ Ạ Ọ

KHOA NÔNG NGHI P & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN Ệ

PHAN VĂN HÙNG

BÀI BÁO CÁO TH C HÀNH Ự

MÔN VIRUS H CỌ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGH SINH H C Ọ Ệ

Khóa h c: 2010 – 2014 ọ

GIÁO VIÊN H NG D N ƯỚ Ẫ

Ts. Nguy n T t Toàn ễ ấ

An Giang, Tháng 04 năm 2014

Bài I

K THU T TIÊM TR NG VÀ K THU T K T T A KHU CH TÁN TRÊN Ế Ủ Ứ Ậ Ậ Ỹ Ỹ Ế

TH CHẠ

I. K thu t tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang ni u mô) ệ ậ ỹ

1. M c đích ụ

ả Xác đ nh s hi n di n c a virus Newcastle trong phôi tr ng gà, ng d ng sâu h n là s n ự ệ ủ ứ ứ ụ ệ ơ ị

xu t V c xin. ắ ấ

2. D ng c - hóa ch t ấ ụ ụ

Hình 1: M t s d ng c và hóa c n thi ộ ố ụ ụ ầ t ế

N c mu i sinh lý 10- 20% ướ ố

C n ồ

Iod

Parafin l ngỏ

Kim tiêm

3. Chu n b nguyên li u ị ệ ẩ

Chu n b tr ng gà đã p t ị ứ ấ ừ ẩ 9 – 11 ngày tu i ổ

Hình 2: Tr ng 9 – 11 ngày tu i ổ ứ

-3, li u l

Chu n b v c xin Newcastle nh c đ c, s d ng n ng đ 10 ng là 0.1- ị ắ ẩ ượ ử ụ ộ ở ồ ộ ề ượ

0.2ml/tr ngứ

Hình 3: V c xin Niu-cát x ắ ơ

-1, 10-2, 10-3.

Pha v c xin v i n c mu i sinh lý n ng đ 10 ớ ướ ắ ố ở ồ ộ

c khi đem pha Hình 4: Kh trùng h v c xin Niu-cát x tr ủ ắ ơ ướ ử

Hình 5: Cho v c xin vào n c mu i sinh lý ắ ướ ố

Hình 6: L c đ tr n đi u v c xin ắ ể ộ ề ắ

-1, 10-2, 10-3

Ti n hành pha loãng v i các n ng đ 10 ế ớ ồ ộ

Hình 7: Virus Niu-cát-x 3 n ng đ 10 ơ ở ộ -1, 10-2, 10-3 ồ

-3 đ tiêm vào tr ng, đ i v i virus Newcastle. Ta ti n hành tiêm

n ng đ 10 S d ng ử ụ ở ồ ộ ố ớ ứ ể ế ở

xoang ni u mô, li u l ng là 0,1-0,2 ml/tr ng. ề ượ ệ ứ

4. Quy trình th c hi n ự ệ

Hình 8: Tr ng đã p t ứ ấ ừ 9 – 11 ngày tu i ổ

Hình 9: Soi tr ng, xác đ nh bu n h i th t, v trí phôi và làm d u v trí phôi ồ ơ ậ ị ấ ị ứ ị

Hình 10: Xác trùng v tr ng b ng c n và Iod ỏ ứ ồ ằ

, sau đó xác trùng l Hình 11: Ti n hành đ c l ế ụ ỗ i l n n a ạ ầ ữ

Hình 12: Ti n hành tiêm(li u tiêm 0,1-0,2 cc/tr ng) ứ ề ế

L u ýư : Tiêm v phía đ i di n phôi không tiêm tr c ti p lên phôi ự ế ệ ề ố

Hình 13: Dùng parafin h i nóng b t kín l khoan sau đó ti n hành ơ ị ỗ ế ủ ở 0c 37

5. Xem k t quế ả

II. k thu t tiêm Virus Đ u mùa(k thu t t o bu ng h i giã) ậ ạ ồ ơ ậ ậ ỹ ỹ

1. M c đích ụ

ể Xác đ nh s hi n di n c a Virus đ u mùa trong phôi tr ng gà, thông qua b nh tích bi u ự ệ ủ ứ ệ ệ ậ ị

hi n trên màng CAM(n t pock trên màng CAM). ố ệ

ng d ng s n xu t V c xin đ phòng b nh đ u mùa Ứ ụ ể ệ ả ấ ắ ậ

2. D ng c - hóa ch t ụ ụ ấ

N c mu i sinh lý, c n, Iod, nút bóp cao su….. ướ ố ồ

3. Chu n b nguyên li u ị ệ ẩ

Chu n b tr ng gà đã p 9 – 11 ngày tu i. ị ứ ẩ ấ ổ

-1,10-2,10-3. S d ng ử ụ

-3, li u tiêm 0,1-0,2 ml/tr ng. Cách pha loãng th c hi n t

Chu n b v c xin đ u gà nh c đ c, pha loãng thành các n ng đ 10 ị ắ ẩ ậ ượ ộ ồ ộ

ng t nh trên. n ng đ 10 ồ ộ ệ ươ ứ ự ề ư ư

Hình 14: V c xin Đ u gà ắ ậ

4. Quy trình th c hi n ự ệ

Hình 15: Chu n b tr ng đã p 9-11 ngày tu i ổ ị ứ ẩ ấ

Hình 16: Soi tr ng, đánh d u v trí bu ng h i giã, kh trùng v tr ng, đ c l ồ ỏ ứ ấ ị ụ ỗ ứ ử ơ

Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút không khí ở ồ ơ ộ bu n h i giã ra, cho màng cam tu t

kh i v l a ỏ ỏ ụ

Hình 18: Đ c l trên v ụ ỗ ỏ

0

ng tiêm l ch m t góc 30 - 45 Hình 19 : Tiêm Virus Đ u mùa vào màng cam, h ậ ướ ộ ệ

III. K THU T K T T A KHU CH TAN TRÊN TH CH Ế Ủ Ậ Ạ Ỹ Ế

1. M c đích ụ

ế Xem s khu ch tán c a kháng nguyên(kháng th gà) và kháng th (kháng th th ) khu ch ể ỏ ủ ự ể ể ế

? tán trên m t th ch nh th nào ạ ư ế ặ

2. Chu n bẩ ị

Kháng nguyên : là kháng th gàể

Kháng thể : là kháng th th ể ỏ

 Chu n b môi tr

ng ẩ ị ườ : 12,5gr Agar + 80gr NaCl + 5gr phenol trong 1 lít n c c t ướ ấ

Hình 20: Đun môi tr ườ ng trên b p cách th y ủ ế

Dùng v i l t, l c môi tr ả ượ ọ ườ ng v a n u xong ừ ấ

Hình 21: Môi tr ng đ c l c xong cho vào chai ườ ượ ọ

Chú ý : Môi tr ng r t mao đông đ c l i, c n nên ti n hành ngay sao khi l c xong ườ ặ ạ ấ ế ầ ọ

ả Dùng pipet hút 4 - 5 ml th ch nh vào lame, đ t pipet vuông góc v i lame, cho th ch ch y ạ ặ ạ ỏ ớ

. ch y đ u trên lame không đ c có v t nhăn và l i l m ch nào, đ dày xu ng t ố t ừ ừ ề ả ượ ế ồ ỗ ộ ỗ

kho ng 3 mm ả

Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi tr ng th ch dày 3 mm trên Lame ườ ạ

Hình 23: Đem th ch vào t , ti n hành đ c l ạ ủ ạ l nh, làm d u nh ng v trí c n đ c l ữ ầ ụ ỗ ế ụ ỗ ấ ị

Cho kháng nguyên( kháng th gà) và kháng th ( kháng th th ) vào nh ng v trí đã đ c l ể ỏ ụ ỗ ữ ể ể ị

: l trung tâm là kháng th th , 4 l xung quanh là kháng th gà, t theo quy đ nh nh sau ị ư ỗ ể ỏ ỗ ể ừ

20µl - 50µl cho m i l trên th ch. ỗ ỗ ạ

Hình 24: Cho kháng th th vào l trung tâm, kháng th gà vào 4 l còn l ể ỏ ỗ ể ỗ ạ ặ i, đ t

nh ng mi ng bông gòn đ gi đ m ể ữ ộ ẩ ữ ế

0c, sau 48h đ quan sát k t qu

Th c hi n xong ta chuy n vào t 37 ự ệ ể , ủ ủ ủ ở ể ế ả

Bài 2

THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO

I. M c đích ụ ể ọ ỏ H c h i tìm hi u thêm v quy trình s n xu t V c xin c a công ty, và m t s v n đ liên ấ ộ ố ấ ủ ề ề ả ắ

quan v công ty. ề M t s thi ộ ố ế ị ấ ắ t b và nh ng ng d ng Công ngh sinh hocj vào s n xu t v c ữ ứ ụ ệ ả

xin đ c anh Tú nhi t tình h ượ ệ ướ ng d n ẫ

Hai đi m m i và n i b t nh t , đáng quan tâm nh t đó là ấ ỗ ậ ể ấ ớ ể ả : cách nuôi Virus dùng đ s n

xu t v c xin, và k thu t DNA tái t ỹ ấ ắ ậ ổ ợ h p vào s n xu t v c xin. Đi u thi ấ ắ ề ả ệ t thòi nh t là ch ấ ỉ

đ c ng i trên gi ng đ ng, mà không đ c ch ng ki n t n m t. do công ty tan ca làm ượ ả ồ ườ ượ ế ậ ứ ấ

vi c.ệ

c t i công ty ộ ố ắ ả ấ ượ ạ V c xin heo tai xanh II. M t s v c xin s n xu t đ ắ

V c xin cúm ắ

V c xin viêm não nh t b n ậ ả ắ

V c xin u n ván….. ố ắ

III. Quy trình s n xu t v c xin b ng công ngh DNA tái t ằ ả h p l y đo n DNA mi n d ch g n vào vi khu n Plasmid chuy n vào Công ngh tái t h p ổ ợ ẩ ấ ắ ạ ổ ợ ấ ệ ắ ệ ễ ể ị

n m men, hay vi khu n, đ nhân nhanh sinh kh i, tách thu sinh kh i, đ s n xu t v c xin. ấ ấ ắ ể ả ể ẩ ố ố

BÀI 3

K THU T PCR Ậ Ỹ

I. M c đích ụ

ậ ố K thu t pcr là m t k thu t khu ch đ i đo n gen, mà không c n nh vào sinh v t s ng ạ ộ ỹ ế ậ ậ ạ ầ ờ ỹ

nh ecoli, hay n m men. ư ấ

ụ Có r t nhi u ng d ng quan tr ng trong y h c, cũng nh trong di truy n, nh ng ng d ng ọ ề ứ ụ ư ư ứ ề ấ ọ

quan tr ng nh t đó chính là chu n đoán b nh tìm ra tác nhân gây b nh, qua đó xóm đ a ra ư ệ ệ ấ ẩ ọ

bi n pháp can thi p ki p th i. Đ c ng d ng r t nhi u trong vi c chu n đoán b nh trên ụ ượ ứ ệ ệ ệ ề ệ ệ ấ ẩ ờ

đ ng v t. Đ c bi ậ ộ ặ ệ t hi n nay m t s b nh quan tr ng nh virus heo tai xanh(PRRS ọ ộ ố ệ ư ệ

), hay virus v t cúm gia c m(H5N1),… ầ ị

II. Quy trình ly trích ARN cho b nh PRRS, DNA cho b nh Porcine Circovirus

ệ

ệ

Type 2 (PCV2) và ch y PCR

ạ

ị M u ph i, th n, lách, h ch c a heo ngi ng m t b nh 1.Chu n b nguyên li u và hóa ch t ạ ấ ờ ắ ệ ẩ ậ ệ ủ ầ ổ

Hình 25: Mô heo ngi ng m t b nh PRRS(a), PCV2(b) ờ ấ ệ

B kit th ộ ươ ng m i đ ti n hành phân l p ậ ạ ể ế

Hình 26: B kít Promega dùng đ trích ly RNA, b kít Vi t Á dùng đ trích ly DNA ộ ộ ể ệ ể

2.D ng c và thi ụ ụ t b ế ị

ố ộ

ầ

Máy ch y PCR ạ Máy ly tâm có t c đ cao Vortex Máy homogenizer hay chày c iố Pipette, đ u col Tube Máy ch y đi n di ạ ệ

Eppendorf

3.Cách th c hi n ự ệ

3.1 Trích ly RNA c a b nh heo tai xanh(PRRS) ủ ệ

B c 1: x lý m u ử ướ ẫ

L y 5gr m u đã chu n tr c đó, c t nh cho vào c i giã nhi n ra ẫ ẩ ấ ướ ễ ắ ỏ ố

Hình 27: C t m u và giã nhi n ẫ ễ ắ

Cho 5ml dung d ch PBS vào m u đã giã nhi n và tr n đi u ề ễ ẫ ộ ị

Hình 28: Hút dd PBS cho vào m u đã giã nhi n ễ ẫ

Hút m u mô cho vào eppendorf, b c n. Đem ly tâm 6000 vòng/5 phút ỏ ặ ẫ

Hình 29: Hút m u vào eppendorf và đem ly tâm ẫ

B c 2: Cho 200µl m u vào eppendorf ch a s n 1000µl RNA Lysis Buffer tr n đ u, đ ứ ẵ ướ ề ẫ ộ ể

yên 30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/1 phút Phá v t bào, phóng thích RNA. ỡ ế

Hình 30: Cho m u vào eppendorf ch a s n RNA Lysis Buffer sau đó tr n đ u m u ộ ề ứ ẵ ẫ ẫ

B c 3: Cho 175µl h n h p dung d ch trên vào eppendorf ch a 350µl RNA Dilution Buffer, ướ ứ ỗ ợ ị

tr n đ u, 65 ề ủ oc trong 3 phút, ly tâm 13000 vòng/ 10 phút  T a protein t p và các t p ạ ủ ạ ộ

ch t.ấ

0. Cho t

ỗ ợ Hình 31: Cho h n h p vào eppendorf ch a ứ 350µl RNA Dilution Buffer sau đó đem ly tâm

t c vào ướ ứ ẵ ồ ổ ị ấ ả B c 4: eppendof l c, ly tâm 13000 vòng/1 phút RNA trên màng l c. Hút 300µl d ch n i cho vào eppendorf ch a s n 200µl c n 96  Gi ọ ữ ọ

Hình 32: Hút 300µl d ch n i cho vào eppendorf ch a s n 200µl c n 96

0 và Cho t

ứ ẵ ổ ồ ị t cấ ả vào eppendof l cọ

B c 5: Đ h t ph n n c, cho 600µl dung d ch r a vào eppendof l c ly tâm 13000 vòng/1 ướ ổ ế ầ ướ ử ọ ị

phút  Lo i b protein t p và t p ch t. ạ ỏ ạ ấ ạ

Hình 32: Hút 600µl dung d ch r a vào eppendof l c ọ ị ử

B c 6: ướ

4. Thu ho ch tr ng tiêm màng CAM ứ ạ ở

C t đ u qu tr ng hút h t n c l y phôi quan sát ắ ầ ả ứ ế ướ ấ

C t đ u qu tr ng ch l y màng CAM xem n t pock ắ ầ ả ứ ỉ ấ ố

5. Thu ho ch tr ng tiêm xoang ni u mô ứ ạ ở ệ

5.1. Ph n ng HA trên kính ả ứ

ế Ph n ng này dùng đ xét nghi m nhanh các virus Newcastle có kh năng gây ng ng k t ả ứ ư ệ ể ả

h ng c u c a m t s loài. ồ ầ ủ ộ ố

Chu n bẩ ị

Huy n d ch h ng c u 10%. ồ ễ ầ ị

G c virus Newcastle chu n làm đ i ch ng. ứ ẩ ố ố

Lam kính.

N c tr ng. ướ ứ

Th i gian x y ra ph n ng là 1 phút. ả ứ ả ờ

Th c hi n` ự ệ

N c tr ng ly tâm 1500- 3000 vòng/phút, l y n c trong phía trên nh m t gi t n ướ ứ ấ ướ ỏ ộ ọ ướ c

tr ng lên lam sau đó nh m t gi t h ng c u r i tr n l n v i nhau. ỏ ộ ứ ọ ồ ầ ồ ộ ẫ ớ

Quan sát

c tr ng có virus Newcastle, k t qu d N u có s ng ng k t h ng c u thì trong n ế ồ ự ư ế ầ ướ ả ươ ng ứ ế

tính (+) và không có s ng ng k t h ng c u cho k t qu âm tính (-). ế ồ ự ư ế ầ ả

c c a virus Newcastle 5.2. Xác đ nh kích th ị ướ ủ

Th c hi n ự ệ

- Tr c tiên l y huy n d ch n c tr ng v i HA (+) đem li tâm. ướ ễ ấ ị ướ ứ ớ

- Dùng kim tiêm hút l y ph n n c phía trên. ầ ướ ấ

- B m kim tiêm đã hút n c huy n d ch vào màng l c có kích th c 0.45 µm và 0.22 µm. ơ ướ ễ ọ ị ướ

- Thu d ch l c. ị ọ

Th nghi m ph n ng HA trên kính và ghi nh n k t qu ả ứ ử ế ệ ậ ả

c đã l c đ c L y d ch n ị ấ ướ ọ ượ ở màng l c 0.45µm th c hi n ki m tra b ng ph n ng HA trên ể ả ứ ự ệ ằ ọ

kính, có 2 tr ng h p x y ra: ườ ả ợ

+ N u m u làm ph n ng HA trên kính cho k t qu âm tính, t c virus trong huy n d ch ả ứ ứ ế ễ ế ẫ ả ị

có kích th c l n h n 0.45µm. ướ ớ ơ

+ N u m u làm ph n ng HA trên kính cho k t qu d ả ứ ả ươ ế ế ẫ ễ ng tính, t c virus trong huy n ứ

c nh h n 0.45µm. ng h p HA d ng tính ng v i d ch n c đã l c đ d ch có kích th ị ướ ỏ ơ tr Ở ườ ợ ươ ớ ị ứ ướ ọ ượ ở c

màng l c 0.45µm, ti p t c l y d ch n c đã l c đ c ế ụ ấ ọ ị ướ ọ ượ ở ả ứ màng l c 0.22µm th c hi n ki m tra ph n ng ự ệ ể ọ

HA trên kính.

* N u m u làm ph n ng HA trên kính cho k t qu âm tính, t c virus trong ả ứ ứ ế ế ẫ ả

huy n d ch có kích th c l n h n 0.22µm. ễ ị ướ ớ ơ

* N u m u làm ph n ng HA trên kính cho k t qu d ng tính, t c virus trong huy n d ch ả ứ ả ươ ế ế ẫ ứ ễ ị

có kích th c l n h n 0.22µm. ướ ớ ơ

6. K t qu và th o lu n ế ả ả ậ

 màng CAM màu đ t Quan sát phôi c a tr ng tiêm b nh ph m ứ ẩ ở ủ ệ ỏ ươ ậ i do virus Đ u

gây xu t huy t phôi nh ng không làm ch t phôi. (Hình 1) ư ế ế ấ

màng CAM Hình 1 : Phôi c a tr ng tiêm b nh ph m ứ ẩ ở ủ ệ

 màng CAM và tiêm xoang ni u mô So sánh phôi c a tr ng tiêm b nh ph m ứ ẩ ở ủ ệ ở ệ

- Khi tiêm virus Đ u màng CAM không gây ch t phôi, nh ng gây xu t huy t, phôi có ậ ở ư ế ế ấ

màu đ t i và virus này t o n t Pock trên màng CAM. Còn tiêm virus Newcastle xoang ni u mô thì sau ỏ ươ ạ ố ở ệ

24 gi p tr ng (sau khi tiêm) virus làm ch t phôi. Phôi đã ch t nên không có màu đ t i. (Hình 6) ờ ấ ỏ ươ ứ ế ế

Hình 2: Tiêm ở xoang ni u mô làm phôi ch t ế ệ

 N t Pock trên màng CAM: B nh tích gây th y th ng, dày lên t o thành n t pock ố ủ ủ ệ ạ ố

trên màng CAM.

Hình 3: N t Pock trên màng CAM ố

 Ph n ng HA trên kính: ả ứ

5 m u đ u x y ra ph n ng ng ng k t h ng c u ch ng t có s hi n di n c a virus ế ồ ả ứ ư ứ ề ẫ ả ầ ỏ ự ệ ủ ệ

Newcastle.

Hình 4: Ph n ng ng ng k t h ng c u (HA) ư ế ồ ả ứ ầ

Bài 2: Ph n ng ng ng k t h ng c u ế ồ ả ứ ư ầ

(HA: Haemagglutination)

1. Nguyên lý

ế ợ Trên b m t virus Newcastle có c u trúc kháng nguyên haemagglutine, có kh năng k t h p ề ặ ả ấ

v i các th th trên b m t h ng c u c a loài gà, v t… nên nó làm ng ng k t các lo i h ng c u này l ị ớ ề ặ ồ ầ ủ ụ ể ạ ồ ư ế ầ ạ i

v i nhau. ớ

2. M c đích ụ

Xác đ nh hi u giá pha loãng mà đó virus còn kh năng gây ng ng k t h ng c u. ệ ị ở ế ồ ư ầ ả

3. Chu n b và cách ti n hành ế ẩ ị

 Chu n b ị ẩ

Huy n d ch h ng c u gà 1%. ồ ễ ầ ị

Virus Newcastle.

N c mu i sinh lý 0.9%. ướ ố

Vĩ 96 l có đáy hình ch U. ỗ ữ

Micropipette 1 đ u và 8 đ u. ầ ầ

Cách chu n b dung d ch h ng c u gà 1%. ị ầ ẩ ồ ị

Ch n gà tr ng kh e m nh, l y máu có ch t kháng đông ấ ấ ạ ỏ ố ọ ở tĩnh m ch cánh. ạ

L y máu gà v a thu nh n tr n v i n c mu i sinh lý, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, ớ ướ ừ ấ ậ ộ ố

lo i b ph n n c trong bên trên, gi i ph n h ng c u l ng d i đáy. Ti p t c pha h ng c u v i n ạ ỏ ầ ướ l ữ ạ ầ ắ ầ ồ ướ ế ụ ớ ướ c ầ ồ

mu i sinh lý, ly tâm. Th c hi n thao tác này đ n khi nào h ng c u đ ầ ượ ử c r a th tt s ch (th ậ ạ ự ệ ế ố ồ ườ ệ ng th c hi n ự

thao tác ly tâm kho ng 3 – 4 l n). L n cu i cùng lo i b ph n n c trong bên trên, ph n h ng c u pha ạ ỏ ả ầ ầ ầ ố ướ ầ ầ ồ

c mu i sinh lý đ đ c h ng c u 1%. v i n ớ ướ ể ượ ồ ầ ố

Hình 5: H ng c u 1% ồ ầ

 Ti n hành ế

Cho n c mu i sinh lý vào các hàng t 1 đ n 12, m i l 50µl ướ ố l ừ ỗ ỗ ỗ ế

th 1, tr n đ u. sau đó l y 50µl huy n d ch t l Cho thêm 50µl huy n d ch virus vào l ễ ị ỗ ứ ễ ề ấ ộ ị ừ ỗ 1

cho vào l th 11, hút 50µl huy n d ch t l ỗ 2, tr n đ u và c ti p t c làm cho đ n l ứ ế ụ ế ỗ ứ ề ễ ộ ị ừ ỗ ứ th 11 b ra ngoài. ỏ

L th 12 dùng làm đ i ch ng. ỗ ứ ứ ố

Cu i cùng cho 50µl huy n d ch h ng c u gà 1% vào t t c các l 1 đ n 12, l c đ u, đ ễ ầ ố ồ ị ấ ả t ỗ ừ ắ ề ế ể

yên 30 phút r i đ c k t qu . ả ồ ọ ế

Ta ti n hành 3 l n l p l i. ầ ặ ạ ế

4. K t quế ả

ng tính : x y ra ng ng k t h ng c u  Ph n n HA d ả ứ ươ ế ồ : ầ ở ư ả

Hàng I: t v trí th 1 - 6 (n = 6), đóng nút t đó ừ ị ứ ạ ị i v trí th 7 . V y hi u giá pha loãng mà ệ ứ ậ ở

virus còn kh năng gây ng ng k t h ng c u là 1/ 64. ư ế ồ ả ầ

Hàng II: x y ra hi n t ả ệ ượ ng “ nh y cóc”. ả

Hàng III: t v trí th 1 - 8 ( n = 8), đóng nút t đó ừ ị ứ ạ ị i v trí th 9. V y hi u giá pha loãng mà ệ ứ ậ ở

virus còn kh năng gây ng ng k t h ng c u là 1/ 512. ư ế ồ ả ầ

Hàng IV: t v trí th 1- 10 ( n =10), đóng nút t ừ ị ứ ạ ị i v trí th 11. V y hi u giá pha loãng mà ệ ứ ậ ở

đó virus còn kh năng gây ng ng k t h ng c u là 1/ 1024. ư ế ồ ầ ả

Hàng V: x y ra hi n t ả ệ ượ ng “ nh y cóc”. ả

Hàng VI: x y ra hi n t ả ệ ượ ng “ nh y cóc”. ả

 K t qu : ế ả X y ra hi n t ệ ượ ả ễ ng “ nh y cóc” có th do sai sót thao tác không cho huy n ể ả

nên không th ng ng k t h ng c u gà t o hi n t d ch virus vào l ị ỗ ể ư ế ồ ệ ượ ầ ạ ng đ ng nút. ố

Bài 3: Ph n ng ngăn tr ng ng k t h ng c u ở ư ế ồ ả ứ ầ

(HI: Haemagglutination inhibition)

1. Nguyên lý

Khi Newcastle g p kháng th đ c hi u tu ng ng s b kháng th này k t h p,không còn ế ợ ể ặ ẽ ị ứ ể ệ ặ ơ

ầ ủ kh năng gây ng ng k t h ng c u, hay nói cách khác kháng th đã ngăn tr s ng ng k t h ng c u c a ế ồ ế ồ ở ự ư ư ể ả ầ

virus.

M c đích: xác đ nh hàm l ng kháng th ch ng l i b nh Newcastle ụ ị ựơ ể ố ạ ệ

2. Chu n bẩ ị

Huy n d ch h ng c u gà 1% ồ ễ ầ ị

Huy n d ch virus newcastle pha loãng n ng đ n – 2 (4 đ n v HA) ễ ị ở ồ ơ ộ ị

Nu c mu i sinh lý 0.9% ớ ố

Huy t thanh gà thí nghi m ế ệ

Vĩ 96 l có đáy hình ch U ỗ ữ

Micropipette 1 đ u và 8 đ u ầ ầ

3. Ti n hành ế

Cho nu c mu i sinh lý vào hàng th nh t t th 1 đ n 12, m i l l 50 µl. ứ ấ ừ ỗ ứ ỗ ỗ ế ớ ố

Cho thêm 50 µl huy t thanh gà vào l 1 cho ế ỗ 1, tr n đ u. Sau đó l y 50 µl huy n d ch t ấ ề ễ ộ ị l ừ ỗ

vào l th 10, hút 50 µl huy n d ch l ỗ 2, tr n đ u lên và c ti p t c nh th cho đ n l ứ ế ụ ư ế ế ỗ ứ ề ễ ộ ị ở ỗ ứ ỏ th 10 b ra

ngoài. L 11 dùng làm đ i ch ng âm, l ứ ỗ ố ỗ 12 dùng làm đ i ch ng du ng. ố ứ ơ

Cho vào m i l l 1 đ n l th 11 m i l 50 µl huy n d ch virus đã pha loãng n ng đ t ỗ ỗ ừ ỗ ế ỗ ứ ỗ ỗ ễ ị ở ồ ộ

4 đ n v HA. Đ yên 10 – 15 phút ể ơ ị

Cu i cùng cho 50 µl huy n d ch h ng c u gà 1% vào t t c các l 1 đ n 12, l c đ u, đ ễ ầ ố ồ ị ấ ả t ỗ ừ ắ ề ế ể

yên 30 phút r i đ c k t qu . ả ồ ọ ế

4. K t qu và th o lu n ế ả ậ ả

Qua hình nh ta th y: ả ấ

S ng ng k t và đóng nút không rõ r t. K t qu này không đ c chính xác. Có th do thao ự ư ế ệ ế ả ượ ể

tác pha loãng và trình t ự ự ả th c hi n ph n ng HI. Do đó trong quá trình th c hi n ph n ng HI c n ph i: ả ứ ả ứ ự ệ ệ ầ

S d ng thành th o các thao tác trong quá trình th c hi n ph n ng HI. ử ụ ả ứ ự ệ ạ

Bài 4: Qui trình tách chi ế t DNA t ng s và ch y PCR ố ổ ạ

1. D ng c và thi

ụ ụ t b ế ị

Máy ch y PCR ạ

Máy ly tâm có t c đ cao ( kho ng 13000 vòng/10 phút) ố ộ ả

Vortex

Máy homogenizer hay chày c iố

Pipette, đ u col ầ

Tube

2. Nguyên li u và hóa ch t ấ ệ

Mô gang đ ng v t ậ ộ

B kit g m các dung d ch: dung d ch pED1, dung d ch pEX2, dung d ch pEX3, dung d ch ộ ồ ị ị ị ị ị

EX4, dung d ch ED5. ị

3. Các b

c ti n hành ướ ế

B c 1: ướ X lý m u (nghi n m u, ly tâm, thu d ch mô) ẫ ử ề ẫ ị

Nghi n m u: ẫ 1gram mô + 2ml PPS ề

Hút n c mô vào đ y 2 tube vô trùng ướ ầ

Ly tâm: 13000 vòng/5 phút

Thu d ch mô ị

B c 2: ướ Đánh d u các tube 1,5ml vô trùng b ng ký hi u m u ẫ ệ ấ ằ

B c 3: Cho 200µl m u vào m t tube vô trùng có s n 900µl , voxtex 30s, ướ ẫ ẵ ộ dung d ch pED1 ị

đ yên 10 phút. Thêm vào 200µl ể dung d ch pEX2 ị ả , tr n đ u sao cho toàn b dung d ch trong tube ph i ộ ề ộ ị

chuy n thành màu tr ng đ c. Ly tâm 13000 vòng /10 phút. ụ ể ắ

B c 4: Thu 600µl d ch n i có ch a DNA vào m t tube vô trùng có s n 600µl ướ ứ ẵ ổ ộ ị dung d chị

pEX3. Tr n đ u đ yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút. ể ề ộ

B c 5: Lo i b d ch n i, thu c n màu h ng ( ho c xanh). Cho t 900µl ướ ạ ỏ ị ặ ặ ổ ồ t ừ ừ dung d chị

EX4 vào. Ly tâm 13000 vòng /5 phút

oC trong 10 – 15 phút. Cho vào 50µl dung

B c 6: Lo i b d ch n i, thu c n. Đ khô 60 ướ ạ ỏ ị ể ặ ổ ở

d ch ED5 . ị

B c 7: Tr ướ ướ c khi s d ng, dung pipet tr n đ u đ n khi ph n c n tan hoàn toàn. ề ầ ặ ử ụ ế ộ

oC.

B c 8: -20 ướ B o qu n m u ả ẫ ở ả

B c 9: L y m u cho vào eppendorf cho vào máy PCR và thi t l p ch ng trình ch y. ướ ấ ẫ ế ậ ươ ạ

Hình 13: Ch y PCR ạ

Hình 14: Chu trình ch y PCR ạ

4. K t qu th o lu n

ả ả ế ậ

Bài 4: Ph n ng k t t a và khu ch tán trên th ch ế ủ ả ứ ế ạ

(Agar gel immunodiffustion test – AGID test)

1. Nguyên t cắ

- Kháng nguyên và kháng th khu ch tán trong th ch. ể ế ạ

- Khi g p nhau s k t h p t o thành đ ẽ ế ợ ạ ặ ườ ng k t t a tr ng m đ c. ắ ế ủ ờ ụ

2. Chu n bẩ ị

- Kháng nguyên: huy t thanh gà. ế

- Kháng th đ a kháng huy t thanh gà. ể ư ế

- Đun cách thu cho đ n khi tan h t. ế ế ỷ

3. Ti n hành ế

- Hút 3- 4ml th ch đã nung ch y cho vào lam th y tinh, chú ý r i th ch theo hình ziczac ủ ả ả ạ ạ

đ th ch ch y đ u lên m t lam. ể ể ạ ả ặ

- Lam đ i. ượ ể c đ trên m t bàn b ng ph ng cho đ n khi th ch đông l ẳ ế ằ ặ ạ ạ

- Th ch ph i dày kho ng 3 mm. ả ạ ả

- Dùng ng kim lo i đ c 5 l : 1 l còn l i đ t vuông góc v i nhau. ạ ụ ố ỗ ỗ ở ữ gi a th ch, 4 l ạ ỗ ạ ặ ớ

- Cho kháng nguyên vào 1 l gi a th ch, cho kháng th vào 4 l còn l i hay có th cho ỗ ở ữ ể ạ ỗ ạ ể

ng i cho kháng th vào 1 l gi a, cho kháng nguyên vào 4 l còn l i. c l ượ ạ ể ỗ ở ữ ỗ ạ

Chú ý: tùy vào đ l n c a m i l mà ta tiêm vào 1 l ng ng ộ ớ ủ ỗ ỗ ượ ng th tích t ể ươ ứ

- Đ t lam vào trong đĩa petri, đ t bông gòn có th m n ặ ặ ấ ướ ạ c xen k gi a các lam nh m t o ẽ ữ ằ

đ m cho đĩa.. ộ ẩ

0C.

- 37 Ủ ở

, l n 2 là sau 48 gi - Đ c k t qu 2 l n: l n 1 là sau 24 gi ầ ọ ế ả ầ ờ ầ . ờ

Hình 16: Các lam đã tiêm kháng nguyên – kháng thể

4. K t quế ả

L n I: sau 24 gi ầ ờ ư ch a có v ng tr ng đ c nh m u đ i ch ng. ụ ư ứ ắ ẫ ầ ố

K t qu : ng đã đ ả do không đ th i gian nên ch có th quan sát m u đ i ch ng d ỉ ủ ờ ế ứ ể ẫ ố ươ ượ c

gi ng viên chu n b t c. tr ị ừ ướ ả ẩ

A phát hi n kháng th kháng virus gây b nh Gumboro Bài 5: Ph n ng ELIS ả ứ ệ ể ệ

1. Gi i thi u ớ ệ

1.1. B nh Gumboro ệ

B nh Gumboro (Infections Brusal Disease) là b nh th ng x y ra trên gà ệ ệ ườ ả ở giai đo n 1 - 12 ạ

tu n tu i, rõ nh t là giai đo n 3 - 6 tu n tu i. ầ ấ ạ ầ ổ ổ

ệ T t c các gi ng gà đ u m c b nh. Gà nh h n 3 tu n tu i m c b nh không bi u hi n ỏ ơ ấ ả ề ệ ệ ể ắ ầ ắ ố ổ

tri u ch ng nh ng s làm gà suy gi m mi n d ch. T l m c b nh là 100%, t ch t t ỷ ệ ắ ứ ư ệ ẽ ễ ệ ả ị l ỷ ệ ế ừ ặ 10-50% ho c

cao h n n u k t h p v i các b nh khác. ế ợ ế ệ ơ ớ

a. Nguyên nhân: Do virus thu c h Birnaviridae, serotype 1. ộ ọ

b. Ph ng th c truy n lây ươ ứ ề

c u ng, d ng c - B nh có th lây gián ti p qua tr ng, qua không khí, ho c th c ăn, n ứ ứ ệ ể ế ặ ướ ụ ố ụ

chăn nuôi nhi m m m b nh. ễ ệ ầ

- B nh lây lan tr c ti p gi a gà mang m m b nh và gà kh e do ti p xúc. ự ế ữ ệ ệ ế ầ ỏ

c. Tri u ch ng ứ ệ

- Th i gian ờ ủ ệ b nh ng n 2-3 ngày. ắ

- Sau khi nhi m b nh gà bi u hi n tri u ch ng đ u tiên là c n m vào h u môn c a nhau, ứ ủ ễ ệ ể ệ ệ ầ ắ ậ ổ

bi ng ăn, lông xù, l đ , đi run r y, gi m cân, phân tiêu ch y màu tr ng, loãng còn nhi u ch t nh y sau ế ờ ờ ề ẩ ả ả ắ ấ ầ

đó chuy n sang màu nâu, phân dính đ y xung quanh h u môn. ể ầ ậ

d. B nh tích ệ

- Xác ch t khô, lông x xác, chân khô. ế ơ

- C đùi, c ng c, c cánh xu t huy t đ thành v t ho c thâm đen. ơ ự ế ỏ ệ ấ ặ ơ ơ

ậ ư - M khám túi Fabricicus s ng to, đ , có xu t huy t l m t m ho c c đám, th n s ng ấ ặ ả ế ấ ư ấ ổ ỏ

nh t màu. Xu t huy t trên niêm m c d dày tuy n (ch ti p giáp gi a m và ti n m ), ru t s ng to có ộ ư ổ ế ữ ế ế ề ề ề ạ ấ ạ ạ

nhi u d ch nh y bên trong. ầ ề ị

- N u gà nhi m b nh đ n ngày th i, đ n ngày th ế ễ ệ ế ứ 5, 6, 7 thì túi Fabricius nh l ỏ ạ ế ứ 8

thì ch b ng 1/3 tr ng l ng ban đ u. ỉ ằ ọ ượ ầ

1.2. ELISA

ế ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) có nghĩa là h p th mi m d ch liên k t ụ ễ ấ ị

đây kháng th đ c hi u cho v i enzyme, là m t phân tích s d ng kháng th đ nh n di n protein. ớ ử ụ ể ể ệ ậ ộ Ở ể ặ ệ

kháng nguyên (th ng là protein ta quan tâm) đ c g n vào đáy gi ng. Ch t mà ta quan tâm n m trong ườ ượ ế ắ ấ ằ

m u th đ ử ượ ẫ ế c tr n l n v i ch t chu n có liên k t enzyme. Khi ta cho h n h p này vào gi ng thì gi ng ộ ẫ ế ế ấ ẩ ớ ỗ ợ

ạ nào có ch t c a ta trong m u th s c nh tranh v i ch t chu n làm cho gi ng đó sau khi b t màu s nh t ử ẽ ạ ấ ủ ế ẽ ẫ ấ ẩ ắ ớ

t l h n. So k t qu đó v i m t gi ng chu n ch có ch t chu n ta s bi ơ ẽ ế ượ ế ế ả ẩ ấ ẩ ớ ộ ỉ ẫ ng ch t ta quan tâm trong m u ấ

th c a ta là bao nhiêu. ELISA đ c s d ng nhi u trong y h c, trong ch n đoán (ví d có thai, ung ử ủ ượ ử ụ ụ ề ẩ ọ

th ...v.v), trong ch n đoán b nh cho gia súc v t. ư ệ ẩ ậ

u đi m c a ph Ư ể ủ ươ ng pháp ELISA là: đ nh y cao, có th phát hi n đ ạ ể ệ ộ ượ ứ ợ c ph c h p

nh kháng nguyên- kháng th , cho phép phát hi n s m tác nhân gây b nh ệ ớ ể ệ ỏ ở ệ giai đo n s m khi m m b nh ạ ớ ầ

ấ m i xâm nhi m. Dùng đ phát h ên nhi u lo i Protein, nh n di n virut, vikhu n, và m t s h p ch t ộ ố ợ ễ ể ề ệ ạ ậ ẩ ớ ị

phân t l ử ượ ng nh trong nhi u m u sinh h c khác nhau. ẫ ề ỏ ọ

2. D ng c - hóa ch t ấ ụ ụ

- Vĩ ph n ng có ph kháng nguyên virus gây b nh Gumboro. ả ứ ủ ệ

- Đ i ch ng d ứ ố ươ ng : có kháng th . ể

- Đ i ch ng âm : không có kháng th . ể ứ ố

- Kháng kháng th ch t dê có g n enzyme (Horseradish Peroxidase Conjugate). ể ế ừ ắ

- Dung d ch phát hi n màu (TMB Substrate): conzurat + ch t hi n màu. ệ ệ ấ ị

- Dung d ch d ng ph n ng (Stop Solution): d ng ph n ng t o màu. ả ứ ả ứ ừ ừ ạ ị

- Dung d ch pha loãng m u (Sample Diluent) dùng đ pha loãng m u huy t thanh. ể ế ẫ ẫ ị

- N c c t ho c n c ti ướ ấ ặ ướ ệ t trùng: r a m u. ử ẫ

3. Chu n bẩ ị

- B kit ph i đ c đ nhi t đ phòng 1 gi ả ượ ể ở ộ ệ ộ tr ờ ướ c khi th c hi n ph n ng. ệ ả ứ ự

M uẫ

- Dùng µl pipet hút huy t thanh t ng chích sang các tube có n p. ế ừ ố ắ

- Chu n b 10 tube có n p ch a 1500µl dung d ch pha loãng. ứ ẩ ắ ị ị

- Hút 3µl huy t thanh t tube ch a huy t thanh sang các tube ch a dung d ch pha loãng. ế ừ ứ ứ ế ị

- Th c hi n pha loãng m u v i dung d ch pha loãng m u v i t l 1:500 (3µl huy t thanh + ớ ỉ ệ ự ệ ẫ ẫ ớ ị ế

1500µl dung d ch pha loãng m u). ẫ ị

Chú ý :

m i m u. - Thay đ u type ầ ở ỗ ẫ

- Không pha loãng đ i ch ng. ứ ố

Hình 18: M u huy t thanh Hình 19: M u huy t thanh pha loãng 1: 500 ế ẫ ế ẫ

4. Ti n hành ế

- Ghi kí hi u m u. ệ ẫ

- Nh 100µl đ i ch ng âm vào gi ng A1 và A3. ứ ế ỏ ố

- Nh 100µl đ i ch ng d ng vào gi ng A2 và A4. ứ ỏ ố ươ ế

- L n l ng ng : B3, B4, C3, C4, D3, D4, E3, E4, F3, ầ ượ t nh 100µl m u vào 10 gi ng t ẫ ế ỏ ươ ứ

F4.

Hình 20: Vĩ ph n ng có ph kháng ả ứ ủ

Hình 21: Nh m u pha loãng vào gi ng nguyên virus ỏ ẫ ế

- 30 phút nhi t đ phòng. Ủ ở ệ ộ

- V y b dung d ch bên trong các gi ng. ế ẩ ỏ ị

c c t ho c n c ti c th c hi n t 3-5 - R a b ng n ử ằ ướ ấ ặ ướ ệ t trùng, 350µl/l n, quá trình r a đ ầ ử ượ ệ ừ ự

l n. ầ

- V y khô. ẩ

- Nh 100µl Horseradish peroxidase conjugate vào các gi ng. ế ỏ

- 30 phút nhi t đ phòng. Ủ ở ệ ộ

- R a n c c t ho c n c ti c th c hi n t 3-5 l n. ử ướ ấ ặ ướ ệ t trùng, 350µl/l n, quá trình r a đ ầ ử ượ ệ ừ ự ầ

- V y khô. ẩ

- Nh 100µl TMB solution vào các gi ng. ế ỏ

- 15 phút trong ch t i, nhi t đ phòng. Ủ ỗ ố ở ệ ộ

- Nh 100µl Stop Solution vào các gi ng đ ng ng ph n ng trong các gi ng. ể ừ ả ứ ế ế ỏ

- Đ c k t qu c sóng 650nm. ọ ế b ả ở ướ

5. K t quế ả

B ng 1: c sóng 650nm ả K t qu ph n ng ELISA ả ứ ế ả b ở ướ

8 9 10 11 12

A B C 0.066 0.05 0.059 0.087 0.065 0.056 0.076 0.062 0.082 0.123(+) 0.062(+) 0.057 0.07(-) 0.07(-) 0.053

0.083 0.052 0.083

D E F

 Tính toán:

Đi u ki n ph n ng: ả ứ ề ệ

PCx – NCx = 0.0225 < 0.075 (Không th a)ỏ

NCx = 0.07 > 0.015 (Không th a)ỏ

Do k t qu thu đ ế ả ượ ự c không th a c hai đi u ki n trên nên ta có th suy ra quá trình th c ỏ ả ệ ể ề

hi n có sai sót nên không th tính ra đ c tr s S/P chính xác nh công th c: ệ ể ượ ị ố ứ ư

Ch s S/P = (sample mean - NCx)/ (PCx - NCx) ỉ ố

S/P > 0.2 : d ng tính (titer > 396) ươ

S/P<0.2: âm tính

: t ch s S/P âm tính hay d ng tính ta có th xác đ nh đ  Ý nghĩa c a ch s S/P ủ ỉ ố ừ ỉ ố ươ ể ị ượ c

hi u giá kháng th titer (bi u th kh năng b o h c a kháng th trong đàn gà): ộ ủ ệ ể ể ể ả ả ị

Log10 Titer = 1.09 (log10S/P) + 3.36

 Th o lu n nhóm v k t qu : ả ề ế ả ậ

K t qu th nghi m ELISA sai ả ử ế ệ ở 2 m u đ i ch ng d ố ứ ẫ ươ ng (g n b ng đ i ch ng âm) có ố ứ ầ ằ

th x y ra 2 tr ể ả ườ ng h p: ợ

 ắ Cho quá ít ho c không cho kháng nguyên chu n vào nên kháng kháng th có g n ể ẩ ặ

enzyme sinh ra quá ít ho c không có làm cho k t qu không chính xác. ế ả ặ

 ố Quá trình th c hi n có m t s nh m l n khi cho m u đ i ch ng âm vào m u đ i ộ ố ự ứ ệ ẫ ầ ẫ ẫ ố

ch ng d ứ ươ ng nên k t qu c a c 2 đ i ch ng đ u g n nh nhau. ố ả ủ ả ứ ư ề ế ầ