Báo cáo thực hành môn Virus học

Chia sẻ: Phan Van Hung | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:32

Thêm vào BST

Báo xấu

231
lượt xem 35
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

"Báo cáo thực hành môn Virus học" trình bày về: kỹ thuật tiêm trứng và kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch, tham quan công ty navetco, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, qui trình tách chiết DNA tổng số và chạy PCR, phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh Gumboro.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo thực hành môn Virus học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN PHAN VĂN HÙNG BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN VIRUS HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa học: 2010 – 2014 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Ts. Nguyễn Tất Toàn An Giang, Tháng 04 năm 2014
Bài I KỸ THUẬT TIÊM TRỨNG VÀ KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TÁN TRÊN THẠCH I. Kỹ thuật tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang niệu mô) 1. Mục đích Xác định sự hiện diện của virus Newcastle trong phôi trứng gà, ứng d ụng sâu h ơn là s ản xuất Vắc xin. 2. Dụng cụ - hóa chất Hình 1: Một số dụng cụ và hóa cần thiết Nước muối sinh lý 10- 20% Cồn Iod Parafin lỏng Kim tiêm 3. Chuẩn bị nguyên liệu Chuẩn bị trứng gà đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi
Hình 2: Trứng 9 – 11 ngày tuổi Chuẩn bị vắc xin Newcastle nhược độc, sử dụng ở n ồng đ ộ 10 -3, liều lượng là 0.1- 0.2ml/trứng Hình 3: Vắc xin Niu-cát xơ Pha vắc xin với nước muối sinh lý ở nồng độ 10-1, 10-2, 10-3. Hình 4: Khử trùng hủ vắc xin Niu-cát xơ trước khi đem pha Hình 5: Cho vắc xin vào nước muối sinh lý
Hình 6: Lắc để trộn điều vắc xin Tiến hành pha loãng với các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Hình 7: Virus Niu-cát-xơ ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Sử dụng ở nồng độ 10-3 để tiêm vào trứng, đối với virus Newcastle. Ta tiến hành tiêm ở xoang niệu mô, liều lượng là 0,1-0,2 ml/trứng. 4. Quy trình thực hiện Hình 8: Trứng đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi
Hình 9: Soi trứng, xác định buồn hơi thật, vị trí phôi và làm dấu vị trí phôi Hình 10: Xác trùng vỏ trứng bằng cồn và Iod Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau đó xác trùng lại lần nữa Hình 12: Tiến hành tiêm(liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng) Lưu ý : Tiêm về phía đối diện phôi không tiêm trực tiếp lên phôi
Hình 13: Dùng parafin hơi nóng bịt kín lỗ khoan sau đó tiến hành ủ ở 370c 5. Xem kết quả II. kỹ thuật tiêm Virus Đậu mùa(kỹ thuật tạo buồng hơi giã) 1. Mục đích Xác định sự hiện diện của Virus đậu mùa trong phôi tr ứng gà, thông qua b ệnh tích bi ểu hiện trên màng CAM(nốt pock trên màng CAM). Ứng dụng sản xuất Vắc xin để phòng bệnh đậu mùa 2. Dụng cụ - hóa chất Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su….. 3. Chuẩn bị nguyên liệu Chuẩn bị trứng gà đã ấp 9 – 11 ngày tuổi. Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành các n ồng đ ộ 10 -1,10-2,10-3. Sử dụng nồng độ 10-3, liều tiêm 0,1-0,2 ml/trứng. Cách pha loãng thực hiện tương tư như trên. Hình 14: Vắc xin Đậu gà
4. Quy trình thực hiện Hình 15: Chuẩn bị trứng đã ấp 9-11 ngày tuổi Hình 16: Soi trứng, đánh dấu vị trí buồng hơi giã, khử trùng vỏ trứng, đục lỗ Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút không khí ở buồn hơi giã ra, cho màng cam tuột khỏi vỏ lụa Hình 18: Đục lỗ trên vỏ
Hình 19 : Tiêm Virus Đậu mùa vào màng cam, hướng tiêm lệch một góc 30 - 450 III. KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TAN TRÊN THẠCH 1. Mục đích Xem sự khuếch tán của kháng nguyên(kháng thể gà) và kháng th ể(kháng th ể th ỏ) khu ếch tán trên mặt thạch như thế nào ? 2. Chuẩn bị Kháng nguyên : là kháng thể gà Kháng thể : là kháng thể thỏ  Chuẩn bị môi trường : 12,5gr Agar + 80gr NaCl + 5gr phenol trong 1 lít nước cất Hình 20: Đun môi trường trên bếp cách thủy Dùng vải lượt, lọc môi trường vừa nấu xong Hình 21: Môi trường được lọc xong cho vào chai
Chú ý : Môi trường rất mao đông đặc lại, cần nên tiến hành ngay sao khi lọc xong Dùng pipet hút 4 - 5 ml thạch nhỏ vào lame, đặt pipet vuông góc v ới lame, cho th ạch ch ảy xuống từ từ. chảy đều trên lame không được có vết nhăn và l ồi l ỗm ch ỗ nào, đ ộ dày khoảng 3 mm Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi trường thạch dày 3 mm trên Lame Hình 23: Đem thạch vào tủ lạnh, làm dấu những vị trí cần đục lỗ, tiến hành đục lỗ Cho kháng nguyên( kháng thể gà) và kháng thể( kháng thể th ỏ) vào nh ững v ị trí đã đ ục l ỗ theo quy định như sau : lỗ trung tâm là kháng thể thỏ, 4 lỗ xung quanh là kháng th ể gà, t ừ 20µl - 50µl cho mỗi lỗ trên thạch. Hình 24: Cho kháng thể thỏ vào lỗ trung tâm, kháng thể gà vào 4 lỗ còn lại, đặt những miếng bông gòn để giữ độ ẩm Thực hiện xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ ở 370c, sau 48h để quan sát kết quả
Bài 2 THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO I. Mục đích Học hỏi tìm hiểu thêm về quy trình sản xuất Vắc xin của công ty, và một số vấn đề liên quan về công ty. Một số thiết bị và những ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin được anh Tú nhiệt tình hướng dẫn Hai điểm mới và nỗi bật nhất , đáng quan tâm nhất đó là : cách nuôi Virus dùng để sản xuất vắc xin, và kỹ thuật DNA tái tổ hợp vào sản xuất vắc xin. Điều thiệt thòi nhất là chỉ được ngồi trên giảng đường, mà không được chứng kiến tận mất. do công ty tan ca làm việc. II. Một số vắc xin sản xuất được tại công ty Vắc xin heo tai xanh Vắc xin cúm Vắc xin viêm não nhật bản Vắc xin uốn ván….. III. Quy trình sản xuất vắc xin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp Công nghệ tái tổ hợp lấy đoạn DNA miễn dịch gắn vào vi khuẩn Plasmid chuyển vào nấm men, hay vi khuẩn, để nhân nhanh sinh khối, tách thu sinh khối, để sản xuất vắc xin. BÀI 3 KỸ THUẬT PCR I. Mục đích Kỹ thuật pcr là một kỹ thuật khuếch đại đoạn gen, mà không c ần nh ờ vào sinh v ật s ống như ecoli, hay nấm men. Có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong y học, cũng nh ư trong di truy ền, nh ưng ứng d ụng quan trọng nhất đó chính là chuẩn đoán bệnh tìm ra tác nhân gây bệnh, qua đó xóm đ ưa ra biện pháp can thiệp kiệp thời. Được ứng dụng rất nhiều trong việc chuẩn đoán bệnh trên động vật. Đặc biệt hiện nay một số bệnh quan trọng như virus heo tai xanh(PRRS ), hay virus vịt cúm gia cầm(H5N1),… II. Quy trình ly trích ARN cho bệnh PRRS, DNA cho bệnh Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) và chạy PCR 1.Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất Mầu phổi, thận, lách, hạch của heo ngi ngờ mắt bệnh
Hình 25: Mô heo ngi ngờ mất bệnh PRRS(a), PCV2(b) Bộ kit thương mại để tiến hành phân lập Hình 26: Bộ kít Promega dùng để trích ly RNA, bộ kít Việt Á dùng để trích ly DNA 2.Dụng cụ và thiết bị Máy chạy PCR Máy ly tâm có tốc độ cao Vortex Máy homogenizer hay chày cối Pipette, đầu col Tube Máy chạy điện di Eppendorf 3.Cách thực hiện 3.1 Trích ly RNA của bệnh heo tai xanh(PRRS) Bước 1: xử lý mẫu Lấy 5gr mẫu đã chuẩn trước đó, cắt nhỏ cho vào cối giã nhiễn ra Hình 27: Cắt mẫu và giã nhiễn
Cho 5ml dung dịch PBS vào mẫu đã giã nhiễn và trộn điều Hình 28: Hút dd PBS cho vào mẫu đã giã nhiễn Hút mẫu mô cho vào eppendorf, bỏ cặn. Đem ly tâm 6000 vòng/5 phút Hình 29: Hút mẫu vào eppendorf và đem ly tâm Bước 2: Cho 200µl mẫu vào eppendorf chứa sẵn 1000µl RNA Lysis Buffer trộn đều, để yên 30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/1 phút Phá vỡ tế bào, phóng thích RNA. Hình 30: Cho mẫu vào eppendorf chứa sẵn RNA Lysis Buffer sau đó trộn đều mẫu Bước 3: Cho 175µl hỗn hợp dung dịch trên vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer, trộn đều, ủ 65oc trong 3 phút, ly tâm 13000 vòng/ 10 phút  Tủa protein tạp và các tạp chất.
Hình 31: Cho hỗn hợp vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer sau đó đem ly tâm Bước 4: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 960. Cho tất cả vào eppendof lọc, ly tâm 13000 vòng/1 phút  Giữ RNA trên màng lọc. Hình 32: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 960 và Cho tất cả vào eppendof lọc Bước 5: Đổ hết phần nước, cho 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc ly tâm 13000 vòng/1 phút  Loại bỏ protein tạp và tạp chất. Hình 32: Hút 600µl dung dịch rửa vào eppendof lọc Bước 6:
4. Thu hoạch trứng tiêm ở màng CAM Cắt đầu quả trứng hút hết nước lấy phôi quan sát Cắt đầu quả trứng chỉ lấy màng CAM xem nốt pock 5. Thu hoạch trứng tiêm ở xoang niệu mô 5.1. Phản ứng HA trên kính Phản ứng này dùng để xét nghiệm nhanh các virus Newcastle có kh ả năng gây ng ưng k ết hồng cầu của một số loài. Chuẩn bị Huyễn dịch hồng cầu 10%. Gốc virus Newcastle chuẩn làm đối chứng. Lam kính. Nước trứng. Thời gian xảy ra phản ứng là 1 phút.
Thực hiện` Nước trứng ly tâm 1500- 3000 vòng/phút, lấy nước trong phía trên nh ỏ m ột gi ọt n ước trứng lên lam sau đó nhỏ một giọt hồng cầu rồi trộn lẫn với nhau. Quan sát Nếu có sự ngưng kết hồng cầu thì trong nước trứng có virus Newcastle, kết qu ả d ương tính (+) và không có sự ngưng kết hồng cầu cho kết quả âm tính (-). 5.2. Xác định kích thước của virus Newcastle Thực hiện - Trước tiên lấy huyễn dịch nước trứng với HA (+) đem li tâm. - Dùng kim tiêm hút lấy phần nước phía trên. - Bơm kim tiêm đã hút nước huyễn dịch vào màng lọc có kích thước 0.45 µm và 0.22 µm. - Thu dịch lọc. Thử nghiệm phản ứng HA trên kính và ghi nhận kết quả Lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.45µm thực hiện kiểm tra bằng phản ứng HA trên kính, có 2 trường hợp xảy ra: + Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huy ễn d ịch có kích thước lớn hơn 0.45µm. + Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước nhỏ hơn 0.45µm. Ở trường hợp HA dương tính ứng v ới d ịch n ước đã l ọc đ ược ở màng lọc 0.45µm, tiếp tục lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.22µm thực hi ện ki ểm tra phản ứng HA trên kính. * Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm. * Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch có kích thước lớn hơn 0.22µm. 6. Kết quả và thảo luận  Quan sát phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM màu đ ỏ t ươi do virus Đ ậu gây xuất huyết phôi nhưng không làm chết phôi. (Hình 1)
Hình 1 : Phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM  So sánh phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM và tiêm ở xoang niệu mô - Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nh ưng gây xu ất huy ết, phôi có màu đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM. Còn tiêm virus Newcastle ở xoang ni ệu mô thì sau 24 giờ ấp trứng (sau khi tiêm) virus làm chết phôi. Phôi đã chết nên không có màu đỏ tươi. (Hình 6) Hình 2: Tiêm ở xoang niệu mô làm phôi chết  Nốt Pock trên màng CAM: Bệnh tích gây thủy thủng, dày lên tạo thành nốt pock trên màng CAM. Hình 3: Nốt Pock trên màng CAM  Phản ứng HA trên kính: 5 mẫu đều xảy ra phản ứng ngưng kết hồng cầu chứng tỏ có sự hi ện di ện c ủa virus Newcastle.
Hình 4: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) Bài 2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA: Haemagglutination)
1. Nguyên lý Trên bề mặt virus Newcastle có cấu trúc kháng nguyên haemagglutine, có khả năng kết h ợp với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của loài gà, vịt… nên nó làm ngưng k ết các lo ại h ồng c ầu này l ại với nhau. 2. Mục đích Xác định hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu. 3. Chuẩn bị và cách tiến hành  Chuẩn bị Huyễn dịch hồng cầu gà 1%. Virus Newcastle. Nước muối sinh lý 0.9%. Vĩ 96 lỗ có đáy hình chữ U. Micropipette 1 đầu và 8 đầu. Cách chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 1%. Chọn gà trống khỏe mạnh, lấy máu có chất kháng đông ở tĩnh mạch cánh. Lấy máu gà vừa thu nhận trộn với nước muối sinh lý, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần nước trong bên trên, giữ lại phần hồng cầu lắng dưới đáy. Tiếp tục pha hồng cầu với n ước muối sinh lý, ly tâm. Thực hiện thao tác này đến khi nào hồng cầu được rửa thậtt sạch (thường thực hiện thao tác ly tâm khoảng 3 – 4 lần). Lần cuối cùng lo ại b ỏ ph ần n ước trong bên trên, ph ần h ồng c ầu pha với nước muối sinh lý để được hồng cầu 1%. Hình 5: Hồng cầu 1%  Tiến hành Cho nước muối sinh lý vào các hàng từ lỗ 1 đến 12, mỗi lỗ 50µl
Cho thêm 50µl huyễn dịch virus vào lỗ thứ 1, trộn đều. sau đó lấy 50µl huyễn dịch từ l ỗ 1 cho vào lỗ 2, trộn đều và cứ tiếp tục làm cho đến lỗ thứ 11, hút 50µl huyễn dịch từ lỗ thứ 11 b ỏ ra ngoài. Lỗ thứ 12 dùng làm đối chứng. Cuối cùng cho 50µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các l ỗ từ 1 đ ến 12, l ắc đ ều, đ ể yên 30 phút rồi đọc kết quả. Ta tiến hành 3 lần lặp lại. 4. Kết quả  Phản ứn HA dương tính: xảy ra ngưng kết hồng cầu ở: Hàng I: từ vị trí thứ 1 - 6 (n = 6), đóng nút tại v ị trí th ứ 7 . V ậy hi ệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 64. Hàng II: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”. Hàng III: từ vị trí thứ 1 - 8 ( n = 8), đóng nút tại vị trí thứ 9. Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 512. Hàng IV: từ vị trí thứ 1- 10 ( n =10), đóng nút tại v ị trí th ứ 11. V ậy hi ệu giá pha loãng mà ở đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 1024. Hàng V: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”. Hàng VI: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”.  Kết quả: Xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc” có thể do sai sót thao tác không cho huy ễn dịch virus vào lỗ nên không thể ngưng kết hồng cầu gà tạo hiện tượng đống nút.