Báo cáo tổng kết: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào vero quy mô phòng thí nghiệm

C«ng ty V¾cxin vµ Sinh phÈm sè 1 B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi: Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin d¹i trªn nu«i cÊy tÕ bµo Vero ë quy m« phßng ThÝ nghiÖm Cn®t: §ç TuÊn §¹t

8514

Hµ néi – 2010

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Lyssavirus dơi Úc (Australian Bat Lyssavirus) ABLV

Β-propiolactone BPL

Chủng virút thử thách (Challenge Virus Standard) CVS

Lyssavirus dơi châu Âu (European Bat Lyssavirus) EBLV

Dược điển châu Âu (European Pharmacopoeia) EP

Đơn vị quốc tế (International unit) IU

LAL

Thử nghiệm xác định nội độc tố theo phương pháp LAL (Limulus amoebocyte lysate)

Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose)

Môi trường dinh dưỡng tối thiểu (Minimum Essential medium) LD50 MEM

MNA

Tế bào nguyên bào thần kinh chuột (Murine Neuroblastoma cell)

Multiplicity of Infection MOI

Chủng vi rút giống gốc (Master seed virus) MSV

Viện Sức khỏe Quốc gia Hoa Kỳ (National Institute of Health) NIH

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) NMR

Chủng Pitman-Moore PM

Pleuropneumonia - like organism PPLO

Chủng Pasteur Virus PV

RFFIT

Thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (Rapid fluorescent focus inhibition test)

SDS-PAGE

Điện di trên gel acrylamide (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

VABIOTECH Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1

VVSDT Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

Ngân hàng tế bào sản xuất (Working cell bank) WCB

Chủng vi rút giống sản xuất (Working seed virus)

WSV

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang Bảng số

1.1. Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người

và thú y 14

1.2. Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất 21

2.1. Số lượng tế bào Vero thu được qua các đời cấy chuyển trong

quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp 49

2.2. Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau 51

2.3. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào 66

tế bào

2.4. Kết quả nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trường duy 69 trì tế bào khác nhau

2.5. Kết quả nuôi cấy virút dại trên các dạng chai nuôi cấy khác 72 nhau

2.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút bằng các loại màng lọc khác 75 nhau

2.7. Kết quả bất hoạt virút dại bằng các phương pháp bất hoạt 76 khác nhau

78 2.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút dại theo các tỷ lệ khác nhau

2.9. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trong bán thành phẩm vắcxin 91 dại

3.1. Kết quả nhân nuôi tế bào Vero của các loạt sản xuất thử

95 nghiệm

96 3.2. Kết quả gây nhiễm virút dại của các loạt sản xuất thử nghiệm

3.3. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0109 97

3.4. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0209 98

3.5. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nước nổi loạt 0309 99

3.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử

nghiệm 100

3.7. Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 101

3.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử 101 nghiệm

3.9. Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm 102

3.10. Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các loạt sản xuất 105 thử nghiệm

3.11. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất thử 105 nghiệm

106 3.12. Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX)

107 3.13. Kết quả kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng (VERALVAX)

4.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 141 (dạng lỏng hấp phụ nhôm)

4.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 142

(dạng đông khô)

5.1. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi 153 cấy tế bào Vero

5.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi 153 cấy tế bào Vero

5.3. Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế 154 bào Vero dạng lỏng (VERALVAX)

5.4. So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab 155

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình số Trang Tên hình

1.1. Cấu trúc hạt virút dại

1.2. Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng trong sản 6 18 xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào

2.1. Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy 39 tế bào Vero

2.2. Hình ảnh tế bào Vero qua các đời cấy chuyển 41

2.3. Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV

2.4. Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dưới kính hiển vi 56 60 huỳnh quang

2.5. Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút 85 dại

2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế virút dại theo 86 phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor zonal

2.7. Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh 86 chế virút dại

87 2.8. Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế virút dại theo phương pháp siêu ly tâm phân cùng bằng rotor góc cố định

2.9. Phương pháp lai điểm xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư 88 trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin dại

3.1. Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm 102 của loạt sản xuất vắcxin dại 0209

3.2. Xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm

của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 và 0309 103

3.3. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của

loạt sản xuất vắcxin dại 0109 103

3.4. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE các sản phẩm của

loạt sản xuất vắcxin dại 0209 và 0309 104

5.1. Sơ đồ gây miễn dịch và lấy máu chuột 146

MỤC LỤC

NỘI DUNG Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN 5

1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI 5

1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý 5

1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với virút dại 7

1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng 8

1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay 9

1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮCXIN DẠI 13

1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất 13

1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai 17

1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG

VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO 20

1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 20

1.3.2. Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 24

1.4. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ

SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TẠI VIỆT NAM 31

36 CHƯƠNG 2-XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 39

2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nổi nuôi cấy tế bào 43

2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu 47

2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp 48

2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 49

2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 53

2.3.1. Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại

2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác 54 65 nhau

2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 74

2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT 76

2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 77

2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT

79 79 2.7.1. Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dƣ trong các sản phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phƣơng pháp lai điểm

84 2.7.2. Các phƣơng pháp tinh chế virút dại

2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 89

2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 92

CHƯƠNG 3-SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI Ở QUY

MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 94

3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO 94

3.2. KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO 95

3.3. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI 96

3.4. KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT 100

3.5. KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT 100

3.6. KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT 101

3.7. KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT 101

3.8. KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG 104

3.9. KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM 105

3.10. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮCXIN THÀNH PHẨM

TẠI CƠ SỞ 105

CHƯƠNG 4 - XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT

109 LƯỢNG VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

4.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC 110

110 4.1.1. Phƣơng pháp kiểm tra vô khuẩn

113 4.1.2. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn chung

116 4.1.3. Phƣơng pháp kiểm tra chất gây sốt

119 4.1.4. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu

121 4.1.5. Phƣơng pháp kiểm tra công hiệu

4.1.6. Thử nghiệm nhận dạng 125

4.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ 126

4.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số 126

4.2.2. Xác định pH trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 130

4.2.3. Định lƣợng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 131

Vero

4.2.4. Định lƣợng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero 134 dạng lỏng

4.2.5. Xác định độ ẩm tồn dƣ trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào 136 Vero dạng đông khô

139 4.2.6. Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

5.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN

NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO 140

CHƯƠNG 5- ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC

VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 143

5.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP

144 ỨNG MIỄN DỊCH CỦA VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

5.1.1. Các phƣơng pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động 144 vật thí nghiệm

5.1.2. Các phƣơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên 144 chuột

5.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA

VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

5.2.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật 152 152 thí nghiệm

5.2.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

154 trên động vật thí nghiệm

157 KẾT LUẬN

160 KIẾN NGHỊ

161 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động

vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là

nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và

châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có

thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người. Khi đã có biểu hiện trên lâm

sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong do vậy việc tiêm phòng là biện

pháp phòng bệnh cũng như điều trị bệnh dại cho hiệu quả cao nhất. Gần 10

triệu người được tiêm phòng sau khi phơi nhiễm hàng năm chủ yếu tại các

nước châu Á. Tiêm phòng dại sau khi phơi nhiễm đã tránh được trên 300.000

ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng năm cho

phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này cũng như tỷ

lệ đi tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dự tính sẽ tăng lên một cách đáng kể khi

tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin trên

nuôi cấy tế bào.

Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin

dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi phơi nhiễm dựa trên việc bất hoạt virút

trên mô thần kinh. Từ đó trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử

dụng trên thế giới. Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có

được hỗn dịch chứa virút. Các vắcxin này đã được sử dụng rộng rãi để phòng

bệnh cho cả người và động vật. Tuy nhiên, các vắcxin này có rất nhiều nhược

điểm như còn virút sống tồn dư, hay gặp các phản ứng não tủy sau khi tiêm

vắcxin và hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp đòi hỏi phải có

một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm. Dù đã có

những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật sơ sinh trước

khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứt

sữa vẫn có thể gây ra các phản ứng thần kinh không mong muốn. Do vậy, các

vắcxin thế hệ thứ hai sản xuất trên nuôi cấy tế bào đã ra đời nhằm khắc phục

các nhược điểm của các dạng vắcxin cổ điển. Vắcxin này có tính an toàn và

công hiệu cao do đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho

người trước và sau khi phơi nhiễm với virút. Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực

của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm

và thực địa lâm sàng trên người. Ở cả phương pháp tiêm phòng trước và sau

khi phơi nhiễm, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99%

người được tiêm. Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn

đúng cách và tiêm phòng globulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả

phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả với những trường hợp bị cắn có nguy cơ

mắc bệnh cao. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra

sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết. Các quốc gia trên

thế giới cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp loại

vắcxin tiên tiến và cho hiệu quả cao này.

Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế

nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của

người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố

trên cả nước. Nếu tính một người tiêm vắcxin dại phí tổn 300.000 đồng (gồm

tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại…) thì trong năm 1995 cả nước tốn gần

100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên dưới 500 người thiệt mạng do

bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của bệnh dại, năm 1996, Chính phủ

đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng chống bệnh dại và Bộ Y tế đã

thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại Quốc gia. Thành công của

Chương trình là đến năm 2006 số ca tử vong do bệnh dại đã giảm 81% so với

năm 1995. Tuy nhiên, trong năm 2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng

lên đến trên 100 trường hợp. Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn

gây bệnh mà chủ yếu là chó - nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều

hạn chế. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin, ngừng sử

dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản xuất trên

nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với vắcxin

phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn, vùng

sâu, vùng xa.

Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ

yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có

chứa một lượng virút chưa bất hoạt và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm

nhiều mũi cùng với liều tiêm lớn. Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà

Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của

Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp).

Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não

nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ

cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy làm giảm số liều tiêm. Việc

sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn

chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế

Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin

Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong

muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ

lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không mong muốn

nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử

dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập

ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của

Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên

nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm

vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần

800.000 đồng) do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được

tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế.

Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân,

để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong

do bệnh dại, từ năm 2005 nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm

số 1 (VABIOTECH) đã hướng đến việc nghiên cứu và phát triển vắcxin dại

trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của

của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc

cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành

các nghiên cứu ở cấp cơ sở và lựa chọn ra được chủng virút PV (Pasteur

Virus) và môi trường nuôi cấy không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản

xuất vắcxin. Từ những thành công này, nhóm nghiên cứu bắt đầu tiến hành

xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở

quy mô phòng thí nghiệm. Với kinh nghiệm trên 30 năm sản xuất và kiểm

định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên não chuột ổ, cùng với những kinh

nghiệm và thành công trong việc phát triển các vắcxin mới, VABIOTECH

đưa ra các mục tiêu và nội dung trong Đề tài nghiên cứu này với mong muốn

sớm có được sản phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt tiêu chuẩn được

sản xuất tại Việt Nam.

Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài

1. Xây dựng được qui trình công nghệ ổn định sản xuất vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiệm.

2. Sản xuất được các loạt vắcxin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ

chức Y tế thế giới và tương đương với các vắcxin cùng loại của nước

ngoài như vắcxin Verorab của Aventis Pasteur.

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH DẠI

1.1.1. Tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh lý

Virút dại thuộc nhóm Rhabdoviridae, họ Lyssavirus. Trong họ

Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút hoang dại ở chó, mèo… và các

chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm.

Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh ở động vật, tuy nhiên

đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở người như nhiễm

Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu (EBLV). Hạt

virút dại có hình viên đạn với chiều dài trung bình là 180 nm và đường kính là

75nm. Mỗi hạt virút có chứa nucleocapsid xoắn bao quanh bởi lớp một vỏ

lipid kép (Hình 1.1). Hệ gen là một ARN chuỗi đơn âm không phân đoạn có

chiều dài 11,9 kb. Bề mặt ngoài bao phủ bởi các gai có chiều dài khoảng 10

nm gắn vào lớp lipid. Virút dại có 5 protein cấu trúc chính. Phức hợp

ribonucleoprotein hạt nhân xoắn chứa ARN hệ gen liên kết với 3 protein bên

ngoài là enzyme ARN polymerase phụ thuộc ARN (L) (190kd), nucleoprotein

(N) (55 Kd) và phosphoprotein (NS) (38 KD). Các protein này cùng với ARN

tạo thành phức hợp ARN hoạt động kiểm soát cả quá trình phiên mã và nhân

lên của virút. Các protein cấu trúc khác là protein phức hợp (M) (26 kD) nằm

ở mặt trong vỏ của virút tạo thành cấu trúc ống và glycoprotein (G) (67K) tạo

thành các gai trên bề mặt virút [46], [52].

Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và

vết cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất

lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn

thương da mới của nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết

Protein phức hợp

Hệ gen ARN cuộn xoắn

Nucleoprotein

Màng lipid từ vật chủ

Phức hợp ribonucleoprotein hoặc nucleocapsid

Vỏ bao ngoài

Phosphoprotein

Glycoprotein

ARN polymerase

có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh.

Hình 1.1. Cấu trúc hạt virút dại

Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến

vài tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian

ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn

thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập

[13], [55].

Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ương qua các

dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ vi rút nhân lên và phát tán ngược trở ra

hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại

lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên

lúc đó cơ thể không có được đáp ứng miễn dịch với vi rút [52].

Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở

người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ

dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình

dịch tễ của bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt

nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung

ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ

gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng

thở ngừng tim. Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến

triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng

bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [55].

Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại

được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh

được nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ

dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc

kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng

trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [52].

1.1.2. Đáp ứng miễn dịch với vi rút dại

Sau khi nhiễm, virút dại chủ yếu xâm nhập vào hệ thần kinh do dó

kháng nguyên thường bị tách biệt ra khỏi hệ thống miễn dịch. Đáp ứng kháng

thể thường không được phát hiện ở người nhiễm trước 2 tuần đầu tiên của

bệnh. Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện nay cho kháng thể trung hòa virút

với protein G cao và sớm [46].

Với vắcxin dại, không thể tiến hành các thử nghiệm lâm sàng ngẫu

nhiên có nhóm chứng và theo dõi dọc ở các nhóm so sánh không điều trị. Do

vậy, thông tin về hiệu quả vắcxin sẽ chủ yếu dựa trên các kết quả thực địa

tiêm phòng sau phơi nhiễm ở người đã bị phơi nhiễm với chó có chẩn đoán

chắc chắn mắc dại trong phòng thí nghiệm. Đánh giá gián tiếp hiệu quả

vắcxin có thể được tiến hành qua các nghiên cứu về tính sinh miễn dịch so

sánh giữa hiệu giá kháng thể trung hòa virút sau khi tiêm vắcxin thử nghiệm

với kháng thể có được khi tiêm vắcxin đối chứng đã biết hiệu quả bảo vệ.

Thêm vào đó, mô hình động vật sẽ được sử dụng để chứng minh lợi ích của

tiêm phòng vắcxin. Tuy hiệu giá kháng thể trung hòa virút bảo vệ ở người

chưa được thiết lập nhưng nồng độ tối thiểu là 0,5 IU/ml được coi là tương

đương với khả năng bảo vệ. Ở người khỏe mạnh sau khi tiêm vắcxin, nồng độ

kháng thể có thể đạt được vào ngày thứ 14 của liệu trình tiêm sau phơi nhiễm

không phụ thuộc vào độ tuổi [46], [55].

1.1.3. Tác động của bệnh dại đối với sức khỏe cộng đồng

Tại trên 100 nước và vùng lãnh thổ, dại là một bệnh gây dịch trên động

vật. Bệnh dại ở chó là nguồn lây nhiễm chiếm đến 99% sang cho người và là

nguy cơ đe dọa tính mạng trên 3,3 tỷ người, chủ yếu tại các nước châu Á và

châu Phi. Cùng với chó nuôi tại nhà, nhiều giống thú ăn thịt và dơi cũng có

thể làm lây truyền bệnh dại sang cho người [55].

Khi đã có biểu hiện trên lâm sàng, phần lớn các ca bệnh dại đều tử vong.

Tuy nhiên, các ca tử vong do bệnh dại còn ít được báo cáo tại một số nước có

bệnh dại lưu hành đặc biệt ở nhóm tuổi nhỏ. Số ca tử vong hàng năm ước tính

là 55.000 có thể là thấp hơn so với con số thực. Châu Á và châu Phi chiếm

phần lớn các ca tử vong do bệnh dại. Tính riêng tại Ấn Độ, ước tính có

khoảng 20.000 ca chết mỗi năm với tỷ lệ là 2 /100.000 dân; tại châu Phi con

số này cũng tương đương là 24.000 ca (hoặc 4 ca /100.000 dân). Cho dù tất cả

các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng trẻ dưới 15 tuổi là đối tượng thường

mắc nhất với 30-50% số trường hợp được tiêm phòng sau khi bị cắn là trẻ từ

5-14 tuổi và phần lớn là con trai [55].

Khoảng 98% trường hợp bệnh dại ở người xảy ra tại những vùng nuôi

nhiều chó mà đa phần được thả rông. Bệnh dại ở người là một bệnh hiếm gặp

tại các nước công nghiệp phát triển và ở phần lớn các nước Mỹ La tinh nơi

bệnh dại trên chó đã gần được loại trừ do giảm thiểu số lượng chó thả rông và

tiêm phòng cho chó nuôi tại nhà. Tại các nước như Thái Lan, việc triển khai

tiêm phòng rộng rãi cho chó và tăng cường tiêm phòng sau khi bị cắn đã làm

giảm đáng kể số ca chết do bệnh dại ở người.

Gần 10 triệu người được tiêm phòng sau khi bị cắn hàng năm chủ yếu là

tại Trung Quốc và Ấn Độ. Tiêm phòng dại sau khi bị cắn đã tránh được

330.304 ca tử vong hàng năm tại châu Á và châu Phi. Chi phí toàn cầu hàng

năm cho phòng bệnh dại ước tính khoảng trên 1 tỷ đô la Mỹ. Chi phí này

cũng như tỷ lệ đi tiêm phòng sau khi bị cắn dự tính sẽ tăng lên một cách đáng

kể khi tất cả các nước thay thế vắcxin sản xuất từ mô thần kinh bằng vắcxin

trên nuôi cấy tế bào hiện đại, an toàn và có hiệu lực cao [55].

1.1.4. Các khuyến cáo về tiêm phòng bệnh dại hiện nay

1.1.4.1. Tiêm phòng trước khi phơi nhiễm

Tiêm phòng trước phơi nhiễm được chỉ định cho những người có nguy

cơ phơi nhiễm cao với virút dại. Những đối tượng này bao gồm nhân viên

phòng thí nghiệm, nhân viên thú y, người nuôi giữ động vật, nhân viên bảo vệ

động vật hoang dại thường xuyên phải tiếp xúc với những động vật có khả

năng lây nhiễm cao cũng như các khách du lịch đến các khu vực có nguy cơ

mắc bệnh dại cao. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu về độ tuổi mắc bệnh, nguy

cơ nhiễm bệnh cao nhất là trẻ em sống trong vùng động vật nhiễm bệnh dại

tại các nước đang phát triển [13], [55].

Chỉ định tiêm bắp

Tiêm phòng vắcxin dại trước phơi nhiễm cần liều tiêm bắp 1 ml hoặc

0,5 ml tùy thuộc vào loại vắcxin, tiêm theo lịch 0, 7, 28 ngày (ngày thứ 28

được lựa chọn nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về

mặt thời gian).

Chỉ định tiêm trong da

Tiêm trong da 0,1 ml vào ngày 0, 7, 28 (ngày thứ 28 được lựa chọn

nhưng có thể tiêm sớm hơn vào ngày 21 nếu có giới hạn về mặt thời gian) là

một liệu pháp được lựa chọn thay thể đường tiêm bắp. Tuy nhiên, tiêm trong

da đòi hỏi phải thực hành đúng kỹ thuật, cán bộ tiêm cần được đào tạo và

đượcgiám sát tốt.

Tiêm nhắc lại

Tiêm nhắc lại định kỳ chỉ dành cho các đối tượng thường xuyên và liên

tục tiếp xúc với virút dại. Trong các trường hợp này, liều nhắc cần được tiêm

với khoảng cách phù hợp được dự tính tùy theo kết quả xét nghiệm kháng thể.

Các nhân viên phòng thí nghiệm có nguy cơ lây nhiễm vỉ rút dại cao cần được

xét nghiệm 6 tháng một lần. Hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5

IU/ml được cho là có khả năng bảo vệ. Ở những nơi không có điều kiện xét

nghiệm huyết thanh học, tiêm phòng nhắc lại được tiến hành 5 năm một lần.

1.1.4.2. Tiêm phòng sau khi phơi nhiễm

Chỉ định tiêm phòng sau phơi nhiễm kết hợp hoặc không kết hợp với

huyết thanh kháng dại tùy thuộc vào mức độ tiếp xúc với động vật nghi dại:

Độ I - Sờ hoặc cho động vật ăn, liếm trên bề mặt da (không tiếp xúc)

Độ II - Ngậm, cắn trên da không tổn thương, các vết sây xướt hoặc trợt

nhẹ không gây chảy máu.

Độ III - Một hoặc nhiều vết cắn hoặc vết cào trên da, liếm trên da tổn

thương, lây nhiễm niêm mạc với nước bọt, tiếp xúc với dơi.

Đối với độ I không cần tiêm phòng, độ II tiêm vắcxin ngay lập tức, độ

II tiêm vắcxin kết hợp với huyết thanh. Đối với độ II và độ III, rửa và sát xà

phòng (trong khoảng 15 phút) toàn bộ vết thương và vết cắn ngay lập tức

hoặc càng sớm càng tốt.

Không tiếp tục tiêm phòng sau phơi nhiễm nữa nếu động vật nghi dại

đã được khằng định bằng các xét nghiệm là không nhiễm dại hoặc chó hoặc

mèo nuôi vẫn khỏe mạnh sau 10 ngày theo dõi.

Các yếu tố để quyết định xem có bắt đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm

hay không là mức độ nghi ngờ động vật mắc dại, mức độ tiếp xúc (độ I-III),

đặc điểm lâm sàng của động vật cũng như khả năng xét nghiệm của phòng thí

nghiệm. Trong phần lớn các trường hợp tại các nước đang phát triển, tình

trạng tiêm phòng vắcxin của động vật cũng là một trong những yếu tố cần

được quan tâm đến [55].

Chỉ định tiêm bắp

Lịch tiêm phòng sau phơi nhiễm với liều tiêm bắp là 1 hoặc 0,5 ml tùy

thuộc vào nhà sản xuất. Liệu trình tiêm khuyến cáo bao gồm 4 hoặc 5 liều

tiêm.

- Liệu trình tiêm 5 liều là tiêm bắp 1 liều vào các ngày 0, 3, 7, 14, 28.

- Liệu trình tiêm 4 liều là tiêm bắp 2 liều vào ngày 0 tiếp theo tiêm 1 liều

vào ngày 7 và 21

Chỉ định tiêm trong da

Có thể tiêm theo liệu trình 2 vị trí hoặc 8 vị trí tùy thuộc theo khuyến

cáo của nhà sản xuất

- Liệu trình tiêm trong da 8 vị trí là vào ngày 0, tiêm 8 vị trí (1 mũi vào

mỗi bên cánh tay, 1 mũi vào mỗi bên đùi, 1 mũi vào mỗi bên vùng thượng

đòn và 1 mũi vào mỗi bên vùng bụng dưới); vào ngày thứ 7, tiêm 1 mũi

vào mỗi bên cánh tay và mỗi bên đùi và vào ngày 30 và 90, tiêm 1 mũi vào

một bên cánh tay. Một liều tiêm vào ngày 90 có thể thay thế bằng 2 liều

tiêm ngày thứ 30.

- Liệu trình tiêm trong da 2 vị trí là tiêm 1 mũi 0,1 ml tại 2 vị trí vào

ngày 0, 3, 7 và 28.

Đối với những đối tượng đã tiêm phòng đầy đủ trước phơi nhiễm hoặc

đã từng tiêm phòng sau phơi nhiễm với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào hoặc

hiện có hiệu giá kháng thể trung hòa virút ít nhất là 0,5 IU/ml, chỉ cần tiêm 2

liều tiêm bắp hoặc dưới da vào ngày 0 và 3 là đủ.

1.1.4.3. Tiêm kháng huyết thanh phòng dại

Huyết thanh phòng dại được chỉ định cho phơi nhiễm độ III và phơi

nhiễm độ II ở người suy giảm miễn dịch. Do mức độ thải trừ tương đối chậm,

globulin miễn dịch kháng dại ở người (HRIG) thường được lựa chọn đặc biệt

trong trường hợp bị phơi nhiễm nghiêm trọng và đa vị trí. Tuy nhiên, dạng

HRIG rất hiếm, chỉ đủ sử dụng tại các nước công nghiệp phát triển. Globulin

miễn dịch ngựa tinh chế (ERIG) hoặc sản phẩm F(ab’) của ERIG cũng có thể

được sử dụng. Phần lớn các chế phẩm ERIG mới đều tốt, có độ tinh khiết cao,

an toàn và rẻ hơn so với HRIG. Tuy nhiên, do có nguồn gốc khác loài nên khi

tiêm ERIG sẽ có nguy cơ gặp phải các phản ứng quá mẫn.

Huyết thanh kháng dại không được tiêm muộn quá 7 ngày sau khi bắt

đầu tiêm phòng sau phơi nhiễm. Liều lượng của HRIG là 20IU/kg cân nặng

còn đối với ERIG và sản phẩn F(ab’) là 40IU/kg cân nặng. Toàn bộ các sản

phẩm huyết thanh kháng dại cần được tiêm vào trong hoặc xung quanh vết

thương. Phần còn lại của huyết thanh phải được tiêm bắp vào vị trí xa chỗ

tiêm vắcxin [55].

1.2. TỔNG QUAN VỀ VẮC XIN DẠI

Trên 100 năm trước đây, Louis Pasteur và cộng sự đã phát triển vắcxin

dại thô đầu tiên để tiêm phòng sau khi bị cắn dựa trên việc bất hoạt virút trên

mô thần kinh. Từ đây trở đi một số loại vắcxin đã được phát triển và sử dụng

trên thế giới.

1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất

Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn

dịch chứa virút. Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và

động vật. Các loại vắcxin dại chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho

người và thú y được trình bày trong Bảng 1.1 [27], [36].

Bảng 1.1. Các loại vắc xin dại thế hệ thứ nhất

đƣợc sử dụng cho ngƣời và thú y

Mô đƣợc sử dụng

Chủng virút

Loại vắcxin

Phƣơng pháp bất hoạt

Sử dụng cho ngƣời

Dạng vắcxin

Mô thần kinh: Cừu, dê

Pasteur

Bất hoạt

Dung dịch

Pasteur

Bất hoạt

Phenol (1 ngày) Có Phenol, 300C

Có

Dung dịch

Mô thần kinh: Thỏ, cừu, dê

Mô thần kinh: Cừu

Pasteur

Bất hoạt

Ether-Phenol

Có

Dung dịch

Mô thần kinh: Cừu

Pasteur

Bất hoạt

Phenol (14 ngày) Có

Đông khô

Mô thần kinh: Cừu

PV11

Bất hoạt

Đông khô

-propiolactone Có

Bất hoạt

Tia cực tím

Có

Dung dịch

Não chuột nhắt chưa dứt sữa

CVS, 51, 91

Não thỏ chưa dứt sữa

Bất hoạt

Tia cực tím

Có

Đông khô

Não chuột chưa dứt sữa PV

Bất hoạt

Phenol (14 ngày) Có

Đông khô

Bất hoạt

Phôi vịt

Đông khô

-propiolactone Có

Phôi gà

Đông khô

Flury LEP

Giảm độc lực

Không (chỉ sử dụng cho chó)

Phôi gà

Kelev

Đông khô

Giảm độc lực

Không (chỉ sử dụng cho chó)

Phôi gà

Đông khô

Flury HEP

Giảm độc lực

Không (sử dụng cho gia súc, mèo)

Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin

thế hệ thứ nhất có thể được xếp loại theo:

Vắcxin sản xuất từ mô thần kinh động vật trưởng thành

Các vắcxin này có rất nhiều các nhược điểm như:

- Còn virút sống tồn dư: các vắcxin như vắcxin Fermi thường có chứa virút

sống do chưa được bất hoạt hoàn toàn bởi phenol nên được coi như là

vắcxin hỗn hợp có cả virút sống tồn dư và virút đã bất hoạt, do vậy vắcxin

này nguy hiểm khi sử dụng.

- Phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin: một số vắcxin thuộc nhóm này

như vắcxin Semple và vắcxin Hempt tuy đã được bất hoạt hoàn toàn và

đáp ứng được yêu cầu về mặt công hiệu nhưng những phản ứng não tủy

nghiêm trọng do tiêm vắcxin vẫn xảy ra trong hoặc sau khi tiêm phòng.

Phản ứng do yếu tố gây phản ứng trong não (một protein cơ bản liên quan

đến myelin) tăng cao khi sử dụng các mô thần kinh động vật trưởng thành.

Những phản ứng này là các tai biến liệt thần kinh từ liệt nhẹ thoáng qua

đến các thương tổn thần kinh vĩnh viễn và thậm chí là tử vong.

- Hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp: đặc tính này đòi hỏi

phải có một liệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm.

Các vắcxin này thường được đóng dưới dạng dung dịch nên có tính ổn

định thấp chỉ trong vòng gần 6 tháng [27].

Vắcxin sản xuất trên trứng có phôi

Thích ứng các chủng vắcxin dại trên trứng có phôi (chủng Pitman

Moore) đã phát triển được các vắcxin dại sử dụng cho người an toàn hơn,

giảm thiểu các phản ứng não tủy sau tiêm vắcxin. Tỷ lệ có các phản ứng thần

kinh thấp hơn (dưới 3/100.000 mũi tiêm) ở các vắcxin dùng cho người được

sản xuất trên phôi vịt so với các vắcxin được sản xuất trên mô thần kinh. Tuy

nhiên các phản ứng tại chỗ lại rất hay gặp như có đến 70% gặp ở các liệu

trình tiêm vắcxin dự phòng và 100% ở các liệu trình tiêm điều trị với 14 liều

tiêm. Tính sinh miễn dịch của loại vắcxin này cần được xem xét thêm do

trong một số trường hợp lượng kháng thể đạt được rất thấp. Các chủng virút

cố định Flury và Kelev đã thích ứng trên phôi gà được cấy chuyển nhiều đời

(180 đối với Flury và 70 đối với Kelev) tạo ra các chủng virút giảm độc lực.

Các vắcxin sản xuất với các chủng giảm độc lực trên phôi gà đã được sử dụng

cho chó, mèo và bò.

Trứng có phôi sử dụng trong sản xuất vắcxin đòi hỏi một chất lượng rất

cao, phải đảm bảo loại trừ được tất cả virút ngoại lai (bệnh đốm trắng ở gia

cầm) và vi khuẩn (Salmonella) [27], [36].

Vắcxin sản xuất từ não động vật chưa dứt sữa

Yếu tố gây phản ứng trong não là nguyên nhân của các tai biến thần kinh

sau tiêm vắcxin có trong mô thần kinh động vật trưởng thành nhưng có không

đáng kể hoặc không có ở trong các mô thần kinh của một số động vật chưa

dứt sữa. Thêm vào đó, một lượng lớn hơn virút có được khi nhân nuôi trên

các mô thần kinh của động vật sơ sinh, do đó vắcxin dại đã được phát triển

trên những động vật này. Vắcxin đầu tiên thuộc loại này được phát triển bởi

Fuenzalida và Palacios trên não chuột ổ với việc sử dụng 3 chủng virút dại cố

định (CVS, 51 và 91). Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên

não các động vật sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản

xuất trên não động vật chưa dứt sữa vẫn có thể có các phản ứng thần kinh

không mong muốn. Khoảng 0,3 - 0,8 trên 1.000 cá thể được tiêm vắcxin có

biểu hiện viêm não tủy nặng do trong vắcxin vẫn tồn dư các protein thần

kinh. Thêm vào đó, các vắcxin trên mô thần kinh có hiệu lực thấp hơn so với

vắcxin trên nuôi cấy tế bào nên đòi hỏi một liệu trình tiêm phòng dài hơn.

Trong những năm gần đây, Ấn Độ và Nepal đã dần thành công trong việc

ngừng sản xuất và sử dụng vắcxin trên mô thần kinh. Tuy nhiên, với giá thành

rẻ và điều kiện kinh tế còn khó khăn, vắcxin trên mô thần kinh hiện vẫn được

sử dụng tại một số nước chủ yếu là tại vùng Đông Nam châu Á [36], [55].

1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai

Đây là các vắcxin được sản xuất trên nuôi cấy tế bào. Vắcxin chứa virút

bất hoạt sau khi nhân nuôi trên các dòng tế bào như tế bào lưỡng bội người, tế

bào thận khỉ phôi thai, tế bào thận chuột đất vàng tiên phát, tế bào Vero, tế

bào phôi gà… Các vắcxin này sử dụng tiêm phòng trước và sau phơi nhiễm

[22], [34].

Vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bội người là vắcxin được đưa vào sử

dụng đầu tiên vào năm 1967. Vắcxin này có tính an toàn và công hiệu cao do

đó được các nước phát triển lựa chọn để tiêm phòng cho người trước và sau

khi phơi nhiễm với virút [11]. Với cố gắng tìm ra các vắcxin có giá thành thấp

hơn và nhưng đặc tính lại tương đương với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng

bội người, trong những năm gần đây vắcxin tinh khiết trên tế bào phôi gà và

vắcxin tinh khiết trên tế bào Vero đã được phát triển [30]. Các vắcxin trên

nuôi cấy tế bào đều sử dụng các virút cố định thuộc genotype 1 [36]. Nguồn

gốc của các chủng virút dại cố định chính được sử dụng để sản xuất vắcxin

trên nuôi cấy tế bào được trình bày trong Hình 1.2.

Đáp ứng miễn dịch và hiệu quả cả vắcxin trên nuôi cấy tế bào được

chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm và các đánh giá lâm

sàng trên người. Đối với cả phòng trước và sau khi phơi nhiễm, vắcxin cho

đáp ứng kháng thể ở trên 99% người được tiêm. Sử dụng đúng thời điểm

vắcxin mới kết hợp với việc xử trí vết thương đúng cách và tiêm huyết thanh

kháng dại cho hiệu quả phòng dại gần 100% thậm chí đối với cả các trường

hợp phơi nhiễm nguy cơ cao. Tuy nhiên, việc tiêm phòng muộn hoặc không

tiêm phòng đủ mũi đặc biệt với các tổn thương ở đầu, cổ, tay hoặc đa vết cắn

có thể vẫn bị tử vong do mắc bệnh dại [55].

Các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào cũng được cho là các vắcxin có độ

an toàn cao. Sau khi tiêm bắp vắcxin trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội người,

các phản ứng tại chỗ nhẹ và tự khỏi như đau, sưng tấy, đỏ tại chỗ tiêm xảy ra

ở 21-74% số người được tiêm. Các phản ứng toàn thân nhẹ như sốt, đau đầu,

chóng mặt, rối loạn tiêu hóa gặp ở 5-40% trường hợp. Phản ứng quá mẫn xảy

ra ở 6% người được tiêm liều nhắc lại và rất ít gặp ở tiêm liều ban đầu [43].

Khi thêm bước tinh chế, các phản ứng toàn thân đã hiếm gặp hơn. Với vắcxin

trên nuôi cấy tế bào Vero và tế bào phôi gà, tỷ lệ gặp các phản ứng tại chỗ và

toàn thân nhẹ tương đương với vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, tuy

nhiên không gặp các phản ứng quá mẫn hệ thống [34], [55].

Pháp (Paris) 1882

Mỹ (Georgia) 1939

Trung Quốc 1931

Mỹ (Alabama) 1935

Dại ở bò

Dại ở chó

Dại ở người

Dại ở chó

Não gà

Não thỏ

Não chuột

> 1500 lần cấy chuyển Não thỏ

Argentina

Tế bào thận chuột đất vàng

Mỹ - K.Habel 1940

Phôi gà

Não thỏ

Phôi gà

Nuôi cấy tế bào phôi gà

Nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng

Nuôi cấy tế bào Vero

Pháp (Paris) 1965 Não thỏ

Nuôi cấy tế bào Vero

SAD

Flury HEP/LEP

Beijing-31

PM

Vnukovo-32

Hình 1.2. Nguồn gốc của các chủng dại cố định đƣợc sử dụng để sản xuất

vắcxin trên nuôi cấy tế bào

Kinh nghiệm 20 năm (1985-2005) sử dụng một trong các vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào, vắcxin Verorab, đã cho thấy vắcxin an toàn và cho hiệu quả

phòng bệnh dại cao [45]. Trên 40 triệu liều vắcxin Verorab đã được tiêm tại

trên 100 quốc gia. Không có phản ứng không mong muốn nghiêm trọng nào

do vắcxin Verorab được báo cáo trong thử nghiệm lâm sàng trên 3937 đối

tượng và vắcxin này được cho là dung nạp tốt hơn so với vắcxin sản xuất trên

tế bào lưỡng bội người. Tiêm phòng sau phơi nhiễm đã khẳng định khả năng

sinh miễn dịch trên 1437 đối tượng bằng tất cả các đường tiêm với đáp ứng

sớm sau liều nhắc lại; Verorab cho đáp ứng nhắc lại có hiệu quả ở các đối

tượng đã được tiêm trước với vắcxin sản xuất trên tế bào lưỡng bộ người.

Không như dạng vắcxin sử dụng tế bào lưỡng bội người, Verorab không gây

ra các phản ứng quá mẫn huyết thanh ở người được tiêm nhắc lại. 2183 đối

tượng tại nhiều quốc gia ở châu Âu và châu Á trong đó có 874 đối tượng có

nguy cơ cao đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm và cho hiệu quả bảo vệ.

Verorab đã được tiêm phòng sau phơi nhiễm có hiệu quả và an toàn cho 251

phụ nữ có thai không làm tăng các dị tật bẩm sinh hoặc sảy thai tự nhiên. Đối

với trẻ em, tính an toàn và hiệu quả cũng được thấy trên 759 trẻ (từ 0-15 tuổi)

[45]. Liệu trình sử dụng Verorab tiêm trong da sau phơi nhiễm cho hiệu quả

tốt và giảm giá thành tại các nước đang phát triển. Từ các kết quả nghiên cứu

lâm sàng sử dụng Verorab tiêm bắp và tiêm trong da trước và sau phơi nhiễm

cho thấy vắcxin có hiệu quả bảo vệ tốt và an toàn trên người [3].

Với việc cho ra đời và sử dụng vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã làm giảm

đáng kể số các trường hợp tử vong ở người trên toàn thế giới mà phần lớn là

tại các nước mà bệnh dại trên chó vẫn còn lưu hành phổ biến. Một ví dụ điển

hình nhất là tại Thái Lan, việc triển khai tiêm phòng vắcxin trên nuôi cấy tế

bào cùng với việc giảm liều lượng tiêm bằng liệu trình tiêm trong da đã làm

cho tỷ lệ mắc dại mới ở người giảm đến 80% trong vòng 15 năm. Các kết quả

tương tự cũng được báo cáo tại nhiều nước khác khi vắcxin trên mô thần kinh

được thay thế bằng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào. Do vậy việc nghiên cứu,

phát triển, sản xuất và tiến tới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy

tế bào là cần thiết, các nước cần sớm có các chiến lược để sử dụng và triển

khai rộng khắp để tiêm phòng loại vắcxin tiên tiến và có hiệu quả cao này

[22], [55].

1.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮC

XIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO

1.3.1. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Hiện nay, các vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chia thành 3 nhóm chính

tùy thuộc vào hệ thống tế bào được sử dụng trong sản xuất [36]:

- Nhóm 1: Nhóm này gồm các vắcxin sử dụng các dòng tế bào động vật có

vú nguyên phát như thận chuột đất vàng, thận chó, thận bê bào thai hoặc

các nuôi cấy tế bào của gia cầm như phôi gà, phôi chim cút dựa theo

phương pháp của Kissling.

- Nhóm 2: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào

lưỡng bội chủ yếu có nguồn gốc từ người (W138, MRC5) và một số có

nguồn gốc động vật như bào thai khỉ Rhesus.

- Nhóm 3: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào

thường trực như tế bào Vero.

Các loại tế bào, các quy trình được sử dụng trong sản xuất và các phác

đồ tiêm phòng đối với từng loại vắcxin được trình bày trong Bảng 1.2.

Hình 1.2. Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất

Tá dƣợc

Loại tế bào

Chủng virút

Phƣơng pháp cô đặc

Phƣơng pháp bất hoạt

Tiêm phòng trƣớc khi bị cắn

Tiêm phòng sau khi bị cắn

WI 38

PM 1503

Siêu ly tâm

TNBP/tween-80

0, 7, 21, 28

0, 3, 7, 14, 30, 90

MRC-5 PM 1503

Siêu ly tâm

0, 28

-propiolactone

0, 3, 7, 14, 30, 90

MRC-5 PM 1503

0, 30, 60

-propiolactone

0, 3, 7, 14, 30, 90

Ly tâm phân vùng

MRC-5 SAD-60

Siêu ly tâm

Thử nghiệm Thử nghiệm

-propiolactone

VERO

PM 1503

0, 7, 28

-propiolactone

0, 3, 7, 14, 30, 90

Siêu ly tâm - Ly tâm phân vùng

HKC

Ly tâm

Tia cực tím

0, 3, 7, 28

0, 3, 7, 14, 30, 90

Vnukovo- 32

HKC

Beijing-31 Ly tâm

Formol/Phenol Al(OH)3 0, 3, 7. 28

0, 3, 7, 14, 30, 90

DKC

PM 1503

0, 28, 180

-propiolactone AlPO4

0, 3, 5, 7, 14, 30, 90

Siêu ly tâm – Sepharose 6B

FBKC

0, 21

Thử nghiệm

-propiolactone

PV11/RV 31

Siêu ly tâm - Ly tâm phân vùng

PCEC

0, 28, 180

Flury HEP Siêu ly tâm - Ly tâm

0, 2, 4, 6, 8, 14, 28

-propiolactone hoặc tia cực tím

PCEC

0, 28, 180

-propiolactone

Flury LEP Siêu ly tâm - Ly tâm

0, 2, 4, 6, 8, 14, 28

HKC: Tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát; DKC: Tế bào thận chó nguyên phát;

FBKC: Tế bào thận bào thai bê nguyên phát; PCEC: Tế bào phôi gà nguyên phát; TNBP:

Tri(n)-butyl-phosphate.

Các bước chính của quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

bao gồm:

- Nhân nuôi tế bào: Chai nuôi cấy tế bào một lớp hoặc hệ thống lăn chai

(roller bottle) là một trong những giải pháp được sử dụng để nhân nuôi tế

bào. Để tăng hiệu suất và mở rộng quy mô sản xuất, các chai khuấy

(spinner flask) hoặc hệ thống nuôi cấy sinh khối (bioreactor) được sử

dụng. Các tiểu giá thể (microcarrier) trong hệ thống nuôi cấy sinh khối là

một giải pháp tiên tiến cho phép tăng diện tích bề mặt bám dính của tế bào

từ đó làm tăng số lượng tế bào lên nhiều lần. Đánh giá chính xác các chỉ số

động học thông qua lượng các chất dinh dưỡng được tiêu thụ và lượng các

chất gây độc sản sinh ra do quá trình chuyển hóa sẽ cho phép tìm ra các

giải pháp làm tăng số lượng tế bào lên đến mức cần thiết để tạo ra một

lượng kháng nguyên virút tối ưu [47], [48].

- Gây nhiễm và nhân nuôi virút: Gây nhiễm virút vào tế bào được tiến

hành đối với hỗn dịch tế bào hoặc trên tế bào đã được nuôi cấy một lớp.

Để đạt được hiệu suất virút cao nhất cần lưu ý một số yếu tố liên quan đến

việc kết hợp giữa tế bào và virút như nhiệt độ nuôi cấy, liều lượng virút

gây nhiễm, thời gian và số lần thu hoạch. Mối tương quan giữa mật độ tế

bào và nồng độ kháng nguyên đạt được sau khi gây nhiễm là một vấn đề

rất phức tạp. Về mặt lý thuyết, khi điều kiện gây nhiễm đã được tối ưu, số

lượng tế bào càng nhiều thì lượng virút được sản xuất ra càng cao. Tuy

nhiên, điều này không hoàn toàn đúng trong mọi trường hợp do tính không

đồng nhất về tình trạng chuyển hóa đối với tất cả các tế bào.

- Cô đặc và tinh khiết: Đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào, cô

đặc và tính khiết kháng nguyên virút là những quy trình thường xuyên

được tiến hành. Một vài phương pháp hiện được nhiều nhà sản xuất sử

dụng là siêu ly tâm, ly tâm phân vùng và sắc ký lỏng. Ở quy mô sản xuất

lớn, các kỹ thuật thường được áp dụng là siêu ly tâm và ly tâm trong

gradient tỷ trọng.

- Bất hoạt virút: Quy trình bất hoạt là bắt buộc đối với các vắcxin sử dụng

cho người. Nếu bất hoạt bằng các chất hóa học thì nhiệt độ và thời gian bất

hoạt cần được xác định đối với mỗi loại vắcxin. Một trong những chất

được sử dụng có hiệu quả đối với vắcxin trên nuôi cấy tế bào là -

propiolactone do bất hoạt tốt virút dại và giảm lượng ADN tồn dư từ tế

bào. Nhược điểm của phương pháp này là giá thành còn cao và khá độc

trước khi được xử lý nhiệt. Tia cực tím cũng được sử dụng để bất hoạt

virút. Trong trường hợp này liều lượng và thời gian chiếu nên được xem

xét kỹ để toàn bộ virút đều được bất hoạt mà không làm giảm đi lượng

kháng nguyên.

- Ổn định và đông khô: Phần lớn các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được

giữ ở dạng đông khô để có được tính ổn định cao. Do vậy, thời hạn sử

dụng của vắcxin dạng này kéo dài hơn nhiều so với vắcxin được giữ ở

dạng dung dịch.

Vắcxin sử dụng cho người thường được tiêm với mục đích điều trị sau

khi đã phơi nhiễm với virút dại (5 liều tiêm hoặc nhiều hơn tùy thuộc vào loại

vắcxin) hoặc là dự phòng do đó các vắcxin này phải đáp ứng được các yêu

cầu nghiêm ngặt trong phát triển sản phẩm như:

- Virút phải được bất hoạt hoàn toàn.

- Các dòng tế bào lưỡng bội hoặc thường trực được sử dụng để nhân

nuôi virút không được có các chất gây ung thư hoặc bị chuyển dạng. Do

vậy, các dòng tế bào sử dụng trong sản xuất và hàm lượng ADN trong

một liều tiêm cho người phải đáp ứng được yêu cầu của Tổ chức Y tế

thế giới (TCYTTG) đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào

dùng để tiêm cho người [36].

Xu hướng phát triển các vắcxin dại mới hiện nay là tìm kiếm các công

nghệ có giá thành rẻ nhưng vẫn có hiệu quả tốt. Một trong những xu hướng

được nhiều nhà sản xuất áp dụng là tiến hành nuôi cấy virút trên hệ thống

nuôi cấy sinh khối với các tiểu giá thể nuôi cấy tế bào và sử dụng các môi

trường không chứa huyết thanh (serum-free medium) [19], [59]. Môi trường

không chứa huyết thanh đã hạn chế được các nhược điểm của các môi trường

có huyết thanh như dễ gây ra các phản ứng quá mẫn ở người được tiêm,

không có tính đồng nhất giữa các mẻ huyết thanh, dễ bị nhiễm bởi các tác

nhân vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, mycoplasma, virút ở động vật…) và giá

thành cao hơn. Bên cạnh đó, một số xu hướng áp dụng các công nghệ sinh

học tiên tiến như phát triển vắcxin tái tổ hợp của protein G, vắcxin ADN cũng

đã được nghiên cứu, tuy nhiên hiện các nghiên cứu này chỉ được tiến hành với

mục đích phát triển các vắcxin sử dụng cho động vật chứ không phải là các

vắcxin để sử dụng cho người [22].

1.3.2. Kiểm tra chất lƣợng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Kiểm tra chất lượng nguyên vật liệu gốc

Điều kiện cho nhân nuôi virút

Sử dụng tế bào lưỡng bội hoặc tế bào thường trực để sản xuất vắcxin

dại cần dựa trên hệ thống tế bào giống. Giống tế bào cũng như số lần cấy

chuyển tối đa cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định Quốc gia

[54].

Thử nghiệm nhận dạng tế bào được tiến hành chủ yếu với ngân hàng tế

bào giống gốc. Các thử nghiệm được tiến hành bao gồm thử nghiệm sinh hóa

(phân tích isoenzyme), miễn dịch và gen tế bào.

Môi trường nuôi cấy tế bào:

- Huyết thanh sử dụng để nhân nuôi tế bào phải được thử nghiệm để xác

định không nhiễm vi khuẩn, nấm, mycoplasma và các virút lây nhiễm từ

động vật. Bất kỳ thành phẩn nào có nguồn gốc từ bò, cừu hoặc dê sử dụng

cho nuôi cấy tế bào cần đạt các yêu cầu của TCYTTG và của kiểm định

Quốc gia. Các thành phần này phải đáp ứng được các hướng dẫn hiện tại

của TCYTTG liên quan đến spongiform gây bệnh lý não lây truyền ở động

vật. Huyết thanh người được sử dụng cũng phải kiểm soát về chất lượng

và quy trình sản xuất.

- Các kháng sinh penicillin và thuộc họ beta-lactam khác không được sử

dụng ở bất kỳ giai đoạn sản xuất nào. Nồng độ tối thiểu của các kháng sinh

như kanamycin hay neomycin cũng phải đạt theo các yêu cầu của

TCYTTG và của kiểm định Quốc gia.

- Trypsin có nguồn gốc động vật sử dụng để chuẩn bị nuôi cấy tế bào

cũng cần phải thử nghiệm và không được có vi khuẩn, nấm, mycoplasma

và các virút lây nhiễm khác.

Chủng virút

Chủng virút dại sử dụng trong sản xuất các loạt giống cần được xác

định đặc tính. Chủng cần có hồ sơ lý lịch ghi chép các thông tin và nguồn gốc

đáp ứng được yêu cầu đối với việc sản xuất vắcxin bất hoạt an toàn và có hiệu

quả miễn dịch. Chủng giống virút sản xuất không được cấy chuyển quá 5 đời

từ chủng giống gốc. Vắcxin cần được sản xuất từ loạt giống sản xuất mà

không cấy chuyển thêm. Chủng giống virút cần được bảo quản âm hoặc đông

khô [54]. Các thử nghiệm đối với chủng giống virút bao gồm:

- Thử nghiệm về vi khuẩn, nấm và mycoplasma

- Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trên chuột sữa, chuột trưởng thành và

nuôi cấy tế bào.

- Xác định hàm lượng virút bằng phương pháp gây nhiễm vào não chuột.

Hiệu giá tối thiểu của chủng giống được xác định tùy theo nhà sản xuất tùy

thuộc vào sản phẩm, tế bào và chủng virút.

Kiểm tra chất lượng quá trình sản xuất vắcxin

Kiểm tra nuôi cấy tế bào

Các thử nghiệm kiểm tra nuôi cấy tế bào bao gồm:

- Thử nghiệm về virút hấp phụ hồng cầu

- Thử nghiệm về tác nhân ngoại lai trong dung dịch nuôi cấy tế bào

- Thử nghiệm nhận dạng (dòng tế bào)

Kiểm tra mẻ gặt virút đơn và bán thành phẩm tinh chế

- Thử nghiệm vô khuẩn trên các mẻ gặt virút đơn

- Nhận dạng: mẻ gặt đơn chứa virút cần được xác định là virút bằng cách

sử dụng kháng thể đặc hiệu.

- Hiệu giá virút: mỗi mẻ gặt đơn cần được xác định đặc tính lây nhiễm

bằng thử nghiệm có độ nhạy cao. Nhà sản xuất cần đưa ra các tiêu chuẩn

đối với hiệu giá của các mẻ gặt đơn.

- Xác định hàm lượng kháng nguyên: thử nghiệm xác định kháng nguyên

glycoprotein được thiết lập để xác định lượng kháng nguyên trong bán

thành phẩm cuối cùng. Thử nghiệm này được sử dụng để theo dõi tính ổn

định của sản xuất. Các thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp

khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn dịch gắn men (EIA).

- Thử nghiệm về ADN tế bào tồn dư: đối với virút phát triển trên dòng tế

bào thường trực, bán thành phẩm tinh khiết cần được thử nghiệm về ADN

tế bào tồn dư. Quá trình tinh chế cần làm giảm được lượng ADN tế bào

của vật chủ. Theo quy định, lượng ADN tế bào tồn dư cần phải đạt dưới 10

ng cho 1 liều tiêm cho người [21], [56].

- Thử nghiệm về huyết thanh động vật tồn dư: nếu huyết thanh động vật

được sử dụng trong quá trình sản xuất, nồng độ albumin huyết thanh bò

(BSA) được sử dụng làm chỉ số đối với huyết thanh động vật trong bán

thành phẩm tinh khiết và giá trị này không được vượt quá 50 ng cho một

liều tiêm cho người [54].

- Thử nghiệm về các nguyên vật liệu tồn dư: nhà sản xuất phải cho thấy

các nguyên vật liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá

trình tinh chế đến mức có thể chấp nhận được theo yêu cầu của kiểm định

Quốc gia [54].

Kiểm tra quá trình bất hoạt

Mỗi bán thành phẩm tinh khiết cần phải thử nghiệm theo những phương

pháp thích hợp để đánh giá hiệu quả bất hoạt virút trước khi cho thêm chất

bảo quản và các chất khác. Độ nhạy của các thử nghiệm cần được xác định

tùy theo chủng virút dại được sử dụng trong sản xuất và thử nghiệm có độ

nhạy cao nhất sẽ được áp dụng. Thử nghiệm cần tiến hành ngay sau khi kết

thúc quá trình bất hoạt. Các thử nghiệm được tiến hành để đánh giá sự có mặt

của virút sống bao gồm thử nghiệm tiêm gây nhiễm trực tiếp vào não chuột và

thử nghiệm nhân bội virút dại (amplification test) trên nuôi cấy tế bào [28].

Bán thành phẩn đạt kết quả về bất hoạt nếu đáp ứng được yêu cầu không có

các virút sống tồn lưu [54].

Kiểm tra bán thành phẩm cuối cùng

- Hàm lượng kháng nguyên của bán thành phẩm cuối cùng: thử nghiệm

xác định kháng nguyên glycoprotein trong bán thành phẩm cuối cùng được

tiến hành theo phương pháp khuếch tán miễn dịch đơn (SRID) hoặc miễn

dịch gắn men (EIA).

- Thử nghiệm vô khuẩn

Kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm

- Thử nghiệm nhận dạng: thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít

nhất 1 lọ cho mỗi loạt sản xuất. Thử nghiệm công hiệu có thể được coi là

một thử nghiệm nhận dạng.

- Thử nghiệm vô khuẩn: thành phẩm cuối cùng cần được thử nghiệm vô

khuẩn đối với nấm và vi khuẩn.

- Thử nghiệm an toàn chung: mỗi loạt thành phẩm cần được thử nghiệm

về độc tính không mong muốn (độc tính bất thường) sử dụng các thử

nghiệm an toàn chung theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia.

- Hàm lượng kháng nguyên: nếu không chưa được làm đối với bán thành

phẩm cuối cùng, hàm lượng kháng nguyên cần được xác định và giá trị

nằm trong giới hạn yêu cầu.

- Thử nghiệm công hiệu vắcxin thành phẩm

Công hiệu của các loạt vắcxin thành phẩm cần được xác định. Trước

khi tiến hành thử nghiệm, vắcxin đông khô cần được hồi chỉnh dưới dạng có

thể sử dụng được cho người.

Thử nghiệm NIH được trình bày trong tài liệu Kỹ thuật phòng thí

nghiệm chẩn đoán dại [58], sử dụng để đánh giá độ ổn định sản xuất của

vắcxin thử nghiệm. Thử nghiệm này cũng được sử dụng để đánh giá mức độ

ổn định sản phẩm với mục đích xác định hạn sử dụng cũng như hiệu chỉnh

chế phẩm chuẩn.

Trong thử nghiệm này, chuột được tiêm miễn dịch sau đó thử thách

với virút dại. Thử nghiệm được tiến hành bởi các nhóm chuột tiêm 2 mũi

vắcxin cách nhau 7 ngày với độ pha loãng thích hợp của vật liệu chuẩn đã

được hiệu chỉnh với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế và vắcxin thử nghiệm. 7

ngày sau liều tiêm cuối, chuột được tiêm miễn dịch và nhóm chuột chứng

được thử thách theo được tiêm não với > 5 LD50 chuẩn virút thử thách (CVS).

Hiệu giá của virút thử thách cũng cần được khẳng định bằng cách gây nhiễm

ít nhất ở 3 độ pha loãng 10 lần trên chuột. Chuột được theo dõi 14 ngày và

liều hiệu quả 50% (ED50) của mẫu chuẩn và mẫu thử được xác định dựa trên

tỷ lệ chuột sống sót.

Công hiệu của vắcxin thử nghiệm tính theo IU được xác định bằng cách

so sánh ED50 của mẫu vắcxin thử so với mẫu vắcxin chuẩn đã được hiệu

chỉnh tính theo IU với mẫu vắcxin dại chuẩn quốc tế sử dụng phương pháp

thống kê thích hợp.

Thử nghiệm với tiêu chuẩn được xác định cho quy trình thử nghiệm và

thẩm định, phương pháp thống kê cùng với số lượng tối thiểu các thử nghiệm

được tiến hành để phân tích kết quả và xác định độ tin cậy của thử nghiệm

(25-400%) đạt theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia. Đặc biệt, hiệu chỉnh

mẫu chuẩn vắcxin theo chuẩn quốc tế cũng như việc sử dụng, bảo quản và

vận chuyển CVS cũng cần được xác định trong quy trình thử nghiệm.

Số lượng thử nghiệm đối với mỗi mẻ sản xuất phụ thuộc vào độ ổn

định của thử nghiệm tại mỗi phòng thí nghiệm. Nếu độ ổn định của thử

nghiệm trong phòng thí nghiệm tốt, chỉ cần một thử nghiệm là đủ. Tuy nhiên,

thử nghiệm bổ sung có thể làm tăng tính chính xác của công hiệu ước tính.

Công hiệu cần đạt ít nhất là 2,5 IU cho một liều tiêm ở người.

Nhà sản xuất cần đưa ra các dữ liệu hỗ trợ cho thử nghiệm công hiệu

NIH qua các thử nghiệm in vitro xác định hàm lượng kháng nguyên để đảm

bảo độ ổn định chắc chắn của quá trình sản xuất.

- Độ ẩm tồn dư trong vắcxin đông khô: độ ẩm tồn dư trong mẫu của mỗi

loạt vắcxin đông khô cần được xác định theo các phương pháp thích hợp.

Nói chung, lượng độ ẩm tồn dư cần thấp dưới 3%.

- Thử nghiệm chất gây sốt: mỗi loạt thành phẩm cần thử nghiệm về chất

gây sốt. Thử nghiệm này cần được chấp thuận bởi kiểm định Quốc gia.

- Thử nghiệm về protein huyết thanh động vật: mẫu của loạt thành phẩm

được thử nghiệm về albumin huyết thanh bò trong vắcxin hồi chỉnh cuối

cùng với lượng dưới 50 ng cho một liều tiêm cho người.

- Chất bổ trợ: nếu một chất bổ trợ được cho vào vắcxin, hàm lượng chất

này cần được xác định bằng phương pháp thích hợp. Nếu các phức hợp

nhôm được sử dụng thì nồng độ nhôm không được vượt quá 1,25 mg cho

một liều tiêm ở người. Nếu các chất khác được sử dụng như chất bổ trợ

hoặc có tác dụng như chất bổ trợ, tiêu chuẩn về hàm lượng cần được đưa

ra. Khi nhôm hydroxide được sử dụng làm chất bổ trợ, lượng hấp phụ

trong bán thành phẩm cuối cùng không được ít hơn 95%.

- Chất bảo quản: nếu chất bảo quản được cho vào vắcxin, hàm lượng

chất này cần được xác định bằng phương pháp thích hợp. Lượng chất bảo

quản cho vào vắcxin không được làm mất đi hiệu quả của kháng nguyên

hoặc không làm giảm tính an toàn của vắcxin.

- Kiểm tra cảm quan: mỗi lọ trong các loạt văc xin sau khi đóng lọ cần

được kiểm tra cảm quan để loại bỏ các lọ bất thường.

- Thử nghiệm đối với ADN tế bào tồn dư: thử nghiệm ADN tế bào tồn

dư được tiến hành với thành phẩm vắcxin nếu thử nghiệm này chưa được

làm với bán thành phẩm cuối cùng.

1.4. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC, TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ

SẢN XUẤT VẮC XIN DẠI TẠI VIỆT NAM

Tại Việt Nam, trong những năm 1991-1995, bệnh dại là vấn đề y tế

nghiêm trọng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, tính mạng và kinh tế của

người dân. Bệnh xảy ra quanh năm, lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố

trên cả nước. Theo thống kê chưa đầy đủ tại các Trung tâm Y tế dự phòng

trên toàn quốc, trung bình mỗi năm có từ 300.000 đến gần 600.000 người bị

súc vật cắn phải đi tiêm vắcxin phòng dại. Nếu tính một người tiêm vắcxin

dại phí tổn 300.000 đồng (gồm tiền thuốc, công lao động, tiền đi lại…) thì

trong năm 1995 cả nước tốn gần 100 tỷ đồng. Thêm vào đó, mỗi năm có trên

dưới 500 người thiệt mạng do bệnh dại. Trước tình hình nghiêm trọng của

bệnh dại, năm 1996, Chính phủ đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường phòng

chống bệnh dại và Bô Y tế đã thành lập ban chỉ đạo Phòng chống bệnh dại

Quốc gia.Theo thống kê của khoa Dịch tễ, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương,

trong vòng 11 năm (từ 1996 đến 2006) vẫn có trên 6 triệu người được tiêm

vắcxin phòng dại sau khi bị súc vật cắn với tỷ lệ tiêm phòng là 652,6 /100.000

dân vào năm 1996 và 670,8/100.000 dân vào năm 2006. Cũng trong 11 năm

này có tổng số 1116 trường hợp người chết vì bệnh dại (0,35/100.000 dân vào

năm 1996 và 0,09/100.000 dân vào năm 2006). Như vậy, số ca tử vong do

bệnh dại vào năm 2006 đã giảm 81% so với năm 1995. Tuy nhiên, trong năm

2007, số ca tử vong do bệnh dại đã lại tăng lên đến trên 100 trường hợp.

Nguyên nhân có thể là do việc kiểm soát nguồn gây bệnh mà chủ yếu là chó -

nguồn gây bệnh chính tại Việt Nam còn nhiều hạn chế. Với số lượng ước tính

từ 6-8 triệu con chó, trong đó phần lớn là nuôi thả rông tại các vùng nông

thôn, không được giám sát và tiêm phòng đầy đủ, sẽ là một nguy cơ làm gia

tăng số ca bệnh dại. Bên cạnh đó, việc thay đổi chính sách sử dụng vắcxin,

ngừng sử dụng vắcxin thế hệ cũ rẻ tiền thay thế bằng vắcxin nhập ngoại sản

xuất trên nuôi cấy tế bào đắt tiền hơn, làm giảm khả năng được tiếp cận với

vắcxin phòng bệnh của các bệnh nhân nghèo, đặc biệt tại các vùng nông thôn,

vùng sâu, vùng xa [4].

Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu

là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Các vắcxin này có chứa

một lượng virút chưa bất họa và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều

mũi (18-21 mũi) cùng với liều tiêm lớn (1,5-2,5 ml/mũi). Do vậy khi tiêm

vắcxin dại không chỉ đưa vào 1 lượng kháng nguyên cần thiết mà còn đưa cả

protein - myelin vào cơ thể. Đây chính là nguyên nhân gây ra các tai biến

viêm não tủy có thể dẫn tới liệt và tử vong [4].

Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất

vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được

chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp). Sau khi đất nước thống

nhất, nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu của nhân dân, việc sản xuất vắcxin dại

đã được triển khai tại cả Viện Vắcxin Nha Trang và Viện Pasteur Thành phố

Hồ Chí Minh. Chủng giống sản xuất là chủng VP-13 (Pasteur Virút) do cơ

quan kiểm định quốc gia cung cấp. Chủng sản xuất được gây nhiễm trên não

chuột nhắt trắng 1-4 ngày tuổi, bất hoạt bằng -propiolactone, bảo quản bằng

merthiolate. Ưu điểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít

myelin của não nên ít gây các tai biến thần kinh hơn. Hiệu giá virút thu hoạch

từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễn dịch tốt hơn do vậy số liều tiêm

giảm còn từ 6-8 mũi tiêm. Việc sử dụng vắcxin dại trên não chuột ổ trong hơn

30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại. Hàng năm, có

từ 3,5 đến 4 triệu liều vắcxin Fuenzalida được sản xuất và 150.000 liều vắcxin

Verorab được nhập để tiêm phòng cho người. Theo kết quả nghiên cứu về

nguyên nhân tử vong, tác giả Đinh Kim Xuyến, Trần Văn Tiến cho thấy 87-

90% số trường hợp tử vong là do không được điều trị bằng vắcxin và huyết

thanh kháng dại sau khi bị súc vật dại cắn; tuy nhiên 10-13% trường hợp tử

vong được ghi nhận ở các bệnh nhân đã được tiêm phòng vắcxin Fuenzalida

đầy đủ, nguyên nhân có thể là do vết cắn quá nặng và đi tiêm muộn. Theo tác

giả Hoàng Minh Hiền, 78% người được tiêm có các phản ứng phụ như sưng

đỏ, ngứa tại chỗ tiêm, mệt mỏi, nhức đầu. Kết quả báo cáo từ các Trung tâm

Y tế Dự phòng trên cả nước cũng cho thấy trên 80% các trường hợp có các

phản ứng không mong muốn sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida, các phản ứng

không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử

vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm. Do các phản ứng không

mong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định

ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc. Do tỷ lệ bệnh nhân

được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây

chỉ chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình

tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng) nên cơ hội để các bệnh nhân

nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất ít. Điều này phần

nào lý giải tại sao số ca tử vong do bệnh dại đã tăng lên trong năm 2007. Từ

năm 2004, Việt Nam cũng đã bắt đầu áp dụng phác đồ tiêm trong da đối với

vắcxin Verorab - một vắcxin trên nuôi cấy tế bào nhập ngoại được dùng phổ

biến tại Việt Nam để làm giảm bớt chi phí cho tiêm phòng vắcxin dại [3].

Theo phác đồ này giá thành của liệu trình đã giảm xuống khoảng 300.000

đồng cho 8 mũi tiêm, tuy nhiên vấn đề kỹ thuật tiêm và chi phí vẫn là một

thách thức đối với các vùng kinh tế còn kém phát triển.

Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

được sản xuất trong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân,

để nhiều người có cơ hội được tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong

do bệnh dại, nhiều cơ quan nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành các nghiên

cứu phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào. Viện Vệ sinh dịch tễ Trung

ương đã có những thành công bước đầu trong việc nghiên cứu vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát. Chủng Vnukovo-32 dùng

trong sản xuất và công nghệ được tiếp thu từ Liên bang Nga. Tuy nhiên, hạn

chế của công nghệ này là nguồn cung cấp động vật (chuột đất vàng) có chất

lượng và số lượng đảm bảo cho sản xuất vắcxin. Do vậy, việc phát triển

vắcxin theo công nghệ này hiện chưa được triển khai trên quy mô lớn hơn để

có được sản phẩm hoàn chỉnh. Để khắc phục hạn chế về nguồn tế bào nguyên

phát cho sản xuất vắcxin, các nghiên cứu sử dụng dòng tế bào thường trực mà

đặc biệt là tế bào Vero đã được các nhà khoa học đề cập đến. Cũng từ chủng

Vnukovo-32, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã gây thích ứng trên dòng tế

bào Vero với mong muốn có được chủng virút đạt được yêu cầu để sử dụng

trong sản xuất vắcxin dại. Hiện nghiên cứu này đang tiếp tục được tiến hành.

Nhóm nghiên cứu của Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1

(VABIOTECH) đã bắt tay vào nghiên cứu và phát triển vắc xin dại trên nuôi

cấy tế bào Vero từ năm 2005 với mục đích chọn lựa được chủng virút, điều

kiện nuôi cấy và quy trình sản xuất phù hợp trong điều kiện Việt Nam. Với

các chùng vi rút dại cố định nhận được từ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và

Dự phòng Hoa kỳ (CDC) đã thích ứng trên dòng tế bào Vero - Pasteur virút

(PV) và Pitman-Moore (PM) cùng với dòng tế bào Vero loạt gốc của

TCYTTG, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn được chủng PV và môi trường nuôi

cấy không chứa huyết thanh để tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình công

nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Việt Nam. Quy trình

này cần được tiếp tục nghiên cứu về tính ổn định các thông số và hiệu suất

của từng bước của quy trình. Đồng thời, sau khi có được quy trình công nghệ

ổn định, sản phẩm của quá trình sản xuất thử nghiệm phải đạt được chất

lượng theo yêu cầu của kiểm định Quốc gia và tương đương với các vắcxin

nhập ngoại như vắcxin Verorab.

CHƢƠNG 2

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được

nghiên cứu và phát triển tại Việt Nam là quy trình nhân nuôi chủng virút dại

cố định trên dòng tế bào Vero. Đây là công nghệ đã được nhiều Hãng sản

xuất vắcxin lớn tại Pháp, Trung Quốc, Ấn Độ… sử dụng. So với các công

nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào lưỡng bội người, quy trình này

sản xuất ra vắcxin có giá thành rẻ hơn đồng thời lại có tính an toàn và tính

sinh miễn dịch cao [34].

Lựa chọn dòng tế bào Vero để sản xuất vắcxin dại, nhóm nghiên cứu của

Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã tiến hành các đề tài

nghiên cứu cấp cơ sở từ năm 2005 để lựa chọn chủng virút, điều kiện nuôi

cấy và quy trình sản xuất phù hợp. Nghiên cứu đầu tiên là nghiên cứu lựa

chọn chủng có khả năng tạo được hiệu giá virút cao nhất trong số hai chủng

virút dại cố định nhận được từ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng

Hoa kỳ (CDC) đều đã thích ứng trên dòng tế bào Vero - Pasteur virút-PV và

Pitman-Moore. Cùng một điều kiện là được gây nhiễm vào tế bào Vero loạt

gốc của TCYTTG và duy trì nhân nuôi virút trong môi trường tối ưu - MEM

có chứa 0,3% albumin huyết thanh người, chủng PV luôn cho hiệu giá virút

cao trong tất cả các mẻ gặt đơn từ ngày nuôi cấy thứ 6 đến ngày nuôi cấy thứ 21 (từ 10-6 LD50/ml đến 10-7 LD50/ml) so với chủng PM (chỉ từ <10-4,5 LD50/ml cho tới 10-6 LD50/ml). Từ kết quả này, chủng PV được lựa chọn là

chủng để tiếp tục nghiên cứu và phát triển vắcxin tại Việt Nam do có hiệu giá

virút cao kéo dài, duy trì được nhiều mẻ gặt đơn đáp ứng được yêu cầu về

hiệu giá virút và thể tích đầu vào cho quá trình sản xuất vắcxin. Từ chủng

virút PV được lựa chọn, nhóm nghiên cứu đã xây dựng hệ thống chủng virút

dại giống gốc (Master seed virus-MSV) và chủng virút dại giống sản xuất

(Working seed virus-WSV) đủ để nghiên cứu và sản xuất vắcxin dại trong

vòng nhiều năm tiếp theo tại VABIOTECH. Toàn bộ quá trình nhân chủng và

chuẩn độ hiệu giá của chủng virút đều được thực hiện và ghi chép lại thành hồ

sơ chủng theo đúng khuyến cáo của TCYTTG cho vắcxin dại bất hoạt sử

dụng cho người được sản xuất trên nuôi cấy tế bào [54] (xem phần Phụ lục).

Đồng thời, dòng tế bào Vero loạt gốc của TCYTTG cũng được nhóm nghiên

cứu nhân nuôi và xây dựng thành ngân hàng tế bào Vero sản xuất của

VABIOTECH (Working cell bank - WCB) - Tế bào giống gốc của TCYTTG

CCL 81 đời 134 được nhân nuôi và tiếp tục cấy chuyển đến đời 137, sau đó

được đóng ống và bảo quản trong dung dịch bảo quản tế bào. Các ống tế bào

được làm đông băng và bảo quản trong nitrogen lỏng. Toàn bộ quá trình nhân

nuôi tế bào và pha các môi trường để nhân nuôi cũng như bảo quản tế bào đều

được ghi chép lại để xây dựng thành hồ sơ tế bào Vero sản xuất theo đúng

quy định của TCYTTG về việc sử dụng các tế bào động vật cho sản xuất các

sản phẩm sinh học [53] và khuyến cáo của TCYTTG cho vắcxin dại bất hoạt

sử dụng cho người được sản xuất trên nuôi cấy tế bào [29], [54] (xem phần

Phụ lục).

Nghiên cứu tiếp theo được tiến hành là lựa chọn môi trường nhân nuôi

virút tối ưu nhất trong số các môi trường dinh dưỡng được chấp nhận cho sản

xuất vắcxin. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy hiệu giá virút dại của toàn bộ

các mẻ gặt đơn sau khi thu hoạch đối với từng môi trường nuôi cấy lần lượt là 10-6 LD50/ml cho môi trường chứa albumin huyết thanh người, 10-6,33 LD50/ml

cho môi trường không chứa huyết thanh của VABIOTECH, 10-5,34 LD50/ml cho môi trường MEM không chứa huyết thanh, 10-5,66 LD50/ml cho môi trường không chứa huyết thanh SFM của Gibco và <10-3 LD50/ml cho môi

trường M199 không chứa huyết thanh. Với hiệu giá virút cao, môi trường

không chứa huyết thanh của VABIOTECH được lựa chọn để tiếp tục nghiên

cứu sản xuất vắcxin. Đặc biệt môi trường này sẽ có giá thành thấp hơn, dễ

tinh khiết virút hơn và hạn chế được các nguy cơ lây nhiễm bởi các tác nhân

vi sinh vật so với các môi trường dinh dưỡng có chứa huyết thanh.

Sau khi có được tế bào Vero, chủng virút PV và môi trường nuôi cấy

không huyết thanh đạt các yêu cầu cho sản xuất, nhóm nghiên cứu sẽ tiếp tục

nghiên cứu xây dựng một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi

cấy tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy trình này cần có sự ổn định về

các thông số và hiệu suất của từng bước sản xuất, đồng thời tiến hành các quá

trình sản xuất thử nghiệm để có được sản phẩm đạt được chất lượng theo yêu

cầu của TCYTTG và tương đương với các vắcxin nhập ngoại như vắcxin

Verorab.

Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero bao

gồm các bước chính sau đây (Hình 2.1):

Nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero

Gây nhiễm virút dại vào tế bào Vero

Nuôi cấy virút và thu hoạch nƣớc nổi

Tinh sạch hỗn dịch virút

Bất hoạt virút

Cô đặc hỗn dịch virút

Tinh chế virút

Pha bán thành phẩm cuối cùng

Sản xuất vắcxin thành phẩm

Hình 2.1. Tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại

trên nuôi cấy tế bào Vero

2.1. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO

- Mục đích: Tìm ra các điều kiện tối ưu để cho hiệu suất tế bào cao. Tính

ổn định và chất lượng của tế bào là một trong những yếu tố quyết định đến

hiệu giá thu hoạch virút sau gây nhiễm.

- Các tham số về điều kiện nuôi cấy tế bào bao gồm: môi trường, nhiệt

độ, thời gian, số đời cấy chuyển và loại chai nuôi cấy tế bào. Kết quả của quá

trình nuôi cấy tế bào được đánh giá bằng các phương pháp theo dõi và kiểm

tra chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy.

+ Môi trường nuôi cấy: môi trường nhân nuôi tế bào Vero trước khi gây

nhiễm virút là môi trường MEM có bổ sung huyết thanh động vật. Huyết

thanh được sử dụng là huyết thanh bào thai bê (FBS) hoặc huyết thanh bò

(BS). Các huyết thanh này đều phải đảm bảo yêu cầu về chất lượng sử dụng

trong quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học sử dụng cho người [53], [54].

+ Nhiệt độ nuôi cấy: trong các nghiên cứu sản xuất vắcxin dại, nhiệt độ

nuôi cấy của tế bào Vero thường giao động trong khoảng tương đối rộng từ 34oC [14], 36,5 oC [18] đến 37oC [26], [48], [59]. Trong nghiên cứu này, nhiệt độ để nhân nuôi tế bào trước cũng như sau khi gây nhiễm virút đều là 37oC

theo đúng hướng dẫn của về nhân nuôi tế bào của cơ sở cung cấp tế bào Vero

loạt gốc CCL 81.

+ Thời gian nuôi cấy: thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào nồng độ tế bào đưa

vào nuôi cấy ban đầu. Thời gian nuôi cấy giao động từ 3 ngày đến 7 ngày.

Thời gian nuôi cấy sẽ kết thúc khi tế bào kín một lớp trên chai nuôi cấy và số

lượng tế bào đạt được theo yêu cầu trên mỗi loại chai nuôi cấy khác nhau.

+ Số đời cấy chuyển tế bào: loạt tế bào Vero giống sản xuất của

VABIOTECH ở đời cấy chuyển 137 (xem phần phụ lục). Theo kinh nghiệm

của các chuyên gia sản xuất vắcxin của Hãng Pasteur Merieux, nơi hiện đang

sử dụng hệ thống nuôi cấy tế bào Vero trong sản xuất vắcxin bại liệt bất hoạt

và vắcxin dại, đời cấy chuyển cuối cùng của tế bào Vero trong sản xuất là đời

142 [29], [32]. Nghiên cứu của nhóm các tác giả này không thấy nguy cơ gây

ung thư khi tiêm tế bào Vero ở các đời cấy chuyển dưới 169 trên chuột đã bị

ức chế miễn dịch. Từ đời cấy chuyển 191, các nốt u xuất hiện với nghi ngờ là

ung thư giống với khi tiêm cho chuột dòng tế bào HeLa gây ung thư [32]. Do

vậy để chất lượng hóa các ngân hàng tế bào sản xuất, bên cạnh việc giám sát

chất lượng về tế bào thì việc quy định đời cất giữ tế bào tối đa cũng được các

nhà sản xuất đề cập đến [51]. Hình ảnh tế bào Vero CCL 81 của TCYTTG từ

đời cấy chuyển 135 - đời ra chai nuôi cấy đầu tiên sau khi nhận dòng tế bào

loạt gốc cho đến đời nuôi cấy cuối cùng (đời 142) sử dụng trong sản xuất

vắcxin được trình bày trong hình 2.2. Các hình ảnh này đã cho thấy tính đồng

nhất về hình thái của tế bào Vero qua các đời cấy chuyển.

Đời cấy chuyển Hình ảnh tế bào

Đời 135 Đời 136

Đời 137 Đời 138

(Ngân hàng tế

bào sản xuất)

Đời 139 Đời 140

Đời 142 Đời 141

(Đời nuôi cấy

sản xuất)

Hình 2.2. Hình ảnh tế bào Vero qua các đời cấy chuyển

+ Loại chai nuôi cấy tế bào: Tế bào Vero được nuôi cấy trên các chai

một lớp có diện tích nuôi cấy khác nhau. Các dạng chai thường được sử dụng trong nghiên cứu này là các chai nuôi cấy loại 75cm2 và 150 cm2. Ngoài ra

sau khi gây nhiễm virút có sử dụng thêm các chai nuôi cấy nhiều tầng (3 tầng

hoặc 10 tầng) nhằm đánh giá tính khả dụng của các chai nuôi cấy này trong

việc làm tăng hiệu suất của hỗn dịch virút thu hoạch và làm giảm nguy cơ lây

nhiễm trong quá trình gặt cũng như thay môi trường cho các mẻ gặt đơn virút.

Kết quả duy trì tế bào cũng như nuôi cấy virút đối với các dạng chai nuôi cấy

tế bào một lớp khác nhau được trình bày trong Phần 2.3- Quy trình nuôi cấy

virút và thu hoạch nước nổi.

Theo dõi các chai nuôi cấy tế bào trước khi gây nhiễm virút được tiến

hành hàng ngày bằng phương pháp cảm quan (màu và độ trong của môi

trường nuôi cấy) và kiểm tra dưới kính hiển vi soi tế bào. Soi tế bào nhằm

đánh giá về hình thái tế bào, mức độ mọc kín một lớp và các bất thường của

quá trình phát triển của tế bào như có hay không sự hủy hoại của tế bào

(CPE). Lượng tế bào thu được trong các chai nuôi cấy được xác định bằng

cách tách tế bào và nhuộm đếm số lượng bằng buồng đếm. Chất lượng tế bào

được đánh giá bằng các phương pháp kiểm tra chất lượng trong quá trình nuôi

cấy. Các phương pháp này không những giúp kiểm tra chất lượng của tế bào

trước khi đưa vào gây nhiễm virút sản xuất mà còn giúp theo dõi toàn bộ quá

trình duy trì tế bào trong quá trình nhân nuôi virút thông qua các chai tế bào

chứng không gây nhiễm virút. Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng tế bào

trong quá trình nuôi cấy bao gồm:

2.1.1. Các thử nghiệm kiểm tra nƣớc nổi nuôi cấy tế bào

2.1.1.1. Thử nghiệm kiểm tra vô khuẩn - xem phần 4.1.1: Phương pháp kiểm

tra vô khuẩn

2.1.1.2. Kiểm tra Mycoplasma

Nguyên vật liệu

Sinh phẩm và môi trường

- Mẫu thử: Hộn nước nổi nuôi cấy tế bào

- Môi trường PPLO lỏng

- Môi trường PPLO thạch

Dụng cụ

- Pipét 1ml, 2ml, 5ml, 10 ml vô trùng

- Pipet aid

- Đèn cồn, cồn 700.

- Quần áo, mũ, khẩu trang và găng tay vô trùng.

Trang thiết bị

- Hốt vô trùng

- Tủ ấm 37 ± 10C

- Kính hiển vi

Các bước tiến hành

Mẫu thử

* Môi trường lỏng: cấy trực tiếp 0,2ml mẫu thử vào mỗi ống môi trường. Mỗi

loạt mẫu thử cấy trên 5 ống môi trường lỏng.

- Thể tích cấy: 0,2ml mẫu thử/ 1 ống môi trường.

* Môi trường đặc: 0,2 ml mẫu thử/ 1 đĩa thạch. Mỗi loạt mẫu thử cấy trên 5

đĩa thạch. Dùng giấy parafilm bao quanh rìa đĩa thạch để tránh khô mặt thạch.

Chứng môi trường

- Chứng âm: để nguyên ống hoặc đĩa môi trường, không mở.

- Chứng dưng: Lấy kết quả kiểm tra chất lượng môi trường làm chứng

dương.

Thời gian và nhiệt độ nuôi cấy

- Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ± 10C trong 21 ngày.

Cấy chuyển

- Đến ngày thứ 7, cấy chuyển từ ống môi trường lỏng sang môi trường thạch:

Hút 0,2 ml môi trường lỏng cấy vào 1 đĩa thạch.

- Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ± 10C / 21 ngày.

Theo dõi sau cấy

- Môi trường PPLO (môi trường lỏng và thạch) sau cấy được theo dõi và ghi

kết quả vào Nhật ký kiểm định vào các ngày 3, 5, 7, 14 và 21.

- Đọc kết quả vào ngày thứ 21.

+ Môi trường lỏng: Quan sát sự đổi màu của môi trường. Nếu ống nào có sự

chuyển màu (từ màu hồng nhạt chuyển sang màu vàng cam): cấy chuyển ra

thạch để kiểm tra khuẩn lạc.

+ Môi trường đặc: Quan sát khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên các đĩa thạch

dưới kính hiển vi: khuẩn lạc nhỏ, vùng trung tâm khuẩn lạc có màu sẫm và

dày, rìa khuẩn lạc mỏng và bẹt trông như quả trứng ốplết.

Kết quả

Giá trị của thử nghiệm

- Loạt môi trường PPLO (lỏng và thạch) dùng cho thử nghiệm Mycoplasma

phi đạt yêu cầu về kiểm tra chất lượng môi trường.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Mẫu thử: không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi trên

cả 2 loại môi trường (lỏng và đặc).

- Đối với ống chứng:

. Chứng (-): Không có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi.

. Chứng (+): Có sự phát triển của Mycoplasma sau 21 ngày theo dõi.

2.1.1.3. Thử nghiệm kiểm tra các virút ngoại lai

Nguyên vật liệu

Dụng cụ

- Chai nuôi cấy tế bào (25cm2)

- Pipet 2ml, 5ml, 10ml

Trang thiết bị

- Kính hiển vi soi tế bào

- Tủ ấm

- Pipet Aid

Hóa chất và môi trường

- Tế bàoVERO

- Tế bào HEp 2

- Tế bào thận thỏ

- Môi trường nuôi cấy tế bào - MEM

- Huyết thanh bào thai bê (FBS)

- PBS (-)

Các bước tiến hành

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường MEM chứa 2% FBS

Chuẩn bị tế bào

- Mỗi loại tế bào (HEp2, tế bào thận thỏ, tế bào VERO khác loạt với sản xuất) được nuôi cấy trong các chai nuôi cấy tế bào 25cm2, mỗi mẫu thử dùng

4 chai, mẫu chứng âm là 2 chai.

Thử nghiệm phát hiện các tác nhân ngoại lai trên các dòng tế bào khác nhau

* Mẫu thử: Hộn nước nổi nuôi cấy tế bào chứng.

- Loại bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào. Rửa tế bào 2 lần bằng

PBS(-).

- Cấy vào mỗi chai tế bào 3ml hộn nước nổi nuôi cấy tế bào. Cho thêm 9ml

môi trường MEM 2% FBS vào mỗi chai.

* Mẫu chứng âm:

- Loại bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai tế bào. Rửa tế bào 2 lần bằng

PBS(-).

- Cho vào mỗi chai 12ml môi trường nuôi cấy MEM 2% FBS.

* Nuôi cấy:

- Các chai tế bào đã gây nhiễm được nuôi cấy ở nhiệt độ 36OC±1OC trong 14

ngày, hàng ngày theo dõi tế bào và ghi kết quả vào Nhật ký kiểm định.

Kết quả

- Các chai tế bào chứng (mẫu chứng âm) phát triển bình thường, tế bào mọc

kín một lớp, không có hiện tượng hủy hoại tế bào (CPE).

- Không có CPE trong tất cả các chai tế bào đã gây nhiễm với hộn nước nổi

nuôi cấy tế bào chứng.

2.1.2. Thử nghiệm kiểm tra các virút hấp phụ hồng cầu

Nguyên vật liệu

Dụng cụ

- Pipet 10ml, 25ml

Trang thiết bị

- Kính hiển vi soi tế bào

- Tủ lạnh

- Pipet Aid

Hóa chất và môi trường

- Môi trường Hank

- Dung dịch hồng cầu chuột lang 0,5%

- Các chai tế bào chứng (75cm2)

Các bước tiến hành

Mẫu thử

- Hút bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai nuôi cấy tế bào chứng.

- Cho 20ml dung dịch hồng cầu chuột lang 0,5% vào chai tế bào, láng đều.

Mẫu chứng

- Hút bỏ hết môi trường nuôi cấy trong các chai nuôi cấy tế bào chứng.

- Cho 20ml môi trường Hank vào mỗi chai tế bào, láng đều.

Nhiệt độ ủ

- Ủ ở 2 nhiệt độ: 0- 4OC và 20 - 25OC. Thời gian ủ: 30 phút/khoảng nhiệt độ.

Quan sát tế bào

- Rửa tế bào 3 lần bằng môi trường Hank .

- Quan sát tế bào dưới kính hiển vi soi tế bào.

Kết quả

Đọc kết quả

- Dương tính: có hiện tượng hấp phụ hồng cầu: dưới kính hiển vi soi tế bào

thấy các tế bào hồng cầu chuột lang bám vào lớp tế bào.

- Âm tính: không có hiện tượng hấp phụ hồng cầu: dưới kính hiển vi soi tế

bào không thấy các tế bào hồng cầu chuột lang bám vào lớp tế bào.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Không có hiện tượng hấp phụ hồng cầu trong các chai tế bào: Không có

virút hấp phụ hồng cầu.

2.1.3. Kết quả quy trình nuôi cấy tế bào Vero trên chai tế bào một lớp

Kết quả về tổng lượng tế bào thu được sau quá trình nhân nuôi tế bào

Vero từ đời cấy chuyển 138 (cấy chuyển từ tế bào giống sản xuất đời 137)

đến đời cấy chuyển 141 (cấy chuyển trước khi gây nhiễm virút) được trình

bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Số lƣợng tế bào Vero thu đƣợc qua các đời cấy chuyển trong

quá trình nhân nuôi trên chai nuôi cấy một lớp

Đời cấy chuyển Số lƣợng tế bào

Đời 138 1,4 x 107

Đời 139 9x107

Đời 140 5,5x108

Đời 141 3,5x109

Theo kết quả trong Bảng 2.1, lượng tế bào tăng dần qua các đời nuôi

cấy. Ở các đời cấy chuyển sau, lượng tế bào thường tăng gấp khoảng 6 lần so

với đời nuôi cấy trước đó. Đây là lượng nhân nuôi tối đa đạt được đối với hầu

hết các dòng tế bào thường trực [29], [32]. Quy trình này sẽ được áp dụng

trong quá trình sản xuất thử nghiệm các loạt vắcxin ở quy mô phòng thí

nghiệm.

2.2. QUY TRÌNH GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO

Tế bào Vero đời 141 được tách và gây nhiễm với chủng virút dại trên

các dạng chai nuôi cấy tế bào tế bào một lớp khác nhau. Phương pháp gây

nhiễm là hấp phụ virút dại vào các tế bào Vero ở dạng hỗn dịch sau đó cấy

chuyển vào các chai nuôi cấy tế bào và virút sẽ nhân lên cùng với quá trình

nhân lên của tế bào. Do vậy, môi trường nuôi cấy tế bào được sử dụng trong

quy trình này vẫn là môi trường phát triển của tế bào (MEM có chứa huyết

thanh bào thai bê - FBS).

Chủng giống virút dùng để gây nhiễm vào tế bào là loạt chủng giống sản xuất WS-PV-010805. Chủng giống này có hiệu giá virút là 10-7,19 LD50/ml

do vậy đạt được yêu cầu đối với chủng giống cho gây nhiễm sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero (không được thấp dưới 10-6,7 LD50/ml [30].

Trong quy trình gây nhiễm này, liều lượng virút gây nhiễm sẽ được

khảo sát để tìm ra liều gây nhiễm (MOI) tối ưu cho hiệu giá virút cao đồng

thời duy trì được sự phát triển của tế bào với mục tiêu thu hoạch được nhiều

mẻ gặt đơn nhằm tiết kiệm tối đa môi trường, tế bào, virút và nhân công. Dựa

vào đặc tính gây hủy hoại tế bào chậm của virút dại, các nhà sản xuất thường

nghiên cứu tìm ra các điều kiện để kéo dài tối đa quá trình phát triển của tế

bào với mong muốn có được số mẻ gặt đơn có hiệu giá virút đạt yêu cầu cho

sản xuất cao nhất [30], [31]. Kết quả nghiên cứu về liều lượng gây nhiễm của

virút dại trên nuôi cấy tế bào Vero được trình bày trong Bảng 2.2. Nghiên cứu

này khảo sát 3 liều gây nhiễm (MOI) khác nhau là 0,1; 0,01 và 0,001. Liều

lượng này được tính theo số đơn vị hiệu giá LD50 của virút dại trên một tế

bào. Tế bào và nước nổi nuôi cấy sẽ được theo dõi và đánh giá trong vòng 9

ngày sau gây nhiễm để tìm ra đỉnh hiệu giá virút và mức độ duy trì của tế bào.

Trong 6 ngày đầu tiên với mục đích tìm hiểu đỉnh hiệu giá virút nên môi

trường được sử dụng sẽ là môi trường nuôi cấy có huyết thanh để đảm bảo

cho tế bào luôn có được điều kiện dinh dưỡng tốt. Từ ngày thứ 6 trở đi,

chuyển sang môi trường không có huyết thanh (môi trường sẽ được sử dụng

để nhân nuôi và thu hoạch virút) để đánh giá mức độ duy trì của tế bào trong

môi trường này. Tế bào Vero nuôi cấy được theo dõi hàng ngày bằng kính soi

tế bào và hiệu giá virút trong nước nổi nuôi cấy được xác định bằng thử

nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit của virút dại tính theo

số đơn vị FFD50/0,05 ml(xem Phần 2.3 - Quy trình nuôi cấy virút và thu

hoạch nước nổi) .

Bảng 2.2. Kết quả nuôi cấy virút dại với các liều gây nhiễm khác nhau

Liều gây nhiễm

Ngày sau gây nhiễm

0,1 MOI

0,01 MOI

0,001 MOI

Ngày 1

10-1,5

-

Ngày 2

10-2,3

-

Ngày 3

10-3,58

10-1,25

-

Ngày 4

10-3,27

10-2,58

10-1,55

Ngày 5

10-3,16

10-3,82

10-2,15

Ngày 6

(thay môi trƣờng)

10-3,02

10-4,02

10-2,67

Ngày 7

10-1,05

10-2,32

10-2,02

Ngày 8

10-1,15

10-3,12

10-2,65

Ngày 9

10-1,08

10-3,85

10-3,01

Kết quả trong Bảng 2.2 cho thấy ở liều gây nhiễm cao nhất (0,1 MOI), tế

bào bị hủy hoại sớm từ ngày thứ 3 sau gây nhiễm và hiệu giá virút đã đạt đỉnh

ngay vào thời điểm này. Vào những ngày tiếp theo ngay cả khi được thay

sang môi trường duy trì, hiệu giá virút vẫn rất thấp không đạt được yêu cầu

cho sản xuất vắcxin. Ngược lại, ở liều gây nhiễm thấp nhất (0,001 MOI), tế

bào hầu như không bị hủy hoại nhưng hiệu giá virút luôn ở mức thấp và chỉ

bắt đầu tăng lên vào ngày thứ 6. Khi thay sang môi trường duy trì, hiệu giá

virút cũng chưa đạt được đỉnh sau 3 ngày nuôi cấy. Ở liều gây nhiễm trung

bình (0,01 MOI), hiệu giá virút tăng cao sau 4-5 ngày nuôi cấy ở môi trường

phát triển của tế bào (có huyết thanh) và khi thay sang môi trường duy trì tế

bào (không huyết thanh) hiệu giá virút lại tiếp tục tăng sau 3 ngày nuôi cấy

đồng thời tình trạng tế bào vẫn duy trì tốt trong 9 ngày theo dõi. Liều gây

nhiễm này phù hợp với quá trình sản xuất do luôn tạo được đỉnh hiệu giá virút

đạt yêu cầu sau từ 3-4 ngày nhân nuôi ở môi trường duy trì tế bào. Kết quả

này cũng sẽ được khẳng định rõ rệt hơn trong các nghiên cứu tiếp theo ở

Phần 2.3 - Quy trình nuôi cấy virút và thu hoạch nước nổi. Nghiên cứu của

nhiều tác giả trên thế giới cũng cho thấy việc duy trì tế bào và tạo các đỉnh

hiệu giá virút sau các lần thay môi trường duy trì đã tạo nên một quá trình

nhân nuôi và thu hoạch virút dại được tiến hành với nhiều mẻ gặt đơn nước

nổi nuôi cấy có hiệu giá virút cao [18], [19], [30]. Điều này giúp tiết kiệm tế

bào, chủng giống virút, môi trường, giá thể nuôi cấy và nhân công. Trong mỗi

quá trình nhân nuôi virút dại sẽ có từ 5-6 mẻ gặt đơn được thu hoạch [30].

Như vậy, liều gây nhiễm 0,01 MOI cho kết quả khả quan nhất sẽ được tiếp

tục lựa chọn để nghiên cứu cũng như sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero trong các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.

2.3. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI

Sau khi gây nhiễm, virút dại sẽ nhân lên trong tế bào Vero sau đó giải

phóng ra nước nổi. Quá trình thu hoạch nước nổi nuôi cấy tế bào sẽ thu được

virút dại và đây sẽ là nguyên liệu để tinh chế thành vắcxin. Trong quá trình

ban đầu khi virút nhân lên cùng với tế bào Vero, môi trường được sử dụng

vẫn là môi trường phát triển tế bào có chứa huyết thanh động vật. Nước nổi

này sẽ không được sử dụng trong các công đoạn tiếp theo của quy trình sản

xuất vắcxin. Chi nước nổi nuôi cấy tế bào thu được khi sử dụng môi trường

không chứa huyết thanh mới là nguyên liệu để tiếp tục sản xuất ra vắcxin. Do

vậy mục đích của các nghiên cứu trong quy trình này là nhằm tìm ra các điều

kiện tối ưu để duy trì sự phát triển của virút dại trên tế bào Vero trong môi

trường không có huyết thanh.

- Các thông số được khảo sát để xác định điều kiện nuôi cấy virút tối ưu bao

gồm: thời gian gặt, số mẻ gặt đơn thích hợp, thời điểm thay môi trường duy

trì tế bào và loại chai tế bào một lớp dùng để nuôi cấy tế bào.

- Kết quả của quá trình nuôi cấy virút sẽ được đánh giá bằng các phương

pháp xác định hiệu giá virút dại. Các phương pháp này bao gồm:

2.3.1. Các phƣơng pháp xác định hiệu giá virút dại

2.3.1.1. Thử nghiệm xác định hiệu giá virút dại trên chuột (LD50/ml)

Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Nguyên vật liệu

- Chủng virút Dại cố định:

+ Chủng sản xuất PV 20%

+ Chủng virút thử thách CVS 20%

- Các mẫu virút dại trước bất hoạt

- Dung dịch pha loãng

- Chuột nhắt 3-4 tuần tuổi (13-16g)

Trang thiết bị

- Pipetman 1000l và đầu côn

- Ống nghiệm eppendorf 2ml

- Bơm tiêm 0,3 ml

- Máy lắc.

- Tủ ấm 37OC.

- Máy ly tâm

- Ống nghiệm nhựa 15ml vô trùng

- Găng cao su vô trùng

- Nhãn dán lồng chuột

Tiến hành

Pha loãng mẫu thử

Pha chủng

- Lấy 8 ống nghiệm và ghi ký hiệu từ 1 đến 8, xếp theo thứ tự vào giá đựng

ống nghiệm.

- Dùng pipet nhựa loại 5ml vô trùng để hút dung dịch pha loãng.

- Dùng pipetman 1000l với đầu côn để hút chủng virút dại.

- Chủng kiểm tra được pha loãng bậc 10 từ10-1 đến 10-8

- Mỗi độ pha sau khi pha xong, trước khi chuyển sang độ pha tiếp theo phải

được lắc kỹ trên máy lắc và thay đầu côn của pipetman.

- Sau mỗi độ pha loãng để ngay ống nghiệm đã pha vào hộp có đá lạnh.

Pha mẫu virút dại trước bất họat

- Mẫu thử nghiệm được pha loãng bậc 10 từ từ10-1 đến 10-6

 Đối với chủng PV: Dùng 4 độ pha loãng: 10-4, 10-5, 10-6 và 10-7.

 Đối với chủng CVS: Dùng 4 độ pha loãng: 10-5, 10-6, 10-7 và 10-8.

 Đối với mẫu virút dại trước bất hoạt: Dùng 4 độ pha loãng: 10-3, 10-4,

10-5 và 10-6

Gây nhiễm cho chuột và theo dõi

- Dùng 1 bơm tiêm. Tiêm từ độ pha loãng cao nhất đến độ pha loãng thấp

nhất.

- Mỗi độ pha loãng dùng 10 chuột, mỗi chuột tiêm 0,03ml vào não.

- Theo dõi chuột đã được gây nhiễm virút dại trong vòng 14 ngày. Hàng

ngày ghi số chuột chết hoặc liệt. Chỉ ghi nhận số chuột liệt chết từ ngày thứ 5,

những chuột chết trước đó không được tính trong tổng số chuột.

- Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV được trình bày trong

Hình 2.3.

Hình 2.3. Hình ảnh chuột liệt do chủng virút dại cố định PV

Kết quả

Tính kết quả

- Tính số chuột chết trên tổng số chuột của mỗi nhóm chuột.

- Kết quả được tính theo phương pháp Reed – Muench.

* Công thức :

x k Lg(1/ LD50 ) = Lg(1/ A) -

Trong đó: A: độ pha loãng của chủng gây chết ngay sát dưới 50% .

a: % chuột chết ngay sát dưới 50%

b: % chuột chết ngay sát trên 50%

k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10)

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Hiệu giá của chủng PV phải đạt từ 10-4,5 LD50/ml trở lên

2.3.1.2. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit của

virút dại (FFD50/0,05 ml)

Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Phiến Teflon 8 giếng

- Bản kính đậy phiến

- Hộp lồng 15 cm để ủ phiến

- Phiến 96 giếng để pha loãng huyết thanh mẫu và huyết thanh chứng

- Đầu côn: 20-1000 l

- Giấy thấm.

- Ống ly tâm 1,5 ml

Trang thiết bị

- Pipet nhiều kênh

- Pipetman 20-1000 l

- Tủ ấm 37C

- Cóng rửa phiến

- Kính hiển vi soi tế bào

- Kính hiển vi huỳnh quang

- Tủ lạnh

Vật liệu và hóa chất

- Chai tế bào Vero

- MEM 10% FBS

- Dung dịch Trysin 0,25%

- Mẫu virut dại trước bất hoạt

- Dung dịch PBS

- Dung dịch đệm phủ phiến

- Dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh quang

- Aceton lạnh

- Nước pha tiêm

Tiến hành

Lập sơ đồ phiến

- Trên mỗi bản sơ đồ phiến có 1 phiến chứng dương (mẫu virút dại đã biết

hiệu giá) và 1 phiến chứng âm (phiến chứng tế bào không gây nhiễm virút).

Chuẩn bị tế bào Vero

- Từ chai tế bào Vero 75cm2 đã nuôi cấy 3 ngày trong môi trường MEM-10,

tách tế bào và tạo khoảng 10 ml hỗn dịch tế bào.

- Đếm số lượng tế bào có trong hỗn dịch.

- Từ kết quả thu được pha loãng hỗn dịch tế bào để đạt được nồng độ 106 tế

bào/ml.

Pha loãng mẫu thử

- Mẫu thử được pha loãng bậc 10 từ 10-1 đến 10-4

Ủ mẫu thử với tế bào Vero

- Nhỏ 50 μl các mẫu thử đã pha loãng vào từng giếng. Các giếng ở phiến

chứng tế bào nhỏ 50 μl môi trường MEM 10% FBS.

- Thêm vào từng giếng trên các phiến 100 μl hỗn dịch tế bào đã pha loãng.

- Ủ tất cả các phiến trong hộp lồng có giấy thấm được làm ẩm ở nhiệt độ 370C trong 20 giờ.

Cố định virút

- Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến.

- Nhúng phiến trong cóng đựng dung dịch PBS sau đó nhúng tiếp vào cóng

đựng acetone lạnh.

- Vớt phiến ra và để khô tự nhiên.

Nhuộm phiến

- Nhỏ dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh

quang vào từng giếng trên các phiến.

- Ủ tất cả các phiến trong hộp lồng có giấy thấm được làm ẩm ở nhiệt độ 370C trong 30 phút.

Rửa phiến

- Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến.

- Rửa phiến bằng dung dịch PBS.

- Để khô phiến.

Phủ phiến

- Nhỏ dung dịch đệm phủ phiến vào từng giếng.

- Đậy phiến bằng bản kính.

Đọc bản phiến

- Soi phiến dưới kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20x và ghi kết quả vào

phiếu ghi sơ đồ phiến. Mỗi giếng trên phiến sẽ được soi lần lượt từng vi

trường cho hết toàn bộ diện tích của giếng. Vi trường nhiễm là vi trường soi

thấy hình ảnh virút dại bắt màu xanh huỳnh quang trên nền tế bào Vero có

màu đỏ (Hình 2.4).

Hình 2.4. Hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào Vero dƣới kính hiển vi

huỳnh quang

Tính kết quả

- Tính số vi trường nhiễm trên tổng số vi trường được soi trong mỗi giếng.

- Kết quả được tính theo phương pháp Reed – Muench.

* Công thức :

x k Lg(1/ FFD50 ) = Lg(1/ A) -

Trong đó: A: độ pha loãng của mẫu có mức độ nhiễm ngay sát dưới 50%.

a: % vi trường nhiễm ngay sát dưới 50%

b: % vi trường nhiễm ngay sát trên 50%

k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10)

Giá trị của thử nghiệm và tiêu chuẩn chấp thuận

- Mẫu chứng tế bào phải cho kết quả âm tính

- Hiệu giá của chủng PV phải đạt từ 10-1,5 FFD50/0,05 ml trở lên

2.2.1.3. Thử nghiệm ELISA định lượng kháng nguyên glycoprotein của

virút dại (EL.U/ml)

Nguyên lý

- Thử nghiệm áp dụng theo nguyên lý của thử nghiệm ELISA gián tiếp phát

hiện kháng nguyên glycoprotein của virút dại [37].

- Trước tiên, các giếng phản ứng được gắn bản bằng kháng thể đa dòng ngựa

kháng virút dại. Kháng nguyên trong mẫu thử sẽ kết hợp với kháng thể gắn

bản sau đó tiếp tục gắn kết với kháng thể đơn dòng chuột kháng glycoprotein

của virut dại. Phức hợp này sẽ được phát hiện bởi cộng hợp dê kháng IgG

chuột có gắn peroxidase và cho hiện màu bằng cơ chất.

- Đây là thử nghiệm in-house sử dụng trong quy trình sản xuất vắcxin dại nên

đơn vị được tính theo EL.U/ml với mẫu chuẩn được xây dựng dựa trên mẫu

chuẩn quốc tế đã biết hàm lượng glycoprotein của virút dại [25]. Thử nghiệm

này khá đặc hiệu với chủng virút dại sản xuất do sử dụng kháng thể chuột đơn

dòng kháng chính glycoprotein của virút dại chủng PV (clone 1C5) nên cũng

sẽ được coi là thử nghiệm nhận dạng đối với vắcxin dại cho cả các mẫu sản

phẩm bất hoạt và chưa bất hoạt virút.

Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Vật liệu

- Phiến gắn bản 8 giếng

- Giá gắn bản

- Falcon 50 ml

- Pipet 5ml, 10ml, 25 ml.

- Pipet aid

- Pipet man 1μl, 10μl, 100μl, 200μl, 1000μl.

- Pipet nhiều kênh

- Đầu côn 10μl, 100μl, 200μl, 1000μl.

- Chứng âm (môi trường nuôi cấy virút hoặc PBS)

- Chứng dương (Mẫu chuẩn và vắcxin Verorab).

- Kháng thể đa dòng ngựa kháng dại (PAb).

- Kháng thể đơn dòng chuột kháng dại (MAb) clone 1C5

- Cộng hợp dê kháng IgG chuột.

Hóa chất

- Dung dịch đệm gắn bản

- Dung dịch blocking sau gắn bản

- Dung dịch rửa

- Dung dịch pha loãng mẫu

- Dung dịch pha loãng cộng hợp

- Dung dịch đệm cơ chất

- Dung dịch cơ chất

- Dung dịch ngừng phản ứng

Mẫu thử

- Tất cả các bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắcxin dại như bán

thành phẩm các mẻ gặt đơn virút dại, bán thành phẩm tinh sạch, bán thành

phẩm bất hoạt và các bán thành phẩm cô đặc và tinh chế.

Trang thiết bị

- Máy rửa bản ELISA

- Máy trộn

- Hốt vô trùng

- Máy đọc bản ELISA

Tiến hành

Gắn bản

- Gắn bản kháng thể đa dòng ngựa kháng dại (PAb) đã được pha trong

dung dịch đệm gắn bản. Ủ bản ở 37oC trong 3 giờ.

- Rửa và đập khô bản phiến.

- Cho dung dịch blocking vào mỗi giếng. Ủ bản ở 37oC trong 30 phút.

- Rửa và đập khô phiến.

- Dán phiến và bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.

Chạy ELISA

- Viết sơ đồ phiến

- Lấy phiến ra từ tủ bảo quản, để 5 phút ở nhiệt độ phòng. Lấy số dãy

giếng vừa đủ cho xét nghiệm.

- Pha loãng mẫu chuẩn và mẫu thử theo 4 độ pha loãng từ 1/5; 1/25;

1/125; 1/625.

- Nhỏ các mẫu đã pha loãng vào các giếng thử. Dán và ủ phiến ở 370C

trong 1 giờ.

- Rửa phiến bằng dung dịch rửa. Đập khô phiến.

- Pha kháng thể đơn dòng (MAb) chuột kháng glycoprotein của virút dại

- Nhỏ kháng thể đơn dòng đã được pha vào mỗi giếng. Dán và ủ phiến ở

370C trong 1 giờ.

- Rửa phiến bằng dung dịch rửa. Đập khô phiến.

- Pha dung dịch cộng hợp dê kháng IgG chuột có có gắn peroxidase.

- Nhỏ dung dịch cộng hợp vào các giếng. Dán và ủ phiến ở 370C trong

30 phút.

- Rửa phiến bằng dung dịch rửa. Đập khô phiến.

- Pha chất hiện mầu và nhỏ vào các giếng.

- Để phiến tại chỗ tối ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút.

- Dừng phản ứng bằng dung dịch dừng phản ứng.

- Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450/620 nm trên máy đọc ELISA.

Kết quả

Tính kết quả

- Dựng đường chuẩn: Căn cứ vào OD và hàm lượng glycoprotein tương

ứng ở mỗi độ pha loãng của các mẫu chuẩn, sử dụng chương trình Excel,

xây dựng nên phương trình hồi quy tuyến tính thực nghiệm (phương trình

đường chuẩn) y = ax + b. Dựa theo phương trình đường chuẩn tính ra hàm

lượng glycoprotein của virut dại trong các mẫu thử.

*Công thức:

Trong đó: Y: hàm lượng glycoprotein của mẫu thử tính trong 1 ml (EL.U/ml)

d : độ pha loãng mẫu

y : Hàm lượng glycoprotein của mẫu thử trong thử nghiệm ELISA

tính theo mẫu chuẩn (EL.U) với phương trình đường chuẩn

y = ax + b

x: OD đo được tương ứng với từng hàm lượng glycoprotein.

a, b: Hệ số của phương trình đường chuẩn.

Giá trị của thử nghiệm

- Thử nghiệm có giá trị khi: Giá trị OD của chứng âm ở các độ pha loãng

khác nhau nhỏ hơn 0,15. Giá trị OD của chứng dương ở độ pha loãng 1/5

lớn hơn 0,5.

2.3.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo các điều kiện nhân nuôi khác nhau

Các thông số khác nhau của điều kiện nhân nuôi chủng virút dại giống

sản xuất PV được nghiên cứu. Kết quả thu được sẽ là căn cứ để xây dựng nên

quy trình nhân nuôi virút và thu hoạch nước nổi. Đây là một công đoạn rất

quan trọng trong quá trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào. Hiệu giá

virút thu hoạch được sẽ quyết định đến hiệu suất của toàn bộ quá trình sản

xuất vắcxin dại sau này.

2.3.2.1. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào tế bào

Nghiên cứu được tiến hành với mục đích tìm ra thời điểm thu hoạch

virút cũng như xác định số mẻ gặt đơn thu được trong quá trình nhân nuôi

virút dại trên tế bào Vero. Tế bào và nước nổi nuôi cấy tế bào được theo dõi

và xác định hiệu giá virút hàng ngày sau khi gây nhiễm virút vào tế bào Vero.

Trong 3 ngày đầu tiên, môi trường sử dụng là môi trường phát triển tế bào có

chứa huyết thanh, vào những ngày tiếp theo, môi trường duy trì tế bào không

chứa huyết thanh sẽ được thay thế để nhân nuôi và thu hoạch virút dại cho sản

xuất.

Bảng 2.3. Kết quả nuôi cấy virút dại theo ngày sau gây nhiễm virút vào tế bào

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3 (thay môi trƣờng duy trì tế bào)

<10-4,5 LD50/ml 10-1,78 FFD50/0,05 ml

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

10-6,0 LD50/ml 10-2,86 FFD50/0,05 ml 1,28 EL.U/ml

10-6,0 LD50/ml 10-2,71 FFD50/0,05 ml 1,67 EL.U/ml

10-6,75 LD50/ml 10-3 FFD50/0,05 ml 2,58 EL.U/ml

Ngày 9

Ngày 7

Ngày 8

(thay môi trƣờng duy trì tế bào)

10-5,875 LD50/ml 10-2,71 FFD50/0,05 ml 3,61 EL.U/ml

10-5,333 LD50/ml 10-2,89 FFD50/0,05 ml 3,92 EL.U/ml

10-5,962 LD50/ml 10-3,19 FFD50/0,05 ml 4,36 EL.U/ml

Ngày 10

Ngày 11

Ngày 12

10-5,125 LD50/ml 10-2,89 FFD50/0,05 ml 2,12 EL.U/ml

10-5,875 LD50/ml 10-3,71 FFD50/0,05 ml 3,12 EL.U/ml

10-5,875 LD50/ml 10-3,94 FFD50/0,05 ml 4,87 EL.U/ml

Ngày 13

Ngày 14

Ngày 15

(thay môi trƣờng duy trì tế bào)

10-3 FFD50/0,05 ml

10-3,4 FFD50/0,05 ml

10-6,125 LD50/ml 10-3,25 FFD50/0,05 ml 5,31 EL.U/ml

Ngày 16

Ngày 17

Ngày 18

(thay môi trƣờng duy trì tế bào)

10-2,13 FFD50/0,05 ml

10-3 FFD50/0,05 ml

10-6,0 LD50/ml 10-3,13 FFD50/0,05 ml 5,78 EL.U/ml

Ngày 20

Ngày 19

Ngày 21

(thay môi trƣờng duy trì tế bào)

10-2,19 FFD50/0,05 ml

10-5,0 LD50/ml 10-3,17 FFD50/0,05 ml 4,82 EL.U/ml

10-5,67 LD50/ml 10-3,4 FFD50/0,05 ml 5,12 EL.U/ml

Ngày 22

Ngày 23

Ngày 24

10-2,08 FFD50/0,05 ml

10-1,58 FFD50/0,05 ml

10-4,5 LD50/ml 10-1,54 FFD50/0,05 ml 3,66 EL.U/ml

Theo bảng 2.3, hiệu giá virút đạt đỉnh sau từ 3-4 ngày nuôi cấy trong

môi trường duy trì tế bào và đến ngày thứ 24 tế bào đã bị hủy hoại hoàn toàn.

Như vậy, khoảng thời gian nuôi cấy cho mỗi mẻ gặt đơn virút và thay môi

trường để duy trì tế bào là 3 ngày và số lần thu hoạch tối đa sẽ có được là 6

mẻ gặt đơn trong cả quá trình nuôi cấy virút này. Hiệu giá virút xác định theo

phương pháp miễn dịch huỳnh quang sẽ được lựa chọn là phương pháp theo

dõi hiệu giá virút của các mẻ gặt đơn do đơn giản, dễ thực hiện, dễ đọc kết

quả và không tốn thời gian theo dõi. Hiệu giá virút xác định theo phương

pháp ELISA cũng là một thông số có thể tham khảo. Tuy nhiên, phương pháp

này có giá trị hơn khi áp dụng để tính hiệu suất của toàn bộ quá trình sản xuất

vắcxin do có thể xác định được hiệu giá virút trong cả mẫu thử virút sống lẫn

mẫu thử virút đã bất hoạt [17], [44]. Tiêu chuẩn để mỗi mẻ gặt đơn đạt yêu cầu cho sản xuất phải có được hiệu giá virút dại ít nhất là 10-4,5 LD50/ml khi thử nghiệm tiêm trên chuột hoặc 10-1,5 FFD50/0,05 ml khi thử nghiệm theo

phương pháp miễn dịch huỳnh quang và 1,5 EL.U/ml khi thử nghiệm theo

phương pháp ELISA.

2.3.2.2. Kết quả nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trƣờng duy trì

tế bào khác nhau

Nghiên cứu tiến hành gây nhiễm virút dại vào tế bào Vero với số lượng

tế bào cũng như liều lượng virút gây nhiễm trong các chai nuôi cấy là tương

đương nhau. Tiến hành thay từ môi trường phát triển tế bào sang môi trường

duy trì tế bào vào các thời điểm khác nhau trong quá trình nuôi cấy tế bào sau

gây nhiễm. Mục đích của nghiên cứu là nhằm tìm ra thời điểm thích hợp để

thay thế từ môi trường chứa huyết thanh sang môi trường không chứa huyết

thanh sử dụng cho sản xuất vắcxin. Hiệu giá virút được xác định trong nghiên

cứu này bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit

của virút dại tính theo số đơn vị FFD50/0,05 ml

Bảng 2.4. Kết quả nuôi cấy virút dại theo thời điểm thay môi trƣờng duy

trì tế bào khác nhau

Thời điểm thay môi trƣờng duy trì tế bào (môi trƣờng không huyết thanh)

Thời điểm theo dõi

2 giờ

4 giờ

6 giờ

24 giờ

72 giờ

Mẻ gặt H0

(bắt đầu sang môi trƣờng duy trì tế bào)

-

Mẻ gặt H1

(sau 3 ngày)

-

10-1,10

10-2,21

10-2,93

-

Mẻ gặt H2

(sau 6 ngày)

10-3,10

10-2,42

10-2,70

10-3,50

Mẻ gặt H3

(sau 9 ngày)

10-3,25

10-3,88

10-3,39

10-3,50

10-3,69

Mẻ gặt H4

(sau 12 ngày)

10-2,79

10-2,21

10-3,07

10-2,75

10-3,83

Mẻ gặt H5

(sau 15 ngày)

10-1,83

10-2,13

10-2,17

10-2,07

10-2,58

Mẻ gặt H6

(sau 18 ngày)

-

10-1,20

10-1,50

Theo Bảng 2.4, sau 3 ngày (72 giờ) nuôi cấy trong môi trường phát

triển tế bào (có huyết thanh), tế bào được thay sang môi trường duy trì (không

có huyết thanh) đã cho hiệu giá virút của các mẻ gặt đơn đạt yêu cầu. Như

vậy, tế bào Vero phải đạt được mức độ phát triển kín một lớp trong các chai

nuôi cấy tế bào thì mới đủ được số lượng tế bào để virút nhân lên. Môi trường

duy trì tế bào cũng giúp các tế bào Vero tiếp tục nhân lên (hình ảnh tế bào ở

các mẻ gặt từ H2 đến H4 khi thay sang môi trường duy trì tế bào sau 2,4,6 giờ

nuôi cấy trong môi trường phát triển tế bào), tuy nhiên số lượng tế bào nhân

lên này không đáp ứng đủ nhu cầu phát triển của virút nên hiệu giá thu được

không cao và không kéo dài. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả khác trên thế

giới cũng đã cho thấy 3 ngày là thời điểm thích hợp nhất để chuyển từ môi

trường phát triển tế bào sang môi trường duy trì tế bào [18], [19], [26], [59].

2.3.2.3. Kết quả nuôi cấy virút dại trên các dạng chai nuôi cấy khác nhau

Nghiên cứu đề cập đến việc nuôi cấy virút trên các dạng chai nuôi cấy tế bào một lớp khác nhau như chai 75 cm2 và 150 cm2, chai nuôi cấy 3 tầng và

và 10 tầng (cell factory) nhằm tìm ra được dạng chai nuôi cấy cho hiệu suất

nuôi cấy virút cao nhất khi tiến hành nhân nuôi virút ở quy mô phòng thí

nghiệm. Lượng tế bào được cấy vào mỗi chai được tính theo diện tích của

từng loại chai và liều gây nhiễm virút cũng sẽ tương đương nhau ở tất cả các

dạng chai nuôi cấy.Hiệu giá virút được xác định số đơn vị FFD50/0,05 ml.

Bảng 2.5. Kết quả nuôi cấy virút dại trên các dạng chai nuôi cấy khác nhau

Chai 75 cm2

Chai 150 cm2

Chai 3 tầng

Chai 10 tầng

Mẻ gặt đơn

Tế bào gây nhiễm

Tế bào chứng

Tế bào gây nhiễm

Tế bào chứng

Tế bào gây nhiễm

Tế bào chứng

H0

-

H1

10-2,67

10-2,87

10-3,16

10-2,02

H2

10-3,46

10-3,54

10-3,42

H3

10-3,63

10-3,73

10-4,21

10-3,52

H4

10-3,92

10-4,05

10-4,02

10-3,87

H5

10-2,67

10-3,01

10-3,34

10-2,62

H6

10-1,52

10-1,86

10-1,48

10-2,09

Kết quả trong Bảng 2.5 cho thấy, các dạng chai nuôi cấy tế bào một lớp

khác nhau cho hiệu giá virút nuôi cấy gần tương đương nhau. Nuôi cấy trên

chai tế bào 3 lớp cho hiệu giá virút dại cao nhất. Chai nuôi cấy tế bào 10 lớp

không có được hiệu giá virút cao như kỳ vọng. Điều này có thể là do tế bào

không được chia đều ở các tầng của chai nuôi cấy đồng thời phòng thí nghiệm

chưa có được hệ thống ủ chai nhiều tầng chuyên biệt nên tế bào không được

giàn và mọc đều 1 lớp trên các tầng của chai nuôi cấy. Hơn nữa, hạn chế của

chai nuôi cấy 10 tầng là rất khó theo dõi quá trình phát triển của tế bào do

không soi được với các kính soi tế bào thông thường. Do vậy, trong quy trình

sản xuất thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm, sẽ chỉ áp dụng nhân nuôi

virút trên hệ thống chai nuôi cấy tế bào 3 tầng. Trong tương lai, cùng với việc

tiếp tục nghiên cứu nhân nuôi virút dại trên các hệ chai tế bào một lớp nhiều

tầng (cell factory) thì một kỹ thuật nuôi cấy tế bào tiên tiến cũng cần được áp

dụng là nhân nuôi tế bào trên hệ thống tiểu giá thể (microcarrier). Nhiều

nghiên cứu đã được tiến hành trên thế giới với mục đính nuôi cấy tế bào Vero

từ đó nhân nuôi các virút để sản xuất vắcxin trên các hệ thống tiểu giá thể

trong bình nuôi sinh học (bioreactor) [19], [47], [48], [59]. Hãng Pasteur

Merieux đã thành công trong việc ứng dụng công nghệ này trong sản xuất

vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero (Verorab) [29]. Các kết quả nghiên cứu

nhân nuôi tế bào Vero cũng như virút trên chai nuôi cấy một lớp sẽ là tiền đề

để có thể tiếp tục phát triển công nghệ trên hệ thống nuôi cấy có hiệu suất cao

hơn trong tương lai.

Hỗn dịch virút thu được từ các mẻ gặt đơn sẽ được tinh sạch nhằm loại

2.4. QUY TRÌNH TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT bỏ các mảnh vỡ của xác tế bào và giữ lại các hạt virút nguyên vẹn. Phương pháp được sử dụng trong tinh sạch hỗn dịch tế bào là ly tâm và lọc qua màng.

Ly tâm với tốc độ thấp là phương pháp thường được các nhà sản xuất

vắcxin áp dụng. Ly tâm chỉ giúp loại trừ các mảnh vỡ tế bào có kích thước

lớn. Đối với các mảnh vỡ có kích thước nhỏ trên dưới 1 m, cần được loại bỏ

bằng các hệ thống lọc sử dụng màng siêu lọc. Do có kích thước khá lớn trong

các loại virút, nên việc lựa chọn loại màng lọc có kích thước lỗ lọc phù hợp

cần được tiến hành khi nghiên cứu tinh sạch hỗn dịch virút dại. Kết quả về

hiệu giá virút sau khi sử dụng các loại màng lọc có kích thước lỗ lọc khác

nhau được trình bày trong Bảng 2.6.

Bảng 2.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút bằng các loại màng lọc

khác nhau

Kích thƣớc lỗ lọc

1,2 µm

0,45 µm

0,22 µm

Hiệu giá virút trƣớc khi lọc

7,86 EL.U/ml

Hiệu giá virút sau khi lọc

7,20 EL.U/ml 7,06 EL.U/ml 3,25 EL.U/ml

Hiệu suất lọc

91,6% 89,8% 41,3%

Kết quả Bảng 2.6 cho thấy, màng lọc 0,22 µm không cho phần lớn

virút dại đi qua nên hiệu suất thu hồi rất thấp. Màng lọc 0,45 µm có hiệu suất

lọc tương đương với loại màng lọc có kích thước lớn hơn 1,2 µm. Do vậy,

màng lọc 0,45 µm là loại màng lọc sẽ được lựa chọn trong tinh sạch hỗn dịch

virút cũng như lọc các sản phẩm khác trong quá trình sản xuất vắcxin sau này.

Màng lọc này vừa lọc được virút dại với hiệu suất cao vừa giúp loại trừ được

các mảnh vỡ tạp hay các hạt virút kết dính có kích thước trên 1 µm.

2.5. QUY TRÌNH BẤT HOẠT VIRÚT

Bất hoạt là một bước quan trọng trong quy trình sản xuất vắc xin dại,

quyết định đến tính an toàn của sản phẩm vắc xin khi sử dụng cho người.

Nhiều phương pháp bất hoạt khác nhau được sử dụng trong quy trình sản xuất

vắc dại như bất hoạt bằng hóa chất (-propiolactone, phenol, formol..) hay bất

hoạt bằng tia cực tím [36], [40], [57]. Nghiên cứu này sẽ đề cập đến các

phương pháp bất hoạt virút bằng hóa chất theo hai cách thức khác nhau là bất

hoạt bằng -propiolactone đơn thuần và bất hoạt bằng -propiolactone kết

hợp với phenol. Phương pháp bất hoạt bằng -propiolactone kết hợp với

phenol đã từng được áp dụng trong quy trình sản xuất vắc xin dại trên não

chuột ổ theo công nghệ của Fuenzalida-Palacios. Để đánh giá hiệu quả của

quá trình bất hoạt, tiến hành thử nghiệm kiểm tra an toàn đặc hiệu trên chuột

(xem Phần 4.1.4 - Kiểm tra an toàn đặc hiệu), thử nghiệm xác định hiệu giá

virút đối với các sản phẩm trước và sau bất hoạt, kiểm tra hình ảnh virút dưới

kính hiển vi điện tử .

Bảng 2.7. Kết quả bất hoạt virút dại bằng các phƣơng pháp bất hoạt

khác nhau

Thông số theo dõi

-propiolactone đơn thuần

-propiolactone kết hợp với phenol

Trƣớc bất hoạt

7,97 EL.U/ml

Hiệu giá virút

Sau bất hoạt

7,78 EL.U/ ml 4,21 EL.U/ml

Kiểm tra an toàn đặc hiệu

Đạt yêu cầu Không đạt yêu cầu

Hình ảnh hiển vi điện tử

Theo Bảng 2.7, hỗn dịch virút bất hoạt bằng -propiolactone kết hợp

với phenol không bất hoạt hoàn toàn được virút dại. Hạt virút bị kết dích sau

khi tiếp xúc với phenol do đó làm cho hiệu giá virút xác định theo phương

pháp ELISA giảm đồng thời kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu trên chuột

không đạt yêu cầu. Với kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu trên chuột đạt yêu

cầu, hiệu giá virút ổn định và hình ảnh nguyên vẹn của hạt virút sau khi bất

hoạt đã cho thấy -propiolactone là hóa chất có hiệu quả bất hoạt virút dại.

Quy trình bất hoạt này sẽ được áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất vắc xin

dại trên nuôi cấy tế bào. Bên cạnh phương pháp đánh giá an toàn đặc hiệu

trên chuột cần có các nghiên cứu về tính bất hoạt virút theo phương pháp

nhân nuôi trên tế bào. Phương pháp này sẽ cho độ nhạy cao hơn, đơn giản và

tiết kiệm, giúp nhà sản xuất chắc chắn hơn về kết quả tính chất bất hoạt của

sản phẩm [28], [54].

2.6. QUY TRÌNH CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT

Trước khi tinh chế, virút cần đạt được một mức độ hiệu giá càng cao

càng tốt. Điều này có ý nghĩa quyết định đến hiệu suất của quá trình tinh chế

virút sau này. Quá trình cô đặc hỗn dịch virút được tiến hành trên hệ thống

Pellicon cassette sử dụng các màng siêu lọc. Một trong những yếu tố cần

được nghiên cứu trong quy trình cô đặc là tỷ lệ cô đặc hỗn dịch virút. Tỷ lệ

này sẽ thay đổi từ 10 lần đến 50 lần so với hỗn dịch virút ban đầu. Các thông

số về hiệu giá virút và hình ảnh virút sau cô đặc sẽ được đề cập đến trong

nghiên cứu.

Bảng 2.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút dại theo các tỷ lệ khác nhau

Thông số theo dõi

10 lần

20 lần

50 lần

Trƣớc cô đặc

3,23 EL.U/ml

Hiệu giá virút

Sau cô đặc

23,63 EL.U/ml 42,16 EL.U/ml 114,84 EL.U/ml

Hình ảnh hiển vi điện tử

Theo kết quả trong Bảng 2.8, ở tỷ lệ cô đặc 10 lần, vi rút dại giữ nguyên

hình dạng và là những hạt vi rút rời rạc. Tuy nhiên, ở tỷ lệ này hiệu giá vi rút

không đạt được mức độ yêu cầu cho quá trình tinh chế vi rút. Đến tỷ lệ cô đặc

20 lần vi rút bắt đầu bị tổn thương và xuất hiện hiện tượng kết dính. Ở tỷ lệ cô

đặc cao nhất, 50 lần, vi rút dại thay đổi về hình dạng và kết dính rất nhiều với

nhau. Như vậy, cô đặc trong khoảng tỷ lệ từ 20-40 lần là phù hợp nhất cho kết

quả tối ưu về hiệu giá vi rút cũng như tính toàn vẹn của hạt vi rút. Kết quả này

cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu về cô đặc vi rút dại cho sản xuất vắc xin

của các tác giả trong và ngoài nước [2], [30]. Sản phẩm của quá trình cô đặc

đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sản xuất tiếp theo - tinh chế vi rút.

2.7. QUY TRÌNH TINH CHẾ VIRÚT

Tinh chế kháng nguyên virút dại là một bước quan trọng trong quá

trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero. Vero là một dòng tế bào

thường trực do vậy bên cạnh những lợi thế như virút dại thường phát triển tốt

cho hiệu suất nuôi cấy cao hơn, dễ dàng nâng cao quy mô sản xuất và giá

thành rẻ hơn so với sản xuất trên các dòng tế bào lưỡng bội và tế bào tiên phát

thì một yêu cầu cần đặt ra đối với các vắcxin sản xuất trên dòng tế bào này là

việc loại trừ các nguy cơ có liên quan đến mức độ tồn dư các thành phần

ADN tế bào và protein huyết thanh của động vật [23], [56]. Trong quy trình

sản xuất này, không sử dụng các môi trường có huyết thanh để nhân nuôi

virút nên thành phần protein tạp nhiễm chỉ là các protein của tế bào hoặc các

axít amin có trong môi trường nuôi cấy, do vậy việc kiểm soát mức độ tồn dư

của ADN tế bào cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng của các sản phẩm

sau quá trình tinh chế cũng như chất lượng của vắcxin thành phẩm. Các

phương pháp đánh giá mức độ tinh khiết của các sản phẩm sau tinh chế về

mặt protein là các kỹ thuật thông thường như đo độ mật độ quang (OD) ở

bước sóng 280 nm và điện di trên gel SDS-PAGE [5], [18], [20], [24]. Để

đánh giá mức độ tinh khiết về mặt ADN, tiến hành phát hiện ADN tế bào tồn

dư bằng phương pháp lai ADN [24], [26], [50], [60].

2.7.1. Thử nghiệm phát hiện ADN tế bào Vero tồn dƣ trong các sản

phẩm của quy trình tinh chế vắcxin dại bằng phƣơng pháp lai điểm

2.7.1.1. Nguyên lý

- ADN tế bào Vero tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin

được phát hiện bằng cách tách chiết và lai với ADN dò đã đánh dấu bằng hóa

chất phát quang. Các điểm lai ADN sẽ được hiển thị trên phim X-quang. Hàm

lượng ADN tồn dư sẽ được xác định bằng cách so sánh về mặt hình ảnh giữa

ADN mẫu thử và ADN thang chuẩn.

2.7.1.2. Tiến hành

Bƣớc 1: Tách chiết ADN của tế bào Vero để tạo thang ADN chuẩn

- Chuẩn bị hỗn dịch tế bào Vero

+ Dùng Trysin tách tế bào từ chai nuôi cấy để tạo hỗn dịch tế bào Vero.

+ Ly tâm hỗn dịch tế bào Vero. Loại nước nổi. Thu cặn tế bào và rửa cặn

bằng dung dịch TBS.

+ Tiếp tục ly tâm thu cặn tế bào và hòa cặn trong dung dịch PBS.

- Tách chiết ADN của tế bào Vero

+ Tiến hành tách chiết ADN tế bào Vero bằng các bộ sinh phẩm tách chiết

ADN.

+ Thu mẫu và bảo quản ở -200C

- Cắt đoạn ADN của tế bào Vero

+ Sử dụng các enzyme giới hạn Pst 1, EcoR 1 để cắt đoạn ADN tế bào

Vero.

- Tinh sạch ADN của tế bào Vero

+ Tiến hành tinh sạch ADN của tế bào Vero bằng các bộ sinh phẩm tinh

sạch ADN

+ Thu mẫu và bảo quản ở -200C

- Đo hàm lượng ADN sau tinh sạch

+ Đo hàm lượng ADN bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 260 nm

+ Pha loãng ADN theo các hàm lượng khác nhau (10ng, 1ng, 100 pg, 10

pg và 1 pg) để tạo thành thang ADN chuẩn.

Bƣớc 2: Chế tạo ADN dò

Nguyên liệu và hóa chất

- ADN của tế bào Vero đã được tinh sạch

- Bộ sinh phẩm NEBlot Phototope Kit

- Dung dịch EDTA 0.2M pH 8.0

- Dung dịch NaCl 3M

- Glycogen solution

- Ethanol

- Dung dịch TE/0.1% SDS

Tiến hành

- Pha loãng ADN của tế bào Vero để đạt được nồng độ theo yêu cầu

- Làm biến tính ADN và tiến hành phản ứng gắn biotin theo hướng dẫn của

bộ sinh phẩm NEBlot Phototope Kit.

- Ủ mẫu ở nhiệt độ 370C và bổ sung thêm các dung dịch EDTA 0.2M pH

8.0, NaCl 3M, Glycogen và Ethanol.

- Tiếp ủ mẫu ở nhiệt độ -700C, sau đó ly tâm và rửa mẫu bằng Ethanol 70%.

- Ly tâm loại bỏ nước nổi và để khô mẫu. Sau đó bổ sung dung dịch TE/0,1% SDS và bảo quản ở -200C.

Bƣớc 3: Tách chiết ADN từ các sản phẩm của quy trình sản xuất vắcxin

Nguyên liệu và hóa chất

- Mẫu thử: các sản phẩm của quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế

bào Vero

- Dung dịch SDS 10%

- Dung dịch Proteinase-K 20mg/ml

- Dung dịch Phenol:chloroform

- Dung dịch sodium acetate 3M

- Ethanol

- Đệm TE

- Tuýp đựng mẫu

- Máy trộn

- Máy ủ nhiệt

Tiến hành

- Chia mẫu thử vào các tuýp, mỗi tuýp chứa 0,5 ml mẫu.

- Thêm vào mỗi tuýp dung dịch SDS 10% và Proteinase-K 20mg/ml

- Ủ trong bể ủ ở nhiệt độ 450C.

- Thêm dung dịch Phenol:chloroform, trộn đều. Sau đó ly tâm hút lấy phần

dung dịch nổi.

- Thêm dung dịch sodium acetate 3M, trộn đều. Thêm dung dịch ethanol bão hòa. Trộn đều và ủ ở -200C.

- Ly tâm loại nước nổi, sau đó tiếp tục rửa cặn bằng dung dịch ethanol 70%.

- Ly tâm loại nước nổi, để khô. Hòa lại cặn trong dung dịch đệm TE và bảo quản mẫu ở -200C.

Bƣớc 4: Lai ADN dò với ADN của mẫu thử và mẫu chuẩn

Hóa chất

- Dung dịch SSC 20x

- Dung dịch Denhardt 100x

- Dung dịch tiền lai

- Dung dịch lai

- Dung dịch rửa

- Hệ thống tạo điểm Bio-dot

- Màng nitrocellulose

- Máy chiếu UV

Tiến hành

Nhỏ mẫu ADN lên màng lai:

- Lắp màng lai vào hệ thống tạo điểm Bio-dot

- Làm biến tính và nhỏ ADN mẫu chuẩn và mẫu thử lên màng lai.

- Lắp và bật máy hút chân không để chạy hệ thống tạo điểm Bio-dot cho đến

khi mẫu ADN tạo thành điểm khô bám trên màng lai.

- Tháo màng lai và cố định ADN bằng tia UV.

Lai ADN dò với ADN mẫu:

- Ngâm màng trong dung dịch tiền lai và ủ ở nhiệt độ 42oC trong 4 giờ.

- Đổi dung dịch ngâm màng từ dung dịch tiền lại sang dung dịch lai đã được pha với ADN dò. Tiếp tục ủ màng ở 42oC qua đêm.

Rửa màng lai:

- Hút bỏ dung dịch lai.

- Rửa màng lai nhiều lần bằng dung dịch SSC có chứa 0.1% SDS

Bƣớc 5: Phát hiện ADN lai

Hóa chất và dụng cụ

- Bộ sinh phẩm phát hiện biotin - Phototope-Star Detection Kit

- Phim hiện mẫu

- Máy rửa phim X-quang

Tiến hành

- Màng lai được xử lý theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm phát hiện biotin -

Phototope-Star Detection Kit.

- Ép màng lai vào phim hiện mẫu.

- Rửa phim.

2.7.1.3. Kết quả

Tính kết quả

- Dựa vào độ phát quang của mẫu thử so với mẫu ADN chuẩn để tính hàm

lượng ADN tồn dư trong các mẫu thử.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Hàm lượng ADN tồn dư của tế bào có trong vắcxin thành phẩm phải dưới

10ng cho một liều tiêm.

2.7.2. Các phƣơng pháp tinh chế virút dại

Trong quy trình sản xuất vắc xin dại trên nuôi cấy tế bào Vero, các

phương pháp tinh chế vi rút dại được sử dụng bao gồm siêu ly tâm và sắc ký.

Các phương pháp này có thể tiến hành đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau. Từ

phương pháp siêu ly tâm phân vùng (zonal centrifuge) [5], [20], siêu ly tâm

liên tục (continuous-flow centrifuge) [24], [26], siêu ly tâm phân vùng trên hệ

thống ly tâm bằng rotor góc cố định [1] đến các phương pháp sắc ký bằng cột

DEAE-Cellulose [18] và cuối cùng là kết hợp cả siêu ly tâm và sắc ký [23] đã

cho thấy mức độ đa dạng của các phương pháp được ứng dụng trong quy trình

tinh chế vi rút dại để sản xuất vắc xin. Nghiên cứu này đề cập đến các phương

pháp tinh chế vi rút dại bằng siêu ly tâm. Phương pháp này tận dụng được các

các lợi thế sẵn có của cơ sở sản xuất về hệ thống máy siêu ly tâm và các kinh

nghiệm đã áp dụng thành công trong sản xuất các vắcxin virút khác như

vắcxin viêm gan B và vắcxin viêm não Nhật Bản B. Đồng thời, đây cũng là

một phương pháp tinh chế tương đối rẻ tiền hy vọng sẽ làm giảm giá thành

của sản phẩm vắcxin trong tương lai.

Các phương pháp siêu ly tâm tinh chế vi rút dại được nghiên cứu bao

gồm siêu ly tâm phân vùng trong gradient đường sucrose trên hệ thống rotor

zonal hoặc rotor góc cố định. Phân đoạn có chứa kháng nguyên vi rút được

xác định bằng thử nghiệm ELISA phát hiện glycoprotein của vi rút dại. Độ

tinh khiết của bán thành phẩm sau tinh chế được đánh giá bằng thử nghiệm

điện di trên gel SDS-PAGE, đo hàm lượng protein ở bước sóng 280 nm và

xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư bằng phương pháp lai điểm.

Phân đoạn sau siêu ly tâm

Hình 2.5. Kết quả siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal tinh chế virút dại

G

N

Sau tinh chế

Thang chuẩn

Trước bất hoạt

Trước tinh chế

Sau bất hoạt

Hình 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm sau khi tinh chế vi rút dại theo phƣơng pháp siêu ly tâm phân vùng bằng rotor zonal

OD

Phân đoạn sau siêu ly tâm

Hình 2.7. Hình ảnh siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định tinh

chế virút dại

G

N

3

5

7

4

6

8

9 10 Cặn

Phân đoạn sau siêu ly tâm

Hình 2.8. Hình ảnh điện di các phân đoạn sau khi tinh chế vi rút dại theo

phƣơng pháp siêu ly tâm phân vùng bằng rotor góc cố định

Theo Hình 2.5, sau khi siêu ly tâm bằng rotor zonal, một đỉnh hiệu giá

vi rút cao tạo được ở các phân đoạn đường từ 29 đến 41. Các phân đoạn này

có lượng protein tạp thấp và hình ảnh chạy điện di trên gel SDS-PAGE (Hình

2.6) cho thấy mức độ tinh sạch của kháng nguyên vi rút thu được. Tuy nhiên,

độ tập trung của phân đoạn vi rút tinh khiết không cao biểu hiện bằng hình

ảnh đỉnh hiệu giá vi rút không phân tách rõ ràng, có nhiều đỉnh hiệu giá vi rút

cao thấp khác nhau trong các phân đoạn đường và kết quả kiểm tra công hiệu

trên chuột của sản phẩm sau tinh chế đạt thấp chỉ vào khoảng 10-20 IU/ml.

Ngược lại, khi siêu ly tâm bằng rotor góc cố định, đỉnh hiệu giá vi rút rất tập

trung chủ yếu ở các phân đoạn số 8-10 (Hình 2.7). Các phân đoạn này cũng

cho hình ảnh vi rút tinh khiết khi điện di trên gel SDS-PAGE (Hình 2.8). Kết

quả kiểm tra công hiệu trên chuột của các phân đoạn này đạt được tới trên

dưới 50 IU/ml. Như vậy, phương pháp siêu ly tâm trong gradient đường

sucrose bằng rotor góc cố định đã cho kết quả tinh khiết vi rút dại cao đạt yêu

cầu để pha chế thành bán thành phẩm vắc xin dại.

Bên cạnh việc đánh giá về mức độ tinh khiết protein của các sản phẩm

sau tinh chế, một tiêu chuẩn khác cũng cần được đánh giá đối với các sản

phẩn này là hàm lượng ADN tồn dư. Vào năm 1987, TCYTTG thiết lập tiêu

chuẩn về hàm lượng ADN là ít hơn hoặc bằng 100 pg/liều đối với các sản

phẩm sử dụng cho tiêm truyền. Vào năm 1998, tiêu chuẩn này được thay đổi

là ít hơn hoặc bằng 10 ng/ liều đối với các sản phẩm tiêm truyền dựa trên các

đánh giá sâu hơn được thực hiện trong một thời gian theo dõi kéo dài. Không

có giới hạn áp dụng cho các sản phẩm được sản xuất từ các hệ thống vi sinh

vật, tế bào lưỡng bội và tế bào tiên phát và cả đối với các sản phẩm sản xuất

trên dòng tế bào thường trực nhưng sử dụng theo đường uống [53], [54]. Kết

quả của nghiên cứu này cho thấy, qua toàn bộ quá trình sản xuất vắc xin từ

tinh sạch, bất hoạt đến tinh chế, hàm lượng ADN tế bào tồn dư đã giảm đi rõ

ràng (Hình 2.9).

10 ng

100 pg

1 ng

10 pg

1 pg

Thang chuẩn

Mẫu trong các giai đoạn của quá trình sản xuất vắcxin

Mẫu mẻ gặt đơn virút

Mẫu sau tinh chế virút

Hình 2.9. Phƣơng pháp lai điểm xác định hàm lƣợng ADN tế bào tồn dƣ trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắc xin dại

Hình 2.9 so sánh hàm lượng ADN tế bào tồn dư trong sản phẩm đầu

tiên của quá trình sản xuất vắc xin dại là mẫu của các mẻ gặt đơn và sản phẩm

sau quá trình tinh chế. Hàm lượng ADN tồn dư của mẫu mẻ gặt đơn vi rút

khoảng 2,5 ng/0,5 ml mẫu thử và của mẫu sau tinh chế là 100 pg/0,5 ml mẫu.

Nếu tính tương đương với một liều tiêm vắc xin thì hàm lượng ADN tồn dư

đã giảm từ 125 ng/liều xuống còn 50 pg/liều. Việc giảm thiểu lượng ADN tế

bào tồn dư xuống đến mức đạt yêu cầu cho 1 liều vắc xin tiêm đã cho thấy

hiệu quả loại trừ ADN tế bào của toàn bộ quá trình sản xuất vắc xin dại.

Nhiều tác giả cho rằng, ngay từ những bước đầu tiên của quá trình sản xuất

như bước tinh sạch vi rút bằng cách ly tâm và lọc đã giúp loại trừ một phần

đáng kể ADN [24], [26]. Đặc biệt khi sử dụng -propiolactone, bên cạnh tác

dụng làm bất hoạt vi rút còn làm giảm thiểu hoạt tính sinh học của ADN [33],

[38]. Cuối cùng, chính quá trình tinh chế vi rút đã làm loại trừ một cách đáng

kể lượng ADN tế bào tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắc

xin dại trên nuôi cấy tế bào Vero [24].

2.8. QUY TRÌNH PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG

Hỗn dịch virút sau tinh chế được pha với đệm đông khô có chứa chất

bảo quản (Thimerosal) và chất ổn định (Albumin huyết thanh người) để tạo

thành bán thành phẩm cuối cùng. Bán thành phẩm này phải đạt được yêu cầu

về chất lượng như vô trùng và hàm lượng glycoprotein của vi rút dại. Giống

với nhiều nhà sản xuất khác, xây dựng tiêu chuẩn về hàm lượng glycoprotein

cho pha chế bán thành phẩm cuối cùng của vắc xin dại là rất khó khăn. Hiện

chưa có chuẩn chung về hàm lượng glycoprotein của vi rút dại. Mỗi nhà sản

xuất, tùy thuộc vào quy trình cũng như chủng giống sản xuất, phát triển các

phương pháp định lượng glycoprotein phù hợp sử dụng cho kiểm định và xây

dựng công thức pha bán thành phẩm cuối cùng [17], [54]. Trong khi đó, kiểm

tra công hiệu, một thử nghiệm kiểm định bắt buộc đối với tất cả các dạng vắc

xin dại lại được tiến hành hoàn toàn trên động vật sống là chuột. Mô hình sinh

học này rất nhạy cảm và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quá trình thử

nghiệm [58]. Do vậy, nhóm nghiên cứu cần thêm thời gian để tìm hiểu về mối

tương quan giữa kết quả định lượng glycoprotein của vi rút dại bằng phương

pháp ELISA với kết quả kiểm tra công hiệu có được trên chuột từ đó tạo ra

một công thức pha chế bán thành phẩm vắc xin dựa hoàn toàn trên hàm lượng

glycoprotein của vi rút dại. Muốn có được công thức pha tối ưu này, cần tập

hợp được nhiều kết quả về công hiệu và ELISA của các loạt sản xuất cũng

như kiểm định vắc xin dại ổn định. Công thức pha bán thành phẩm cuối hiện

đang áp dụng chủ yếu dựa vào tỷ lệ pha chế của các mẻ sản xuất thử nghiệm

đã đạt yêu cầu về công hiệu. Do tiêu chuẩn về công hiệu của vắc xin dại

tương đối rộng (≥2,5 IU/ml), nên tỷ lệ pha chế luôn cần tạo ra một khoảng an

toàn đủ lớn để đảm bảo kết quả về công hiệu của vắc xin thành phẩm. Tuy

nhiên, điều này đã làm nảy sinh một vấn để mới đó là yêu cầu về chất gây sốt

đối với vắc xin dại trên nuôi cấy tế bào thành phẩm. Kết quả kiểm tra chất gây

sốt đối với toàn bộ các loạt vắc xin dại trên nuôi cấy tế bào đông khô

(VERAPVAX) có công hiệu cao đều không đạt yêu cầu (xem Phần 3.10 - Kết

quả kiểm tra chất lượng vắc xin thành phẩm tại cơ sở). Do đó, một nghiên

cứu đã được tiến hành nhằm tìm hiểu yếu tố gây sốt trong công thức pha bán

thành phẩm vắc xin với các thành phẩn và các tỷ lệ pha chế khác nhau (Bảng

2.9). Phương pháp kiểm tra chất gây sốt áp dụng trong nghiên cứu này được

trình bày trong Phần 4.1.3.

Bảng 2.9. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trong bán thành phẩm vắcxin dại

Theo dõi

Nhiệt độ tăng từng thỏ Tổng

Sản phẩm

Kết quả

Thỏ 1 Thỏ 2 Thỏ 3

nhiệt độ tăng

Tiêu chuẩn chấp thuận

<0,60C

<1,40C

Đạt yêu cầu

0,10C

0,70C 0,90C

1,70C

Không đạt yêu cầu

1/2

0,20C

0,40C 0,80C

1,40C

Không đạt yêu cầu

1/4

Tỷ lệ pha loãng bán thành phẩm tinh chế

0,20C

0,40C 0,10C

0,70C

Đạt yêu cầu

1/6

0,60C

0,80C 10C

2,40C

Không đạt yêu cầu

Thẩm tích bán thành phẩm tinh chế

0,40C 00C

0,60C

Đạt yêu cầu

Albumin huyết thanh ngƣời 0,20C

0,20C

00C

0,10C

0,30C

Đạt yêu cầu

Dung dịch đƣờng sucrose

0,20C

0,30C 0,10C

0,60C

Đạt yêu cầu

Đệm đông khô

Theo Bảng 2.9, các thành phần có trong đệm đông khô đều không gây

sốt trong khi đó bán thành phẩm sau tinh chế được thẩm tích hoàn toàn lại gây

sốt rất cao. Điều này cho thấy, chính kháng nguyên vi rút dại là thành phần

gây sốt. Yếu tố này sẽ tạo ra sự mâu thuẫn giữa yêu cầu về công hiệu và chất

gây sốt trong vắc xin dại. Nếu đạt được yêu cầu về công hiệu cao, rất có thể

lại không đạt được yêu cầu về chất gây sốt và ngược lại. Do vậy, cần tìm ra

một tỷ lệ pha bán thành phẩm thích hợp vừa đạt được yêu cầu về công hiệu

vừa đạt được yêu cầu về chất gây sốt. Điều này hiện khó khắc phục được đối

với vắc xin dạng đông khô do tỷ lệ pha loãng quá thấp sẽ làm công hiệu giảm

thấp xuống dưới mức yêu cầu. Hơn nữa, quá trình đông khô cũng làm giảm

bớt một phần công hiệu nên khi pha bán thành phẩm vắc xin đông khô sẽ cần

một lượng kháng nguyên vi rút nhiều hơn so với vắc xin để ở dạng lỏng. Một

trong những giải pháp để khắc phục khó khăn này là phát triển một dạng vắc

xin dạng lỏng đặc biệt là dạng có hấp phụ nhôm để làm giảm bớt thêm lượng

kháng nguyên vi rút cần thiết. Vắc xin dại dạng lỏng hấp phụ nhôm cũng đã

được nhiều nhà sản xuất trên thế giới phát triển và cho hiệu quả phòng bệnh

tốt. Tại Mỹ, vắc xin dại dạng lỏng hấp phụ nhôm sản xuất nguyên bào sợi

phổi khỉ bào thai (FRh1-2) đã được cấp phép sử dụng từ năm 1988 đến năm

2008 [12], [13]. Vắc xin này đã chứng minh được hiệu quả phòng bệnh cao và

an toàn cho người sử dụng [6], [9], [10]. Tại Trung Quốc, vắc xin dại dạng

lỏng hấp phụ nhôm cũng đã được phát triển trên tế bào thận chuột đất vàng

nguyên phát [7]. Kết quả sử dụng vắc xin rộng rãi trên người cũng cho thấy

hiệu quả bảo vệ rất cao [16]. Để lựa chọn được hàm lượng nhôm hấp phụ phù

hợp trong thành phẩm vắcxin dạng lỏng, bán thành phẩm sau tinh chế đã được

pha với đệm nhôm photphate để có các nồng độ nhôm trong thành phẩm

vắcxin là 300 g, 450 g trên 1 ml. Các mẫu vắcxin dại sau khi pha theo các

công thức có hàm lượng nhôm khác nhau đều cho mức độ hấp phụ hoàn toàn

kháng nguyên vi rút sau 6 giờ theo dõi. Do vậy, hàm lượng nhôm thấp nhất sẽ

được sử dụng để pha bán thành phẩm vắc xin dại dạng lỏng.

2.9. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM Bán thành phẩm cuối cùng sau khi pha được chia vào các lọ vắcxin.

Bán thành phẩm đông khô sẽ tiến hành đông khô theo chương trình trên máy

đông khô đồng thời đóng lọ nước hồi chỉnh để hồi chỉnh vắc xin đông khô sau

này. Vắc xin dạng lỏng được chia theo liều lượng 1ml/lọ.

Các loạt thành phẩm vắcxin được kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn

cơ sở tại Phòng kiểm tra chất lượng sản phẩm (QC), Công ty Vắcxin và sinh

phẩm số 1. Kết quả kiểm tra chất lượng các loạt vắcxin thành phẩm này được

trình bày trong Bảng 3.12 và Bảng 3.13. Mẫu vắcxin của các loạt sản xuất thử

nghiệm này cũng sẽ được đánh giá thêm về tính an toàn và đáp ứng miễn dịch

trên động vật thí nghiệm. Kết quả được trình bày cụ thể trong Chương 5 -

Đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắcxin trên động vật thí nghiệm. Các

mẫu vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở các dạng thành phẩm khác nhau

sẽ được sử dụng để xây dựng các quy trình kiểm tra chất lượng và tiêu chuẩn

cơ sở cho vắc xin dại trên nuôi cấy thành phẩm (xem Chương 4).

Công nghệ sản xuất vắcxin dại được nghiên cứu và phát triển tại

VABIOTECH là công nghệ sử dụng dòng tế bào Vero nhân nuôi chủng vi rút

PV trong môi trường không có huyết thanh. Các nghiên cứu đã được tiến

hành để tìm ra một quy trình công nghệ sản xuất ổn định về các thông số cho

ra đời các sản phẩm đảm bảo yêu cầu chất lượng. Quy trình sản xuất này sẽ

được áp dụng để sản xuất các loạt vắc xin thử nghiệm. Chính các sản phẩm

này sẽ là căn cứ để kiểm chứng mức độ ổn định và chất lượng của quy trình

sản xuất đã được xây dựng.

CHƢƠNG 3

SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY

TẾ BÀO VERO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Sau khi xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi

cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm, các loạt sản xuất thử nghiệm

được tiến hành để sản xuất ra vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào đạt yêu cầu kiểm

tra về chất lượng tại cơ sở cũng như của kiểm định Quốc gia. Đối với mỗi

công đoạn của quá trình sản xuất đều cần phải tiến hành ít nhất 3 loạt liên tiếp

để thẩm định về chất lượng và tính ổn định của quy trình. Đồng thời, trong

mỗi công đoạn đều được lấy mẫu sản phẩm để kiểm tra và đánh giá chất

lượng. Các kết quả của quy trình sản xuất thử nghiệm này sẽ là căn cứ để lựa

chọn quy trình sản xuất tối ưu cũng như áp dụng cho sản xuất với quy mô lớn

hơn trong tương lai.

3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ CHUẨN BỊ TẾ BÀO VERO

Tế bào Vero đời 137 từ ngân hàng tế bào Vero sản xuất WCB-VERO-

010705 được nhân nuôi và cấy chuyển đến đời 141 trên chai nuôi cấy tế bào

một lớp với môi trường phát triển phù hợp có chứa huyết thanh. Các chai nuôi

cấy tế bào được theo dõi hàng ngày bằng phương pháp cảm quan (màu và độ

trong của môi trường nuôi cấy) và kiểm tra dưới kính hiển vi soi tế bào. Sau

mỗi đời nuôi cấy, hỗn dịch tế bào thu được được đếm số lượng và xác định

nồng độ cấy chuyển sang các chai tế bào mới. Chai nuôi cấy tế bào đời 141

được kiểm tra chất lượng về các chỉ tiêu vô khuẩn, mycoplasma, các virút

ngoại lai và virút hấp phụ hồng cầu. Kết quả nuôi cấy tế bào Vero qua các

loạt sản xuất thử nghiệm được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả nhân nuôi cấy tế bào Vero của các loạt sản xuất

thử nghiệm

Chỉ số

Loạt 0109

Loạt 0209

Loạt 0309

1,2 x 107 tế bào 1,4 x 107 tế bào 1,3 x 107 tế bào

Đời 138

8,5x107 tế bào 9x107 tế bào 8,7 x107 tế bào

Đời 139

5,3x108 tế bào 5,5x108 tế bào 5,4 x108 tế bào

Đời 140

3,5x109 tế bào 3,7x109 tế bào 3,6x109 tế bào

Đời 141

Đạt yêu cầu về chất lƣợng

Theo kết quả trong Bảng 3.1, số lượng tế bào thu được qua các đời nuôi

cấy là tương đương nhau giữa các loạt sản xuất khác nhau. Kết quả kiểm tra

chất lượng tế bào đời 141 đều đạt yêu cầu và phù hợp để đưa vào sản xuất

vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero.

3.2. KẾT QUẢ GÂY NHIỄM VIRÚT DẠI VÀO TẾ BÀO VERO

Tế bào Vero đời cấy chuyển 141 được tách và gây nhiễm với chủng

virút dại PV loạt giống sản xuất WS-PV-010805. Liều gây nhiễm virút là 0,01

MOI. Tế bào Vero sau khi hấp phụ virút được cấy chuyển vào chai nuôi cấy 3

tầng. Khoảng 5% lượng tế bào không gây nhiễm virút được nuôi cấy trong

các chai nuôi cấy một lớp. Các chai tế bào chứng này sẽ được tiến hành và

theo dõi song song cùng với các chai gây nhiễm trong suốt quá trình nhân

nuôi virút. Môi trường sử dụng trong công đoạn này vẫn là môi trường phát

triển tế bào có chứa huyết thanh.

Bảng 3.2. Kết quả gây nhiễm virút dại của các loạt sản xuất thử nghiệm

Chỉ số

Loạt 0109

Loạt 0209

Loạt 0309

Số chai tế bào gây nhiễm

180 chai

Số chai tế bào chứng

20 chai

Kết quả trong Bảng 3.2 cho thấy số lượng chai gây nhiễm và chai chứng

tế bào là tương đương nhau giữa các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin.

3.3. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRÚT VÀ THU HOẠCH NƢỚC NỔI

Sau 3 ngày gây nhiễm virút, tiến hành thay môi trường phát triển tế bào

có chứa huyết thanh bằng môi trường duy trì tế bào không có huyết thanh.

Sau đó cứ 3 ngày một lần, thu hoạch một mẻ gặt đơn virút và toàn bộ quá

trình nuôi cấy thu được 6 mẻ gặt đơn.

Tất cả các mẻ gặt đơn đều được kiểm tra vô trùng, xác định hiệu giá

virút bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Kết quả thu hoạch các mẻ

gặt đơn virút của các loạt sản xuất thử nghiệm được trình bày trong Bảng 3.3,

Bảng 3.4 và Bảng 3.5. Các loạt sản xuất đều cho thể tích nước nổi thu hoạch

và hiệu giá virút tương đương nhau. Hiệu giá virút của các loạt sản xuất thử

nghiệm này đều đạt yêu cầu cho các quá trình sản xuất tiếp theo.

Bảng 3. 3. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nƣớc nổi loạt 0109

Thông số theo dõi

Mẻ gặt đơn Chứng tế bào

Hình ảnh tế bào

Hiệu giá virút

Thể tích thu hoạch

H0

36 lít

10-3,01 FFD50/0,05 ml

H1

36 lít

10-3,65 FFD50/0,05 ml

H2

36 lít

10-3,76 FFD50/0,05 ml

H3

36 lít

10-4,21 FFD50/0,05 ml

H4

36 lít

10-3,18 FFD50/0,05 ml

H5

36 lít

10-2,35 FFD50/0,05 ml

H6

Bảng 3.4. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nƣớc nổi loạt 0209

Thông số theo dõi

Mẻ gặt đơn Chứng tế bào

Hình ảnh tế bào

Hiệu giá virút

Thể tích thu hoạch

H0

36 lít

10-3,21 FFD50/0,05 ml

H1

36 lít

10-3,64 FFD50/0,05 ml

H2

36 lít

10-4,25 FFD50/0,05 ml

H3

36 lít

10-3,87 FFD50/0,05 ml

H4

36 lít

10-3,31 FFD50/0,05 ml

H5

36 lít

10-2,12 FFD50/0,05 ml

H6

Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy virút dại và thu hoạch nƣớc nổi loạt 0309

Thông số theo dõi

Mẻ gặt đơn Chứng tế bào

Hình ảnh tế bào

Hiệu giá virút

Thể tích thu hoạch

H0

36 lít

10-3,05 FFD50/0,05 ml

H1

36 lít

10-3,42 FFD50/0,05 ml

H2

36 lít

10-4,24 FFD50/0,05 ml

H3

36 lít

10-3,89 FFD50/0,05 ml

H4

36 lít

10-3,18 FFD50/0,05 ml

H5

36 lít

10-2,17 FFD50/0,05 ml

H6

3.4. KẾT QUẢ TINH SẠCH HỖN DỊCH VIRÚT

Các mẻ gặt đơn sau khi thu hoạch sẽ được hộn lại, ly tâm và lọc qua

màng để loại trừ các mảnh xác tế bào và các hạt virút kết dính có kích thước

lớn. Hỗn dịch virút tinh sạch được xác định hiệu giá bằng phương pháp

ELISA. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

được trình bày trong Bảng 3.6. Các loạt sản xuất thử nghiệm có tính ổn định

về thể tích thu hoạch và tổng hiệu giá virút thu được.

Bảng 3.6. Kết quả tinh sạch hỗn dịch virút của các loạt sản xuất

thử nghiệm

Chỉ số

Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0409 Loạt 0509 Loạt 0609

95 lít

104 lít

92 lít

94 lít

105 lít

106 lít

Thể tích thu đƣợc

3,35 EL.U/ml

3,20 EL.U/ml

4,29 EL.U/ml

4,14 EL.U/ml

3,37 EL.U/ml

3,56 EL.U/ml

Hiệu giá virút

3.5. KẾT QUẢ BẤT HOẠT VIRÚT

Hỗn dịch virút sau khi tinh sạch được bất hoạt bằng -propiolactone.

Để thẩm định qui trình bất hoạt virút, tiến hành thử nghiệm xác định tính an

toàn đặc hiệu trên chuột. Hiệu giá virút sau bất hoạt được xác định bằng

phương pháp ELISA. Kết quả bất hoạt virút các loạt sản xuất vắcxin thử

nghiệm được trình bày trong Bảng 3.7. Hiệu giá virút sau bất hoạt tương tự

nhau ở tất cả các loạt sản xuất thử nghiệm và gần tương đương với giá trị hiệu

100

giá của hỗn dịch virút tinh sạch.

Bảng 3.7. Kết quả bất hoạt virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

Chỉ số

Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0409 Loạt 0509 Loạt 0609

9,9 lít

9 lít

9,9 lít

Thể tích thu đƣợc 9 lít

Hiệu giá virút

3,55 EL.U/ml

3,82 EL.U/ml

3,66 EL.U/ml

3,74 EL.U/ml

3,08 EL.U/ml

3,22 EL.U/ml

Đạt yêu cầu

Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu

3.6. KẾT QUẢ CÔ ĐẶC HỖN DỊCH VIRÚT

Hỗn dịch virút sau bất hoạt được tiến hành cô đặc bằng màng siêu lọc

trên hệ thống pellicon cattsete. Kết quả về hiệu giá virút xác định bằng

phương pháp ELISA và thể tích hỗn dịch thu được sau cô đặc được trình bày

trong Bảng 3.5. Hiệu giá virút của tất cả các loạt sản xuất đều đạt yêu cầu cho

bước tinh chế virút tiếp theo.

Bảng 3.8. Kết quả cô đặc hỗn dịch virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

Chỉ số

Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0409 Loạt 0509 Loạt 0609

2 lít

2,3 lít

2 lít

2,2 lít

Thể tích thu đƣợc

6,54 EL.U/ml

6,60 EL.U/ml

9,36 EL.U/ml

10,47 EL.U/ml

7,84 EL.U/ml

8,67 EL.U/ml

Hiệu giá virút

3.7. KẾT QUẢ TINH CHẾ VIRÚT

Hỗn dịch virút sau cô đặc được tinh chế theo phương pháp siêu ly tâm

phân vùng bằng rotor góc cố định. Hỗn dịch virút sau tinh khiết được xác

101

định hiệu giá bằng thử nghiệm ELISA. Các đặc tính về vô khuẩn và an toàn

đặc hiệu của bán thành phẩm này cũng sẽ được đánh giá. Độ tinh khiết về

protein của sản phẩm được đánh giá bằng thử nghiệm điện di trên gel SDS-

PAGE và độ tinh khiết về ADN tế bào Vero tồn dư được đánh giá bằng thử

nghiệm lai ADN. Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

được trình bày trong Bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả tinh chế virút của các loạt sản xuất thử nghiệm

Chỉ số

Loạt 0109

Loạt 0209

Loạt 0309

750 ml

Thể tích thu đƣợc

Đạt yêu cầu

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu

An toàn đặc hiệu

14,59 EL.U/ml

15,70 EL.U/ml

16,56 EL.U/ml

Hiệu giá virút

≤ 100 pg/ml

Hàm lƣợng ADN tế bào tồn dƣ

Hình 3.1. Xác định hàm lƣợng ADN tế bào tồn dƣ trong các sản phẩm

102

của loạt sản xuất vắcxin dại 0209

bán thành phẩm sau tinh chế PUR-0109

Hình 3.2. Xác định hàm lƣợng ADN tế bào tồn dƣ trong các sản phẩm

của loạt sản xuất vắcxin dại 0109 và 0309

Mẫu trước tinh chế virút

Thang chuẩn

Mẫu sau tinh chế virút

Hình 3.3. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS PAGE các sản phẩm của

103

loạt sản xuất vắcxin dại 0109

Mẫu trước tinh chế virút

Mẫu sau tinh chế virút

Thang chuẩn

Hình 3.4. Hình ảnh chạy điện di trên gel SDS PAGE các sản phẩm của

loạt sản xuất vắcxin dại 0209 và 0309

Kết quả tinh chế các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy

tế bào Vero trình bày trong Bảng 3.9, Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3 và Hình

3.4 cho thấy mức độ ổn định về hiệu giá vi rút, độ tinh khiết của protein và

ADN tế bào tồn dư. Hàm lượng ADN tế bào tồn dư đều vào khoảng 50 pg/0,5

ml mẫu sau tinh sạch. Mẫu này sẽ tiếp tục được pha loãng với các dung dịch

đệm để tạo thành bán thành phẩm cuối cùng, do vậy lượng ADN cho 1 liều

tiêm sẽ <50 pg. Hàm lượng này đạt yêu cầu của TCYTTG cho các sản phẩm

tiêm dùng cho người (10 ng/liều tiêm).

3.8. KẾT QUẢ PHA BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG

Bán thành phẩm cuối cùng được pha cho 2 dạng vắcxin khác nhau

đông khô và hấp phụ nhôm. Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các

104

loạt sản xuất thử nghiệm được trình bày trong Bảng 3.10.

Bảng 3.10. Kết quả pha bán thành phẩm cuối cùng của các loạt sản xuất

thử nghiệm

Vắcxin dạng đông khô

Vắcxin dạng lỏng hấp phụ nhôm

Chỉ số

Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0110 Loạt 0210

Loạt 0310

1100 ml

820 ml

810 ml

2000 ml

1980 ml

Thể tích thu đƣợc

Hiệu giá virút

5,31 EL.U/ml

5,65 EL.U/ml

5,19 EL.U/ml

3.9. KẾT QUẢ SẢN XUẤT VẮCXIN THÀNH PHẨM

Bán thành phẩm đông khô được chia vào các lọ và đông khô. Mỗi lọ

đông khô chứa một liều đơn 0,5 ml sau khi hồi chỉnh. Bán thành phẩm dạng

lỏng được chia thành các lọ mỗi lọ chứa một liều đơn 1ml. Kết quả sản xuất

vắc xin thành phẩm của các loạt sản xuất thử nghiệm được trình bày trong

Bảng 3.11.

Bảng 3.11. Kết quả sản xuất vắcxin thành phẩm của các loạt sản xuất

thử nghiệm

Vắcxin dạng đông khô (VERAPVAX)

Vắcxin dạng lỏng hấp phụ nhôm (VERALVAX)

Chỉ số

Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309 Loạt 0110 Loạt 0210 Loạt 0310

1525 lọ

1505 lọ

1775 lọ

1768 lọ

1770 lọ

Số lọ vắcxin 2120 lọ

3.10. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VẮC XIN THÀNH PHẨM

TẠI CƠ SỞ

Các loạt thành phẩm vắcxin được kiểm tra chất lượng theo tiêu chuẩn

cơ sở tại Phòng kiểm tra chất lượng sản phẩm (QC), Công ty Vắcxin và sinh

phẩm số 1. Kết quả kiểm tra chất lượng các loạt vắcxin thành phẩm này được

105

trình bày trong Bảng 3.12 và Bảng 3.13.

Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra chất lƣợng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX)

Tên thử nghiệm

Tiêu chuẩn cơ sở

Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309

Nhận dạng

Virút dại

Tính chất vật lý

Đạt yêu cầu

Viên xốp màu trắng, khi hoà tan bằng nước hồi chỉnh tạo thành dung dịch trong suốt, không vón cục hoặc không có chất lạ khó tan.

Đạt yêu cầu

V« khuÈn

Không thấy nấm và vi khuẩn mọc sau 14 ngày theo dõi.

Protein toàn phần

≤ 20 mg/ml

7,21

6,03

6,85

7,34

7,32

7,0 - 8,0

0,0086

0,0065

0,0077

Hàm lượng Thimerosal (%)

≤ 0,012

5,13

2,62

4,30

Công hiệu (IU/0,5 ml)

≥ 2,5

An toàn chung trên chuột lang

Đạt yêu cầu

Chuột không chết, khỏe mạnh, tăng trọng bình thường

An toàn chung trên chuột nhắt

An toàn đặc hiệu

Đạt yêu cầu

Chuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh (liệt,chết), tăng trọng bình thường

Chất gây sốt

2,7 oC

1,8 oC

2,5 oC

Tổng To tăng của 3 thỏ ≤ 1,3oC Nhiệt độ tăng của từng thỏ <0,60C

Độ ẩm tồn dư

≤ 3%

0,26%

0,35%

0,28%

Theo Bảng 3.12, tất cả 3 loạt thành phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế

bào Vero dạng đông khô (VERAPVAX) đều không đạt được các tiêu chuẩn

cơ sở về chất gây sốt. Do vậy, các loạt vắcxin này không được gửi đi kiểm tra

106

chất lượng sản phẩm tại Viện Kiểm định quốc gia Vắcxin và Sinh phẩm y tế.

Nhóm nghiên cứu cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện sản phẩm vắcxin

dạng đông khô này.

Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra chất lƣợng vắcxin thành phẩm tại cơ sở của các loạt sản xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào dạng lỏng (VERALVAX)

Tên thử nghiệm

Tiêu chuẩn cơ sở

Loạt 0110

Loạt 0210 Loạt 0310

Vi rút dại

Virút dại

Nhận dạng

Tính chất vật lý

Đạt yêu cầu

Sau khi lắc, vắcxin có màu trắng hơi đục. Để lắng sau 1 giờ, vắcxin phải tách làm hai lớp, trong đó lớp nhôm phải tủa bông mịn, không vón cục.

Đạt yêu cầu

V« khuÈn

Không thấy nấm và vi khuẩn phát triển sau 14 ngày theo dõi.

6,0 - 7,5

7,50

7,49

7,48

0,0055

0,0053

Hàm lượng Thimerosal (%)

≤ 0,012

3,11

3,13

2,82

Công hiệu (IU/0,5 ml)

≥ 2,5

272,50

270,09

265,53

≤ 1250

Hàm lượng nhôm (g/ml)

An toàn chung trên chuột lang

Đạt yêu cầu

Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thường

An toàn chung trên chuột nhắt

Chất gây sốt

0,8 oC

0,7 oC

Tổng To tăng của 3 thỏ ≤ 1,3oC. Nhiệt độ tăng của từng thỏ <0,60C

Theo Bảng 3.13, cả 3 loạt thành phẩm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Vero dạng lỏng hấp phụ nhôm (VERALVAX) đều đạt được các tiêu chuẩn cơ

107

sở về chất lượng sản phẩm. Các mẫu loạt sản xuất này sẽ được tiếp tục gửi đi

kiểm tra chất lượng sản phẩm tại Viện Kiểm định quốc gia Vắcxin và Sinh

108

phẩm y tế.

CHƢƠNG 4

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG

VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮC XIN DẠI

TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

Tổ Chứ c Y Tế Thế Giớ i (TCYTTG) có các qui định riêng cho từng loại vắcxin về các tiêu chuẩn tối thiểu trong sản xuất và kiểm tra chất lươ ̣ng . Tuy nhiên do mỗi sản phẩm có một đặc điểm riêng trong quá trình sản xuất cũng

như trong thành phần của vắcxin thành phẩm, do vậy mỗi nhà sản xuất đều

phải xây dựng những yêu cầu và tiêu chuẩn riêng cho sản phẩm của mình dựa

vào các khuyến cáo chung c ó tính nguy ên tắc củ a TCYTTG [54]. Quy trình

kiểm tra chất lượng sản phẩm sẽ được tiến hành trong quá trình sản xuất và

cho thành phẩm cuối cùng. Theo khuyến cáo của TCYTTG thì viê ̣c kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào bao gồm các bước chính sau đây

(xem thêm phần 1.3.2 - Kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào):

- Kiểm tra nuôi cấy tế bào;

- Kiểm tra mẻ gặt virút đơn và bán thành phẩm tinh chế;

- Kiểm tra quá trình bất hoạt;

- Kiểm tra bán thành phẩm cuối cùng;

- Kiểm tra chất lượng vắcxin thành phẩm và;

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin thành phẩm.

Trong phần này, chủ yếu trình bày các phương pháp kiểm tra chất lượng

vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero thành phẩm (dạng đông khô và dạng lỏng

hấp phụ nhôm) và xây dựng bảng tiêu chuẩn cơ sở cho các vắcxin dại trên nuôi

109

cấy tế bào Vero. Các phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm dở dang và bán thành phẩm trong quá trình sản xuất đươ ̣c trình bày chi tiết tại Chương 2:

“Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

ở quy mô phòng thí nghiệm” và kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin thành phẩm sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm đươ ̣c trình bày tại Chương 3: “Sản

xuất thử nghiệm vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí

nghiệm”.

4.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA SINH HỌC

4.1.1. Phƣơng pháp kiểm tra vô khuẩn

4.1.1.1. Mục đích

- Kiểm tra vô khuẩn nhằm phát hiện sự nhiễm tạp khuẩn hoặc nấm bằng

phương pháp cấy trực tiếp.

4.1.1.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Tủ cấy vô trùng.

- Tủ ấm.

- Tủ mát.

- Pipet 2ml vô trùng.

- Pipet aid.

- Đèn cồn. - Cồn 700 .

- Bông vô trùng, panh.

Mẫu thử

- Bán thành phẩm, bán thành phẩm cuối cùng và vắcxin dại trên nuôi cấy

tế bào Vero thành phẩm:

+ Bán thành phẩm và bán thành phẩm cuối cùng: 10ml / 1 loạt

+ Vắcxin thành phẩm: 40 lọ

110

Môi trường

- Loại môi trường:

 Môi trường Thioglycolate.

 Môi trường Soybean (Soybean Casein Digest).

 Thể tích môi trường: 20ml/ ống.

- Số lượng ống môi trường:

 Bán thành phẩm và bán thành phẩm cuối cùng:

 Môi trường Thioglycolate: 05 ống/1 loạt mẫu thử.

 Môi trường Soybean: 05 ống/1 loạt mẫu thử.

 Vắcxin thành phẩm:

 Môi trường Thioglycolate: 30 ống/1 loạt mẫu thử.

 Môi trường Soybean: 10 ống/1 loạt mẫu thử.

4.1.1.3. Các bước tiến hành

Thể tích cấy

- Bán thành phẩm và Bán thành phẩm cuối cùng: 1ml mẫu thử/1 ống môi

trường.

- Vắcxin thành phẩm: Toàn bộ thể tích đóng trong lọ.

Các bước tiến hành

- Dùng pipet 2ml để lấy sinh phẩm từ trong mỗi chai (hoặc lọ), cấy trực

tiếp vào môi trường bằng cách đưa sâu đầu pipet tới đáy ống. Phối hợp

động tác bơm sinh phẩm và di chuyển pipet từ đáy ống môi trường lên

trên mặt ống môi trường theo một đường thẳng.

- Sau khi cấy khử trù ng miệng ống môi trường cẩn thận trên đèn cồn và

đậy kín bằng nút bông vô trù ng.

- Đối với vắcxin đông khô, phải hồi chỉnh bằng nước hồi chỉnh.

- Các thao tác cứ lặp đi lặp lại như vậy cho đến hết số chai (hoặc lọ) mẫu

thử.

111

Nhiệt độ nuôi cấy

- Sau khi các thao tác trong phòng vô trùng được tiến hành xong, các ống

môi trường sẽ được xếp vào 2 giá và giữ ở hai nhiệt độ khác nhau.

* BTP và BTP cuối cùng:

- Môi trường Thioglycolate:

- Môi trường Soybean: 32,5 ± 2,50C. 22,5 ± 2,50C.

* Vắcxin thành phẩm:

- Môi trường Thioglycolate:

2/3 số ống môi trường: 32,5 ± 2,50C. 1/3 số ống môi trường: 22,5 ± 2,50C.

- Môi trường Soybean: 22,5 ± 2,50C.

Thời gian nuôi cấy: 14 ngày

Theo dõi sau thử nghiệm

- Cả hai loại môi trường đều được theo dõi hàng ngày và ghi kết quả theo

dõi vào phiếu theo dõi thử nghiệm vô khuẩn vào các ngày 1, 3, 5, 7, 10

và 14.

4.1.1.4. Kết quả

Cách đọc kết quả

- Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: cả 2 loại môi trường đều

trong, không bị vẩn đục. Lớ p chỉ thi ̣ màu phía trên ống môi trường Thioglycolate không bị mất màu.

- Có sự phát triển của vi khuẩn và nấm: cả 2 loại môi trường đều bị vẩn

bị mất

đục. Lớ p chỉ thi ̣ màu phía trên ống môi trường Thioglycolate màu.

Giá trị của thử nghiệm

- Loạt môi trường sử dụng để kiểm tra vô khuẩn đạt yêu cầu về thử

nghiệm kiểm tra chất lượng môi trường khi kiểm tra bằng thử nghiê ̣m

112

“tăng sinh”.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày theo dõi.

Thử nghiệm nhắc lại

- Điều kiện nhắc lại

- Khi không đạt tiêu chuẩn. (mục 4.2 và 4.3).

- Nếu có ống môi trường nuôi cấy bị nhiễm khuẩn: phải tiến hành phân lập

và định danh vi sinh vật.

- Thử nghiệm nhắc lại lần 1

- Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường bằng lần thử đầu.

- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi đạt mục 4.2 và 4.3.

- Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong bất kỳ ống môi trường nuôi

cấy nào: phải phân lập và định danh vi sinh vật.

- So sánh kết quả với lần thử đầu: nếu không có sự khác biệt, sản phẩm

bị coi là không đạt vô khuẩn và phải hủy bỏ. Nếu có sự khác biệt, phải

tiến hành thử nghiệm nhắc lại lần 2.

- Thử nghiệm nhắc lại lần 2:

- Thực hiện với số lượng mẫu và ống môi trường gấp đôi lần thử đầu.

- Thử nghiệm đạt yêu cầu khi đạt mục 4.2 và 4.3.

- Nếu phát hiện dù chỉ 1 ống môi trường không kể bất kỳ loại vi khuẩn

tạp nhiễm, loạt sản phẩm đó được kết luận là không đạt yêu cầu về tiêu

chuẩn vô khuẩn, phải hủy bỏ.

4.1.2. Phƣơng pháp kiểm tra an toàn chung

4.1.2.1. Mục đích

- Áp dụng để kiểm tra an toàn chung cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Vero.

4.1.2.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

113

Dụng cụ

- Cân động vật.

- Máy trộn.

- Bơm tiêm nhựa loại 1 ml, 5 ml.

- Tube Falcon 50ml.

- Hộp đựng đá.

- Bông, cồn, găng tay, panh.

Vật liệu

- Vắcxin đóng 0,5 ml/lọ: 40 lọ

Động vật thí nghiệm

- Chuột lang

 Trọng lượng: 250 - 350 g.

 Số lượng: 2 chuột / 1 loạt mẫu thử.

- Chuột nhắt trắng

 Giống chuột Swiss.

 Trọng lượng: 17 - 22 g.

 Số lượng: 5 chuột / 1 loạt mẫu thử.

4.1.2.3. Các bước tiến hành

Chuẩn bị chuột trước khi tiêm

- Chuột trước khi tiêm phải được theo dõi cách ly 2 ngày (đối với chuột

nhắt) và 3 ngày (đối với chuột lang). Trong thời gian cách ly chuô ̣t phả

đươ ̣c theo dõi hàng ngày về tình trạng sức khoẻ, trọng lượng và ghi vào

sổ theo dõi.



- Chọn chuột



Chuột nhắt 17 - 22g: 5 chuột/1 mẫu thử.

Chuột lang 250 - 350g : 2 chuột/1 mẫu thử.

Tiêm chuột

114

- Chuột lang

 Liều tiêm:

 Đường tiêm:

5 liều tiêm/1chuột.

Phúc mạc.

 Liều tiêm:

- Chuột nhắt

 Đường tiêm:

1 liều tiêm/1chuột.

Phúc mạc.

Theo dõi chuột

- Thời gian theo dõi súc vật thí nghiệm là 7 ngày.

- Hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe và cân trọng lượng của từng

chuột.

4.1.2.4. Kết quả

Tính kết quả

- Tính % trọng lượng tăng của từng chuột

% tăng trọng = ( P7 / PO ) x 100%

Trong đó: trọng lượng ngày thứ 7. P7:

trọng lượng ngày tiêm. PO:

- Tính % trọng lượng tăng trung bình của từng nhóm chuột.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Không có chuột nào bị chết trong thời gian theo dõi.

- 100% sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý và tăng cân.

Thử nghiệm nhắc lại

- Điều kiện phải nhắc lại: thử nghiệm được nhắc lại khi không đạt tiêu

chuẩn chấp thuận (mục 4.2).

- Thử nghiệm nhắc lại lần 1: với số lượng mẫu và chuột như lần thử

nghiệm thứ nhất. Tiêu chuẩn chấp thuận (mục 4.2).

- Thử nghiệm nhắc lại lần 2: nếu thử nghiệm nhắc lại lần 1 không đạt yêu

cầu, tiến hành thử nghiệm nhắc lại lần 2 với số lượng chuột và mẫu gấp

115

đôi lần thử nghiệm thứ nhất. Tiêu chuẩn chấp thuận (mục 4.2).

- Nếu thử nghiệm nhắc lại lần 2 không đạt tiêu chuẩn chấp thuận (mục

4.2), loạt vắcxin đó bị huỷ bỏ vì không đạt yêu cầu về tiêu chuẩn an toàn

chung.

4.1.3. Phƣơng pháp kiểm tra chất gây sốt

4.1.3.1. Nguyên lý

- Chất gây sốt được xác định gián tiếp qua thí nghiệm đo thân nhiệt của

thỏ trước và sau khi tiêm mẫu thử nghiệm. Thử nghiệm này được xây

dựng dựa trên phương pháp kiểm tra chất gây sốt cho vắcxin dại có

trong Dược điển Châu Âu [15].

4.1.3.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Động vật thí nghiệm

- Thỏ trưởng thành cân nặng > 1,5 kg, khoẻ mạnh, không có dấu hiệu

bệnh lý.

- Sử dụng 03 thỏ/mẫu thử.

Mẫu thử và môi trường

- Văcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero: 10 lọ.

Dụng cụ và trang thiết bị

- Bơm tiêm nhựa 3ml (dùng 1 lần).

- Bông, cồn sát trùng.

- Giá cố định thỏ.

- Máy đo chất gây sốt.

- Cân động vật.

- Nồi cách thuỷ.

4.1.3.3. Các bước tiến hành

Chuẩn bị động vật thí nghiệm và mẫu thử

116

* Cách ly thỏ:

- Thỏ được nhốt cách ly 2 ngày trước khi thử nghiệm ở điều kiện nhiệt độ

200C - 250C, cho ăn uống đầy đủ.

* Chuẩn bị thỏ trước thử nghiệm:

- Thỏ được nhốt trong phòng cách ly: không cho ăn, uống nước trong

vòng 16 giờ trước thử nghiệm.

Chuẩn bị mẫu thử

- Đối với vắcxin đông khô, hoàn nguyên bằng nước hồi chỉnh.

- Pha loãng 1:10 các mẫu thử nghiệm: pha 0,5 ml vắcxin với 4,5 ml nước muối

sinh lý (vắcxin dạng đông khô) và pha 1 ml vắcxin với 9 ml nước muối sinh lý

(vắc xin dạng lỏng hấp phụ nhôm)

- Mẫu thử nghiệm được làm ấm lên trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 37OC.

Các bước tiến hành

- Cân trọng lượng của từng thỏ.

- Cố định thỏ trong hộp cố định.

- Gắn các đầu sensor vào hậu môn thỏ.

Theo dõi nhiệt độ thỏ trước tiêm

- Theo dõi thân nhiệt thỏ bằng máy đo chất gây sốt trước tiêm 30 phút.

- Dùng thỏ có thân nhiệt ổn định để tiến hành thử nghiệm. - Không dùng thỏ có thân nhiệt > 39,80C.

Tiêm thỏ

- Liều tiêm: 5 ml mẫu thử đã pha loãng/1 thỏ.

- Đường tiêm: tĩnh mạch vành tai thỏ.

- Theo dõi thân nhiệt thỏ bằng máy đo chất gây sốt sau tiêm 180 phút.

- Kết quả theo dõi nhiệt độ thân nhiệt thỏ trước và sau tiêm được máy in

Theo dõi nhiệt độ thỏ sau tiêm

117

ra.

4.1.3.4. Kết quả

Tính kết quả

- Nhiệt độ cao nhất (Tmax) của thỏ thử nghiệm sau khi tiêm ghi nhận sau 3

lần đo được coi là nhiệt độ tối đa.

- Hiệu số giữa nhiệt độ tối đa (Tmax) và nhiệt độ ban đầu (Base) được coi

là phản ứng của thỏ với chất gây sốt có trong văcxin thử nghiệm.

- Nếu hiệu số này là âm tính ( 0) thì phản ứng đọc là 0oC.

- Tính tổng nhiệt độ tăng của 03 thỏ sau 3 giờ theo dõi.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Tổng nhiệt độ tăng của 03 thỏ sau 3 giờ theo dõi phải  1,30C. - Nhiệt độ tăng của từng thỏ phải < 0,60C.

Thử nghiệm nhắc lại

- Điều kiện phải nhắc lại thử nghiệm:  Tổng nhiệt độ tăng của cả 3 thỏ < 1,40C nhưng nhiệt độ tăng của 1

trong 3 thỏ thử nghiệm tăng quá 0,60C.

 Tổng nhiệt độ tăng của cả 3 thỏ  1,40C nhưng < 2,40C .

- Thử nghiệm nhắc lại lần thứ nhất: được tiến hành trên 3 thỏ khác. Kết

quả đánh giá theo tiêu chuẩn trong bảng.

- Thử nghiệm nhắc lại lần 2: được tiến hành trên 3 thỏ khác. Kết quả đánh

Lần thử nghiệm

Tổng số thỏ cộng dồn

Thử nghiệm đạt nếu tổng nhiệt độ không quá (0C)

Thử nghiệm không đạt nếu tổng nhiệt độ quá (0C)

2,4

1,4

4,1

3,0

4,9

118

giá theo tiêu chuẩn trong bảng.

4.1.4. Kiểm tra an toàn đặc hiệu

4.1.4.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Ống ly tâm 15 ml

- Bơm tiêm nhựa 1ml

- Hộp đựng đá

Động vật thí nghiệm và mẫu thử

* Động vật thí nghiệm:

 Giống chuột Swiss

 Giới: chuột đực hoặc cái.

 Trọng lượng: 12-14 g.

- Chuột nhắt trắng:

- Số lượng: 10 con / 1 loạt mẫu thử.

* Mẫu thử:

- Bán thành phẩm sau bất hoạt: 2 ml

- Bán thành phẩm sau tinh chế (với vắcxin dạng lỏng hấp phụ nhôm): 2 ml

- Vắcxin thành phẩm (với vắcxin dạng đông khô): 4 lọ

Trang thiết bị

- Cân động vật 3100g

- Máy trộn

119

- Hotte vô trùng

4.1.4.2. Các bước tiến hành

Chuẩn bị chuột

- Chuột trước khi tiêm phải được theo dõi cách ly 2 ngày. Trong thời gian

cách ly hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe và ghi vào sổ theo dõi.

- Chọn chuột trọng lượng 12-14g: 10 con/1 loạt mẫu thử.

- Đánh dấu chuột, dãn nhãn lên lồng chuột với các chi tiết: Loạt vắc-xin,

dấu chuột và ngày tiêm.

- Dùng bông cồn khử trùng lọ văcxin.

- Hoàn nguyên và hút vắcxin thử nghiệm từ các lọ đựng vắcxin cho vào

Hộn vắcxin thử nghiệm

ống Falcon 15ml, trộn đều trên máy trộn, để vào hộp lạnh.

- Sát trùng vị trí tiêm. Dùng bơm tiêm 1ml lấy vắcxin đã hộn ở trên.

- Liều tiêm: 0,03ml/1 chuột.

- Đường tiêm: Não

Tiêm chuột

- Thời gian theo dõi động vật thí nghiệm là 14 ngày.

- Hàng ngày theo dõi tình trạng sức khỏe và cân trọng lượng cả nhóm

Theo dõi chuột

chuột vào ngày cuối cùng.

4.1.4.3. Kết quả

- Tính % trọng lượng tăng của từng nhóm chuột:

Tính kết quả

120

% tăng trọng = ( P14 / PO ) x 100%

Trong đó: P14 : trọng lượng của 10 chuột ngày thứ 14.

PO: trọng lượng của 10 chuột ngày tiêm.

- Không có chuột nào chết trong suốt thời gian theo dõi.

- 100% chuột sống khỏe mạnh, không liệt, không có dấu hiệu bệnh lý và

Tiêu chuẩn chấp thuận

tăng cân‎.

4.1.5. Phƣơng pháp kiểm tra công hiệu

4.1.5.1. Nguyên lý

- Gây miễn dịch cho chuột bằng các độ pha loãng khác nhau của vắcxin

mẫu chuẩn và vắcxin thử, sau đó thử thách bằng một độ pha loãng của chủng

virút thử thách (CVS-Challenge Virus Strain). Tính liều bảo vệ ED50 (IU/liều)

của vắcxin thử nghiệm.

4.1.5.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Ống nghiệm Falcon loại 15ml

- Ống nghiệm Falcon loại 50ml

- Bơm tiêm nhựa 1ml & 3ml

- Pipet nhựa loại 2ml, 5ml, 10ml & 25ml

- Giá để ống nghiệm Falcon 15, 50ml

Nguyên vật liệu

- Chuột 5 tuần tuổi (NMRI, ICR, SWISS)

121

- Vắcxin Dại mẫu chuẩn quốc gia

- Mẫu thử nghiệm: vắcxin Dại tế bào

- Chủng virút thử thách CVS

- Dung dịch Nacl 0,9%

- Dung dịch huyết thanh ngựa 2%

- Nước cất pha tiêm

Trang thiết bị

- Máy trộn

- Pipette Aid

4.1.5.3. Tiến hành

Gây miễn dịch trên chuột

* Chuẩn bị súc vật thí nghiệm:

- Chuột được chuẩn bị trước ngày tiêm miễn dịch 1 ngày.

- Chuột 5 tuần tuổi được chọn ngẫu nhiên với số lượng:

+ 48 chuột cho vắcxin mẫu chuẩn.

+ 48 chuột cho vắcxin thử nghiệm.

+ 40 chuột cho chuẩn độ chủng thử thách CVS.

- Mỗi loạt vắcxin (kể cả mẫu chuẩn ) gồm 3 độ pha, mỗi độ pha 16 chuột.

- Chuột được đánh dấu và ghi nhãn mỗi lồng theo từng loại và từng độ pha,

ghi nhãn rõ ràng cho mỗi lồng chuột bao gồm các thông tin sau: tên sản

phẩm, loạt số, độ pha loãng và màu đánh dấu chuột.

* Pha vắcxin:

- Lấy 6 ống nghiệm Falcon loại 50ml và đánh dấu: ghi rõ tên vắcxin thử,

122

vắcxin chuẩn và từng độ pha loãng của vắcxin thử và vắcxin chuẩn theo ký

hiệu V(A), V(B), V(C), và R(A), R(B), R(C). Vắcxin được pha loãng theo

bảng sau:

Ký hiệu

Độ pha loãng Vắcxin chuẩn (ml) dd NaCl 0,9%

1:5

R(A)

1:25

3 ml A

R(B)

1:125

3ml B

R(C)

- Mỗi độ pha sau khi pha xong, trước khi chuyển sang độ pha tiếp theo phải

được trộn đều trên máy trộn và thay pipét.

- Sau mỗi độ pha loãng để ngay ống nghiệm đã pha loãng vào hộp có đá

lạnh.

* Tiêm chuột:

- Lắc kỹ trước khi hút vắcxin đã pha loãng vào bơm tiêm. Mỗi mẫu vắcxin

sử dụng 1 bơm tiêm riêng.

- Tiêm từ độ pha loãng cao nhất đến độ pha loãng thấp nhất (từ C đến A).

- Liều tiêm: 0,5ml/1 chuột.

- Đường tiêm: Phúc mạc.

- Tiêm 2 mũi vào ngày 0 và ngày 7.

* Nhóm đối chứng:

- Nhóm chuột đối chứng gồm 40 con được nuôi song song trong cùng điều

kiện với nhóm chuột miễn dịch. Chuột đối chứng được dùng để chuẩn độ

123

hiệu giá chủng virut thử thách. Mỗi độ pha loãng tiêm 10 chuột.

Tiêm thử thách

* Pha chủng virút thử thách CVS:

- Pha chủng virut thử thách CVS: dùng dung dịch huyết thanh ngựa 2% làm

dung môi pha loãng, pha loãng chủng virut thử thách để đạt được 25 - 30

LD50/liều thử thách.

* Tiêm thử thách:

- Tiêm thử thách cho tất cả nhóm chuột đã được gây miễn dich vào ngày

thứ 14 sau mũi tiêm miễn dịch thứ nhất.

- Liều tiêm: 0,03ml/1 chuột .

- Đường tiêm: não.

* Chuẩn độ liều virút thử thách

10-2 và 10-3 .

- Pha loãng bậc 10 chủng thử thách CVS chứa 25-30LD50/liều thử thách (100) ra các đậm độ 10-1

- Gây nhiễm cho 4 nhóm chuột, mỗi nhóm một độ pha loãng từ 100 đến 10-3

+ Liều tiêm: 0,03ml/1 chuột .

+ Đường tiêm: não.

Theo dõi chuột sau tiêm thử thách

- Thời gian theo dõi: 14 ngày.

- Chỉ ghi nhận những chuột có biểu hiện liệt, chết từ ngày thứ 5 đến ngày

thứ 14.

4.1.5.4. Kết quả

Tính kết quả

* Tính liều virút thử thách CVS

124

- Tính số chuột chết trên tổng số chuột của mỗi nhóm chuột.

- LD50 của chủng CVS được tính theo phương pháp Reed-Muench:

* Công thức :

x k Lg(1/ LD50 ) = Lg(1/ A) -

Trong đó : A: độ pha loãng của chủng gây chết ngay sát dưới 50% .

a: % chuột chết ngay sát dưới 50%

b: % chuột chết ngay sát trên 50%

k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10)

* Tính công hiệu của vắcxin thử nghiệm:

- Tính số chuột sống trên tổng số chuột của mỗi nhóm chuột đối với vắcxin

thử nghiệm và vắcxin mẫu chuẩn

- Kết quả công hiệu của vắcxin được tính theo chương trình Probit

Analysis của TCYTTG.

Giá trị của thử nghiệm

- Liều virút thử thách CVS phải nằm trong khoảng 10-100 LD50.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Công hiệu của vắcxin mẫu thử phải  2,5 IU/1 liều tiêm.

4.1.6. Thử nghiệm nhận dạng

5.1.6.1. Mục đích

Mô tả các phương pháp xác định các kháng nguyên đặc hiệu có trong

vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

5.1.6.2. Phương pháp

125

- Xem phần 4.1.6 - Phương pháp kiểm tra công hiệu

- Xem phần 2.2.1.3 - Thử nghiệm ELISA xác định hàm lượng glycoprotein của

virút dại

4.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA LÝ

4.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số

4.2.1.1. Nguyên lý:

- Protein trong vắcxin được tủa bằng acid tricloracetic (TCA) rồi định

lượng theo phương pháp Lowry.

4.2.1.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

- Ống nghiệm ly tâm thuỷ tinh,

- Pipetman 1ml

- Dụng cụ chia mẫu tự động

- Đầu côn 1ml

- Ống đong 100ml

- Cốc có mỏ loại 100ml

- Cóng đo

- Đồng hồ hẹn giờ

- Giấy parafilm

- Nồi inox, bếp điện

Dụng cụ

- Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml

- Dung dịch natri hydroxyd/ natri cacbonat

126

Hoá chất

- Dung dịch đồng sulfat 2%

- Dung dịch natri tactrat 4%

- Dung dịch TCA 5%

- Dung dịch TCA 10%

- Thuốc thử Folin 2N

- Nước pha tiêm

- Mẫu thử:

+ Bán thành phẩm 5 ml

+ Bán thành phẩm cuối cùng 10 ml

+ Vắcxin dại 10 lọ

+ Nước hồi chỉnh (với dạng đông khô) 10 lọ

- Máy quang phổ

- Nồi cách thuỷ

- Bồn rửa siêu âm

- Máy ly tâm

- Máy lắc

Trang thiết bị

4.2.1.3. Tiến hành

Đánh dấu các ống nghiệm

Pha dung dịch albumin chuẩn 25; 50; 100; 150 µg/ml

* Pha dung dịch albumin chuẩn 25µg/ml:

- Hút 0,25ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm

127

9,75ml nước pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

* Pha dung dịch albumin chuẩn 50µg/ml:

- Hút 0,5ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm

9,5ml nước pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

* Pha dung dịch albumin chuẩn 100 µg/ml:

- Hút 1ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm 9

ml nước pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

* Pha dung dịch albumin chuẩn 150µg/ml:

- Hút 1,5ml dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml vào ống nghiệm. Thêm

8,5ml nước pha tiêm vào ống nghiệm trên, lắc đều.

- Bán thành phẩm: Pha loãng bằng nước pha tiêm từ 200 đến 500 lần tùy theo

Pha loãng mẫu thử

- Bán thành phẩm cuối cùng: Pha loãng 2 lần bằng nước pha tiêm.

- Thành phẩm: Lắc kỹ các lọ vắcxin, trộn vào ống Falcon 50ml đã đánh dấu

mức độ cô đặc.

tên loạt vắcxin, lắc đều. Pha loãng 2 lần bằng nước pha tiêm.

Pha các dung dịch thử nghiệm (pha ngay trước khi dùng)

Dung dịch đồng alkalin

Thuốc thử Folin 1N

- Hút các dung dịch albumin chuẩn 25; 50; 100; 150g/ml và mẫu thử

Tiến hành

- Thêm dung dịch TCA 10% vào mỗi ống nghiệm.

- Lắc đều.

128

vào các ống nghiệm.

- Đun cách thủy ở 80C trong 15 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phòng. Bao

- Ly tâm, hút bỏ nước nổi.

- Thêm TCA 5% vào mỗi ống nghiệm, lắc kỹ. Bao kín miệng các ống

kín miệng các ống nghiệm bằng giấy parafilm.

- Ly tâm, hút bỏ nước nổi.

- Thêm dung dịch đồng alkalin vào mỗi ống nghiệm, lắc kỹ.

- Để ở nhiệt độ phòng qua đêm.

- Thêm nước pha tiêm vào mỗi ống nghiệm, lắc đều.

- Thêm thuốc thử Folin vào mỗi ống nghiệm, lắc đều.

- Đun cách thủy 37C trong 30 phút, để nguội.

- Ly tâm, lấy nước nổi đo quang phổ bước sóng 750nm.

nghiệm bằng giấy parafilm.

4.2.1.4. Kết quả

Dựng đường chuẩn

- Căn cứ vào độ hấp thụ của dung dịch albumin chuẩn và hàm lượng

albumin tương ứng để dựng phương trình đường chuẩn. Xử lý số liệu theo

chương trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng được phương trình

hồi quy tuyến tính thực nghiệm (phương trình đường chuẩn) y = ax + b. Dựa

theo phương trình tính ra hàm lượng protein trong mẫu vắcxin.

Tính kết quả

* Công thức: Y = n.y

Trong đó: Y: Hàm lượng protein có trong mẫu vắcxin (g/ml).

y = ax + b

129

y: Hàm lượng protein (g/ml)

x: Độ hấp phụ quang đo được tương ứng với mỗi nồng độ protein.

a, b: Hệ số của phương trình đường chuẩn.

n: Độ pha loãng mẫu.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Bán thành phẩm cuối cùng, thành phẩm vắcxin dại: Hàm lượng protein

≤ 20 mg/ml.

4.2.2. Xác định pH trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

- pH của vắcxin được xác định bằng máy đo pH với điện cực thuỷ tinh

4.2.2.1. Nguyên lý

4.2.2.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Cốc có mỏ loại 50ml

- Giấy lau

Trang thiết bị

- Máy đo pH

Hóa chất

- Dung dịch pH chuẩn 7,00

- Dung dịch pH chuẩn 4,01

- Nước cất pha tiêm

- Mẫu thử: 20 lọ vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

4.2.2.3. Các bước tiến hành

Chuẩn bị mẫu

- Lắc kỹ các lọ vắcxin, trộn vào ống Falcon 50ml đã đánh dấu tên loạt

vắcxin, lắc đều.

130

- Đối với vắcxin đông khô, phải hồi chỉnh nước trước khi đo.

Tiến hành đo

- Chuẩn lại pH của máy đo bằng các dung dịch pH chuẩn

- Nhúng điện cực vào các cốc đựng dung dịch mẫu thử. Đọc các thông số

về pH hiện lên trên máy đo.

- Trước mỗi lần chuyển điện cực sang một dung dịch mới, phải rửa kỹ

điện cực bằng nước cất pha tiêm và lau khô.

4.2.2.4. Kết quả

Tiêu chuẩn chấp thuận

- pH của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero phải nằm trong khoảng 6,0

- 8,0.

4.2.3. Định lƣợng thimerosal trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

4.2.3.1. Nguyên lý

- Dựa trên cơ sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất có

cực đại hấp thụ ở bước sóng 480nm. Định lượng thimerosal bằng cách

đo độ hấp phụ chất tạo thành ở bước sóng này.

4.2.3.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Bình định mức 100ml.

- Dụng cụ chia mẫu tự động.

- Cốc có mỏ loại 100ml.

- Cốc có mỏ loại 500ml.

- Bình gạn loại 100ml.

- Ống đong loại 500ml.

- Buret thủy tinh 50ml.

- Cóng đo.

131

- Máy hút chân không.

- Găng tay, khẩu trang.

Hóa chất

- Dung dịch thimerosal chuẩn 1%.

- Dung dịch dithizon 0,02%.

- Cacbon tetraclorid.

- Amomiac đậm đặc 32%.

- Dung dịch acid sulfuric 10%.

- Nước pha tiêm.

Trang thiết bị

- Máy đo quang

- Máy ly tâm

- Máy lắc

4.2.3.3. Tiến hành

Mẫu thử

Lắc kỹ các lọ vắcxin, trộn vào ống Falcon đã đánh dấu tên loạt vắcxin, lắc

đều.

Pha dung dịch dithizon 0,002%

Hút 10ml dung dịch dithizon 0,02% vào bình định mức loại 100ml,

thêm carbontetraclorid vừa đủ tới vạch.

Pha dung dịch amoniac 60% (9N)

- Rót 180ml nước amoniac đậm đặc vào ống đong loại 500ml, thêm nước

pha tiêm vừa đủ 300ml, khuấy đều.

Tiến hành

- Hút 0,5ml dung dịch thimerosal chuẩn 50g/ml, 100g/ml, 150g/ml

lần lượt vào mỗi 2 bình nón 4 - 5, 6 - 7, 8 - 9.

132

- Hút 0,5ml mẫu thử vào mỗi bình nón 2 - 3.

- Thêm nước pha tiêm vừa đủ 5ml vào mỗi bình nón từ 1 đến 9, lắc đều.

- Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 10% vào mỗi bình nón từ 1 đến 9, lắc

đều.

- Dùng buret thêm 10ml dung dịch dithizon 0,002% vào mỗi bình nón từ

1 đến 9.

- Đậy nắp, lắc mạnh trong 2 phút. Để yên cho tách thành 2 lớp, hút bỏ lớp

nước nổi.

- Thêm 10ml nước pha tiêm vào mỗi bình, lắc mạnh. Để yên cho tách

thành 2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi.

- Thêm 10ml dung dịch amoniac 60% vào mỗi bình, lắc mạnh. Để yên

cho tách thành 2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi.

- Làm bước này 3 lần.

- Màu của cacbon tetraclorid chuyển từ xanh lá cây sang màu vàng cam.

- Thêm 10ml nước pha tiêm vào mỗi bình, lắc mạnh. Để yên cho tách

thành 2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi.

- Chuyển sang bình gạn, gạn lấy lớp cacbon tetraclorid.

- Lọc qua giấy lọc, đo quang phổ bước sóng 480nm.

Dựng đường chuẩn

- Căn cứ vào độ hấp thụ của dung dịch thimerosal chuẩn và hàm lượng

thimerosal tương ứng để dựng phương trình đường chuẩn. Xử lý số liệu

theo chương trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng được

phương trình hồi quy tuyến tính thực nghiệm (phương trình đường

chuẩn) y = ax + b. Dựa theo phương trình tính ra hàm lượng thimerosal

có trong mẫu vắcxin.

4. Kết quả

Tính kết quả

Công thức: Y = y. 100/1000000 = y. 0,0001

133

Trong đó: Y: Hàm lượng thimerosal có trong mẫu vắcxin (g%).

y = ax + b

y: Hàm lượng thimerosal (g/ml).

x: Độ hấp thụ quang đo được tương ứng với từng hàm lượng thimerosal.

a, b: Hệ số của phương trình đường chuẩn.

100: Đổi ra g%.

1000000: Hệ số qui đổi từ g ra g.

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Hàm lượng thimerosal có trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ≤

0,012%.

4.2.4. Định lƣợng nhôm trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng

lỏng hấp phụ nhôm

4.2.4.1. Nguyên lý

- Hàm lượng nhôm có trong vắcxin được xác định bằng cách đo màu của hợp chất tạo ra từ phản ứng của ion Al3+ với thuốc thử Stilbazo.

4.24.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Bình nón loại 100ml.

- Ống nghiệm thủy tinh  = 18mm.

- Pipetman 1ml, pipet aid, pipet thủy tinh 5 ml.

- Dụng cụ chia mẫu tự động

- Cốc có mỏ loại 100ml, 500ml.

- Bình định mức 25ml, 250ml.

- Cóng đo.

Trang thiết bị

- Máy đo quang phổ

134

Hóa chất

- Dung dịch nhôm chuẩn 0,1%

- Dung dịch Stilbazo

- Dung dịch đệm acetat

- Acid nitric đậm đặc

- Nước pha tiêm

4.2.4.3. Các bước tiến hành

Pha dung dịch nhôm chuẩn 2μg/ml

- Dùng pipet thuỷ tinh 1ml hút 0,5ml dung dịch nhôm chuẩn 0,1% vào

trong bình định mức 250ml, thêm nước pha tiêm vừa đủ tới vạch, lắc đều.

Pha loãng mẫu thử

- Mẫu thử đươ ̣c pha loãng 25 và 50 lần trướ c khi tiến hành thử nghiê ̣m.

Tiến hành

- Hút 1ml – 2ml – 3ml – 4ml – 5ml dung dịch nhôm chuẩn 2g/ml vào

lần lượt các bình nón ký hiệu số 4 – 5 – 6 – 7 – 8.

- Hút 1ml mẫu thử pha loãng 25 lần, 50 lần vào các bình nón ký hiệu số

2-3.

- Thêm nước pha tiêm vừa đủ 5ml vào các bình nón ký hiệu từ 1 đến 8,

lắc đều.

- Thêm 10ml dung dịch acetat buffer vào mỗi bình nón từ 1 đến 8, lắc

đều.

- Thêm 5ml dung dịch Stilbaso vào mỗi bình nón từ 1 đến 8, lắc đều.

- Thêm 5ml nước pha tiêm vào mỗi bình nón từ 1 đến 8, lắc đều.

- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.

- Đo quang phổ ở bước sóng 510 nm.

Dựng đường chuẩn

Căn cứ vào độ hấp thụ của dung dịch nhôm chlorid chuẩn và hàm lượng

nhôm chlorid tương ứng để dựng đường chuẩn. Xử lý số liệu theo chương

135

trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng được phương trình hồi

quy tuyến tính thực nghiệm (phương trình đường chuẩn) y=ax+ b. Dựa

theo phương trình tính ra hàm lượng nhôm trong mẫu vắcxin.

4.2.4.4. Kết quả

Tính kết quả

Công thức: Y = (y25.25/1 + y50.50/1)/2

Trong đó:

Y: Hàm lượng nhôm có trong mẫu vắcxin (g/ml).

y = ax + b

y: Hàm lượng nhôm (g).

y25: Hàm lượng nhôm của mẫu thử pha loãng 25 lần.

y50: Hàm lượng nhôm của mẫu thử pha loãng 50 lần.

x: Độ hấp phụ quang tương ứng với các hàm lượng nhôm.

a, b: Hệ số của phương trình đường chuẩn.

25, 50: Độ pha loãng của mẫu thử.

1: Thể tích mẫu thử (ml).

- Hàm lượng nhôm có trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ≤ 1250

Tiêu chuẩn chấp thuận

g/ml.

4.2.5. Xác định độ ẩm tồn dƣ trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

dạng đông khô

4.2.5.1. Nguyên lý

Dựa trên phản ứng toàn lượng của nước với lưu huỳnh dioxyd và iod

trong dung môi khan chứa một chất bazơ hữu cơ thích hợp.

4.2.5.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

136

- Ống nghiệm 15x15mm.

- Cốc có mỏ 50ml.

- Thìa cân.

Hóa chất

- Sodium L-.tactrate dihydrate (tinh khiết >99%).

- Thuốc thử Karl Fischer.

Bao gồm: 1. Titrant 5.

2. Solvent .

Trang thiết bị

- Cân phân tích

- Máy chuẩn độ điện thế

4.2.5.3. Các bước tiến hành

Xác định đương lượng của thuốc thử

- Do đương lượng của thuốc thử Karl Fischer dễ bị thay đổi theo thời

gian nên trước khi dùng phải xác định lại và phải đạt tối thiểu 3,5mg

nước cho 1ml thuốc thử.

- Dẫn hoá chất vào máy theo đường dẫn từng loại cho Solvent, Titrant 5.

- Bơm dung môi, thuốc thử cũ ra khỏi đường ống dẫn vào chai đựng chất

thải.

- Hút (Purging) vài lần để trộn đều thuốc thử.

- Bơm dung môi (Solvent) vào khoảng 1/3 cốc chuẩn độ.

- Chuẩn bị cốc và ống nghiệm để cân natri tactrat (natri tactrat đã được loại hết ẩm bằng cách sấy khô ở 60oC trong 1 giờ). Cân chính xác

khoảng 0,13g natri tactrat vào ống nghiệm dựng đứng trong cốc. Sau

khi đổ hết natri tactrat vào cốc chuẩn độ, đặt ống nghiệm trở lại cân, ghi

lại số g hiện trên màn hình cân (giá trị âm).

- Tính đương lượng của thuốc thử (F) theo công thức sau:

137

Trong đó: F: Đương lượng của thuốc thử (mg/ml)

18,02: Khối lượng phân tử của nước trong phân tử

natri tactrat

230,08: Khối lượng của phân tử natri tactrat

V: Thể tích thuốc thử sử dụng để chuẩn độ natri

tactrat (ml)

- Tiến hành xác định đương lượng của thuốc thử 2 lần, lấy kết quả trung bình

M: Khối lượng natri tactrat (mg)

( ).

Tiến hành định lượng

- Chuẩn bị cân mẫu: Tuỳ theo từng chế phẩm đông khô, lấy khoảng 3-4 lọ

vắcxin bỏ nút nhôm, đem cân, trước khi nhấc ra bấm Tare trên cân. Mở

từng lọ vắcxin, lấy thìa cân nhỏ cho vào lọ làm vụn bánh đông khô, nhanh

chóng đổ vào cốc chuẩn độ qua đường cho mẫu, làm lần lượt từng lọ đến

hết. Đặt lại cân lọ và nút cao su, ghi lại khối lượng cân (giá trị âm).

- Tiến hành định lượng mẫu thử 2 lần, tính giá trị trung bình.

4.2.5.4. Kết quả

- Công thức:

Tính kết quả

Trong đó: X: Hàm lượng nước có trong mẫu thử (% kl/kl)

V: Thể tích thuốc thử sử dụng để chuẩn độ mẫu thử (ml)

: Đương lượng trung bình của thuốc thử (mg/ml)

m: Lượng mẫu thử khi cân (mg)

138

100: Chuyển sang %

Và

Trong đó: : Hàm lượng nước trung bình có trong mẫu thử (% kl/kl)

: Hàm lượng nước có trong mẫu thử làm lần thứ nhất (%

kl/kl)

: Hàm lượng nước có trong mẫu thử làm lần thứ hai (%

kl/kl)

Tiêu chuẩn chấp thuận

- Độ ẩm tồn dư trong vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero đông khô ≤

3%.

4.2.6. Kiểm tra tính chất vật lý vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

4.2.6.1. Nguyên lý

Quan sát vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero bằng mắt thường dưới

ánh sáng đèn.

4.2.6.2. Nguyên vật liệu và trang thiết bị

- Bơm tiêm 3ml

- Dụng cụ mở nắp lọ vắcxin

Dụng cụ

- Mẫu vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero

Hoá chất

- Dạng dung dịch: Bóc nhãn từng lọ vắcxin, lau sạch lọ, quan sát bằng mắt

4.2.6.3. Các bước tiến hành

- Dạng đông khô: Kiểm tra dạng đông khô trọng lọ. Hồi chỉnh bằng nước hồi

dưới ánh sáng đèn tuýp.

chỉnh, kiểm tra thời gian hoà tan hoàn toàn, sau đó quan sát lọ vắcxin như

139

dạng dung dịch.

- Ghi chép kết quả quan sát được.

4.2.6.4. Kết quả

- Ghi chép lại các kết quả quan sát được.

Kết quả

- Dạng dung dịch: Sau khi lắc, vắcxin có màu trắng hơi đục. Để lắng sau 1

Tiêu chuẩn chấp thuận

giờ, vắcxin phải tách làm hai lớp, trong đó lớp nhôm phải tủa bông mịn,

- Dạng đông khô: Vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero đông khô có dạng

không vón cục.

viên xốp màu trắng, khi hoà tan bằng nước hồi chỉnh tạo thành dung dịch

trong suốt, không màu, không có chất lạ khó tan.

4.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI TRÊN

NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

Từ tiêu chuẩn chấp thuận của từng thử nghiệm kiểm tra chất lượng

vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero, các bảng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại

trên nuôi cấy tế bào Vero đã được xây dựng. Căn cứ để đưa ra các tiêu chuẩn

này đều được dựa trên các khuyến cáo của TCYTTG [54] và theo Dược điển

châu Âu [15]. Bảng 4.1 đưa ra các tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi

cấy tế bào Vero dạng lỏng và Bảng 4.2 đưa ra các tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin

140

dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô.

BẢNG 4.1. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI

TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

(Dạng lỏng hấp phụ nhôm)

STT

Tên thử nghiệm

Tiêu chuẩn chấp thuận

Tài liệu tham khảo

Dương tính

TCYTTG, EP

Nhận dạng

Tính chất vật lý

Sau khi lắc, vắcxin có màu trắng hơi đục. Để lắng sau 1 giờ, vắcxin phải tách làm hai lớp, trong đó lớp nhôm phải tủa bông mịn, không vón cục.

TCYTTG, EP

V« khuÈn

Không phát hiện thấy nấm và vi khuẩn phát triển sau 14 ngày theo dõi.

7,0 - 8,0

TCYTTG, EP

Hàm lượng Thimerosal (%)

≤ 0,012

TCYTTG, EP

Công hiệu (IU/1 ml)

≥ 2,5

TCYTTG, EP

≤ 1250

Hàm lượng nhôm (g/ml)

An toàn chung trên chuột lang

TCYTTG

Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thường

An toàn chung trên chuột nhắt

Chất gây sốt

TCYTTG, EP

Tổng To tăng của 3 thỏ ≤ 1,3oC Nhiệt độ tăng của từng thỏ < 0,60C

141

BẢNG 4.2. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VẮCXIN DẠI

TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

(Dạng đông khô)

STT Tên thử nghiệm

Tiêu chuẩn chấp thuận

Tài liệu tham khảo

Virút dại

TCYTTG, EP

Nhận dạng

Tính chất vật lý

Viên xốp màu trắng, khi hoà tan bằng nước hồi chỉnh tạo thành dung dịch trong suốt, không vón cục hoặc không có chất lạ khó tan.

TCYTTG, EP

3 V« khuÈn

Không phát hiện thấy nấm và vi khuẩn phát triển sau 14 ngày theo dõi.

Protein toàn phần (mg/ml)

≤ 20

7,0 - 8,0

TCYTTG, EP

6 Hàm lượng Thimerosal (%)

≤ 0,012

TCYTTG, EP

Công hiệu (IU/0,5ml)

≥ 2,5

8 An toàn chung trên chuột lang

TCYTTG

Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thường

9 An toàn chung trên chuột nhắt

10 An toàn đặc hiệu

TCYTTG

Chuột khỏe mạnh, không có biểu hiện bệnh (liệt,chết), tăng trọng bình thường

11 Chất gây sốt

TCYTTG, EP

Tổng To tăng của 3 thỏ ≤ 1,3oC Nhiệt độ tăng của từng thỏ < 0,60C

12 Độ ẩm tồn dư

≤ 3%

TCYTTG, EP

142

CHƢƠNG 5

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC VẮC XIN

TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

Các thử nghiệm an toàn đối với vắcxin dại được thiết kế nhằm phát

hiện bất kỳ một chất hay đặc tính nào có hại cho các đối tượng tiêm như việc

lây nhiễm các tác nhân ngoại lai, virút chưa bất hoạt hoặc độc tính. Yêu cầu

đối với các thử nghiệm này được trình bày trong khuyến cáo của TCYTTG

cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào [54]. Từng quốc gia hay khu vực cũng có

những yêu cầu đặc trưng riêng tuy nhiên đều dựa trên căn cứ là các yêu cầu

chung do TCYTTG đề ra [15], [35], [49]. Cũng giống với phần lớn các vắcxin

virút bất hoạt khác, việc phát hiện và loại trừ sự có mặt của các virút độc tính

tồn dư là rất quan trọng. Đối với vắcxin dại, thử nghiệm này được tiến hành

bằng cách tiêm vào não chuột các mẫu bán thành phẩm sau bất hoạt hoặc

thành phẩm và phương pháp này được gọi là thử nghiệm kiểm tra an toàn đặc

hiệu trên chuột. Thêm vào đó, nếu vắcxin được sản xuất trên tế bào, nên tiến

hành các thử nghiệm nhân nuôi virút trên các hệ tế bào giống với tế bào hiện

đang sử dụng trong sản xuất [28], [54]. Đồng thời, cần thực hiện việc kiểm

soát các tác nhân ngoại lai trong quá trình nhân nuôi tế bào theo đúng yêu cầu

của TCYTTG cho các sản phẩm được sản xuất trên nuôi cấy tế bào. Các thử

nghiệm kiểm tra chất lượng tế bào này được tiến hành đối với từng loạt sản

xuất chủng giống cũng như loạt sản xuất vắcxin [53], [54]. Đối với các vắcxin

dại được phát triển với mục đính sử dụng cho người thì việc đánh giá đáp ứng

miễn dịch tiền lâm sàng là cần thiết. Khi tiến hành các thử nghiệm này, cần có

sự so sánh về hiệu quả đáp ứng miễn dịch của vắcxin mới với các vắcxin đã

biết rõ về công hiệu cũng như có hiệu quả phòng bệnh tốt trên người [41].

143

Nghiên cứu này đề cập đến việc đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch

của các dạng thành phẩm vắcxin dại khác nhau. Các sản phẩm này đều được

đánh giá so sánh về đáp ứng miễn dịch với các nhóm chứng tiêm nước muối

sinh lý và tiêm với một vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero đã được thương

mại hóa cho hiệu quả phòng bệnh tốt trên người (Verorab của Sanofi-Pasteur,

Pháp).

5.1. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ ĐÁP ỨNG

MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

5.1.1. Các phƣơng pháp đánh giá tính an toàn của vắcxin trên động vật

thí nghiệm

5.1.1.1. Phương pháp kiểm tra tính an toàn chung

Xem Phần 4.1.2.

5.1.1.2. Phương pháp kiểm tra an toàn đặc hiệu

Xem Phần 4.1.4.

5.1.1.3. Phương pháp kiểm tra chất gây sốt

Xem Phần 4.1.3.

5.1.2. Phƣơng pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin trên chuột

5.1.2.1. Thử nghiệm gây miễn dịch trên chuột

Nguyên lý

- Thử nghiệm được tiến hành trên các giống chuột NMRI có so sánh với

144

các nhóm chứng là nhóm tiêm nước muối sinh lý và nhóm tiêm vắcxin

Verorab. Đánh giá đáp ứng miễn dịch được thực hiện bằng thử nghiệm xác

định hiệu giá kháng thể trung hòa đối với virút dại theo phương pháp RFFIT

[42].

Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Ống nghiệm Falcon loại 15ml

- Ống nghiệm Falcon loại 50ml

- Bơm tiêm nhựa 1ml & 3ml

- Pipet nhựa loại 2ml, 5ml, 10ml & 25ml

- Giá để ống nghiệm Falcon 15, 50ml

Nguyên vật liệu

- Chuột 5 tuần tuổi giống NMRI

- Vắcxin Verorab

- Mẫu thử nghiệm: vắcxin dại VERAPVAX và VERALVAX

- Dung dịch NaCl 0,9%

- Nước pha tiêm

Trang thiết bị

- Máy trộn

- Pipette Aid

Tiến hành

Chuẩn bị động vật thí nghiệm

145

- Chuột được chuẩn bị trước ngày tiêm miễn dịch 1 ngày.

- Chuột 5 tuần tuổi được chọn ngẫu nhiên với số lượng 10 con cho 1

nhóm tiêm miễn dịch

- Chuột được đánh dấu và ghi nhãn mỗi lồng theo từng loại vắcxin

bao gồm các thông tin sau: tên sản phẩm, loạt số và màu đánh dấu

chuột.

Pha vắcxin thử

- Hồi chỉnh vắcxin bằng nước hồi chỉnh.

- Hộn vắcxin đã hồi chỉnh và vắcxin dạng lỏng vào falcon 15ml.

- Pha loãng vắcxin 5 lần trong dung dịch nước muối sinh lý.

Gây miễn dịch cho chuột

Lịch tiêm miễn dịch và lấy máu

- Chuột được tiêm 3 mũi theo lịch 0, 7, 28 ngày. Lấy máu vào ngày 7,

14, 21, 28, 42 và 56 (Hình 5.1).

Tiêm mũi 2

Tiêm mũi 3

Tiêm mũi 1

Ngày 0

Lấy máu sau mũi Ngày 56 3

Lấy máu sau mũi Ngày 14 1

Lấy máu sau mũi Ngày 42 1

Lấy máu sau mũi Ngày 21 1

Lấy máu sau mũi Ngày 28 2

Lấy máu sau mũi Ngày 7 1 1

146

Hình 5.1. Sơ đồ gây miễn dịch và lấy máu cho chuột

Tiêm vắcxin cho chuột

- Lắc kỹ trước khi hút vắcxin đã pha loãng vào bơm tiêm. Mỗi loại

vắcxin sử dụng 1 bơm tiêm riêng.

- Liều tiêm: 0,5ml/1 chuột.

- Đường tiêm: Phúc mạc.

Tiêm cho nhóm chuột chứng

- Tiến hành tiêm nước muối sinh lý với liều tiêm và đường tiêm như

tiêm mẫu vắcxin.

Chăm sóc chuột thí nghiệm:

- Chuột sau khi tiêm miễn dịch được cán bộ của phòng chăn nuôi

chăm sóc và theo dõi trong suốt thời gian thử nghiệm (56 ngày).

Lấy máu kiểm tra đáp ứng miễn dịch

- Ngày 7, 14, 21, 28 và 42 tất cả các chuột gây miễn dịch đều được

lấy máu mắt.

- Ngày 56 tất cả các chuột gây miễn dịch đều được lấy máu tim.

Kết quả

- Các mẫu huyết thanh được xét nghiệm xác định hiệu giá kháng thể

trung hòa đối với virút dại theo phương pháp RFFIT.

5.1.2.2. Thử nghiệm đánh giá đáp ứng miễn dịch

Thử nghiệm để đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại

trên chuột là thử nghiệm ức chế điểm huỳnh quang nhanh (RFFIT) phát hiện

kháng thể trung hòa đối với virút dại trong các mẫu huyết thanh [42].

147

Nguyên vật liệu và trang thiết bị

Dụng cụ

- Tuýp pha loãng mẫu 1,5 ml

- Phiến Teflon 3 giếng

- Bản kính đậy phiến

- Hộp lồng 15 cm để ủ phiến

- Phiến 96 giếng để pha loãng

- Đầu côn: 20-1000 l

- Giấy thấm.

- Pipet 5ml, 10ml, 25 ml.

- Pipet aid

- Pipet man 1ml, 10ml, 100ml, 200ml, 1000ml

- Pipet nhiều kênh

- Cóng nhựa

- Cóng rửa phiến

- Hộp đựng đá

Hóa chất

- Chai nuôi cấy tế bào MNA

- MEM 10% FBS

- Dung dịch Trysin

- Dung dịch PBS

148

- Dung dịch đệm phủ phiến

- Dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh

quang

- Aceton lạnh

- Nước pha tiêm

Mẫu thử

- Chủng virút dại thử thách CVS -11

- Huyết thanh kháng dại chuẩn (2 IU/ml)

- Huyết thanh mẫu thử: 1 ml

Trang thiết bị

- Tủ ấm 37C

- Máy trộn

- Nồi cách thủy

- Kính hiển vi soi tế bào

- Kính hiển vi huỳnh quang

- Hốt vô trùng

Tiến hành

Bất hoạt mẫu huyết thanh thử

- Mẫu huyết thanh thử được bất hoạt ở nhiệt độ 560C trong 30 phút

Chuẩn bị phiến mẫu huyết thanh chứng

- Chuẩn bị phiến 96 giếng, mỗi mẫu huyết thanh chứng sẽ được pha

loãng trên một hàng dãy dọc của phiến.

149

- Các mẫu huyết thanh được pha loãng theo các độ pha từ 1/5 đến 1/625.

- Chuyển các mẫu huyết thanh đã được pha loãng vào từng giếng trên

các phiến thử. Mỗi phiến nhỏ lần lượt 3 độ pha loãng 1/25; 1/125; 1/625.

Chuẩn bị phiến mẫu huyết thanh thử

- Pha loãng và nhỏ mẫu vào phiến như đối với mẫu huyết thanh chứng.

Pha loãng và chuẩn bị phiến virút chứng

- Chủng virút thử thách CVS-11 được pha loãng bằng MEM 10% FBS

để đạt được nồng độ 50FFD50/0,1 ml.

- Tiếp tục pha loãng 10 lần mẫu virút chứng thêm 2 độ pha loãng 1/10 và

1/100 để đạt được các nồng độ 5FFD50/0,1 ml và 0,5FFD50/0,1 ml.

- Chuyển các mẫu virút chứng đã được pha loãng này vào từng giếng

trên phiến chứng virút.

Trung hòa huyết thanh với virút thử thách

- Nhỏ mẫu virút có nồng độ 50FFD50 vào tất cả các giếng của phiến mẫu

huyết thanh thử và huyết thanh chứng.

- Ủ tất cả các phiến ở nhiệt độ 370C trong 90 phút.

Chuẩn bị và ủ tế bào MNA với mẫu thử

- Tách chai tế bào MNA đã nuôi cấy 3 ngày trong môi trường MEM 10%

FBS bằng trypsin để tạo thành hỗn dịch tế bào.

- Đếm số lượng tế bào có trong hỗn dịch. Pha loãng hỗn dịch tế bào để

đạt được nồng độ theo yêu cầu..

- Cho hỗn dịch tế bào vào từng giếng trên tất cả các phiến mẫu đã có

virút thử thách và 1 phiến không có virút là chứng tế bào.

150

- Ủ tất cả các phiến ở nhiệt độ 370C trong 20 giờ.

Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsit của virút dại

thử thách

Cố định virút

- Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến.

- Nhúng phiến trong cóng đựng dung dịch PBS sau đó nhúng tiếp vào cóng

đựng acetone lạnh.

- Vớt phiến ra và để khô tự nhiên.

Nhuộm phiến

- Nhỏ dung dịch cộng hợp thỏ kháng nucleocapsit của virút dại gắn huỳnh

quang vào từng giếng trên các phiến.

- Ủ tất cả các phiến trong hộp lồng có giấy thấm được làm ẩm ở nhiệt độ 370C trong 30 phút.

Rửa phiến

- Đổ hết nước nổi có ở các giếng trên các phiến.

- Rửa phiến bằng dung dịch PBS.

- Để khô phiến.

Phủ phiến

- Nhỏ dung dịch đệm phủ phiến vào từng giếng.

- Đậy phiến bằng bản kính.

Đọc bản phiến

- Soi phiến dưới kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20x và ghi kết quả vào

phiếu ghi sơ đồ phiến. Mỗi giếng trên phiến sẽ được soi lần lượt từng vi

151

trường cho hết toàn bộ diện tích của giếng. Vi trường nhiễm là vi trường soi

thấy hình ảnh virút dại bắt màu xanh huỳnh quang trên nền tế bào Vero có

màu đỏ (xem Hình 2.4).

Kết quả

Tính kết quả

- Tính số vi trường nhiễm trên tổng số vi trường được soi trong mỗi giếng.

- Kết quả được tính theo phương pháp Reed – Muench.

* Công thức :

x k Lg(1/ FFD50 ) = Lg(1/ A) -

Trong đó: A: độ pha loãng của mẫu có mức độ nhiễm ngay sát dưới 50%.

a: % vi trường nhiễm ngay sát dưới 50%

b: % vi trường nhiễm ngay sát trên 50%

k =1 (logarit của hệ số pha loãng bậc 10)

Giá trị của thử nghiệm và tiêu chuẩn chấp thuận

- Phiến mẫu chứng huyết thanh, chứng virút và chứng tế bào phải đạt được

yêu cầu của thử nghiệm.

- Hiệu giá kháng thể trung hòa đối với virút dại trong huyết thanh từ 0,5

IU/ml trở lên được coi là dương tính.

5.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU LỰC CỦA

VẮCXIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

5.2.1. Tính an toàn của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào trên động vật thực

152

nghiệm

Kết quả về tính an toàn chung và an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero được đánh giá trên cả vắcxin thành phẩm dạng đông

khô (VERAPVAX) và vắcxin thành phẩm dạng lỏng hấp phụ nhôm

(VERALVAX) trình bày trong Bảng 5.1 và Bảng 5.2. Kết quả kiểm tra chất

gây sốt của các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng đông khô

(VERAPVAX) được trình bày trong Phần 3.10 - Kết quả kiểm tra vắc xin

thành phẩm tại cơ sở. Trong phần này chỉ trình bày kết quả kiểm tra chất gây

sốt của các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng hấp phụ nhôm

(VERALVAX) (Bảng 5.3).

Bảng 5.1. Kết quả kiểm tra tính an toàn chung của vắcxin dại trên nuôi

cấy tế bào Vero

Chuột nhắt trắng

Chuột lang

VERAPVAX

VERALVAX VERAPVAX

VERALVAX

Kết quả theo dõi sau 7 ngày

Loạt 0209 Loạt 0309

Loạt 0210

Loạt 0209 Loạt 0309

Loạt 0210

0/5

0/2

Số chuột chết

125,23%

127,77%

116,03%

105,36%

108,14%

110,47%

Trung bình tăng trọng

Đạt yêu cầu

Kết luận

Đạt yêu cầu

Bảng 5.2. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu của vắcxin dại trên nuôi cấy

tế bào Vero

VERAPVAX

VERALVAX

Kết quả theo dõi sau 14 ngày

Loạt 0209

Loạt 0309

Bán thành phẩm Loạt 0210

0/10

Số chuột chết, liệt hoặc có bệnh lý

224,53%

206,26%

Trung bình tăng trọng 212,09%

Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu

Kết luận

153

Bảng 5.3. Kết quả kiểm tra chất gây sốt của vắcxin dại trên nuôi cấy tế

bào Vero dạng lỏng (VERALVAX)

Sản phẩm

Nhiệt độ tăng của từng thỏ

Kết luận

Tổng nhiệt độ tăng

Thỏ 1

Thỏ 2

Thỏ 3

Đạt yêu cầu

Tiêu chuẩn

Đạt yêu cầu

Loạt 0110

Đạt yêu cầu

Loạt 0210

<0,60C 0,10C 0,40C 0,30C

0,30C 0,10C 0,10C

<1,40C 0,80C 0,70C 0,70C

Đạt yêu cầu

0,40C 0,20C 0,30C

Loạt 0310

Theo kết quả trong Bảng 5.1, Bảng 5.2 và Bảng 5.3, vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero ở cả 2 dạng đông khô và hấp phụ với nhôm phosphate

đều đạt yêu cầu về tính an toàn khi kiểm tra trên động vật thực nghiệm.

5.2.2. Đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero trên

động vật thí nghiệm

Vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero được sử dụng trong nghiên cứu là

vắcxin được sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm tại Công ty Vắcxin và sinh

phẩm số 1 dưới hai dạng thành phẩm khác nhau là vắcxin đông khô

(VERAPVAX) và vắcxin hấp phụ với nhôm phosphate (VERALVAX). Các

vắcxin này được đánh giá so sánh về đáp ứng miễn dịch với các nhóm chứng

tiêm nước muối sinh lý và nhóm tiêm một vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Vero đã được thương mại hóa có hiệu quả phòng bệnh cao trên người

(Verorab của Sanofi-Pasteur, Pháp). Kết quả về đáp ứng miễn dịch trên chuột

đối với các dạng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero khác nhau được trình

bày trong Bảng 5.4. Giống chuột được lựa chọn trong nghiên cứu này là chuột

NMRI. Đây là giống chuột được nhiều nhà sản xuất sử dụng để đánh giá đáp

154

ứng miễn dịch đối với vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào [8], [39].

Bảng 5.4. So sánh đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào

Vero do VABIOTECH sản xuất với vắcxin Verorab

Chỉ số

Verorab

Chứng âm

Ngày đánh giá

VERAPVAX Loạt 0309

VERALVAX Loạt 0210

7/10 (70%)

9/10 (90%)

0/10 (-)

Ngày 7

Tỷ lệ*

1,66

4,30

0,22

Mức độ# 1,15

9/10 (90%)

0/10 (-)

Ngày 14

Tỷ lệ*

11,53

21,50

0,30

Mức độ# 10,64

10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Ngày 21

Tỷ lệ*

17,96

24,20

0,22

Mức độ# 17,81

10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Ngày 28

Tỷ lệ*

4,06

14,02

0,32

Mức độ# 4,41

10/10 (80%)

10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Ngày 42

Tỷ lệ*

8,80

18,25

0,12

Mức độ# 3,99

10/10 (100%) 10/10 (100%) 10/10 (100%) 0/10 (-)

Ngày 56

Tỷ lệ*

10,23

27,85

0,33

Mức độ# 2,69

*Tỷ lệ có đáp ứng miễn dịch là tỷ lệ giữa số chuột có kết quả xét nghiệm kháng thể kháng virút dại dương tính trên tổng số chuột được gây miễn dịch #Mức độ đáp ứng miễn dịch được xác định bằng giá trị trung bình nhân (GMT) của các hiệu giá kháng thể kháng virút dại tính theo IU/ml.

Kết quả trong Bảng 5.4 cho thấy chuột nhắt trắng NMRI là mô hình

thực nghiệm thích hợp để đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero. Sau 2 liều tiêm đầu tiên vào ngày 0 và 7, hầu hết chuột

(90%) ở tất cả ba nhóm tiêm vắcxin đã có được đáp ứng miễn dịch bảo vệ.

Kháng thể này tăng cao nhất vào ngày thứ 21 sau đó giảm thấp vào ngày thứ

28. Kháng thể tiếp tục tăng cao cho đến ngày thứ 56 sau khi tiêm liều vắcxin

thứ ba. Kết quả này tương tự với nhiều nghiên cứu khác đã được tiến hành

trên động vật sau khi tiêm các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero [18], [26]

155

hoặc tế bào phôi gà [8]. Tỷ lệ có đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm tiêm

vắcxin là tương đương nhau, tuy nhiên, nhóm tiêm vắcxin Verorab có hiệu giá

kháng thể cao hơn so với các nhóm tiêm vắcxin VERAPVAX và

VERALVAX. Tuy nhiên, có được đáp ứng miễn dịch bảo vệ sớm với hiệu giá

kháng thể ≥0,5 IU/ml mới là yếu tố chính để đánh giá về hiệu lực của vắcxin

dại. Kháng thể sớm sẽ giúp trung hòa virút ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể,

giúp ngăn chặn sự lây lan và phát tán của virút theo hệ thống thần kinh từ đó

156

gây ra các bệnh lý nghiêm trọng [52], [55].

KẾT LUẬN

Nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero

- Vô khuẩn - Mycoplasma - Virút ngoại lai - Virút hấp phụ hồng cầu

Gây nhiễm virút dại vào tế bào Vero

Nuôi cấy vi rút và thu hoạch nước nổi

- Vô khuẩn - Hiệu giá virút (FFD50/0,05 ml)

Tinh sạch hỗn dịch vi rút

Bất hoạt virút

- An toàn đặc hiệu

Cô đặc hỗn dịch vi rút

- Vô khuẩn - Hàm lượng ADN tế

Tinh chế virút

bào tồn dư - Hiệu giá virút (EL.U/ml)

Pha bán thành phẩm

cuối cùng

Sản xuất vắcxin thành phẩm

- An toàn đặc hiệu - Vô khuẩn - Công hiệu - Vô khuẩn - An toàn chung - Chất gây sốt - Thử nghiệm nhận dạng - Các thử nghiệm hóa lý

157

1. Xây dựng đươ ̣c qui trình công nghê ̣ sả n xuấ t vắ cxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở qui mô phòng thí nghiê ̣m đả m bả o tính ổ n đi ̣nh và cho hiê ̣u suấ t cao theo cá c công đoa ̣n sau:

2. Sản xuất được các loạt vắc xin dại có chất lượng đạt yêu cầu của Tổ

chức Y tế thế giới và tương đương với các vắc xin cùng loại của nước

ngoài như vắc xin Verorab của Aventis Pasteur

- Dựa trên quy trình công nghệ đã được xây dựng, 03 loạt vắcxin dại trên

nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng hấp phụ nhôm đã đươ ̣c sản xuất ở quy mô

phòng thí nghiệm đạt các tiêu chuẩn chất lượng so với qui định của

TCYTTG về các chỉ số : vô khuẩn, an toàn chung , an toàn đặc hiệu , chất gây sốt, công hiệu và hóa lý:

 Nhận dạng : đạt yêu cầu

 Vô khuẩn : đạt yêu cầu

 pH : đạt yêu cầu (giao động trong khoảng 7,48 - 7,50)

 Hàm lượng Thimerosal (%) : đạt yêu cầu (0,0053 - 0,0055)

 Công hiệu (IU/1ml): đạt yêu cầu (2,82-3,13).

 Hàm lượng nhôm (µg/ml) : đạt yêu cầu (265,53 - 272,50).

 An toàn chung trên chuột lang: đạt yêu cầu.

 An toàn chung trên chuột nhắt: đạt yêu cầu.

 Chất gây sốt: đạt yêu cầu (nhiệt độ tăng từ 0,7 - 0,8oC)

 An toàn đặc hiệu (đối với bán thành phẩm tinh chế) : đạt yêu cầu

- Kết quả đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vắcxin trên động vật thí

nghiệm cho thấy vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào sản xuất theo qui trình đã đươ ̣c xây dựng đều đa ̣t yêu cầu về an toàn và công hiê ̣u.

 Vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero dạng lỏng hấp phụ với nhôm đạt 

yêu cầu về tính an toàn chung, an toàn đặc hiệu và chất gây sốt khi kiểm  tra trên động vật thực nghiệm. 



158



 Các dạng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero thành phẩm do

159

VABIOTECH nghiên cứ u sản xuất cho đáp ứng miễn dịch qua các liều tiêm đều tương đương so với vắcxin đã được thương mại (Verorab).

KIẾN NGHỊ

1. Tiến hành thử nghiệm thực địa lâm sàng đánh giá tính an toàn và hiệu

lực gây miễn dịch trên người tình nguyện

2. Đánh giá tính ổn định và hiệu suất của quy trình sản xuất ở quy mô

160

mở rộng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Thị Kiều Anh, Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông, Nguyễn

Thị Hồng Hạnh. Thử nghiệm tinh chế virus dại bằng siêu ly tâm qua dung

dịch đường nồng độ 10-40%. Tạp chí Y học dự phòng, 2009, tập XIX, số 7

(106), 88-94.

2. Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Đinh Kim Xuyến,

Ngô Châu Giang, Nguyễn Vĩnh Đông. Thử nghiệm sản xuất kháng nguyên

vi rút dại tế bào cô đặc bằng phương pháp siêu lọc. Tạp chí Y học dự phòng,

2009, tập XIX, số 7 (106), 95-101.

3. Đinh Kim Xuyến. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể và độ an toàn của vắc

xin dại Verorab sản xuất tại Pháp theo phương pháp tiêm bắp và tiêm trong da

trên người Việt Nam tình nguyện. Tạp chí Y học dự phòng, 2003, tập XIII, số

6 (63), 134-139.

4. Đinh Kim Xuyến. Nghiên cứu đáp ứng kháng thể và độ an toàn của

vắcxin dại tế bào, tinh chế , cô đặc, bất hoạt, đông khô sản xuất tại Viện Bại

liệt và Viêm não virút Chumakov của Viện Hàm lâm khoa học Y học liên

bang Nga theo phương pháp tiêm trong da trên người Việt Nam tình nguyện.

Đề tài Nghiên cứu khoa học cấp cơ sở, 2007.

Tiếng Anh

5. Atanasiu P., Tsiang H., Reculard P., Aguilon F., Lavergne M.,

Adamivicz P. Zonal centrifuge purification of human rabies vaccine abtained

on bovine fetal kidney cells: biological results. Develop. Biol. Standard.,

161

1977, 40, 35-44.

6. Barth R., Franke V. Fetal rhesus monkey lung diploid cell vaccine for

humans. In: Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 297-300.

7. Barth R., Franke V., Lin F.T. Primary hamster kidney cell vaccine for

humans. In: Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 306-309.

8. Barth R., Gruschkau H., Bijok U., Hilfenhaus J., Hinz J., Milcke L.,

Moser H., Jaeger O., Ronneberger H., Weinmann E. A new inactivated

tissue culture rabies vaccine for use in man: evaluation of PCEC-vaccine by

laboratory tests. J. Biol. Standard., 1984, 12, 29-46.

9. Berlin B.S. Rabies vaccine adsorbed: neutralizing antibody titers after

three-dose pre-exposure vaccination. AJPH, 1990, 80 (4), 476-478.

10. Berlin B.S., Mitchell J.R., Burgoyne G.H., Brown W.E., Goswick C.

Rhesus diploid rabies vaccine (adsorbed), a new rabies vaccine. JAMA, 1983,

249 (19), 2663-2666.

11. Branche R. Vaccine for humans prepared in human diploid cells. In:

Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 280-284.

12. CDC. Current trends rabies vaccine, adsorbed: a new rabies vaccine for

use in humans. MMWR, 1988, 37 (14), 217-223.

13. CDC. Human rabies prevention-United States, 2008: Recommendation

of advisory committee on Immunization practices. MMWR, 2008, 57(RR03),

1-28.

14. El-Karamany R.M. Production in Vero cells of an inactivated rabies

vaccine from strain FRV/K for animal and human use. Acta Virol, 1987, 31,

162

321-328.

15. European Pharmacopoeia. Rabies vaccine, 2003.

16. Fangtao L. The protective effect of the large-scale use of PHKC rabies

vaccine in humans in China. Bull. World Health Org., 1990, 68 (4), 449-454.

17. Fournier-Caruana J., Poirier B., Haond G., Jallet C., Fuchs F.,

Tordo N., Perin P. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an

ELISA method. Biologicals, 2003, 31, 9-16.

18. Frazatti-Gallina N. M., Mourao-Fuches R. M., Paoli R. L., Silva

M.L. N., Miyaki C., Valentini E. J. G., Raw I., Higashi H. G. Vero-cell

rabies vaccine produced using serum-free medium. Vaccine, 2004, 23, 511-

517.

19. Frazzati-Gallina N.M., Paoli R.L., Mourao-Fuches R.M., Jorge

S.A.C., Pereira C.A. Higher production of rabies virus in serum-free medium

cell cultures on microcarriers. J. Biotechnol., 2001, 92, 62-72.

20. Hilfenhaus J., Kole R., Barth R., Majer M., Mauler R. Large-scale

purification of animal viruses in the RK-model zonal ultracentrifuge. J. Biol.

Standard., 1976, 4, 263-271.

21. Horaud F. Viral vaccines and residual cellular DNA. Biologicals, 1995,

23, 225-228.

22. Kammer A.R., Ertl H.C.J. Rabies vaccine: From the past to the 21st

century. Hybridoma and Hybridomics, 2002, 21 (2), 123-127.

23. Kumar A.A.P., Mani K.R., Palaniappan C., Bhau L.N.R.,

Swaminathan K. Purification, potency and immunogenicity analysis of Vero

cell culture-derived rabies vaccine: a comparative study of single-step column

chromatography and zonal centrifuge purification. Microbes and infection,

163

2005, 23-30.

24. Kumar A.A.P., Rao Y.U.B., Joseph A.L.W., Mani K.R.,

Swaminathan K. Process standardization for optimal virus recovery and

removal of substrate DNA and bovine serum proteins in Vero cell-derived

rabies vaccine. J. Bioscience and bioengineering, 2002, 94 (5), 375-383.

25. Lyng J., Bentzon M.W., Ferguson M., Fitzgerald E.A. Rabies vaccine

standardization: international collaborative study for the characterization of

the fifth international standard for rabies vaccine. Biologicals, 1992, 20, 301-

313.

26. Mendonca R.Z., Ioshimoto L.M., Mendonca R.M.Z., De-Franco M.,

Valentini E.J.G., Becak W., Raw I., Pereira C.A. Preparation of human

rabies vaccine in Vero cell culture using a microcarrier system. Brazillian J.

Med. Biol. Res., 1993, 26, 1305-1317.

27. Meslin F.X., Kaplan M.M. General considerations in the production

and use of brain-tissue and purified chicken-embryo rabies vaccine for human

use. In: Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 223-233.

28. Michell J.R., Everest R.E., Anderson G.R. Sensitive procedure for

detecting residual viable virus in inactivated rabies vaccine. Appl. Microbiol.,

1971, 22 (4), 600-603.

29. Montagnon B. J. Polio and rabies vaccine produced in continuous cell

lines: A reality for Vero cell line. Develop. Biol. Standard., 1989, 70, 27-47.

30. Montagnon B.J, Fanget B. Purified Vero cell vaccine for human. In:

Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 285-289.

31. Montagnon B.J. Polio and rabies vaccines produced in continuous cell

164

lines: a reality for Vero cell line. Develop. Biol. Standard., 1989, 70, 27-47.

32. Montagnon B.J., Vincent-Falquet J.C. Experience with the Vero cell

line. Dev. Biol. Stand., 1998, 93, 119-123.

33. Morgeaux S., Tordo N., Gontier C., Perrin P. β-propiolactone

treatment impairs the biological activity of residual DNA from BHK-21 cell

infected with rabies virus. Vaccine, 1993, 11(1), 82-90.

34. Nicholson K.G. Cell-culture vaccines for human uses general

considerations. In: Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 271-280.

35. NIID. Free-dried inactivated tissue culture rabies vaccine. Minimum

requirement for Biological products, 2006, 37-40.

36. Perez O., Paolazzi C.C. Production methods for rabies vaccine. J.

Inducstrial. Micro. Biotech., 1997, 18, 340-347.

37. Perrin P., Lafon M., Sureau P. Enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) for the determination of the glycoprotein content of rabies vaccines.

In: Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996,383-388.

38. Perrin P., Morgeaux S. Inactivation of DNA by β-propiolactone.

Biologicals, 1995, 23, 207-211.

39. Ronneberger H., Gruschkau H., Majer M. Rabies vaccine HDC:

toxicological studies in laboratory animals. Develop. Biol. Standard., 1977,

40, 215-220.

40. Singh H. β-propiolactone-inactivated sheep brain vaccine. In: Meslin F.- X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed.

165

Geneva, WHO, 1996, 234-242.

41. Sizaret P. General consideration in testing the safety and potency of

rabies vaccines. In: Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 355-358.

42. Smith J.S., Yager P.A., Baer G.M. A rapid fluorescent focus inhibition

test (RFFIT) for determining rabies virus-neutralizing antibody. In: Meslin F.- X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed.

Geneva, WHO, 1996,181-193.

43. Swanson M.C., Rosanoff E., Gurwith M., Deitch M.,

Schnurrenberger P., Reed C.E. IgE and IgG antibodies to β-Propiolactone

and human serum albumin associated with urticarial reactions to rabies

vaccine. J. Infect. Dis., 1987, 155 (5), 909-913.

44. Thraenhart O., Ramakrishnan K. Standardization of an enzyme

immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies

vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal

antisera. J. Biol. Standard., 1989, 17, 291-309.

45. Toovey S. Preventing rabies with the Verorab vaccine: 1985-2005

twenty years of clinical experience. Travel Med. Infect. Dis., 2007, 5, 327-

348.

46. Tordo N. Characteristics and molecular biology of rabies virus. In:

Meslin F.-X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed. Geneva, WHO, 1996, 28-51.

47. Trabelsi K., Rourou S., Loukil H., Majoul S., Kallel H. Comparison

of various culture modes for the production of rabies virus by Vero cells

grown on microcarriers in a 2-l bioreactor. Enzyme Microbial Technology,

166

2005, 36, 514-519.

48. Trabelsi K., Rourou S., Loukil H., Majoul S., Kallel H. Optimization

of virus yield as a strategy to improve rabies vaccine production by Vero cells

in bioreactor. J. Biotechnol., 2006, 121, 261-271.

49. US Pharmacopoeia. Rabies vaccine. 2000.

50. Van Wezel A.L., van der Marel P., van Beveren C.P., Salk P.L., Salk

J. Detection and elimination of cellular nucleic acids in biological produced

on continuous cell lines. Develop. Biol. Standard., 1982, 50, 59-69.

51. Vincent-Falquet J.C., Peyron L., Souvras M., Moulin J.C., Tektoff

J., Patet J. Qualification of working cell banks for the Vero cell line to

produce licensed human vaccines. Develop. Biol. Standard., 1989, 70, 153-

156.

52. Warrell M. J., Warrell D.A. Rabies and other Lyssavirus diseases.

Lancet, 2004, 363, 959-969.

53. WHO. Requirement for the use of animal cells as in vitro substrates for

the production of biologicals. WHO Expert Committee on Biological

Standardization, 1998, Annex 1, WHO Technical Report Series, No. 878.

54. WHO. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use

produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report

Series, 2007, 941.

55. WHO. WHO position paper on rabies vaccines. Weekly epidemiological

record, 2007, 82, 425-436.

56. WHO. WHO study group on cell substrates for production of

167

biologicals. WHO meeting report, 2007.

57. Wiktor T.J., Aaslestad H.G., Kaplan M.M. Immunogenicity of rabies

virus inactivated by β-propiolactone, acetylethyleneimine, and ionizing

irradiation. Appl. Microbiol., 1972, 23 (5), 914-918.

58. Wilbur L.A., Aubert M.F.A. The NIH test for potency. In: Meslin F.- X., Kaplan M.M., Koprowski H. Laboratory techniques in rabies, 4th ed.

Geneva, WHO, 1996, 360-368.

59. Yokomizo A.Y., Antoniazzi M.M., Galdino P.L., Azambuja N., Jorge

S.A.C., Pereira C.A. Rabies virus production in high Vero cell density

cultures on macroporous microcarriers. Biotechnology and Bioengineering,

2004, 85 (5), 506-515.

60. Yoneyama T., Zibai Q., Miyamura T. A sensitive method for the

detection of residual cell DNA in a recombinant hepatitis B vaccine prepared

168

from Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Standard., 1989, 17, 371-375.

Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phòng thí nghiệm

Chủ đề:

Báo cáo thực tập dược học

C«ng ty V¾cxin vµ Sinh phÈm sè 1 B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi: Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin d¹i trªn nu«i cÊy tÕ bµo Vero ë quy m« phßng ThÝ nghiÖm Cn®t: §ç TuÊn §¹t

8514

Hµ néi – 2010

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN

Mô đƣợc sử dụng

Chủng virút

Loại vắcxin

Phƣơng pháp bất hoạt

Sử dụng cho ngƣời

Dạng vắcxin

Pháp (Paris) 1882

Mỹ (Georgia) 1939

Trung Quốc 1931

Mỹ (Alabama) 1935

Dại ở bò

Dại ở chó

Dại ở người

Dại ở chó

Argentina

Mỹ - K.Habel 1940

SAD

Flury HEP/LEP

Beijing-31

PM

Vnukovo-32

Tá dƣợc

Loại tế bào

Chủng virút

Phƣơng pháp cô đặc

Phƣơng pháp bất hoạt

Tiêm phòng trƣớc khi bị cắn

Tiêm phòng sau khi bị cắn

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO

Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Nuôi cấy và chuẩn bị tế bào Vero

Gây nhiễm virút dại vào tế bào Vero

Nuôi cấy virút và thu hoạch nƣớc nổi

Tinh sạch hỗn dịch virút

Bất hoạt virút

Cô đặc hỗn dịch virút

Tinh chế virút

Đời cấy chuyển Hình ảnh tế bào

Đời cấy chuyển Hình ảnh tế bào

Liều gây nhiễm

Ngày sau gây nhiễm

0,1 MOI

0,01 MOI

0,001 MOI

Ngày 1

10-1,5

-

-

Ngày 2

10-2,3

-

-

Ngày 3

10-3,58

10-1,25

-

Ngày 4

10-3,27

10-2,58

10-1,55

Ngày 5

10-3,16

10-3,82

10-2,15

Ngày 6

(thay môi trƣờng)

10-3,02