Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo)

LOGO

Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo)

Nguyen Thi Viet Anh

Nội dung

1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp

1.1. Khái niệm 1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.4. Nhân dòng gen (gene cloning) 1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen

2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA 2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA 2.3. Phương pháp PCR 2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA) 2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR) 2.7. Genomic và proteomic

www.themegallery.com

2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

 Ngân hàng bộ gen:

 Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);  Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA):

• Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…); • Bao gồm exon và intron; • VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn; • tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách

dòng trong tế bào chủ;

• Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi.

www.themegallery.com

2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn

Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều đoạn khác nhau

Bước 3: đoạn DNA được đưa vào vector

www.themegallery.com

Ngân hàng cDNA

 Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);  Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược

mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);

 Exon;  Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…  cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào, từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng cDNA của một cơ quan nào đó.

 VD: rễ lúa

www.themegallery.com

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA

 Kỹ thuật phiên mã ngược

tạo cDNA:  Tách chiết và tinh sạch mRNA của

tế bào;

 Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn mồi (primer) đặc hiệu, các loại nucleotide tự do, DNA polymerase…

 mRNA tổng hợp nên cDNA;  Enzyme RNase H để phân huỷ sợi

khuôn RNA;

 Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2

www.themegallery.com

Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA

 Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm

phương pháp chủ yếu:  Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA (cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S1 nuclease cắt bỏ);

 Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid

amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA.

 Video cDNA libraries

www.themegallery.com

Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA

 Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:

 Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của

một gen;

 Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1

loại protein;

 Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng

mong muốn từ ngân hàng gen.

www.themegallery.com

Phương pháp PCR

 PCR = Polymerase chain reaction: phản

ứng polymerase dây chuyền:  Khuếch đại một lượng lớn đoạn DNA trong điều

kiện in-vitro;

 Trong ống nghiệm plastic nhỏ (ependoff);  Khác hẳn với sự tạo dòng các đoạn DNA bằng tế

bào vi khuẩn hay nấm men;

www.themegallery.com

Phương pháp PCR

 Nguyên tắc thực hiện:

 Sự khuếch đại nhờ vào chu trình nhiệt lập lại (~35 lần) gồm

các bước: 1. Đun nóng, biến tính (950C); 2. Làm nguội, gắn mồi (37-650C); 3. Ủ dài, tổng hợp (720C).

 Sử dụng các đoạn mồi (primer) để bắt cặp bổ sung với đầu

đoạn mạch tương ứng;

 DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, vi khuẩn

Thermophilus aquatus)

www.themegallery.com

Phương pháp PCR

www.themegallery.com

Phương pháp PCR

 Phản ứng PCR:

 Khuôn mẫu (DNA cần khuếch đại);  Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide);  DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase);  Các nucleotide tự do (dNTP);  Dung dịch đệm thích hợp;  Video phản ứng PCR

www.themegallery.com

Phương pháp PCR

 Lợi ích:

 Khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu  Thời gian thực hiện cực nhanh;  Đơn giản và ít tốn kém;  Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.

Giới hạn:

 Cần phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất là một

phần của đoạn cần khuếch đại).

www.themegallery.com

Phương pháp PCR

 Các dạng PCR mở rộng:

 RT-PCR (reverse transcripstase PCR): mRNA làm khuôn mẫu chuyển thành cDNA cho sự khuếch đại PCR;

 Real-Time PCR: PCR định lượng, có thể biết được số lượng DNA khuếch đại trong quá trình khuếch đại;  PCR-ELISA: kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đoán.

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA



 DNA: một chuỗi xoắn kép: 4 loại Nucleotide: A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanine), T (Thymine);

 Xác định trình tự của DNA

(sequencing) là biết được trình tự sắp xếp của 4 loại Nu trên chuỗi DNA.

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp hoá học xác định trình tự

DNA của Maxam và Gilbert: 1. Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của DNA; 2.

Xử lí với hoá học làm biến đổi 1 hay 2 base (dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và NaCl làm biến đổi Cytosine…);

3. Các Nucleotide biến đổi sẽ bị lấy ra khỏi chuỗi DNA; 4. 4 loại Nucleotide4 nhóm với 4 bản điện di  Tổng hợp đầy đủ 4 bản điện di sẽ phản ánh đầy đủ trình tự các nucleotide của đoạn DNA.

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp hoá học xác định trình tự

DNA của Maxam và Gilbert:

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Phương pháp hoá học xác định trình tự DNA của

Maxam và Gilbert:

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Hạn chế của phương pháp hoá học

xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert:  Khó thực hiện;  Cần nhiều thông số tối ưu từ thí nghiệm;  Xác định nồng độ giới hạn của các chất hoá học;

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phương pháp dideoxy

của F. Sanger: 1. Dideoxynucleotide: mất

nhóm OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose (nơi gắn dNTP kế cận)dừng tổng hợp DNA; 2. 4 phản ứng với 4 loại ddNTP

(A, T, C, G)

3. Cũng có 4 bản điện di

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Các phương

pháp xác định trình tự DNA thế hệ mới:  Dùng 4 màu

huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP

www.themegallery.com

Kỹ thuật xác định trình tự DNA

Kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự nối với chất hoá học 4 màu

Kỹ thuật giải trình tự 454 pyrosequencing

www.themegallery.com

Kỹ thuật RFLP

 Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA):  RFLP=Restriction fragment length polymorphism;  Dựa trên đặc điểm của các loại enzyme cắt giới hạn;  Các đoạn cắt = các “dấu vân tay” (fingerprinting) đặt

trưng cho từng loại phân tử;

 Bản đồ di truyền các kết quả của RFLP: xác định

nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hoá của các loài sinh vật

www.themegallery.com

Kỹ thuật RFLP

 Bao gồm các bước:

 Tách chiết và tinh sạch DNA;  Xử lí bằng enzyme cắt giới hạn;  Điện di đoạn cắt trên gel agarose;  Southern blotting (lai DNA/DNA)

www.themegallery.com

Kỹ thuật RFLP

 Southern blotting:  Phương pháp lai giữa các đoạn DNA mạch đơn của mẫu cần nghiên cứu với các mẫu dò đánh dấu phóng xạ (các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự)  Gồm các bước:

Caét ADN baèng men giôùi haïn Ñieän di treân gel Bieán tính ADN (NaOH & NaCl) Chuyeån ADN sang maøng (transfer) Lai vôùi maãu doø ñöôïc ñaùnh daáu baèng ñoàng vò phoùng xaï Röûa maøng lai Phaùt hieän phaân töû lai nhôø phoùng xaï töï ghi (autoradiography)

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Kỹ thuật RFLP

 Ứng dụng:

 Chọn lọc các cá thể; chọn giống động thực vật;  Phát hiện các cặp gen nghiên cứu là đồng hợp hay

dị hợp tử hay có liên kết gen…;

 Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng

theo quy luật Mendel;

 So sánh sự tiến hoá của các loài;  So sánh sự khác nhau giữa các cá thể trong loài.

www.themegallery.com

Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR  Kỹ thuật AFLP:

 AFLP = Amplified fragment length polymorphism (các đoạn DNA đa hình được khuếch đại chọn lọc);  Các cặp mồi (primer) đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA

cần nghiên cứu;

 Thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi được nối thêm 1 hoặc 2 nucleotide ở đầu 3’ (hoặc 5’) của mồiđể nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao;

 Cho phép phân biệt mức độ giống nhau khác nhau

của các đơn vị dưới loài (quan hệ di truyền gần nhau)

www.themegallery.com

Kỹ thuật AFLP

www.themegallery.com

Kỹ thuật AFLP

www.themegallery.com

Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR

 Kỹ thuật SSR:  SSR = Simple

sequence repeat (các trình tự lặp lại đơn giản, Arbitrary primer- PCR, PCR mồi tự chọn);

www.themegallery.com

Kỹ thuật SSR

 Các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeat):  Hay còn gọi là

microsatellite (vi vệ tinh);

 Phổ biến trong hệ gen động vật và thực vật;  Thường gồm từ 2-6 cặp

base;

 Số lượng lặp lại từ 2-40

www.themegallery.com

lần.

Kỹ thuật SSR

 Ưu điểm:

 Khả năng phát hiện tính đa hình cao;  Phát hiện được kiểu gen đồng hợp hay dị hợp.  Tiết kiệm thời gian và hoá chất.

 Nhược điểm:

 Thiết kế mồi đặc hiệu cho từng locus;  Khó xác định mối quan hệ giữa các allele với những

trình tự lặp lại SSR này.

www.themegallery.com

Ý nghĩa của các kỹ thuật

Gene

Đặc tính Nguồn

Nhiễm sắc thể

Liên kết marker

Khoảng cách

Bph-10(t) Rầy nâu O.australi

12

RG457

3.68 cM

ensis

Pi-1

Đạo ôn

LAC23

11

Npb181

3.5 cM

Xa-1

Bạc lá

Kogyoku 4

Npb235

3.3 cM

Xa-4

Bạc lá

IR20

11

Npb181

1.7 cM

www.themegallery.com

Bản đồ di truyền nhiễm sắc thể số 12 của cà chua

www.themegallery.com

Bản đồ di truyền nhiễm sắc thể số 10 của bắp

www.themegallery.com

Genomics

 Giải kí tự chuỗi DNA của hàng loạt mô hình:  Vi khuẩn E.coli (kích thước 4,6 Mb; năm 1997; số lượng

4.200 gen);

 Nấm men Saccharomyces (kích thước 12,1 Mb; năm 1996; số

lượng 6.034 gen);

 Thực vật Arabidopsis thaliana (kích thước 100 Mb; năm 2000;

số lượng 25.000 gen);

 Con người (kích thước 3200 Mb; năm 2003; số lượng khoảng

30.000 gen)

www.themegallery.com

Genomics

www.themegallery.com

Genomics

 Genome = bộ gen;  Sự giải kí tự chuỗi thành công ở bộ gen người và

hàng trăm sinh vật khác đã tạo nên khoa học về bộ gen gọi là Genomics hay bộ gen học;

 Cho phép hiểu chi tiết về cơ chế phân tử của sự

sống, xác định được trình tự DNA nhanh chóng và các chức năng;

www.themegallery.com

 Phát hiện, bảo tồn và sử dụng sự đa dạng sinh học.

Proteomics

 Proteomics: nghiên cứu toàn bộ các phức hợp protein, gồm vị trí, chức năng, các biến đổi và tương tác;

 Ứng dụng trong sản xuất ra hormon và vaccin có

hiệu quả với số lượng lớn;  Mạng lưới các gen điều hoà;  Chữa trị một số bệnh do thiếu biến đổi sau dịch mã;  Mạng lưới biểu hiện gen giữa các loài

www.themegallery.com

www.themegallery.com

Tài liệu tham khảo

 Nhập môn CNSH – Phạm Thành Hổ;  Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thuỳ Dương;  Biện pháp sinh học trong Bảo vệ thực vật – Nguyễn Văn Đĩnh;  Bài giảng về công nghệ sinh học trong bệnh cây-Hà Viết Cường;  System biology – Pierre Hilson;  Molecular breeding and biodiversity of plants- Isabel Roldan

Ruiz;

www.themegallery.com

 Google.com.vn  ….

LOGO