Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 3. Coâng ngheä phoâi voâ tính – Haït nhaân taïo
22
CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ PHÔI VÔ TÍNH – HẠT NHÂN TẠO
Một vấn đề trong việc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để tạo nên cây
con mới nhằm thay thế phương pháp nhân giống bằng hạt là phải tính đến việc
giảm nhân công lao động để từ đó giảm giá thành cây nuôi cấy mô. Một trong
những giai đoạn tốn nhiều sức lao động nhất là giai đoạn chuyển cây nuôi cấy mô
sang điều kiện ex vitro. Phôi vô tính có một ưu thế rất đặc biệt so với các thể nhân
giống in vitro khác là nó sở hữu một hệ thống vận chuyển tương tự như hạt ngoài
tự nhiên. Nhờ đó mà phôi vô tính được nghiên cứu rất nhiều và được sử dụng để
làm vật liệu để sản xuất hạt nhân tạo, đây là một phương pháp thu được nhiều lợi
nhuận dựa trên khả năng nhân giống cây trồng thông qua sự phát triển phôi sinh
dưỡng.
1. Phôi vô tính
Hạt là cơ quan bảo quản chất mầm và nhân giống ở tất cả thực vật có hoa.
Hạt có chứa phôi phát triển từ hợp tử sau khi sự thụ tinh giữa một tế bào trứng với
một giao tử đực diễn ra. Sự tái tổ hợp gene trong suốt quá trình hình thành cũng
như sự kết hợp giữa hai giao tử đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hoá của thực
vật hạt kín. Trong suốt quá trình tiến hóa, nhiều loài thực vật đã phát triển nên
những cách nhân giống mới để vượt qua các trở ngại gây ra bởi yếu tố môi trường,
gene, yếu tố vật lý làm ngăn cản quá trình ra hoa, tạo hạt. Các cách nhân giống
mới này bao gồm sự tạo thành những cấu trúc như thân củ, thân rễ, củ, thân bò,...
Một hình thức tiến bộ khác xuất hiện ở những loài có khả năng sinh sản vô tính đó
là tạo phôi từ giao tử không được thụ tinh hoặc từ các tế bào sinh dưỡng. Cũng
giống như phôi hợp tử, các phôi vô tính này phát triển trong hạt, được bảo vệ và
phân tán đi như các hạt tự nhiên. Sinh sản vô tính được coi như là không chịu
kiểm soát bởi gene, nhưng các điều kiện môi trường về nhiệt độ, quang kỳ cũng
thúc đẩy sự phát triển từ hữu tính sang vô tính.
Sự tạo phôi vô tính bất định xuất hiện ở một số loài thực vật hạt kín trong
tự nhiên hay trong các thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp nuôi cấy mô
và tế bào thực vật in vitro. Quá trình hình thành phôi vô tính này được mô tả bằng
thuật ngữ “somatic embryogenesis”. Những mô tả đầu tiên về sự hình thành phôi
vô tính trong nuôi cấy tế bào được đưa ra khi nuôi cấy tế bào cà rốt. Kể từ đó thì
hiện tượng này được nghiên cứu thành công trên nhiều đối tượng một lá mầm
thuộc các họ: Alliaceae, Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae,
Henerocallidaeae, Iridaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae.
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 3. Coâng ngheä phoâi voâ tính – Haït nhaân taïo
23
1.1. Khái niệm về phôi vô tính
Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là khái niệm
để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới
những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng
hoàn chỉnh. Sự hình thành phôi vô tính được xem như là một con đường phát triển
riêng biệt, khác hẳn với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ. Trong đó, một tế
bào sẽ phát triển thành một cấu trúc có mô phân sinh chồi và rễ đầy đủ và không
có kết nối với hệ thống mao mạch của mô mẹ ban đầu. Sự tạo phôi vô tính là một
quá trình nguyên vẹn và vì vậy sự phát sinh chồi chỉ là một biến đổi của quá trình
cảm ứng và phát triển của phôi. Với quan niệm như trên thì sự tạo phôi có thể
được coi như là kết quả của một chuỗi các sự kiện phát sinh cơ quan cạnh tranh
nhau.
Không như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào
không chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng có mang
tính toàn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt
hóa hoàn toàn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất
định. Sự lặp lại toàn bộ chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự
tạo phôi đòi hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gene cần thiết. Sau khi đã
hoàn toàn thoát khỏi chức năng trước đó của các tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh
dưỡng mang tính toàn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng
thái biến dưỡng tương tự như phôi hợp tử.
Phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế
bào. Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hoá,
trưởng thành và phát triển thành cây con. Cây có thể phát triển từ một hay từ một
cụm tế bào phôi.
Sự sinh phôi từ một tế bào sinh dưỡng được định nghĩa là một quá trình mà
trong đó một hay vài tế bào sinh dưỡng, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm
việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật), có thể tham gia vào một quá
trình phân chia theo một trật tự nhất định để tạo thành một phôi, theo kiểu giống
hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử.
Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phôi
có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động
biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không
bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt
là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 3. Coâng ngheä phoâi voâ tính – Haït nhaân taïo
24
lưới nội chất nhỏ. Các tế bào có khả năng sinh phôi được phân biệt rõ ràng với các
tế bào không có khả năng sinh phôi dựa trên những đặc tính trên.
Phôi vô tính được hình thành sau khi được cảm ứng sẽ trải qua những giai
đoạn phát triển tương tự như phôi hợp tử. Đối với phôi của thực vật hai lá mầm thì
sau giai đoạn tiền phôi sẽ là giai đoạn phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và giai
đoạn 2 lá mầm tương tự như ở phôi hữu tính (Hình 3.1). Phôi của thực vật một lá
mầm sẽ trải qua giai đoạn hình cầu (hình trứng hay hình chùy), bao lá mầm và lá
mầm (một lá mầm hay thuẫn). Quá trình hình thành cơ quan tính từ khi phôi hình
cầu phát triển sang giai đoạn lá mầm được gọi là sự biệt hóa mô. Sự tạo cơ quan
phôi một lá mầm về căn bản giống ở cây hai lá mầm trừ vài khác biệt về số tử diệp
hay tính đối xứng của phôi.
Hình 3.1. Các biến đổi hình thái hợp tử cây Capsella bursa-pasturis
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có
quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ
tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Về nguyên tắc, tất cả những cây con được tái
sinh bằng con đường này đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng
cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gene thì các cây tái sinh là cây chuyển gene.
Nhân giống vô tính thực vật qua con đường phát sinh phôi vô tính cho hệ số nhân
rất cao. Tuy nhiên, sự phát triển bình thường của tất cả các phôi này là cả một vấn
đề. Các công ty hạt giống đang nghiên cứu quá trình này để sản xuất hạt nhân tạo.
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 3. Coâng ngheä phoâi voâ tính – Haït nhaân taïo
25
1.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phôi vô tính
Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều có chứa toàn bộ thông tin di
truyền cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn thiện với đầy đủ
các chức năng cần thiết. Trong suốt quá trình phát triển, sự biểu hiện gene ở thực
vật được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa
của rất nhiều cơ quan trong cơ thể. Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm
kết thúc sự biểu hiện của một gene trong mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế
nó bằng chương trình biểu hiện của gene sinh phôi. Thuật ngữ IEDC (induced
embryogenic determined cell) nhằm mô tả những tế bào có khả năng sinh phôi xuất
phát ban đầu là những tế bào không sinh phôi. Những tế bào của phôi hợp tử đã có
sẵn chương trình biểu hiện của các gene sinh phôi thì được gọi bằng thuật ngữ
PEDC (pre-embryogenic determined cell). Cả IEDC và PEDC đều có chức năng
tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả hai có thể được gọi chung bằng thuật
ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay gọi đơn giản là EC – embryogenic
cell. Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi vì sự hình thành phôi vô tính không
phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy
là các tế bào sinh phôi này có tính mềm dẻo trong một số trường hợp.
Các thí nghiệm nhằm hình thành phôi vô tính đều phụ thuộc vào việc mô
cấy chứa các PEDC hoặc là EC. Nếu mô cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích
thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự
hình thành phôi vô tính trực tiếp bởi vì phôi xuất hiện trực tiếp từ mô cấy. Ngược
lại, nếu các mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì
chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của
auxin trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phôi. Các tế
bào được sinh ra do nhiều lần phân chia nguyên nhiễm được gọi là mô sẹo, và quá
trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính gián tiếp vì phải thông qua giai
đoạn tạo mô sẹo. Sự chuyển vị từ các tế bào mô sẹo sang trạng thái sinh phôi đi
kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống từ định hướng ngẫu nhiên
để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau.
Trong thực tế, một mô cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có
đặc tính sinh phôi và không sinh phôi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mô cấy
đó. Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính. Từ đó có thể
giải thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phôi của các loại mô cấy
khác nhau. Ví dụ, mô cấy cây đậu nành, cà chua, cây lanh chứa các tế bào già thì
tạo những phôi bất bình thường hơn những tế bào còn non. Khi các phôi hợp tử
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 3. Coâng ngheä phoâi voâ tính – Haït nhaân taïo
26
đậu nành đạt đến giai đoạn khi mà mọi sự phân chia tế bào đều kết thúc thì không
thể nào cảm ứng sự hình thành phôi vô tính nữa.
Hình 3.2. Vai trò tuổi sinh lý của mẫu cấy trong việc khởi phát
sự sinh phôi vô tính
Mẫu cấy bao gồm các tế bào có thể rơi vào các trạng thái giữa trạng thái có
khả năng sinh phôi (PEDC) và không có khả năng sinh phôi (non-EC). (A) Phôi
hợp tử còn non có nhiều khả năng sinh phôi nhất và sẽ đáp ứng các xử lý cytokinin
để hình thành phôi vô tính. (B) Phôi hợp tử trưởng thành hơn sẽ không còn khả
năng đáp ứng cytokinin riêng lẽ nữa mà đòi hỏi một nhân tố auxin để tạo phôi vô
tính. (C) Ở những loài thực vật và mô cấy mà có thể đảo ngược từ trạng thái không
sinh phôi sang có khả năng sinh phôi sẽ hình thành phôi vô tính thông qua giai
đoạn mô sẹo khi được xử lý kết hợp auxin và cytokinin. Những mô cấy này bao
gồm các tế bào cần được cảm ứng để có khả năng sinh phôi (IEDC).
1.3. Nguồn gốc của phôi vô tính
Một chủ đề có liên quan khác đó là phôi vô tính có nguồn gốc từ một tế bào
hay nhiều tế bào. Một giả thuyết cho rằng mô PEDC thì sẽ tạo thành phôi có
nguồn gốc từ nhiều tế bào, trong khi phôi vô tính thứ cấp (phôi vô tính có nguồn
gốc từ phôi vô tính khác) có khuynh hướng là từ tế bào đơn.