4/6/2011
Quá trình chọn lọc tự nhiên
• Trao đổi vật liệu di truyền tạo ra những tính trạng mong muốn gia tăng sản lượng cây trồng.
CHƯƠNG VII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT
• Tính trạng chỉ được tạo ra từ những dòng hữu thụ. • Không loại trừ được những tính trạng
không mong muốn.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA
• Mục đích thay đổi di truyền • Nguồn, chức năng và khả năng tiếp hợp • Giải quyết được những vấn đề trong bền vững của gene chuyển chương trình tạo giống cổ điển.
Overview genetic engineering
• Nhờ xác định và dòng hóa những gene chuyên biệt cho tính trạng mong muốn VD: tính trạng chịu rét, chịu mặn, kháng • Phân tích thành phần thực phẩm (hàm lượng dinh dưỡng, độc tố tích lũy,…) thuốc diệt cỏ, chín chậm, …
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA
Dòng hóa gene đích
• Nguồn gene đích có thể là DNA nhiễm sắc thể hay cDNA từ mRNA • Cây trồng chuyển gene thương mại đầu tiên: FLAVRSAVR tomato (Calgene Inc. ) • Enzyme công cụ • Vector tạo dòng
• Ức chế gene tạo enzyme polygalactu- ronase (PG) phân hủy pectin nhờ chuyển antisense gene
1
4/6/2011
Các enzyme công cụ
• Restriction enzymes (Enzyme cắt giới hạn) • Ligase (Enzyme nối)
Các vector tạo dòng
Cho trình tự DNA:
Phage λ: • DNA sợi đôi thẳng • Kích thước: 48,5 kb • Chèn DNA có kích thước 18-25 kb
B) Có thể xen đoạn DNA được phóng thích vào vector được cắt bởi enzyme BamHI (G/GATCC) hay không? Vẽ hình minh họa
Electron micrograph of bacterial phage from the host E. coli
5’… CCTAGATCTTTAACC…TAGATCTAA…3’ 3’…GGATCTAGAAATTGG…ATCTAGATT…5’ A) Xử lý DNA trên với enzyme giới hạn BgIII (A/GATCT). Sẽ thu được mấy đoạn DNA trong 2 trường hợp DNA đã cho là mạch thẳng và mạch vòng. Vẽ các đoạn DNA được phóng thích (nếu có)
Các vector tạo dòng
Các vector tạo dòng
Plasmid: • DNA vòng sợi kép, nằm ngoài NST VK • Chèn DNA có kích thước 18-25 kb Phage M13: • DNA sợi đơn vòng • Kích thước: 6,4 kb • Nhiều dạng biến đổi của M13 có mang
các polylinker (hay MCS)
pBR322 pBR322 pBR322 4361 bp 4361 bp
2
4/6/2011
Các vector tạo dòng
Các vector tạo dòng
Cosmid: • Là vector plasmid chứa gene cos của Phagemid: • Là sự kết hợp giữa phage M13 với phage λ Tái bản giống plasmid • Chèn được đoạn DNA lớn (35-45 kb)
Tạo plasmid tái tổ hợp
plasmid
Xây dựng DNA library
• Việc lựa chọn DNA hay cDNA phụ thuộc vào tính trạng mong muốn chuyên biệt và vào hệ phương pháp • Tập hợp những đoạn DNA hay cDNA được gắn vào vector thích hợp (plasmid hay phage) Xây dựng DNA library • Chuyển vector vào vi khuẩn để nhân số
lượng và chọn lọc DNA library
Sàng lọc gene mục tiêu
Sàng lọc gene mục tiêu
2. Sàng lọc: • Gene lacZ’ sản xuất β-galactosidase thủy giải X-gal tạo sản phẩm có màu xanh lam
1. Chọn lọc: • Vector mang gene kháng kháng sinh (tetracyclin, penicillin hay ampicillin) • Chỉ có dòng nào chứa vector mới sống được trên môi trường chọn lọc có chứa chất kháng sinh • Nếu có DNA gắn xen vào lacZ’ mất khả năng thủy phân X-gal khuẩn lạc không có màu xanh
3
4/6/2011
Sàng lọc gene mục tiêu
3. Xác định gene đích: • Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc • Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến tính DNA có chứa các probe đánh dấu phóng xạ
Xây dựng DNA library
Screening DNA library
• Tìm vết phóng xạ • So sánh với đĩa Petri ban đầu
Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium
Các phương pháp chuyển gene: • Gián tiếp qua
Agrobacterium • Trực tiếp: PEG, xung điện, bắn gene • Agrobacterium sống lân cận hay ngay trên bộ rễ xuyên qua các vết thương tổ chức tế bào thực vật phát sinh bướu
4
4/6/2011
Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium
• Tác nhân gây tạo bướu là Plasmid Ti của vi khuẩn
Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium • Gene tạo bướu nằm trên đoạn T-DNA • Sự di chuyển của T-DNA vào tế bào thực vật chịu sự quy định của gene vir
Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium
Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium
• Loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T-DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA.
• Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn.
Chuẩn bị Agrobacterium mang plasmid Ti chứa gene đích: • Sàng lọc E.coli chứa gene đích • Tiếp hợp giữa E.coli và Agrobacterium • Tái tổ hợp tương đồng
giữa 2 plasmid
5
4/6/2011
Quy trình chuyển gene nhờ Agrobacterium • Chuẩn bị mô cấy và dịch huyền phù VK • Ngâm chung mô với vi khuẩn • Nuôi chung mô với vi khuẩn (2 ngày) • Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh • Cấy chuyền mô sang môi trường có tác
nhân chọn lọc • Tái sinh cây chuyển gene
Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium
Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp
• Loại mô được biến nạp • Giai đoạn phát triển của mô • Mức độ khởi đầu của vi khuẩn A.
tumefaciens sử dụng
• Hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này.
• Môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp • Marker được sử dụng để chọn lọc thể biến
nạp
• Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens.
• Loại vector sử dụng • Kiểu gen của thực vật.
Các phương pháp chuyển gene: • Gián tiếp qua
• Để DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Chuyển gene trực tiếp bằng cơ chế vật lý đơn giản, không cần có vector.
Agrobacterium • Trực tiếp: PEG, xung điện, bắn gene
• Để nâng cao hiệu quả biến nạp, xử lý protoplast với PEG hoặc dùng xung điện.
6
4/6/2011
Chuyển gene bằng xung điện
• Là một phương pháp cơ học • Màng tế bào không cho các phân tử phân cực như DNA tự do đi qua
• Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn. Xung điện chớp nhoáng có thể gây rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua nhưng sau đó màng có thể đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả.
Chuyển gene bằng xung điện
Chuyển gene bằng xung điện
• B2: Tạo xung điện bằng máy xung gene (gene pulser)
• B1: Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực
Chuyển gene bằng xung điện
• Xung điện cần thiết: 200 - 600 v/cm2 (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây tạo ra các lỗ tạm thời
• Các phân tử đã được nạp điện đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di
• CT1 đóng: tụ điện nạp điện và tích một điện áp cao • CT2 đóng: điện áp phóng qua dịch huyền phù tế bào
7
4/6/2011
Ưu điểm
• Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này. Hiệu quả biến nạp cao. • Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn.
Nhược điểm
Nhược điểm
• Nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng • Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu. Điều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết
Chuyển gene bằng PEG
Nhược điểm tạo
• Phải tái
• PEG tạo ra các lỗ tạm thời trên màng tế bào giúp DNA thấm vào trong tế bào. sinh protoplast, protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường. • Tần số chuyển gene bằng phương pháp này không cao
• PEG còn gây kết dính tế bào trần ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào
8
4/6/2011
Chuyển gene bằng súng bắn gene
Các phương pháp chuyển gene: • Gián tiếp qua = biology • Tên chính xác: hệ thống phân phối hạt biolistic (biolistic particle delivery system; biolistics + ballistics).
Agrobacterium • Trực tiếp: PEG, xung điện, bắn gene • Là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật.
Chuyển gene bằng súng bắn gene
Chuyển gene bằng súng bắn gene
• Gồm 2 buồng bằng thép không gỉ nối với 2 bơm chân không • Nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt.
• Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA.
Chuyển gene bằng súng bắn gene
• DNA được gắn vào các hạt tungsten (vàng,
bạc) có đường kính khoảng 1μm
• Các hạt này được đặt bên trên một cái đĩa ở
mặt bên trong của súng
• Sự bùng nổ khí ở 1000psi làm cho đĩa bắn về
phía trước
• Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt
tungsten được phóng về các tế bào đích
9
4/6/2011
Chuyển gene bằng súng bắn gene
• Mục tiêu của súng bắn gene thường là callus nuôi trên đĩa petri
• Khi hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá hủy nhiều nhưng cũng có một số tế bào tiếp nhận hạt tungsten được bao bọc DNA DNA xâm nhập và hợp nhất vào NST
Xác nhận gene chuyển (nhờ reporter gene)
Ưu điểm
• Thao tác dễ dàng • Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế • Gene mã hóa β-glucuronidase (GUS) phân giải X-glucuronide (X-gluc) là một reporter gene hữu hiệu bào, mô • Mô thực vật được chuyển gene có màu • Các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống xanh sót cao • Cho phép đưa các gene vào tế bào ở vị trí mong muốn
10
4/6/2011
Phương pháp phát hiện
• Khi gene đã được dòng hóa và chuyển và tế bào chủ, cần phải xác nhận xem gene lạ có được sát nhập vào NST vật chủ hay không • Có thể sử dụng 2 phương pháp Southern blot hay Northern blot
Phương pháp Southern blot
Phương pháp Southern blot
• DNA được gắn lên màng là bản sao của DNA trên gel • DNA được cắt bởi một hay vài restriction enzyme tạo ra các phân đoạn DNA • Tách các phân đoạn DNA nhờ điện di • Lai với probe có đánh dấu phóng xạ và có trình tự bổ sung với DNA ngoại lai trên gel agarose • DNA trên gel được biến tính tạo mạch • Loại bỏ probe không gắn lên màng • Xác nhận sự hiện diện của DNA ngoại đơn lai trong cây được chuyển gene • Chuyển lên màng nitrocellulose nhờ lực mao dẫn
Phương pháp Northern blot
• Tương tự như Southern blot • Sử dụng mRNA thay vì DNA • mRNA mạch đơn không cắt bằng • Điểm bất lợi lớn nhất của tất cả các phương pháp chuyển gene trực tiếp là các DNA ngoại lai có xu hướng tái sắp xếp, tái tổ hợp dẫn tới hiện tượng sát nhập nhiều đoạn DNA và tái sắp xếp các đoạn gene chuyển. restriction enzyme • Probe là các cDNA bổ sung với mRNA của gene được chèn • Những cụm gene này dễ dẫn đến hiện tượng tái tổ hợp nội tại transgene silencing. Sử dụng vật liệu chuyển gene trực tiếp là đoạn DNA thuần
11
4/6/2011
Nghiên cứu chuyển gene trên thế giới
• Chuyển gene chịu mặn từ các loài cây Đước (Rhizophoraceae) vào cây lúa. • Chuyển gene Bt vào nhiều loại cây trồng như lúa, bông, ngô, đậu tương,… • Chuyển các gene tham gia vào quá trình quang hợp của cây C4 vào cây C3 để tăng hiệu suất quang hợp • Chuyển gene cố định đạm (nif gene) vào cây lúa
Một số nghiên cứu chuyển gene ở Việt Nam
Nghiên cứu chuyển gene trên thế giới
• Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ vào cây lúa • Chuyển gene chín chậm (ripening delay gene) vào cây cà chua
• Chuyển gene mang nhiều đặc tính chữa bệnh và có tác dụng làm dược phẩm: gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp vitamin A,…
Tăng năng suất cây trồng, tăng chất lượng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi trường
Chuyển gene kháng sâu đục thân vào cây lúa
Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Karabi Datta, Swapan Kumar Datta (Viện sinh học nhiệt đới, Viện lúa Quốc tế)
• Vật liệu: giống lúa Nàng Hương Chợ Đào • Môi trường nuôi cấy mô lúa: MS có bổ sung 2,4-D (tạo mô sẹo) hoặc NAA, Kinetin (tái sinh cây)
• Chủng VK Agrobacterium tumerfasiens: LBA4404 mang plasmid pBIN-BAR- UBI-IB-AB mang gene Bt tổng hợp giữa cryIA và cryIB, gene Bar
12
4/6/2011
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn: duy trì vi khuẩn trên môi trường thạch LB có chứa 50 mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifampicin. Tăng sinh trên môi trường AB lỏng lắc có chất kháng sinh trước khi gây nhiễm cho tế bào lúa
• Chuẩn bị vật liệu chuyển gene: hạt lúa đã khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4-D mô sẹo có khả năng phát sinh phôi • Gây nhiễm: mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được gây nhiễm với dịch vi khuẩn (OD=2) có chứa Acetosyringone • Chọn lọc: cụm mô được rửa lại bằng nước cất vô trùng có bổ sung 500 mg/l Cefotaxime Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có Phosphinothricin (3 mg/l) Cấy chuyền mô kháng PPT sang môi trường chọn lọc từ 3-4 lần
• Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có hoặc không có PPT • Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có hoặc không có PPT
• Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau đó chạy điện di trên gel agarose • Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau đó chạy điện di trên gel agarose
• Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA • Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện • Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA • Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện
protein cryIAb/cryIAc protein cryIAb/cryIAc
• Thí nghiệm Southern blot: sử dụng enzyme giới hạn Hind III đối với gen cryIA(b)-cryIB, enzyme Sma I đối với gen bar.
• Thử tính kháng thuốc diệt cỏ thương mại Basta: theo dõi hiện tượng cháy lá • Thử tính kháng sâu: Cắt đốt thân (8 cm) cho vào đĩa petri, đặt 6 con sâu đục thân lên đoạn thân tính tỉ lệ số sâu chết + số sâu thất lạc / tổng số sâu cho vào đĩa
