Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät
73
CHƢƠNG VIII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT –
CÂY CHUYỂN GENE
Kỹ thuật chuyển gene vào thực vật đã thành công ở nhiều loại cây trồng
như ngô, lúa, đậu tương, bông,... Nhiều gene lạ đã được phân lập từ vi sinh vật,
động vật, thực vật hoặc có thể được tổng hợp nhân tạo và được đưa thành công
vào cây trồng để tạo ra các giống cây trồng mới có năng suất và chất lượng tốt,
có tính chống chịu tốt với sâu, bệnh hại và điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như
mặn, hạn, rét, ngập úng. Lợi ích mang lại do các cây trồng được chuyển gene rất
to lớn, có thể giúp giải quyết vấn đề lương thực toàn cầu, đặc biệt ở các nước
đông dân số và các nước có điều kiện khó khăn cho sản xuất nông nghiệp.
1. Phƣơng pháp chuyển gene trực tiếp
1.1. Phương pháp bắn gene (biolistic)
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng một lực vật lý để bắn các hạt
kim loại (vàng, tungsten) được bao bởi các phân tử DNA vào bên trong tế bào.
Các hạt kim loại được bắn với tốc độ lớn để có thể xuyên qua màng và vào bên
trong tế bào. Hệ thống tạo lực đẩy dùng khí Helium (khí trơ),...
Màng tế bào có tính đàn hồi hoàn hảo nên có thể tái tạo sau khi bắn. Các
giai đoạn tiếp theo sự bắn DNA cho tới khi DNA tích hợp được vào bộ gene của
cây vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Một phần lớn DNA bị hủy bởi enzyme nuclease
của tế bào.
Phương pháp này có ưu điểm là không dùng chuyên biệt cho một loài cây
trồng nào, có thể sử dụng để chuyển gene với hiệu quả cao cho các đối tượng cây
trồng một và hai lá mầm.
1.2. Phương pháp xung điện (electroporation)
Nguyên tắc của phương pháp là cảm ứng một trạng thái thấm cao tạm thời
của màng tế bào do xử lý một điện thế cao, nhờ vậy DNA có thể đi vào bên trong
đến nhân tế bào và tạo sự chuyển gene. Cơ chế cảm ứng trạng thái thấm cao của
màng chưa được hiểu đầy đủ.
Phương pháp này tương đối đơn giản nhưng hiệu quả chuyển gene thấp do
công đoạn chuẩn bị tế bào trần rất phức tạp.
1.3. Phương pháp dùng Polyethylene glycol (PEG)
Dùng PEG để tạo ra các lỗ tạm thời – giúp DNA thấm vào bên trong tế
bào. Khá nhiều dòng cây chuyển gene như thuốc lá, bắp cải, khoai tây, bắp,... đã
được tạo ra nhờ phương pháp này.
Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät
74
Tần số chuyển gene bằng phương pháp này không cao, ngoài ra PEG còn
gây kết dính tế bào trần và có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào.
2. Phƣơng pháp chuyển gene gián tiếp
Nguyên tắc của phương pháp này là đưa gene chuyển vào tế bào qua trung
gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn sống lân cận hoặc ngay trên bộ rễ
của nhiều cây. Chúng chui vào và sống ở các tế bào rễ bằng cách xuyên qua các
vết thương trên mặt rễ. Với sự có mặt của chúng, tổ chức tế bào thực vật phát
sinh bướu, bướu thường thấy trên cây hai lá mầm ở vị trí cổ rễ và gây hại cho cây
trồng.
Gene tạo bướu nằm trên đoạn T-DNA ở trong vi khuẩn và sự di chuyển
của T-DNA vào tế bào thực vật chịu sự quy định của gene vir cũng ở trong vi
khuẩn. Các gene nói trên nằm trên plasmid Ti. Hiện nay, trong lĩnh vực nghiên
cứu chuyển gene vào cây trồng, gene tạo bướu được loại bỏ và thay vào đó là các
gene hữu ích để tạo cho cây trồng mang các đặc tính tốt như kháng sâu, kháng
thuốc trừ cỏ,...
Quy trình tạo cây chuyển gene bằng phương pháp này gồm một số giai
đoạn như sau:
- Chuẩn bị mô cây trồng và dịch huyền phù vi khuẩn
- Nuôi chung mô với vi khuẩn (15 – 20 phút)
- Vớt mô ra, thấm khô nhẹ dịch vi khuẩn thừa và nuôi chung mô với vi
khuẩn (2 ngày). Trong thời gian nuôi chung, vi khuẩn sẽ chuyển gene vào
tế bào thực vật
- Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh (cefatoxime hoặc carbenicillin) để loại
bỏ hết vi khuẩn bám vào mô
- Cấy chuyền mô sang môi trường có tác nhân chọn lọc để sàng lọc tế bào
chuyển gene (3 – 4 lần)
- Tái sinh cây chuyển gene từ mô kháng tác nhân chọn lọc
Do cấu trúc hai gene hữu ích và gene chọn lọc nằm kề nhau và cùng ở trên
đoạn T-DNA nên cây chuyển gene ngoài đặc tính kháng tác nhân chọn lọc cũng
mang gene hữu ích.
Để chuyển gene vào cây hai lá mầm, phương pháp dùng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens là phương pháp được dùng phổ biến nhất. Phương
pháp này tỏ ra khá hiệu quả trong việc tạo cây chuyển gene. Trước đây, phương
Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät
75
pháp này ít hiệu quả đối với cây một lá mầm nhưng những năm gần đây đã có
những tiến bộ.
Sự gây vết thương được xem như là một yếu tố kích thích tạo các phân tử
cảm ứng gene vir, cảm ứng sự tổng hợp DNA và phân chia tế bào. Vì vậy, các
mô đang tăng trưởng mạnh và các hợp chất kích thích gene vir là yếu tố rất cần
thiết. Mô thuốc lá bị thương sản xuất một số hợp chất phenol kích thích các gene
vir ở plastid Ti. Hiện nay, khi nghiên cứu chuyển nạp gene vào cây trồng, nhất là
cây một lá mầm, các nhà nghiên cứu thường sử dụng 4-acetyl-2,6-dimethoxyl-
phenol với nồng độ từ 50 – 200 M.
3. Chuyển gene vào lục lạp tế bào
Thông tin di truyền của thực vật hiện diện ở ba loại cơ quan tử khác nhau
của tế bào: nhân, ty thể và lục lạp. Mỗi loại cơ quan tử chứa bộ gene riêng của
nó. Di truyền gene lục lạp và ty thể không tuân theo quy luật Mendel.
Bộ gene plastid của thực vật bậc cao là những phân tử DNA xoắn kép
vòng có từ 120 – 160 kb (chứa khoảng 130 gene). Các bản sao của bộ gene hiện
diện ở tất cả tế bào và ở các loại plastid khác nhau như tiền plastid chưa biệt hóa,
lục lạp quang hợp, sắc lạp chứa carotenoid, bột lạp. Đặc tính nổi bật của bộ gene
plastid là có mức bội thể rất cao: một tế bào đơn thuốc lá có thể chứa 100 lục lạp,
mỗi lục lạp chứa khoảng 100 bản sao của bộ gene plastid, và như vậy có khoảng
10,000 bộ gene plastid / tế bào.
Kết quả nghiên cứu di truyền gene lục lạp ở giai đoạn đầu trên đối tượng
tảo xanh Chlamydomonas reinhardii và thuốc lá Nicotiana tabacum là tiền đề
của các nghiên cứu ở lĩnh vực chuyển nạp gene vào lục lạp và điều này mở ra
tiềm năng vô cùng lớn cho lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật trong tương lai.
Hiện công nghệ chuyển gene vào lục lạp được thực hiện nhờ công cụ là súng bắn
gene.
Chuyển nạp gene vào lục lạp có nhiều ưu điểm nổi trội hơn so với chuyển
nạp gene vào nhân như:
- Số bản sao của gene chuyển rất cao, có thể lên đến 10,000 bản sao/tế bào.
- Mức biểu hiện của gene chuyển rất cao, hàm lượng protein mục tiêu có thể lên
đến 47% trên tổng số protein hòa tan.
- Sự sắp xếp và sao chép của gene chuyển: nhiều gene có thể được tích hợp và
biểu hiện theo kiểu sao chép đa cistron (polycistronic); ngược lại, đối với chuyển
nạp gene vào nhân, mỗi gene chuyển tích hợp độc lập vào nhiễm sắc thể và có
sao chép theo kiểu đơn cistron (monocistronic).
Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät
76
- Ảnh hưởng của hiệu ứng vị trí lên sự biểu hiện của gene chuyển: không có hiệu
ứng của vị trí ở plastid. Ở trường hợp chuyển gene vào nhân, sự tích hợp ngẫu
nhiên của gene chuyển ở nhiễm sắc thể thường dẫn đến sự hình thành các mức
biểu hiện khác nhau.
- Hiện tượng im lặng của gene: không ghi nhận được. Sự im lặng của gene
chuyển thường làm giảm hoặc loại trừ sự biểu hiện gene chuyển ở trường hợp
chuyển gene vào nhân.
- Sự di truyền gene chuyển: có kiểu di truyền mẹ. Ở trường hợp chuyển gene vào
nhân, có thể có sự giao phấn với các đối tượng khác.
- Sự biểu hiện thì đồng nhất. Ở trường hợp chuyển gene vào nhân, sự biểu hiện
của gene chuyển có sự biến thiên cao.
4. Nghiên cứu chuyển nạp gene ở cây lúa
4.1. Một số yếu tố quan trọng trong chuyển gene ở cây lúa
Nhiều công bố khoa học đã đề cập một số yếu tố cần được quan tâm ở
nghiên cứu chuyển gene vào cây lúa nhằm đạt tần số chuyển gene cao:
- Yếu tố chuyển gene của cây và khả năng đáp ứng của chúng trong nuôi
cấy in vitro.
- Yêu cầu mang tính bắt buộc là chỉ sử dụng mô và tế bào có khả năng sinh
phôi.
- Việc tạo tế bào huyền phù có khả năng sinh phôi để tách tế bào trần là yêu
cầu mang tính tuyệt đối khi sử dụng hệ thống tế bào trần làm chuyển gene.
- Thời gian chọn lọc càng ngắn càng cần thiết cho việc tái sinh cây không bị
biến dị cao.
- Cần sử dụng vector mang gene chuyển và promoter thích hợp.
- Các nuôi cấy từ giai đoạn chọn lọc đến giai đoạn tái sinh cây cần được
kiểm soát hữu hiệu để tránh các trường hợp "escape".
- Trong hầu hết các trường hợp, phôi non mới tách từ cây trồng trong điều
kiện tối ưu là nguyên liệu tốt nhất.
- Mô sẹo vừa mới hình thành từ phôi non luôn có đáp ứng tốt với các thí
nghiệm chuyển gene và tái sinh cây.
- DNA plasmid cần có chất lượng cao và sử dụng với nồng độ tối thiểu.
- Duy trì thời gian tối thiểu giai đoạn nuôi cấy chuyển gene trong phòng,
tránh nuôi cấy quá lâu.
Chöông 8. Coâng ngheä di truyeàn thöïc vaät Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät
77
- Trồng cây chuyển gene ở nhà lưới trong điều kiện tốt nhất để có được cây
sinh trưởng tốt và hữu thụ.
4.2. Vật liệu dùng để chuyển gene
Sự thành công của nghiên cứu chuyển gene tùy thuộc rất nhiều vào vật
liệu sử dụng để chuyển gene. Trước đây, khi một số kỹ thuật khác chưa phát triển
trừ phương pháp sử dụng PEG và phương pháp điện xung thì vật liệu tế bào trần
có nguồn gốc từ tế bào sinh phôi được xem như là sự lựa chọn để tiến hành các
nghiên cứu về chuyển gene. Tuy nhiên, ở hệ thống này, sự nuôi cấy và chọn lọc
cần nhiều thời gian và sự tái sinh tùy thuộc vào kiểu gene. Vì vậy, khi các
phương pháp chuyển gene mới được xây dựng, nhiều loại vật liệu khác đã được
sử dụng như tế bào huyền phù sinh phôi, mô sẹo, phôi trưởng thành và phôi nuôi
cấy từ túi phấn. Ngoài các vật liệu nói trên, các mảnh mô phân sinh, phôi nảy
mầm, mô gốc lá, rễ, mô phân sinh chồi, tế bào lớp mỏng phôi mang chồi và trục
thượng diệp đã được sử dụng để nghiên cứu sự biểu hiện tạm thời và bền vững
của gene chuyển. Sự chọn lựa vật liệu chuyển gene tùy thuộc vào sự thuận lợi
trong thao tác nghiên cứu và hiệu quả tái sinh cây.
4.3. Môi trường nuôi cấy và chọn lọc tế bào chuyển gene
Nhiều loại môi trường cơ bản đã được sử dụng để nuôi cấy mô tế bào lúa
như môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), N6 (Chu et al., 1975), CC
(Potrykus et al., 1979), AA (Muller và Grafe, 1978), R2 (Ohira et al., 1973). Môi
trường chọn lọc phổ biến là môi trường MS và N6 có bổ sung một số chất chọn
lọc thường dùng hiện nay là Kanamycin, Hygromycin, Phosphinothricin. Nồng
độ chất chọn lọc tùy thuộc vào loại cây trồng.
4.4. Gene chỉ thị / chọn lọc và promoter
Nhiều loại gene chỉ thị và chọn lọc khác nhau đã được nghiên cứu. Các
loại gene này cũng được sử dụng để nghiên cứu hoạt động của các promoter. Các
nghiên cứu sự biểu hiện tạm thời cho phép đánh giá hiệu quả hoạt động của gene
chỉ thị trong vòng 24 – 48 giờ sau khi đưa DNA vào mô mà chưa cần sự thâm
nhập của DNA vào bộ gene của cây, và vì vậy giúp đánh giá nhanh chóng và
hiệu quả phương pháp chuyển. Gene chỉ thị lý tưởng là gene không gây hại trên
trao đổi chất của cây, có thể dùng dễ dàng và nhạy với các thí nghiệm phát hiện.
Gene mã hóa -glucuronidase (gene gusA) từ vi khuẩn E. Coli đã được dùng như
gene chỉ thị phổ biến vì nó đáp ứng được các yêu cầu trên. Nó có ưu điểm hơn
một số gene khác như gene cat (mã hóa cho Chloramphenicol acetyltransferase)
và gene nptII (mã hóa cho Neomycin phosphotransferase) vì các thí nghiệm phát
hiện cần nhiều thời gian và có sử dụng các chất đồng vị phóng xạ. Gần đây, gene
tạo protein phát quang màu xanh lá có nguồn gốc từ sứa biển đã được sử dụng.