Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn
35
CHƢƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN
– THU NHẬN SẢN PHẨM THỨ CẤP
Đã từ lâu, các nhà khoa học đã cho rằng tế bào thực vật là một đơn vị độc
lập trong cơ thể thực vật. Đã là đơn vị độc lập thì chúng hoàn toàn có khả năng tự
trao đổi chất, sinh sản và phát triển. Nuôi cấy mô thực vật có giá trị đối với nghiên
cứu sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp và cũng có thể cung cấp các
phương thức sản xuất các sản phẩm chuyển hóa quan trọng của thực vật.
1. Khái niệm tế bào đơn và sản phẩm thứ cấp
Năm 1838, Schleiden – giáo sư thực vật học ở Jena – đã cho rằng: “Tế bào
là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc thực vật”. Theo ông, quá trình căn bản
trong sự phát triển thực vật là sự thành lập các tế bào sống độc lập trong một kiểu
cấu trúc nào đó của cá thể thực vật nguyên vẹn.
Mãi đến năm 1954, Muir và các cộng sự mới bắt đầu những nghiên cứu về
sự phát triển của tế bào đơn thực vật trong môi trường nhân tạo. Tuy nhiên, những
nghiên cứu của họ chưa hoàn chỉnh và các nghiên cứu này chỉ mang tính chất
thăm dò. Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách và
nuôi cấy thành công tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men với môi
trường nhân tạo.
Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỉ XX đến nay, các nhà khoa học
đã công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của các loài
thực vật khác nhau để thu nhận những sản phẩm thứ cấp. Trong đó, đáng lưu ý
nhất là những kết quả của Street. Ông đã hoàn chỉnh toàn bộ công nghệ nuôi cấy
từ giai đoạn đầu đến giai đoạn tinh sạch các sản phẩm bậc 2.
Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào
nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế
bào đi ra môi trường ngoài.
Phần lớn các chất thứ cấp thường không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với
bản thân các tế bào. Quá trình tạo ra những sản phẩm bậc 2 chỉ thông qua những
cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin
di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa.
Tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các hệ thống thích hợp để sản
xuất ra những hợp chất thứ cấp với sản lượng cao hơn cây nguyên vẹn (Bảng 4.1).
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn
36
Bảng 4.1. Các sản phẩm thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy tế bào
Hợp chất
Nguồn thực vật
Dạng nuôi cấy
Shikonin
Lithospermum erythrorhizon
S
Ginsenoside
Panax ginseng
C
Anthraquinone
Morinda citrifolia
S
Ajmalicine
Catharanthus roseus
S
Acid rosmarinic
Coleus blumeii
S
Ubiquinone-10
Nicotiana tabacum
S
Diosgenin
Dioscorea deltoides
S
Benzylisoquinoline alkaloid
Coptis japonica
S
Berberine
Thalictrum minor
S
Nicotin
Nicotiana tabacum
C
Bisoclaurine
Stephania cepharantha
S
Tripdiolide
Tripteryqium wilfordii
S
Ghi chú: C – Callus (mô sẹo); S – Cell suspension (huyền phù tế bào)
Điểm khác biệt giữa nuôi cấy tế bào đơn thực vật và nuôi cấy tế bào vi sinh
vật:
- Nuôi cấy tế bào đơn thực vật đòi hỏi mức độ vô trùng cao hơn rất nhiều so
với mức độ vô trùng trong nuôi cấy vi sinh vật.
- Trong quá trình phát triển ở môi trường nuôi cấy nhân tạo, các tế bào vi
sinh vật thường tồn tại độc lập trong khi tế bào đơn của thực vật tạo ra
những huyền phù tế bào.
- Tế bào thực vật thường phân chia chậm hơn tế bào vi sinh vật. Vì thế, trong
một thời gian nhất định, lượng sinh khối thu được từ tế bào vi khuẩn cao
hơn nhiều so với tế bào thực vật.
- Các chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật và của tế bào
đơn thực vật hoàn toàn khác nhau.
- Tế bào thực vật thuộc loại quang tự dưỡng trong khi phần lớn tế bào vi sinh
vật lại thuộc loại dị dưỡng.
2. Nuôi cấy tế bào đơn
2.1. Đặc điểm sinh lý của tế bào đơn trong nuôi cấy
Tế bào đơn khi phát triển trong môi trường lỏng theo phương pháp nuôi cấy
gián đoạn thường tạo ra dòng tế bào. Dòng tế bào là một huyền phù gồm rất nhiều
tế bào tạo thành. Dòng tế bào có những điểm quan trọng sau:
- Dòng tế bào cho phép tách riêng từng tế bào rất dễ dàng.
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn
37
- Các tế bào trong dòng tế bào có độ đồng nhất cao.
- Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường có nhân to hơn,
nguyên sinh chất đậm đặc hơn so với tế bào nguyên thủy trong mô thực vật.
- Tế bào đơn được nuôi cấy trong môi trường lỏng thường chứa nhiều hạt
tinh bột (năng lượng dự trữ của thực vật).
- Tế bào có khả năng phân chia trong khoảng 24 – 72 giờ.
- Tế bào bị mất tính toàn năng.
- Tế bào bị tăng mức bội thể.
Trong quá trình phát triển trong môi trường lỏng, các tế bào đơn của thực
vật thường phát triển qua bốn giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy
tàn.
Trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng theo
phương pháp chu kỳ, tế bào thực vật thường tạo ra một quần thể dị biệt. Phổ biến
dị của tế bào thực vật lớn và rất dễ nhận thấy trong khi nuôi cấy. Do đó, việc kiểm
soát quá trình nuôi cấy phải được thực hiện nghiêm ngặt.
Trong phương pháp nuôi cấy từng mẻ sẽ xảy ra hệ thống phân chia đồng
bộ, hệ thống này tạo ra những thế hệ tế bào có cùng tuổi sinh lý, phát triển, có
cùng thời điểm trao đổi chất mạnh hoặc trao đổi chất yếu. Do đó trong quá trình
nuôi cần chú ý thay đổi chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và thay đổi
điều kiện chiếu sang cho phù hợp với từng thời kỳ phát triển.
Nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn trong môi trường lỏng là những tế bào
mô sẹo hoặc những tế bào lai hữu tính. Trong quá trình nuôi cấy có thể xảy ra
những thay đổi về mặt di truyền do tác động của các yếu tố bên ngoài. Chính vì
thế, việc kiểm soát thường xuyên phải được thực hiện để loại những tính trạng xấu
làm thoái hóa tế bào và giữ lại những tính trạng tốt để duy trì và làm tăng giá trị
của tế bào.
2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào đơn trong môi
trường lỏng
2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng rất lớn đến sinh lý tế
bào trong quá trình nuôi cấy
- Phần lớn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật làm tăng quá trình phân
bào.
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệt làm tăng quá trình biệt hóa
tế bào để tạo ra những cơ quan riêng biệt của cây như rễ, than, lá,…
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn
38
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng đến việc tạo ra những
sản phẩm thứ cấp.
2.2.2. Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng
- Nguồn đạm: nguồn đạm từ các muối nitrate thường được tế bào dễ hấp thu
hơn cả. Đôi khi người ta sử dụng nguồn đạm từ hỗn hợp nitrate và
ammonium. Cũng có nhiều trường hợp người ta sử dụng nguồn đạm hữu
cơ. Nhưng về căn bản, các nguồn đạm từ muối vô cơ hòa tan thường thích
hợp nhất cho nuôi cấy tế bào đơn.
- Nguồn carbon: người ta thường sử dụng saccharose như nguồn carbon
trong nuôi cấy tế bào đơn thực vật. Điều này cũng còn tùy thuộc vào từng
loại cây mà ta thu nhận tế bào. Đối với nhiều loại thực vật, tế bào lại cần
mannose, galactose hay glucose hơn.
- Ánh sáng: tế bào thực vật là loại tế bào tự dưỡng. Trong quá trình phát
triển, chúng cần ánh sáng cho quá trình quang hợp. Chu kỳ tối, sang có ảnh
hưởng rất lớn đến thành phần và số lượng các sản phẩm trao đổi chất bậc 2.
Do đó, trong quá trình nuôi cấy, việc điều khiển cường độ ánh sang, thời
gian chiếu sáng là điều đặc biệt quan trọng.
- Các chất vi lượng và các chất khác: tùy theo loài thực vật mà nhu cầu về
các nguyên tố vi lượng, vitamin và các chất khác sẽ khác nhau. Do đó, khi
nuôi cấy phải chú ý đến nhu cầu sinh lý của chúng để tạo ra môi trường
nuôi cấy thích hợp.
3. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn thu nhận sản phẩm thứ cấp
Tế bào thực vật cũng tuân theo quy luật trao đổi chất giống như tất cả các tế
bào sinh vật khác. Quy luật tạo ra sản phẩm tiết kiệm nhất và hợp lý nhất ở các tế
bào, đặc biệt là ở tế bào thực vật. Vì thế, việc thu nhận sinh khối tế bào thực vật
khi tiến hành nuôi cấy trong môi trường lỏng không có khó khăn gì. Nhưng mục
tiêu ở đây là các sản phẩm bậc 2 do đó vấn đề sẽ rất phức tạp. Trong quá trình
nghiên cứu, lúc đầu các nhà khoa học đưa ra 2 kết luận:
- Nuôi cấy tế bào đơn không thích hợp cho việc thu nhận sản phẩm bậc 2.
- Trong nuôi cấy tế bào đơn có xảy ra những quá trình chuyển hóa vật chất
để tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau. Tuy nhiên, những quá trình chuyển
hóa này thường cho năng suất thấp.
Đây là hai khó khăn thường gặp nhất khi nuôi cấy tế bào đơn thực vật để
thu nhận các sản phẩm bậc 2. Để giải quyết 2 khó khăn trên, các nhà khoa học đã
đưa ra những hướng giải quyết sau:
Coâng ngheä sinh hoïc thöïc vaät Chöông 4. Coâng ngheä nuoâi caáy teá baøo ñôn
39
- Không nên nuôi cấy tế bào đơn một cách đại trà mà không tính toán đến
khả năng tạo ra những sản phẩm đặc biệt của loài thực vật đó. Vấn đề đầu
tiên là phải chọn ra được một loài thực vật nào đó có khả năng sinh tổng
hợp ra những chất mà ta quan tâm. Đặc tính tổng hợp chất chuyên biệt này
do một gene trong cấu trúc DNA quyết định và chúng có đặc tính loài rất
cao. Việc chọn sai đối tượng sẽ đồng nghĩa với sự thất bại trong nuôi cấy về
sau.
- Thực vật là cơ thể đa bào, do đó không phải tất cả các cơ quan đều có khả
năng tạo ra chất mà ta quan tâm. Ở đó, chỉ có những cơ quan đặc biệt mới
tạo ra những chất đặc biệt. Do đó, việc xác định cơ quan nào có khả năng
sinh tổng hợp chất mà ta quan tâm để tiến hành nuôi cấy là điều rất quan
trọng.
- Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành tuyển chọn, lai tạo và
chuyển gene để nâng cao năng suất tạo ra các sản phẩm bậc 2 mà ta quan
tâm.
- Cũng như quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng ở vi sinh vật, quá trình
tổng hợp hay chuyển hóa ở tế bào thực vật cũng rất cần đến những cơ chất
tương ứng. Do đó, việc cung cấp những cơ chất tương ứng cho quá trình
nuôi cấy là điều bắt buộc.
- Cuối cùng là phải tìm cho được môi trường đặc hiệu riêng cho từng loại tế
bào.
3.1. Kỹ thuật nuôi cấy
Mẫu tế bào dùng để nuôi cấy phải được lấy từ cây đã biết chắc chắn có khả
năng sinh tổng hợp chất cần quan tâm; mẫu tế bào phải được lấy từ cơ quan hay bộ
phận mà ở đó hàm lượng các chất yêu cầu có khả năng được tổng hợp hay chuyển
hóa cao nhất; mẫu tế bào phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh
nhất.
Khi chọn được mẫu thực vật để tiến hành nuôi cấy, người ta tiến hành các
quá trình xử lý như trong vi nhân giống.
Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, người ta cấy mô sẹo này vào môi trường
lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn. Môi trường có thành phần khoáng MS, ngoài ra
còn có bổ sung thêm nước dừa, auxin, dịch chiết nấm men, saccharose,… tùy theo
loài thực vật và loại mô nuôi cấy.
Đầu tiên, mô sẹo được nuôi cấy trong các bình tam giác và đặt trên máy lắc.
Cứ 2 – 3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra bằng cách đếm dưới kính hiển vi sau đó xây
dựng đường cong tăng trưởng của tế bào.