3/24/2011
1
CHƢƠNG V.
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY
TẾ BÀO TRẦN
Khái niệm tế bào trần
Tế bào trần (Protoplast) = tế bào
đơn – vách
Ứng dụng tế bào trần
•Có khả năng tiếp nhận vật liệu “ngoại
lai”: nhân, ti thể, lục lạp, plasmids, vi
khuẩn và virus
•Có khả năng tái sinh vách tế bào
Đối tượng lai tạo giống: lai cùng loài,
lai khác loài, lai khác giới sinh vật.
Ứng dụng tế bào trần
•Nghiên cứu sự
tổng hợp và phân
hủy vách tế bào
•Nghiên cứu hệ
thống tế bào đơn
Nuôi cấy tế bào trần
1) Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy;
2) Xử lý enzyme tạo tế bào trần;
3) Tách tế bào trần;
4) Xác định mật độ tế bào trần;
5) (Dung hợp tế bào trần)
6) Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần.
3/24/2011
2
1) Chọn và khử trùng mẫu cấy
Khử trùng
Xử lý thẩm thấu bằng
manitol hay sorbitol
2) Xử lý enzyme
•Xử lý cơ học
2) Xử lý enzyme
•Xử lý enzyme cellulase, hemi-cellulase,
pectinase, lignase
3) Tách
tế bào
trần
3) Tách
tế bào
trần
4) Xác định mật độ
•Nhuộm bằng phẩm nhuộm fluorescein
diacetate để đánh giá khả năng sống
sót của protoplast
3/24/2011
3
4) Xác định mật độ
• Đếm trên buồng đếm hồng cầu để xác
định mật độ
5) Dung hợp tế bào trần
6) Nuôi cấy và tái sinh
tế bào trần
•Môi trường nuôi cấy thường chứa 13%
manitol, auxin, cytokinin,…
•Tái tạo vách tế bào
•Phân chia tạo cụm tế bào
Dung hợp tế bào trần và
sự lai vô tính
Các tế bào trần có thể dung hợp
một cách tự nhiên trong quá trình cô
lập
Dung hợp tế bào trần và
sự lai vô tính
Nếu như những tế bào trần được cô lập
từ các nguồn tế bào khác nhau mà được xử
lý để dung hợp thì gọi là lai vô tính.
3/24/2011
4
Phƣơng pháp dung hợp tế
bào trần
1) Phương pháp xử lý cơ học
2) Phương pháp xử lý bằng nitrate sodium
3) Phương pháp xử lý bằng ion Ca2+ (pH
cao)
4) Phương pháp xử lý bằng Polyethylene
Glycol (PEG)
5) Phương pháp dung hợp bằng xung điện
1) Phƣơng pháp xử lý cơ học
•Tế bào trần cô lập được gom lại cho nằm
gần với nhau nhờ một dụng cụ cầm tay cực
nhỏ và một micropipette.
•Một phần của đầu micropipette được chận
lại vì vậy các tế bào trần được giữ lại và
được đẩy đi theo dòng chất lỏng.
•Số lượng tế bào dung hợp nhờ phương
pháp này rất thấp và vì vậy phương pháp
này không thông dụng.
2) Phƣơng pháp xử lý bằng
nitrate sodium
•Tế bào trần cô lập được đặt trong hỗn hợp
NaNO3 5,5% trong dung dịch sucrose 10%. Giữ
ổn định trong nước ở 35ºC và sau đó đem đi ly
tâm 200 vòng trong 5 phút.
•Loại bỏ phần nổi và cho các cụm tế bào vào nước
trong 30 phút. Trong suốt quá trình này, hầu
hết các tế bào trần sẽ tiến hành dung hợp. Các
cụm tế bào được gạn ra sẽ được đưa vào trong
môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% NaNO3.
3) Phƣơng pháp xử lý bằng
ion Ca2+ (pH cao)
•Tế bào trần được ly tâm trong 3 phút ở
tốc độ 50 vòng/phút trong môi trường
cảm ứng sự dung hợp gồm có 0,5M
manitol, 0,05M CaCl2.2H2O ở pH 10,5.
•Các ống ly tâm có chứa tế bào trần được
ngâm trong nước ở 37ºC trong 40-50
phút. Sau khi xử lý xong có khoảng 20-
50% tế bào trần được dung hợp.
4) Phƣơng pháp xử lý bằng
Polyethylene Glycol (PEG)
•Dung dịch PEG làm tăng sự kết dính của tế bào
trần và cảm ứng sự dung hợp tế bào trần của
một số loài thực vật.
•Hút 1 ml dung dịch môi trường có chứa tế bào
trần với mật độ thích hợp cho vào ống nghiệm
chứa môi trường nuôi cấy có 1 ml dung dịch PEG
56%. Ống nghiệm được lắc trong 5 giây rồi sau
đó để yên 10 phút. Tế bào trần sau đó được rửa
vài lần để loại bỏ PEG rồi chuyển lại vào trong
môi trường nuôi cấy.
4) Phƣơng pháp dung hợp
bằng xung điện
Electrofusion
chambers Fusion electrodes Electrofusion
apparatus
3/24/2011
5