Tinh dầu Quế: Khảo sát thành phần hóa học và khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh răng miệng, biofilm

Ngày nhận bài: 25-11-2024 / Ngày chấp nhận đăng bài: 19-12-2024 / Ngày đăng bài: 28-12-2024

*Tác giả liên hệ: Nguyễn Vũ Giang Bắc. Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

E-mail: nguyenvugiangbac@ump.edu.vn.

46 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn

ISSN : 1859-1779

Nghiên cứu Dược học

Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học;27(6):46-54

https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.06

Khảo sát thành phần hóa học và khả năng ức chế sự

phát triển và biofilm do vi sinh vật gây bệnh răng miệng

của tinh dầu Quế

Nguyễn Vũ Giang Bắc1,*, Võ Thanh Hóa2, Lê Thu Hoài3

1Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam

2Khoa Dược, Đại học sức khỏe, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam

3Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam

Tóm tắt

Đặt vấn đề: Sâu răng là bệnh lý phổ biến nhất vùng răng miệng, liên quan đến mảng bám chứa Streptococcus mutans

và Candida albicans, làm bệnh tiến triển nhanh và nặng hơn. Biofilm bảo vệ vi sinh vật khỏi môi trường và kháng sinh,

gây khó khăn trong điều trị. Nghiên cứu này khảo sát thành phần tinh dầu Quế và khả năng kháng hai vi sinh vật trên,

nhằm tìm kiếm giải pháp thay thế chất kháng khuẩn tổng hợp.

Mục tiêu: Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu Quế và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm đối với

Streptococcus mutans và Candida albicans gây nhiễm trùng răng miệng.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:Thành phần hoá học của tinh dầu Quế được xác định bằng phương pháp sắc

ký khí với đầu dò khối phổ. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ ức chế biofilm tối thiểu (MBIC) được khảo sát

bằng phương pháp vi pha loãng trên đĩa 96 giếng, kết hợp nhuộm tím tinh thể. Khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu

được đánh giá thông qua phương pháp đếm sống tế bào.

Kết quả: Thành phần chính của tinh dầu Quế là aldehyd cinnamic, chiếm tỉ lệ 86,53%. Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát

triển và hình thành biofilm của S. mutans là 0,05% và C. albicans là 0,003125%. Khi cho vi sinh vật tiếp xúc với tinh dầu

Quế trong 1 phút, 0,1% tinh dầu Quế đã diệt hơn 90% lượng vi sinh vật. Lượng vi sinh vật bị tiêu diệt hơn 99,99% khi

nồng độ tinh dầu tăng lên 0,2%.

Kết luận: Tinh dầu Quế cho thấy hiệu quả trong việc ngăn chăn sự phát triển và hình thành biofilm từ các vi sinh vật gây

sâu răng gồm S. mutans và C. albicans, tạo cơ sở cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc răng miệng sử dụng tinh

dầu Quế.

Từ khoá: tinh dầu Quế; sâu răng; S. Mutans; C. albicans

Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024

https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.06 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn| 47

Abstract

INVESTIGATION OF THE CHEMICAL COMPOSITION AND

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF CINNAMOMUM CASSIA (L.) ESSENTIAL

OIL AGAINST ORAL PATHOGENS

Nguyen Vu Giang Bac, Vo Thanh Hoa, Le Thu Hoai

Introduction: Dental caries is the most common oral disease, associated with biofilm containing Streptococcus mutans

and Candida albicans, which accelerates and worsens the condition. Biofilm protects microorganisms from

environmental factors and antibiotics, making treatment more challenging. This study investigated the chemical

composition of cinnamon essential oil and its antimicrobial activity against the two microorganisms, aiming to find

alternatives to synthetic antimicrobial agents.

Objective: This study aimed to determine Cinnamomum cassia (L.) essential oil's chemical compositions and investigate

its antimicrobial activity against Streptococcus mutans and Candida albicans, pathogens causing oral infections.

Subjects and methods: Determination of the chemical composition of Cinnamomum cassia (L.) essential oil using Gas

Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum biofilm

inhibitory concentration (MBIC) were determined using the microdilution method in 96-well plates, followed by crystal

violet staining to assess biofilm inhibition. The antimicrobial efficacy was further evaluated using the viable cell counting

technique to determine the bactericidal or fungicidal effects of the essential oil.

Results: The main composition of cinnamon essential oil was aldehyde cinnamic, accounted for 86.53%. The minimum

inhibitory concentration (MIC) of this essential oil which prevented the development and biofilm formation by S. mutans

and C. albicans were 0.05% and 0.003125%. Exposure of microorganisms to 0,1% cinnamon essential oil for 1 minute

resulted in the eradication of 90% of the microorganism population. Complete removal over 99.99% of S. mutans and

C. albicans was observed when the concentration of essential oil increased to 0.2%.

Conclusion: Cinnamon essential oil showed effectiveness in inhibiting the development and formation of biofilm by

pathogens causing oral infection such as S. mutans and C. albicans. This highlights the potential of cinnamon essential

oil in establishing oral care products.

Keywords: Cavit; Cinnamomum cassia (L.) essential oil; S. Mutans; C. albicans; oral infections

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các bệnh lý vùng răng miệng, bệnh sâu răng

chiếm tỉ lệ cao nhất và đang có xu hướng tăng cao tại

các nước đang phát triển. Bệnh liên quan đến việc vi

sinh vật tạo thành mảng bám trên răng, trong đó phổ

biến nhất là Streptococcus mutans thuộc nhóm

Streptococci và Candida albicans thuộc nhóm nấm

men thường trú ở khoang miệng. Một số nghiên cứu đã

chứng minh rằng sự tồn tại song song của hai vi sinh

vật trên mảng bám răng khiến cho tình trạng sâu răng

tiến triển nhanh và nặng hơn [1,2].

Biofilm chính là kết quả của sự kết dính giữa bề mặt rắn

với sản phẩm ngoại bào của vi sinh vật, giúp bảo vệ vi sinh

vật từ những thay đổi môi trường và các yếu tố ảnh hưởng

đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, làm hình

thành những mảng bám vi sinh vật trên răng. Đây cũng là

một trong những nguyên nhân giúp cho vi sinh vật tránh

được tác động của các chất kháng sinh do cấu trúc vững

chắc của biofilm hạn chế sự tiếp xúc của chất kháng sinh

lên vi sinh vật [3].

Các nghiên cứu trên thế giới từ rất lâu đã chứng minh tác

dụng của các chất kháng khuẩn sử dụng trong nước súc

miệng hoặc trong các sản phẩm chăm sóc răng miệng như

kem đánh răng, giúp cho việc phòng ngừa sâu răng và các

Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024

48 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.06

bệnh về răng miệng. Các chất thường được sử dụng là các

dẫn chất của fluor và một vài hợp chất khác như clohexidin,

trichlosan, sodium dodecyl sulfat. Tuy nhiên, nhược điểm

của chất hóa học là dễ làm đổi màu răng hoặc tạo chủng vi

khuẩn đề kháng [4].

Việc tìm kiếm các sản phẩm mới có nguồn gốc tự nhiên

để thay thế các chất kháng vi vật tổng hợp ngày càng trở nên

quan trọng, đặc biệt ở Việt Nam với nguồn dược liệu phong

phú. Điển hình là việc sử dụng tinh dầu trong các sản phẩm

nha khoa bởi đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

biofilm và chống oxy hóa [5-7].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành

phần hóa học của tinh dầu Quế và xác định hoạt tính kháng

Streptococcus mutans và Candida albicans, đây là những vi

sinh vật đóng vai trò quan trọng trong các bệnh nhiễm trùng

răng miệng.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Tinh dầu Quế được chiết xuất từ vỏ Quế thu hoạch tại tỉnh

Quảng Nam vào tháng 3 năm 2023 bằng phương pháp lôi

cuốn hơi nước. Mẫu Quế được định danh bằng phương pháp

so sánh hình thái thực vật với các tài liệu tham khảo từ

JSTOR database, Cây cỏ Việt Nam (Phạm Hoàng Hộ),

những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (Đỗ Tất Lợi), được

xác định là loài Cinnamomum cassia (L.).

Chủng vi sinh vật: Streptococcus mutans ATCC 25175 và

Candida albicans ATCC 10231.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Chiết xuất tinh dầu Quế

Phương pháp nghiên cứu được thực hiện như sau: Nguyên

liệu sử dụng là vỏ Quế có độ dày từ 1,5 - 2,5 mm, chiều dài

từ 35 - 45 cm, độ ẩm không quá 16%, đảm bảo không bị mốc

hay mối mọt, sau đó được nghiền thành bột thô. Quá trình

chiết xuất tinh dầu được tiến hành bằng phương pháp lôi

cuốn hơi nước. Cụ thể, 150 g bột vỏ Quế được cho vào bình

chưng cất có dung tích 1 lít, kết nối với hệ thống sinh hàn

ống thủy tinh xoắn và một bình ngưng tụ để thu hồi tinh dầu.

Hỗn hợp được đun sôi ở nhiệt độ 110 °C trong thời gian 5

giờ, đến khi thể tích tinh dầu không còn tăng thì dừng quá

trình chưng cất. Hỗn hợp thu hồi được để lắng và tách tinh

dầu bằng bình lắng gạn, trong đó tinh dầu nằm ở lớp dưới.

Tinh dầu sau đó được làm khan bằng natri sulfat khan để loại

bỏ nước còn sót lại. Quy trình chiết xuất được lặp lại nhiều

lần để thu đủ lượng tinh dầu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp

theo. Tinh dầu thu được được kiểm nghiệm theo Chuyên

luận tinh dầu Quế trong Dược điển Việt Nam V, với các chỉ

tiêu kiểm tra bao gồm: tính chất, tỉ trọng, định tính và định

lượng [8].

2.2.2. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu

Quế

Thành phần hóa học của tinh dầu Quế được xác định bằng

phương pháp sắc ký khí với đầu dò khối phổ (GC-MS) trên

máy sắc ký khí SCION SQ 456-GC. Thí nghiệm sử dụng cột

Rxi-5ms RESTEK với thành phần gồm 5% diphenyl

polysiloxane và 95% dimethyl polysiloxane, có kích thước

30 m × 0,25 mm và độ dày màng 0,25 µm. Đầu dò khối phổ

được sử dụng để phân tích. Chương trình nhiệt được thiết lập

bắt đầu ở 50 °C giữ trong 1 phút sau đó tăng 30 °C/phút đến

80 °C, tiếp tục tăng 7 °C/phút đến 230 °C, và cuối cùng tăng

25 °C/phút đến 280 °C, giữ ở nhiệt độ này trong 3 phút. Khí

mang được sử dụng là helium với tốc độ dòng 1,0 mL/phút.

Nhiệt độ tiêm mẫu được thiết lập ở 250 °C với tỉ lệ chia dòng

là 30. Phương pháp ion hóa sử dụng là bắn phá điện tử (EI+)

với năng lượng ion hóa 70 eV, và nhiệt độ buồng ion hóa

được duy trì ở 250 °C. Phạm vi quét của thiết bị là từ 50 đến

500 amu, với tốc độ quét là 1 giây/1 lần quét. Kết quả thu

được được so sánh với thư viện phổ NIST MS search

program phiên bản 2.2 (2014 - NIST 14). Thể tích tiêm mẫu

là 10 uL, số lần tiêm là 3 lần.

2.2.3. Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu

Quế trên vi sinh vật gây bệnh răng miệng

Chuẩn bị vi sinh vật: Vi sinh vật được tăng sinh

trong môi trường thích hợp (BHI đối với S. mutans và

SDA đối với C. albicans), ủ ở 37 oC trong 18-24 giờ.

Lấy 3-5 khóm vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch

nước muối sinh lý, vortex khoảng 30 giây. Mật độ vi

sinh vật được xác định bằng cách đo mật độ quang ở

bước sóng 600 nm với S. mutans và 530 nm với

C. albicans. Điều chỉnh mật độ vi sinh vật đến ~1-2x108

CFU/mL với S. mutans và ~1-2x106 CFU/ml đối với

C. albicans [9,10].

Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6 * 2024

https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.06 https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn

Chuẩn bị tinh dầu: tinh dầu Quế được pha trong dung

dịch DMSO với nồng độ 10% (tt/tt) tạo thành dung dịch

mẹ. Sau đó, pha loãng dung dịch mẹ trong môi trường

nuôi cấy thích hợp khi tiến hành thử vi sinh vật để đạt

nồng độ thử mong muốn.

2.2.4. Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh

vật (MIC) bằng phương pháp vi pha loãng trên đĩa

96 giếng.

Tinh dầu sẽ được pha loãng 2 lần liên tục từ nồng độ cao

nhất là 0,4% trong đĩa 96 giếng. Vi sinh vật sau được chuẩn

bị sẽ điều chỉnh mật độ trong môi trường nuôi cấy thích hợp

khoảng 2x106 CFU/mL với S. mutans và 2x103 CFU/mL

với C. albicans, sau đó được thêm vào trong mỗi giếng của

đĩa 96 giếng với tỉ lệ 1:1, ủ ở 37 oC trong 18-24 giờ ở điều

kiện thích hợp (điều kiện CO2 5% với S. mutans và điều kiện

hiếu khí với C. albicans). Nồng độ ức chế tối thiểu MIC là

nồng độ tinh dầu thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh

vật quan sát được bằng mắt thường [11,12]. Thí nghiệm được

lặp lại 3 lần.

2.2.5. Xác định nồng độ ức chế biofilm tối thiểu

(MBIC) bằng phương pháp vi pha loãng trên đĩa

96 giếng và nhuộm tím tinh thể (CV)

Sau khi xác định MIC, loại bỏ huyền dịch vi sinh

vật trong đĩa 96 giếng và rửa lại giếng với nước muối

sinh lý. Sau đó, các giếng được nhuộm bằng dung dịch

tím tinh thể 1% trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa

các giếng ít nhất 3 lần với nước muối sinh lý để loại

bỏ thuốc nhuộm không liên kết với biofilm trong

giếng. Sau khi để khô, biofilm được thôi ra bằng cồn

tuyệt đối và hàm lượng biofilm được xác định bằng

cách đo mật độ quang học ở bước sóng 595 nm. Thí

nghiệm được lặp lại 3 lần [9,13].

2.2.6. Xác định khả năng diệt vi sinh vật của tinh

dầu Quế bằng phương pháp đếm sống

Cho 100 µL huyền dịch vi sinh vật đã được chuẩn bị ở

bước trên cho tiếp xúc với 900 µL tinh dầu Quế ở nồng độ

0,1; 0,2 và 0,4% trong 1 phút (tương tự với quá trình súc

miệng). Mẫu chứng âm được tiến hành song song với dung

dịch nước muối sinh lý. Số lượng vi sinh vật còn sống được

xác định bằng phương pháp đếm sống [10]. Thí nghiệm được

lặp lại 3 lần.

3. KẾT QUẢ

3.1. Chiết xuất tinh dầu Quế

Quá trình chiết xuất tinh dầu được thực hiện theo quy trình

đã nêu trên và thu được hiệu suất 2,21%. Tinh dầu sau chiết

xuất có mùi thơm, vị cay đặc trưng và màu nâu đỏ nhạt. Kết

quả kiểm tra tỉ trọng tinh dầu là 1,04 tại nhiệt độ 20 °C theo

Phụ lục 6.5 của Dược điển Việt Nam V [8]. Về mặt định tính,

tinh dầu đáp ứng đầy đủ các yêu cầu trong chuyên luận Tinh

dầu Quế thuộc Dược điển Việt Nam V. Kết quả định lượng

cho thấy hàm lượng phần trăm aldehyd cinnamic trong tinh

dầu là 87,15%, phù hợp với tiêu chuẩn chất lượng quy định

trong chuyên luận Tinh dầu Quế (Dược điển Việt Nam V).

3.2. Thành phần hóa học của tinh dầu Quế

Hiệu suất chiết tinh dầu từ vỏ Quế đạt 2,21%. Kết quả GC-

MS cho thấy tinh dầu Quế có chứa thành phần chính là

aldehyd cinnamic (86,53%, tính theo phần trăm diện tích

đỉnh). Ngoài ra, trong tinh dầu còn có chứa các thành phần

có hàm lượng cao khác là cymol, linalool, thymol, eugenol,

(-)-trans-caryophyllen, cinnamyl acetat ester (Hình 1).

Thành phần hóa học của tinh dầu Quế được trình bày trong

Bảng 1.

Bảng 1. Thành phần hóa học của tinh dầu Quế

STT

Thời gian

lưu (phút)

Khối lượ

phân tử

% diện

tích đỉnh

Hợp chất dự đoán

1 16,21 134 1,13 Cymol

2 16,54 136 1,10 D-Limonen

3 16,65 154 0,49 1,8-Cineol

4 16,94 108 0,02 Benzyl alcohol

5 21,85 154 2,66 Linalool

6 25,11 154 0,01 β-Terpineol

7 27,64 154 0,64 α-Terpineol

8 31,14 132 86,53 Aldehyd cinnamic

9 31,90 150 1,05 Thymol

32,29 134 0,7 Cinnamyl alcohol

11 33,89 164 1,36 Eugenol

36,01 204 3,68 (-)-trans-Caryophyllen

36,76 176 4,26 Cinnamyl acetat ester

40,18 220 0,13 (-)-Caryophyllen oxid

Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 6* 2024

50 | https://www.duoc.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.06.06

Hình 1. Sắc ký đồ GC mẫu tinh dầu Quế

3.3. Nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu của tinh dầu quế

Hình 2. Nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu của tinh dầu Quế trên S. mutans (A) và C. albicans (B)

Sau khi nuôi cấy vi sinh vật với những nồng độ khác

nhau của tinh dầu Quế, chứng âm là môi trường không

cấy vi sinh vật không thấy có sự phát triển của vi sinh

vật, chứng âm không có chất thử thì vi sinh vật phát

triển bình thường. Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát

triển của S. mutans là 0,05% và đối với C. albicans là

0,003125%, thấp hơn nồng độ ức chế trên S.mutans là

8 lần. Kết quả được trình bày trong Hình 2.

3.4. Nồng độ ức chế biofilm tối thiểu của tinh

dầu Quế

Sau khi loại bỏ các vi sinh vật không bám dính, tiến hành

nhuộm lượng biofilm hình thành trong bảng 96 giếng bằng

dung dịch tím tinh thể 1% để xác định hàm lượng biofilm

dưới tác dụng của tinh dầu quế. Kết quả cho thấy, tại giếng

chứng âm (chỉ có môi trường không cấy vi sinh vật) thì

không có sự bám dính của biofilm. Tại giếng chứng (chỉ có

môi trường và vi sinh vật, không có chất thử nghiệm) thì có

sự bám dính của biofilm cao nhất. Nồng độ tối thiểu ức chế

biofilm của tinh dầu Quế trên S. mutans là 0,05% (tương

đương với MIC) và trên C. abicans là 0,003125% (tương

đương với MIC). Kết quả được trình bày trong Hình 3.

3.5. Khả năng diệt vi sinh vật của tinh dầu Quế

Nhằm mô phỏng lại quá trình súc miệng, nghiên cứu

đã cho vi sinh vật tiếp xúc với tinh dầu Quế ở nồng độ

cao hơn nồng độ ức chế vi sinh vật để khảo sát khả

năng diệt vi sinh vật của tinh dầu. Nồng độ được lựa

chọn ở đây là 0,1; 0,2 và 0,4%.

Sau khi cho tiếp xúc trong 1 phút, số lượng vi sinh vật còn

sống được xác định bằng phương pháp đếm sống rồi so sánh

với chứng âm (chỉ cho tiếp xúc với nước muối sinh lý). Kết

quả cho thấy với nồng độ 0,1%, tinh dầu Quế đã diệt hơn

90% lượng vi sinh vật. Khi tăng nồng độ lên 0,2% thì tinh

dầu Quế diệt 100% lượng vi sinh vật sau 1 phút tiếp xúc

(Hình 4).

Khảo sát thành phần hóa học và khả năng ức chế sự phát triển và biofilm do vi sinh vật gây bệnh răng miệng của tinh dầu Quế

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi