Luận văn tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl Cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA VÀ CARBOXYMETHYL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ CỪU (Ovis aries)

ỰC HIỆN

SINH VIÊN TH Phan Th

ị Mỹ Dung

MSSV:3082499 LỚP:CNSH K34

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. Võ Văn Song Toàn TS. Trần Nhân Dũng

Cần Thơ, Tháng 5/2012

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN TH

ỰC HIỆN

ThS. Võ Văn Song Toàn Phan Th

ị Mỹ Dung

TS. Trần Nhân Dũng

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

............................................................................................................................................................

.........................................................................................................................

Cần Thơ, ngày tháng năm 2012

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

LỜI CẢM TẠ

(cid:154)(cid:155) & (cid:157)(cid:156)

Đề tài lu ận văn được hoàn thành không ch ỉ với quá trình làm vi ệc, học tập và nghiên

cứu của tôi, mà còn có s ự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin ghi nh ớ và gửi

lời cảm ơn chân thành đến:

- Gia đình, đã giúp đỡ tôi về mặt vật chất, và ủng hộ về mặt tinh thần trong suốt quá

trình tôi học đại học.

- Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cho tôi rất nhiều.

- Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, đã quan tâm và cho tôi nhi ều lời khuyên bổ ích để thực

hiện tốt đề tài.

- Các thầy cô và anh ch ị cán bộ ở các phòng thí nghi ệm Vi sinh V ật, thực phẩm…

đã tạo điều kiên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học việc và làm đề tài.

- Các anh chị lớp Công nghệ Sinh học khóa 32TT và 33 đã tận tình chỉ dẫn tôi giúp

tôi nắm được những kiến thức căn bản trong phòng thí nghiệm.

- Các bạn và các em sinh viên trong Vi ện đã giúp đỡ tôi trong quá trình th ực hiện đề

tài.

- Thầy cô đã tận tình truy ền dạy những kiến thức trong su ốt quá trình h ọc tập của

tôi, để tôi có th ể nắm vững và vận dụng tốt trong quá trình th ực hiện đề tài cũng

như trong công việc sau này.

Xin chân thành cảm ơn tất cả!

¶¶¶

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát kh ả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose c ủa vi

khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được tiến hành nhằm khảo sát và tuyển chọn các

dòng vi khu ẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu có kh ả năng thủy phân m ạnh cơ chất bã

mía và CMC trong điều ki ện hi ếu khí và k ỵ khí. K ết qu ả phân l ập được 46 dòng vi

khuẩn trên cơ chất bã mía, trong đó có 21 dòng vi khu ẩn trong điều kiện hiếu khí và

25 dòng vi khu ẩn trong điều kiện kỵ khí, kết quả khảo sát đường kính th ủy phân cho

thấy 4 dòng vi khuẩn CD 22, CD 26, CD 11 và CD 15 có kh ả năng thủy phân mạnh cơ

chất CMC và c ơ ch ất bã mía. Đặc bi ệt, dòng vi khu ẩn hi ếu khí CD 22 có hi ệu su ất

thủy phân CMC và bã mía sau 5 ngày cao nh

ất trong nhóm hi ếu khí, l ần lượt là

21,581%, 9, 3147%, dòng vi khu ẩn kỵ khí CD 11 có hi ệu su ất th ủy phân CMC và

dòng CD 15 có hiệu suất thủy phân bã mía cao nh ất lần lượt là 30,049% và 8,8867%.

Tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa các dòng vi khu ẩn tuyển chọn, cho

thấy, dòng CD 22 tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus

và dòng CD 26 t

ương đồng ở mức 73% v ới dòng Clavibacter

agropygi

(Corynebacterium).

Từ khóa: Clavibacter agropygi (Corynebacterium), Pediococcus pentosaceus, dạ cỏ

cừu, thủy phân cellulose,...

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................

LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................

TÓM LƯỢC ................................................................................................................. i

MỤC LỤC ................................................................................................................... ii

DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. v

DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................... viii

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................1

1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1

1.2. Mục tiêu đề tài..................................................................................................... 2

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................3

2.1. Tổng quan về cellulose, CMC, bã mía ................................................................. 3

2.1.1. Cellulose..................................................................................................3

2.1.2. CMC.........................................................................................................5

2.1.3. Bã mía......................................................................................................6

2.2. Hệ enzyme cellulase............................................................................................. 7

2.2.1. Phân loại.................................................................................................. 7

2.2.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose.......................................................9

2.2.3. Nguồn enzyme cellulase..........................................................................9

2.2.4. Ứng dụng enzyme cellulase.................................................................. 10

2.3. Tổng quan về dạ cỏ cừu ......................................................................................10

2.3.1. Cấu tạo chung dạ cỏ cừu .......................................................................10

2.3.2. Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ .......................................... 12

2.4. Các phương pháp vi sinh.....................................................................................13

2.4.1. Phân l

ập vi khuẩn.......................................................................................13

2.4.2. Ki

ểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập.........................................13

2.4.3. Ph

ương pháp kiểm tra catalase..................................................................14

2.4.4. Ph

ương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân..........................15

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

2.5. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................... 15

2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .........................................................15

2.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................... 16

CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 17

3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu ......................................17

3.1.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị ...............................................17

3.1.2. Vật liệu thí nghiệm .............................................................................. 18

3.1.2.1. Bã mía ....................................................................................... 18

3.1.2.2. Dạ cỏ cừu ...................................................................................18

3.1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật........................................ 18

3.1.3.1. Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến ..................................18

3.1.3.2. Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến ................................ 19

3.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................19

3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía ..........................................19

a. Khảo sát hàm lượng cellulose bột bã mía...........................................19

b. Khảo sát hàm ẩm trong bã mía ..........................................................20

c. Khảo sát hàm lượng tro tổng số trong bột bã mía.............................20

3.2.2. Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu .....................................21

3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân CMC................................22

3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía..............................22

3.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC...............................23

3.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía..............................23

3.2.7. Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn........................................................24

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................25

4.1.

Kết quả khảo sát thành phần bã mía................................................................25

4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu............................................................27

4.2.1. Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc............................................................27

4.2.2. Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn.............................................................30

4.3. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC.......33

4.4. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất bã mía.....36

iii

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

4.5. Kết qu ả kh ảo sát hi ệu su ất th ủy phân c ơ ch ất CMC c ủa một số dòng

vi khuẩn được tuyển chọn.................................................................................39

4.6. Kết qu ả kh ảo sát hi ệu su ất th ủy phân c ơ ch ất bã mía c ủa một số dòng

vi khuẩn được tuyển chọn.................................................................................41

4.7. Kết qu ả định danh m ột số dòng vi khu ẩn tuy ển ch ọn bằng ph ương pháp

định danh sinh hóa............................................................................................42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 47

PHỤ LỤC

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu phổ biến.................4

Bảng 2: Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến (M1)..............................................18

Bảng 3: Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến (M2)............................................19

Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm 3.................................................................................22

Bảng 5: Bảng bố trí thí nghiệm 4.................................................................................23

Bảng 6: Kết quả khảo sát thành phần bã mía sau xử lý...............................................25

Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu...........................................27

Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu..............................................27

Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí....................28

Bảng 10: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí....................29

Bảng 11: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí.......................................30

Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí..........................................32

Bảng 13: Hiệu suất thủy phân các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh....................43

Bảng 14: Tóm tắt giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn .........................................ph ụ lục 1

Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khoáng của bã mía

nguyên liệu.......................................................................................ph ụ lục 2

Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía..............................................................ph ụ lục 2

Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí.....ph ụ lục 2

Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí........ph ụ lục 2

Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn

hiếu khí.............................................................................................ph ụ lục 2

Bảng 20: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí....ph ụ lục 2

Bảng 21: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày.........ph ụ lục 2

Bảng 22: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày.......ph ụ lục 2

Bảng 23: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn

hiếu khí ............................................................................................ph ụ lục 2

Bảng 24: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí....ph ụ lục 2

Bảng 25: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí................................ph ụ lục 2

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Bảng 26: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí..............................ph ụ lục 2

Bảng 27: Số liệu khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía các dòng vi khuẩn

tuyển chọn........................................................................................ph ụ lục 2

Bảng 28: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân

của vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất CMC.............................................ph ụ lục 3

Bảng 29: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất CMC....................................................................ph ụ lục 3

Bảng 30: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất bã mía...............................................................ph ụ lục 3

Bảng 31: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất bã mía....................................................ph ụ lục 3

Bảng 32: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí..ph ụ lục 3

Bảng 33: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí.....ph ụ lục 3

Bảng 34: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn

hiếu khí sau 5 ngày..............................................................................ph ụ lục 3

Bảng 35: Kết quả phân tích thống kê hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn

kỵ khí sau 5 ngày.................................................................................ph ụ lục 3

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Cấu trúc cellulose..............................................................................................3

Hình 2: Cấu trúc CMC...................................................................................................6

Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase......................................................................7

Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở vi sinh vật

hiếu khí (A) và vi khuẩn kỵ khí (B).................................................................8

Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu........................................................................................11

Hình 6: Một số thiết bị sử dụng...................................................................................17

Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý..................................................26

Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28....................................................28

Hình 9: Hình chụp nhuộm Gram một số dòng vi khuẩn..............................................31

Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí...............................34

Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26.........35

Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí..................................35

Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 23 và CD 37.........36

Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí ...........................36

Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí................................37

Hình 16: Hoạt tính thủy phân bã mía của một số dòng vi khuẩn.................................38

Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn.......39

Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn..........40

Hình 19:Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn kỵ khí

được tuyển chọn.............................................................................................41

Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn hiếu khí

được tuyển chọn.............................................................................................42

Hình 21: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 22.......................................44

Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 26.......................................45

Hình 23: Phương pháp pha loãng mẫu..............................................................ph ụ lục 1

Hình 24: Đường chuẩn phần trăm CMC theo độ nhớt của môi trường............ph ụ lục 2

vii

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

viii

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

CÁC TỪ VIẾT TẮT

nm: nanomete

CMC: carboxymethyl cellulose

m: meter

mm: milimete

g: gram

FAO: Food anh Agriculture Organization

ml:mililite

EM: Effective Microorganisms

UV: Untra violet

Đktp: đường kính thủy phân

đvC: đơn vị cacbon

CFU: colony forming unit

VSV : vi sinh vật

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG I. GI

ỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề

Tình hình ô nhi ễm môi tr ường đang là v ấn đề nóng trên các di ễn đàn trong

nước và th ế gi ới. Trong các nguyên nhân d ẫn đến ô nhi ễm, thì nguyên nhân do các

chất hữu cơ thực vật dễ xử lý và ít nguy hại nhất. Tuy nhiên, việc làm thế nào để xử lý

nhanh chóng và hi ệu quả các ch ất thải hữu cơ thực vật đồng thời có th ể tận dụng sản

phẩm sau xử lý phục vụ cho nền nông nghiệp sạch và năng lượng xanh là vấn đề quan

trọng đối với những nước có nền sản xuất nông nghiệp như nước ta.

Trong tế bào th ực vật, cellulose là thành ph ần chi ếm tỉ lệ cao nh ất, ở các lo ại

cây gỗ nói chung, hàm l ượng cellulose kho ảng 40-50% riêng ở cây bông, hàm l ượng

cellulose lên đến 90%. Hàng n ăm, có đến hàng tỉ tấn cellulose được tích lũy lại trong

đất dưới dạng rác th ải hữu cơ thực vật, hoặc do chính th ực vật thải ra trong quá trình

sinh tr ưởng phát tri ển. Nếu lượng cellulose này không được xử lý thì trong th ời gian

không lâu, toàn bộ nguồn cacbon trong không khí sẽ được chuyển hóa thành cellulose.

Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức

tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu

cơ chứa cellulose b ằng công ngh ệ sinh học, đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase

ngoại bào từ vi sinh vật (VSV) sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi

trường. Mặt khác, việc ứng dụng enzyme cellulase để xử lý các sản phẩm thải thực vật,

đồng thời tạo ra các sản phẩm phụ như thức ăn gia súc, cồn sinh học, biogas… đang là

hướng phát triển tiềm năng của công nghệ sinh học.

Số lượng các loài VSV tham gia sinh t ổng hợp enzyme cellulase có trong điều

kiện tự nhiên r ất phong phú nh ư nấm, vi khu ẩn, xạ khu ẩn… đặc bi ệt, khu h ệ VSV

cộng sinh với các loài động vật ăn cỏ, là đối tượng VSV thủy phân cellulose được chú

ý nhất. Các nhà khoa h ọc đã phân lập được trên 200 loài vi khu ẩn có kh ả năng thủy

phân cellulose từ dạ cỏ các loài động vật nhai lại (Theodorou và France, 1993).

Nhằm phân lập và tuyển chọn những dòng vi khu ẩn có hoạt tính cellulase cao ,

đề tài: “Khảo sát kh ả năng th ủy phân bã mía và carboxymethyl cellulose c ủa vi

khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được thực hiện, góp phần cung cấp nguồn giống

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 1 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

vi khuẩn phân hủy cellulose có hoạt tính cao để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

1.2. Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 2 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

cơ chất CMC và bã mía.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG II.

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.6. Tổng quan về cellulose

2.1.1. Cellulose

Cellulose là một chất xơ không hòa tan và là m ột trong nh ững thành ph ần chủ

yếu của thành t ế bào th ực vật, chúng được cấu tạo bởi nhi ều gốc β-glucose, liên k ết

với nhau nh ờ cầu nối β 1,4-glucan có công th ức cấu tạo là (C 6H10O5)n hay

[C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000.

Hình 1: Cấu trúc cellulose

(Nguồn: http://mpronovost.ep.profweb.qc.ca/BIONP1/bionp1_molecules_glucides.html

Ngày 15/03/2012 )

Cellulose là glucan không phân nhánh, đó chính là s ự khác bi ệt giữa cellulose

và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song

tạo thành các vi s ợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Các vi s ợi lại liên kết với

nhau tạo thành vi s ợi lớn hay còn g ọi là bó mixen có đường kính 20 nm, gi ữa các sợi

trong mixen có nh ững khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, nh ững khoảng này ch ứa

đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose.

Khối lượng phân tử cellulose thay đổi khác nhau ph ụ thuộc vào từng loại thực

vật và tùy phương pháp xác định (khi xác định bằng phương pháp siêu li tâm, ng ười ta

nhận thấy rằng khối lượng phân tử của cellulose ở bông là 150.000-500.000 đvC còn ở

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 3 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

gai là 1.840.000 đvC), (Nguyễn Lân Dũng, 2008).

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Các mạch cellulose được liên k ết với nhau nh ờ liên k ết hydro và liên k ết van

Der Waals, hình thành hai vùng c ấu trúc chính là tinh th ể và vô định hình. Trong vùng

tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó b ị tấn công bởi

enzyme cũng nh ư hóa ch ất. Ng ược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên k ết

không chặt với nhau nên dễ bị tấn công.

Bảng 1: Thành phần Lignocellulose trong rác th ải và phế phụ liệu phổ biến

Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

24-40 18-25 40-55 Thân gỗ cứng

25-35 25-35 45-50 Thân gỗ mềm

25-30 30-40 25-30 Vỏ lạc

35 15 45 Lõi ngô

0 0-15 85-99 Giấy

24 18 32.1 Vỏ trấu

50 15 30 Vỏ trấu của lúa mì

20 20 60 Rác đã phân loại

80-85 0 15-20 Lá cây

5-20 0 80-95 Hạt bông

25-40 18-30 40-55 Giấy báo

10-20 5-10 60-70 Giấy thải từ bột giấy hóa học

- 24-29 8-15 Chất rắn nước thải ban đầu

28 - 6 Chất thải của lợn

1,4-3,3 2,7-5,7 1,6-4,7 Phân bón gia súc

35,7 6,4 25 Cỏ ở bờ biển Bermuda

31,4 12,0 45 Cỏ mềm

25-50 10-30 25-40 Các lo ại cỏ (tr ị số trung bình cho các loại)

(Nguồn: Nguyễn Vũ Minh Hạnh, 2011)

33,4 Bã thô 30,0 18,9

Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh th ể

và vô định hình.

- Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân t ử cellulose được kéo th ẳng và định

hướng theo chi ều sợi. Vùng tinh th ể có chi ều dài 500 Å và x ếp xen k ẽ với vùng vô

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 4 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

định hình.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

- Trong mô hình chu ỗi gập: phân tử cellulose g ấp khúc theo chi ều sợi. Mỗi đơn

vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chu ỗi nhờ

vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại,

hai đầu là vùng vô định hình, càng vào gi ữa, tính ch ất kết tinh càng cao. Trong vùng

vô định hình, các liên k ết β 1,4 - glycoside gi ữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân t ử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn

mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân th ủy phân hơn vùng tinh th ể

vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β 1,4 - glycoside) s ẽ làm giảm

độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro.

Cellulose có cấu trúc rất bền, không tan trong n ước, chỉ bị trương phồng do hút

nước, và khó b ị thủy phân, chỉ bị phân hủy do đun nóng với kềm hay acid hay do các

enzyme gọi chung là cellulase. Ng ười và động vật không có enzyme phân h ủy

cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì v ậy cellulose không có giá

trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có th ể có vai trò điều

hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khu ẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật

nhai lại và động vật nguyên sinh trong ru ột của mối sản xu ất enzyme phân h ủy

cellulose. Nấm đất cũng có th ể phân h ủy cellulose. Vì v ậy chúng có th ể sử dụng

cellulose làm thức ăn.

Trong xác thực vật (nhất là trong thành ph ần của thân và rễ) thì thành ph ần hữu

cơ chiếm tỉ lệ cao nh ất bao gi ờ cũng là cellulose. Hàm l ượng cellulose trong xác th ực

vật thường thay đổi trong kho ảng 50-80% (tính theo kh ối lượng khô), trong s ợi bông,

hàm lượng này thường vượt quá 90%. Có ng ười đã tính rằng tổng lượng cellulose trên

Trái Đất là vào kho ảng 3500 tỉ tấn. Nếu không có quá trình phân h ủy cellulose thì s ố

lượng này s ẽ tăng lên r ất nhanh và ch ẳng bao lâu, tât c ả CO 2 trong không khí s ẽ

chuyển hóa h ết thành cellulose, s ự sống sẽ không t ồn tại được nữa. (Nguy ễn Lân

Dũng, 2004)

2.1.2. C

arboxymethyl cellulose (CMC)

CMC còn được gọi là carboxymethyl cellulose, là m ột dẫn su ất của cellulose,

được tạo thành từ phản ứng với kiềm và acid chloroacetic có độ nhớt cao và tan trong

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 5 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

nước.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Chế ph ẩm CMC khác nhau ph ụ thu ộc vào m ức độ thay th ế gốc hydroxyl b ằng

gốc carboxy methyl trong chu ỗi cellulose. Thông th ường, mức độ thay th ế ở khoảng

6-9.5 dẫn xuất trên 1 monomer.

CMC có tác d ụng ổn định hệ huy ền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn

trong khai thác mỏ và dầu khí, trong công nghi ệp dùng CMC để hồ vải. (Hồ Sĩ Tráng,

2003).

(Nguồn: http://www.lsbu.ac.uk/water/hycmc.html, ngày 15/03/2012)

Hình 2: Cấu trúc CMC

2.1.3. Bã mía

Mía, Saccharum officinarum, là loài thân thảo, cao 1-4m, đường kính có thể tới

40 – 60 mm.

Sau khi ép tách đường, bã mía còn chứa khoảng 50% ẩm và 1 -2 % đường.

Về thành phần hóa học, bã mía chứa 40 – 50% cellulose, 18 – 23 % lignin và 20

– 25% hemincellulose. (Hồ Sĩ Tráng, 2003)

Các th ống kê cho th ấy hơn 300 tri ệu tấn bã mía và c ủ cải đường được th ải ra

mỗi năm, tập trung h ầu hết ở các nhà máy đường. Các s ố li ệu của FAO cho th ấy

khoảng 1.248 tấn mía được thu ho ạch vào năm 1997, trong đó là 25% bã mía ép (312

triệu tấn). Năng lượng của 1 tấn bã mía ép ( độ ẩm 50%) là 2,85 GJ/t ấn. Đó là chưa kể

các phần thừa (bã bỏ, phần ngọn và lá) và phần thải trong quá trình thu hoạch mía. Các

phần này lại chiếm một tiềm năng năng lượng cao hơn cả (55%), th ế nhưng hiện nay

phần lớn vẫn chỉ bị đốt bỏ hoặc để phân rã ngoài đồng. Nói cách khác, ti ềm năng lớn

này hầu hết vẫn đang bị bỏ phí. Cho đến năm 1999, Châu Á v ẫn dẫn đầu về sản lượng

bã mía (131 tri ệu tấn), sau đó là đến Nam M ỹ (89 tri ệu tấn). Các nhà máy s ản xu ất

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 6 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

đường đã có truyền thống tái sử dụng bã mía để đốt tạo hơi nước từ nhiều thế kỷ qua,

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

nhưng hi ệu suất vẫn còn r ất th ấp. Cho đến gần đây, do s ức ép kinh t ế, các nhà máy

đường đã phải tìm các gi ải pháp khác ho ặc cải thiện hiệu suất tái tạo năng lượng, một

số nhà máy th ậm chí còn bán điện thừa, đặc biệt là tại Brazil, Ấn Độ, Thái Lan... ( Đỗ

Văn Chương và Nguyễn Thị Hồng Anh, 2007).

2.7. Hệ enzyme cellulase

2.7.1. Phân loại

(Nguồn: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Cellulases&lang=1, ngày 15/03/2012)

Hình 3: Cấu trúc nhóm enzyme cellulase

Liên k ết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1(cid:224)4) glucoside. Nói chung,

để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase v ới

những tác động đặc trưng riêng biệt.

Cellulase là một phức hệ enzyme gồm:

+ Exocellulase (1,4 b -glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91): c ắt từ đầu

không kh ử của chu ỗi polymer cho s ản ph ẩm là các g ốc đường đôi cellobiose, không

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 7 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

phân hủy cellulose kết tinh mà ch ỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của phân tử, giúp cho

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

enzyme endocellulase phân h ủy chúng t ốt hơn. Ngoài ra exocellulase còn có các tên

khác như: cellobiohydrolase (CBH), exoglucanase, cellobiosidase, avicellase.

+ Endocellulase (1,4 b -D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): phân h ủy

liên kết b -1,4 glucoside trong vùng vô định hình c ủa cellulose thành: cellodextrin,

cellobiose, glucose. Tác động yếu lên vùng cellulose k ết tinh. Các tên g ọi khác nh ư: endoglucanase, endo 1,4 b -glucanase, C-cellulase.

+ b -D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): phân h ủy các g ốc đường đôi

cellobiose thành glucose. Không có kh ả năng phân hủy cellulose nguyên th ủy. Các tên

gọi khác như: b -glucosidase hay cellobiase. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 4: Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase ở VSV hiếu khí (A)

(Nguồn: Lee R. Lynd, et al. 2002)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 8 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

và vi khuẩn kỵ khí (B)

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

2.7.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose

¶ Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose ( phân hủy hiếu khí)

Quá trình oxy hóa x ảy ra b ắt đầu bằng sự th ủy phân sau đó chuy ển hóa thành

CO2 và H2O.

Cơ chế quá trình oxy hóa cellulose có th ể qua hai giai đoạn:

Giai đoạn th ứ nh ất: là s ự th ủy phân cellulose thành cellulobiose d ưới tác d ụng

của nhóm cellulase. Ngoài ra còn tạo thành một lượng đường glucose.

Giai đọan thứ hai: là giai đoạn oxy hóa nh ững đường đơn giản. Quá trình này có

qua nhi ều sản ph ẩm trung gian lo ại oxi axit và cu ối cùng t ạo thành CO 2 và H2O

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

¶ Cơ chế của quá trình phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí

Quá trình phân h ủy kỵ khí khi các ch ất cellulose được ti ến hành qua hai giai

đọan. Giai đoạn thủy phân cellulose thành glucose và sau đó lên men glucose theo kiểu

lên men butyric. Có hai dạng lên men là lên men dạng hydro và lên men dạng methan.

Theo nh ư Omelanskin thì lên men ki ểu methan s ản ph ẩm khi t ạo ra b ằng nửa

trọng lượng cellulose còn theo ki ểu hydro thì khi t ạo ra b ằng 1/3. (Nguy ễn Đức

Lượng, 2004)

2.7.3. Nguồn enzyme cellulase

Trong tự nhiên có nhi ều loại VSV có kh ả năng sinh ra các enzyme xúc tác quá

trình phân hủy cellulose. Những VSV này được gọi chung là VSV phân h ủy cellulose.

Chúng có nghĩa rất lớn đối với việc thực hiện vòng tu ần hoàn cacbon trong t ự nhiên,

góp phần rất quan trọng trong việc nâng cao độ phì cho đất cũng như vào việc tiêu hóa

thức ăn ở các loài động vật nhai lại.

Trong điều kiện hiếu khí thì cellulose có th ể được phân hủy dưới tác dụng của

nhiều lo ại VSV hi ếu khí (vi khu ẩn, niêm vi khu ẩn, xạ khu ẩn, nấm mốc, nấm túi...).

Các loài VSV có kh ả năng sinh cellulase thu ộc về các chi sau: Achromobacter,

Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellviribrio, Bacillus, Chondromyces,

Myxococcus, Cytophaga... Fusarium, Chaetomium, Aspergillus, Penicilium,

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 9 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Trichoderma, Meralius, Fomes.....

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Ngoài các VSV hi ếu khí còn có m ột số vi khu ẩn kỵ khí có kh ả năng tham gia

tích cực vào quá trình phân h ủy cellulose. Ng ười ta còn g ọi quá trình phân h ủy

cellulose kỵ khí là quá trình “lên men cellulose”.

Còn một nhóm VSV đặc bi ệt nữa có kh ả năng phân h ủy cellulose m ột cách

mạnh mẽ trong điều ki ện kỵ khí hoàn toàn, là nhóm VSV phát tri ển trong d ạ cỏ của

trâu bò và các động vật nhai lại khác. Trâu bò s ẽ không thể nào tiêu hóa được cỏ rơm

rạ nếu không có s ự cộng sinh v ới một khu h ệ đông đúc các VSV trong d ạ cỏ của chúng. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong mỗi ml các chất lấy từ dạ cỏ bò có khoảng 109 – 10 10 tế bào vi khu ẩn. Sinh kh ối vi khu ẩn chứa đến 5 – 10% so v ới lượng chất khô

của toàn b ộ ch ất ch ứa trong d ạ cỏ của trâu bò. Ngoài vi khu ẩn ra, trong m ỗi ml các

chất lấy từ dạ cỏ còn có kho ảng vài tri ệu cơ thể động vật nguyên sinh (6 – 10% kh ối

lượng khô dạ cỏ).

Khu hệ vi khuẩn trong dạ cỏ động vật nhai lại có thể kể đến một vài loài có kh ả

năng phân h ủy mạnh mẽ nh ất là: Ruminococcus flavefeciens, ruminococcus albus,

Ruminobacter parvum, Bacteroides succunogenes, Butyrivibrio fibrisolven,

Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens.... (Nguyễn Đức Lượng,

2003)

2.7.4. Một số ứng dụng cellulase

Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), cellulase có một số ứng dụng như sau:

- Phá v ỡ thành tế bào (cellwall) th ực vật để nuôi cấy các tế bào tr ần, để lai tạo

chúng với nhau nhằm tạo giống thực vật.

- S ản xu ất đường glucose th ực ph ẩm, nguyên li ệu công nghi ệp ho ặc nuôi c ấy

nấm men gia súc.

- Lên men đường chuyển hóa (t ạo thành bởi sự thủy phân cellulose do enzyme)

thành etanol nguyên liệu động cơ đốt trong.

- Tách tinh b ột ra khỏi hạt và củ bằng cách dùng các enzyme tách tế bào

- S ản xuất tổ hợp EM trong xử lý rác thải.

2.8. Tổng quan về dạ cỏ cừu

2.8.1. Cấu tạo chung dạ cỏ cừu

Cừu (Ovis aries) là động vật có vú thu ộc họ trâu bò, chúng có c ơ quan tiêu hóa

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 10 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

đặc trưng của nhóm động vật nhai lại.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

(Nguồn: http://www.sheep101.info/cud.html ngày 25/11/2011)

Hình 5: Cấu trúc dạ dày cừu

Trong dạ dày cừu cũng như dạ cỏ của các loài động vật nhai lại, dạ cỏ là túi lớn

nhất, chi ếm hầu hết nửa trái c ủa xoang b ụng, từ cơ hoành đến xương ch ậu. Dạ cỏ

chiếm 85 – 90% dung tích d ạ dày, 75% dung tích đường tiêu hóa, có tác d ụng tích trữ,

nhào lộn và lên men phân h ủy th ức ăn. Th ức ăn sau khi ăn được nu ốt xu ống dạ cỏ,

phần lớn được lên men bởi hệ VSV cộng sinh ở đây. Chất chứa trong dạ cỏ trung bình

có khoảng 850 – 930g n ước/kg, nhưng tồn tại ở hai tầng: tầng lỏng ở dưới chứa nhiều

tiểu phần thức ăn mịn lơ lửng trong đó và ph ần trên khô h ơn, chứa nhiều thức ăn kích

thước lớn. Ngoài ch ức năng lên men, d ạ cỏ còn có vai trò h ấp thu qua vách d ạ cỏ

(cũng như dạ tổ ong và d ạ lá sách) vào máu và tr ở thành ngu ồn năng lượng cho v ật

chủ. Sinh khối VSV cùng với những tiểu phần thức ăn có kích thước nhỏ (<1mm) sẽ đi

xuống dạ múi khế và ruột để được tiêu hóa tiếp bởi men của đường tiêu hóa.

Chất ch ứa dạ cỏ là m ột hỗn hợp gồm th ức ăn vào, VSV d ạ cỏ, các s ản ph ẩm

trao đổi trung gian, n ước bọt và các ch ất chế tiết vào qua vách d ạ cỏ. Đây là một hệ

sinh thái rất phức hợp trong đó liên tục có sự tương tác gi ữa thức ăn, hệ VSV và v ật

chủ. Dạ cỏ có môi tr ường thu ận lợi cho VSV k ỵ khí phát tri ển. Đáp lại, VSV d ạ cỏ

đóng góp vai trò rất quan trọng vào quá trình tiêu hóa thức ăn của vật chủ.

Ngoài dinh d ưỡng, môi tr ường dạ cỏ có nh ững đặc điểm thi ết yếu cho s ự lên

men cuả VSV cộng sinh nh ư sau: độ ẩm cao (85 – 90%), pH trong kho ảng 6,4 – 7,0, nhiệt độ khá ổn định (38 – 42 oC), áp su ất th ẩm th ấu ổn định và môi tr ường kỵ khí

(nồng độ oxi < 1%). Có m ột cơ chế để đảm bảo duy trì ổn định các điều kiện của môi

trường lên men liên t ục này. N ước bọt đổ vào d ạ cỏ liên t ục giúp duy trì độ ẩm của

môi tr ường lên men. Mu ối photphat và cacbonat ti ết qua n ước bọt có tác d ụng đệm

đồng th ời với sự hấp thu nhanh chóng axit béo bay h ơi và amoniac qua vách d ạ cỏ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 11 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

làm cho pH d ịch dạ cỏ ổn định. Khí oxi nu ốt vào th ức ăn nhanh chóng được sử dụng,

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

nên môi tr ường kỵ khí luôn luôn được duy trì. Áp su ất thẩm thấu dạ cỏ được duy trì

tương tự như áp su ất th ẩm thấu của máu nh ờ có s ự trao đổi ion qua vách c ủa dạ cỏ.

Các chất khí (chủ yếu là CO2 và CH4) là phụ phẩm trao đổi cuối cùng của quá trình lên

men dạ cỏ cũng được thải ra ngoài thông qua quá trình ợ hơi. Thời gian th ức ăn lưu

trong dạ cỏ kéo dài tạo điều kiện cho VSV công phá. (Nguyễn Xuân Trạch et al. 2008)

2.8.2. Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ

Hệ VSV cộng sinh trong d ạ cỏ và dạ tổ ong rất phức tạp và thường gọi chung là

vi sinh v ật dạ cỏ. Hệ VSV dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là vi khu ẩn (Bacteria), động

vật nguyên sinh ( Protozoa) và n ấm (Fungi); ngoài ta còn có mycoplasma, các lo ại

virus và th ể th ực khuẩn không đóng vai trò quan tr ọng trong tiêu hóa th ức ăn. Qu ần

thể VSV dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và ph ụ thuộc vào tính ch ất của khẩu phần

ăn. Hệ VSV dạ cỏ đều là VSV k ỵ khí và sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá

trình lên men các chất dinh dưỡng.

Vi khu ẩn xu ất hi ện trong d ạ cỏ loài nhai l ại trong l ứa tu ổi còn non, m ặc dù

chúng được nuôi cách bi ệt cùng với cha mẹ chúng. Thông th ường vi khu ẩn chiếm số

lượng lớn nhất trong VSV d ạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa ch ất xơ.

Tính từ năm 1941 là n ăm Hungate công b ố những công trình nghiên c ứu đầu tiên v ề

VSV dạ cỏ đến nay đã có tới 200 loài VSV d ạ cỏ được mô tả (Theodorou và France, 1993). Tổng số vi khuẩn có trong dạ cỏ thường vào khoảng 109-1010 tế bào/g chất chứa

dạ cỏ. Trong d ạ cỏ vi khu ẩn ở thể tự do chi ếm kho ản 25-%, s ố còn l ại bám vào các

mẫu thức ăn, trú ngụ ở các nếp gấp biểu mô và bám vào protozoa.

Sự phân lo ại vi khu ẩn dạ cỏ có th ể ti ến hành d ựa vào c ơ ch ất mà vi khu ẩn sử

dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng. Vi khu ẩn phân hủy cellulose: đây là

nhóm có số lượng rất lớn trong dạ cỏ của những loài gia súc s ử dụng khẩu phần giàu

cellulose. Nh ững loài vi khu ẩn phân h ủy cellulose quan tr ọng nh ất là Bacteroides

succinogenes, Butyrivibrio fibrisolven, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus

albus, Cillobacterium cellulosolvens. (Nguyễn Xuân Trạch et al. 2008)

2.9. Các phương pháp vi sinh

2.4.1. Phân l ập vi khuẩn

Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV t ừ quần thể ban đầu và đưa

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 12 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

về dạng thuần khiết.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Đây là một khâu có ý ngh ĩa rất quan tr ọng trong vi ệc nghiên cứu và ứng dụng

vi sinh vật.

Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là gi ống vi sinh v ật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban

đầu.

Trong thiên nhiên ho ặc trong các v ật phẩm nghiên cứu, vi sinh v ật thường tồn

tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Mu ốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý,

lý hoá ho ặc sử dụng vào th ực ti ễn một loài nào đó thì c ần ph ải đưa chúng v ề dạng

thuần khiết.

Nguyên tắc: Tách r ời các t ế bào VSV; Nuôi c ấy các t ế bào trên trong môi

trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.

¶ Một số phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose:

Phân lập trên môi tr ường với nguồn carbon là CMC: Cân 1g m ẫu đất trồng lúa

pha loãng với 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, sau đó hút 20µl trải đều trên môi trường CMC. Ủ môi tr ường 2 – 3 ngày ở 30 oC, tách ròng t ừng khu ẩn lạc thu được

những dòng vi khu ẩn riêng bi ệt. Môi tr ường CMC g ồm 1g (NH 4)2SO4, 1g K 2HPO4, 0,5g MgSO 4.7H2O, 0,001g NaCl, 10g CMC, 2g Agar, thêm n ước đến thể tích 1lít và điều chỉnh pH7. Phân lập trên môi tr ường với nguồn carbon là gi ấy photocopy: Cân 1g m ẫu đất

trồng lúa hoặc dịch dạ cỏ bò pha loãng v ới 100ml nước cất khử trùng, lắc 15 phút, hút

20µl dung d ịch này tr ải đều trên môi tr ường M, sau đó dùng gi ấy photocopy ( được

khử trùng và c ắt tròn có đường kính bằng với đường kính bề mặt đĩa môi tr ường) áp sát trên bề mặt môi trường, ủ môi trường 5-10 ngày ở 30oC cho đến khi khuẩn lạc phát

triển trên bề mặt giấy, tiến hành tách ròng t ừng khuẩn lạc trên môi tr ường CMC (Võ

Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp, 2011).

2.4.2. Ki ểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập

Có nhiều cách kiểm tra:

(cid:216) Ki ểm tra vết cấy:

Quan sát sự sinh trưởng của VSV qua vết cấy trên môi trường đặc.

+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu s ắc đồng đều, thu ần nhất chứng tỏ giống mới

phân lập tinh khiết thì giữ lại.

+ Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ.

(cid:216) Ki ểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc:

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 13 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

+ Tách các khu ẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thi ết trong

nước cất vô trùng.

+ Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường.

+ Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi

đĩa thứ 2, thứ 3.

+ Đặt các đĩa pêtri trên vào t ủ ấm với nhiệt độ và th ời gian thích h ợp tu ỳ loại

VSV.

+ Sau l ấy ra quan sát các khu ẩn lạc riêng r ẽ. Sự thu ần khi ết của khu ẩn lạc là

biểu hiện sự thuần khiết của giống (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006).

2.4.3. Phương pháp kiểm tra catalase

Nguyên tắc

- Các VSV hi ếu khí và k ỵ khí không b ắt bu ộc, ch ứa chu ỗi truy ền điện tử có

cytochrome đều có enzyme catalase, có kh ả năng biến dưỡng năng lượng theo phương

thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2.

- Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc

tính cao này trong tế bào.

- Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.

Tiến hành

Hóa chất sử dụng:

- Dung dịch H2O2 30% được giữ trong tủ lạnh với chai màu nâu tránh ánh sáng

- Dung dịch đệm phosphate pH 7,0.

Có thể thực hiện thử nghiệm catalase bằng một trong nh ững phương pháp sau:

(cid:216) Thử trên phi ến kính (lame): dùng que c ấy lấy một ít sinh kh ối từ khu ẩn lạc

thuần đặt trên một phiến kính sạch . Nh ỏ một giọt H2O2 30% lên sinh kh ối VSV trên

phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Hoặc có thể bằng cách chuyển một ít sinh khối

của khuẩn lạc lên phiến kính, nhỏ một giọt H2O2 0,5% rồi đậy lại bằng một lame kính

(lamelle). Ghi nh ận nếu có sự xuất hiện của bọt khí bị giữ lại giữa phiến kính và lam

kính.

(cid:216) Thử trong ống thạch nghiêng: nh ỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên sinh kh ối chủng

thuần trên b ề mặt th ạch nghiêng. Ghi nh ận nếu có s ự sủi bọt quanh sinh kh ối.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 14 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

(cid:216) Thử bằng ống mao dẫn: dùng ống mao dẫn thu lấy dung dịch H2O2 30%, sau đó

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

chấm đầu ống mao dẫn này vào tâm khu ẩn lạc cần thử trên môi tr ường. Ghi nh ận nếu

có sự sủi bọt khí trong ống mao d ẫn. Phương pháp này có ưu điểm là th ử được trên

từng khuẩn lạc nên có thể thực hiện trên các khuẩn lạc của chủng chưa làm thuần.

Đọc kết quả

- Dương tính (+) : khi có hiện tượng sủi bọt khí do khí O2 được tạo ra.

- Âm tính (-) : khi không có hiện tượng sủi bọt khí.

(Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng, 2006)

2.4.4. Phương pháp xác định đường kính vòng tròn thủy phân

Mục đích: Đánh giá s ơ lược về kh ả năng phân h ủy cơ ch ất cellulose c ủa vi

khuẩn, làm cơ sở khảo sát cho những thí nghiệm sau.

Nguyên tắc: Khi cellulase tác d ụng lên cơ chất cellulose trong môi tr ường thạch,

cơ chất bị phân hủy làm cho độ đục môi trường giảm và dần trong suốt. Độ trong suốt

được tạo ra của môi tr ường tỉ lệ với độ hoạt động của cellulase (Nguy ễn Đức Lượng,

2003).

2.10. Tình hình nghiên cứu

2.10.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Nguy ễn Hoài Phong et al. (2003) đã phân lập được 7 chủng vi sinh v ật từ mạt

dừa của các c ơ sở sản xuất chỉ sơ dừa. Bằng kỹ thu ật định danh s ơ bộ dựa vào hình

dạng, tất cả đều là xạ khuẩn, sau đó tiến hành sơ chọn các vi sinh v ật có kh ả năng tạo

ra enzyme cellulase để phân hủy cellulose.

Nguy ễn Lân D ũng et al. đã tiến hành phân l ập tuyển chọn và nghiên c ứu các

chủng nấm men có kh ả năng phân h ủy cellulose t ừ 343 ch ủng nấm men nh ằm ứng

dụng trong xử lý bã th ải hoa qu ả làm th ức ăn chăn nuôi. Kết quả đã tuyển chọn được

các chủng 9B1, 30B1, 97m, VTCC 2.0243, 4B2 có kh ả năng phân hủy cellulose cao.

Võ Hoài B ắc et al. (2010) đã chọn được 2 ch ủng vi sinh v ật từ 17 ch ủng ban

đầu có kh ả năng th ủy phân mạnh cơ ch ất cellulose, qua định danh đã xác định được

các chủng này là Bacillus lichenformis (Li) và Bacillus subtilis VTCC-B-505, sau đó

tiến hành ứng dụng 2 giống này trong thủy phân bã thải agar.

Hà Thanh Toàn và Cao Ng ọc Điệp et al. (2010) kh ảo sát kh ả năng phân h ủy rác thải hữu cơ của 3 dòng vi khu ẩn gồm có 1 dòng vi khu ẩn bình nhi ệt (30oC) (dòng C1b), 2 dòng vi khu ẩn ái nhi ệt (55oC) (dòng 3a1và 3a2). K ết quả cho thấy hai nghiệm

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 15 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

thức C2 (chủng vi khu ẩn phân hủy cellulose bình nhi ệt dòng C1b) và nghi ệm thức C4

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

(chủng vi khu ẩn ái nhi ệt dòng 3a2) đạt được các ch ỉ tiêu phù h ợp nhất. Hơn nữa, hai

nghiệm thức này có l ượng khí CO 2, CH 4 thải ra th ấp, không gây ảnh hưởng đến môi

trường.

Võ V ăn Phước Quệ và Cao Ng ọc Điệp (2011) phân l ập và nh ận diện vi khu ẩn

phân hủy cellulose từ đất trồng lúa và d ạ cỏ bò. Kết quả thu được 4 dòng vi khu ẩn có

khả năng sản sinh enzyme cellulase ngo ại bào và th ủy phân hi ệu quả giấy photocopy

và rơm rạ. Phân tích di truy ền phân t ử dựa trên trình t ự 16S rRNA cho th ấy dòng vi

khuẩn Q5, Q8 và Q9 đồng hình 99-100% tương ứng với dòng Bacillus megaterium,

dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% tương ứng với dòng Cellulomonas flavigena.

2.10.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Oyeleke và Okusanmi (2008), đã tiến hành phân l ập và kh ảo sát ho ạt tính th ủy

phân cellulose c ủa vi sinh v ật từ dạ cỏ động vât nhai l ại nh ư bò, c ừu và dê. K ết qu ả

phân lập được một số dòng vi khu ẩn và nấm có kh ả năng thủy phân cellulose nh ư P.

eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium.

Phân tích l ượng cellulose được phân h ủy và sự sinh tr ưởng của vi khu ẩn phân

hủy cellulose trong dạ cỏ (Russell et al., 2009).

Khảo sát s ự cạnh tranh c ủa 3 nhóm vi khu ẩn dạ cỏ có kh ả năng phân h ủy

cellulose ch ủ yếu trong tr ường hợp có ho ặc không có nhóm vi sinh v ật không phân

hủy cellulose (Chen và Weimer, 2001)

Barbara et al. (1968), phân l ập được 30 dòng vi khu ẩn từ dạ cỏ cừu. Trong đó có

19 dòng phẩy khuẩn Gram âm thuộc chi Butyrivibrio, bốn dòng cầu khuẩn thuộc nhóm

Ruminococcus albus, năm dòng c ầu khu ẩn thu ộc nhóm R.flavefacien, 2 dòng còn l ại

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 16 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

được xác định thuộc chi Clostridium.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG III. PH

ƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.3. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu

3.3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất và thiết bị

Địa điểm: Phòng thí nghi ệm Sinh hóa và Công ngh ệ Enzyme, Vi sinh Th ực

phẩm, Vi sinh, Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ.

Thời gian : Tiến hành từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 4 năm 2012.

4.7H2O, K2HPO4,

Hóa ch ất: Ammonium sulfate (Merck), Congo Red, NaCl, agar, cacboxyl

methyl cellulose (CMC), H 2SO4, NaOH, gellan Gum, MgSO Pluronic F.68, Fuchsin, Iod, Crystal violet, c ồn 96o …

Thiết bị:

- Tủ cấy vi sinh v ật (Pháp), kính hi ển vi Olympus CHT (Nh ật), máy l ắc mẫu

GFL 3005 (Đức), nồi trùng nhi ệt ướt Pbi-international ( Đức), biolog Gen II Microbial

Identification System, h ệ th ống phân tích ch ất xơ VELP, máy đo độ nhớt Handheld

Viscometer SKF TMVM1, máy tro hóa Nabertherm, b ộ micropipet biorad P10, P20,

P200, P1000, P5000 ( Đức), Tủ sấy EHRET ( Đức), máy khu ấy từ (Hoa K ỳ), pH k ế

Orion 420A (Hoa K ỳ), cân điện tử Sartorius ( Đức), ống nghi ệm 15 ml ( Đức), chai Durham 8cc (Đức), đĩa petri đường kính 8cm, 16cm ( Đức), tủ lạnh – 20 ºC Electrolux

Confor plus (Thụy Điển), tủ lạnh – 4 ºC Akira (Vi ệt Nam), máy ch ụp ảnh kỹ thuật số,

máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.

- Một số dụng cụ khác nh ư: kính lúp, que c ấy, lam, lammen, que th ủy tinh, bình

tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylong, ốngđong, đèn cồn,…

Máy tro hóa Nabertherm Hệ thống phân tích chất xơ Máy đo độ nhớt

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 17 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Hình 6: M ột số thiết bị sử dụng

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

3.3.2. Vật liệu thí nghiệm

¶ Bã mía

Bã mía được lấy từ nhà máy đường Hậu Giang, th ị xã V ị Thanh, t ỉnh Hậu

Giang. Bã mía được ngâm và r ửa nước nhiều lần để loại bỏ lượng đường của bã mía, sấy khô ở 70oC và nghiền mịn thành bột với kích thước hạt là 0,2mm.

¶ Dạ cỏ cừu

Mẫu dạ cỏ cừu thu ở lò giết mổ dê cừu ở Cần Thơ.

Cách thu mẫu dạ cỏ:

30ml dịch dạ cỏ thu ở 3 vị trí khác nhau trên cùng một dạ cỏ, trữ vào ống falcon 50ml, bảo quản trong tối ở nhiệt độ lạnh 4oC trong su ốt quá trình v ận chuyển mẫu về

phòng thí nghi ệm; để lắng trong 10 phút để lo ại bỏ th ức ăn, thu d ịch trong ch ứa vi

khuẩn.

3.3.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

3.3.3.1. Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến

Bảng 2: Môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M1)

Thành ph ần môi trường đặc

Cơ chất 10 g

4)2SO4 1 g

(NH

K2HPO4 1 g

4.7H2O 0,5 g

MgSO

NaCl 0,001 g

Agar 20 g

( Nguồn: Ryckeboer et al, 2003)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 18 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Nước 1000 g

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

3.3.3.2. Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến

Bảng 3: Môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M2)

Thành phần môi trường lỏng

Cơ chất 10 g

4)2SO4 1 g

(NH

K2HPO4 1 g

4.7H2O 0,5 g

MgSO

NaCl 0,001 g

( Nguồn: Ryckeboer et al, 2003)

Nước 1000 g

Tùy theo mục đích cấy chuyển vi sinh vật, có thể bổ sung yeast extract nhằm

kích hoạt vi khuẩn.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần bã mía

Chuẩn bị bã mía: bã mía sau khi l ấy từ nhà máy mía đường sẽ được sấy ở 700C

trong kho ảng 60 phút, sau đó nghi ền thành b ột bằng máy nghi ền mẫu RetschMiihle

với kích th ước lổ lưới là 0,2mm. B ột bã mía sau khi nghi ền được rửa với nước lọc để

loại đường.

a. Khảo sát hàm lượng cellulose trong bột bã mía

Nguyên tắc: phương pháp định lượng cellulose d ựa vào tính ch ất bền nhiệt của

cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và base m ạnh. Các ch ất như hemicellulose,

lignin, tinh bột... ít bền hơn với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh nên bị oxy hóa,

phân hủy và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu ( Phạm Thị Ánh Hồng, 2003).

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên, 1 nhân t ố, 3 lần

lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 3.

Tiến hành:

- Phân tích 1g bã mía v ới H2SO4 1,25% và NaOH 1,25% b ằng hệ thống phân tích

xơ VELP.

- Hàm lượng cellulose được tính theo công thức sau:

X = (a*100)/m

Trong đó:

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 19 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

m: trọng lượng mẫu ban đầu (g)

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

a: trọng lượng cellulose còn (g)

X: phần trăm cellulose có trong mẫu (%)

b. Xác định độ ẩm trong bã mía

Nguyên tắc: dùng nhiệt làm bay hơi nước trong nguyên liệu.

Bố trí thí nghi ệm: thí nghi ệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên, 3 l ần lặp lại.

Tổng số đơn vị thí nghiệm là 3.

Tiến hành: sấy 3 gram b ột bã mía ở 105 oC trong 120 phút ở; phần trăm độ ẩm

được tính theo công thức:

X = (G1 – G2)*100/m

Trong đó

G1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g).

G2 : khối lượng mẫu sau khi sấy (g).

m: khối lượng nguyên liệu (g).

X: phần trăm nước có trong bã mía (%).

c. Xác định hàm lượng tro tổng số trong bã mía

Tro là thành ph ần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy h ết các ch ất hữu cơ.

Tro thật sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong nguyên liệu (do đó tro còn được gọi

là tổng số muối khoáng).

Nguyên tắc: Các ch ất hữu cơ sẽ bị nung cháy hoàn toàn ở nhi ệt độ cao (550 – 6000C); nh ững thành ph ần còn l ại được dùng để xác định ph ần tr ăm tro có trong

nguyên liệu.

Bố trí thí nghi ệm: thí nghi ệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên, 3 l ần lặp lại,

tổng số đơn vị thí nghiệm là 3.

Tiến hành: Nung 3 gram bột bã mía ở 5500C trong 5 giờ.

Hàm lượng tro toàn phần được tính theo công thức sau:

X = G2*100/G1

Trong đó:

G1: trọng lượng mẫu ban đầu (g).

G2: trọng lượng mẫu sau khi nung (g).

X: phần trăm tro có trong mẫu phân tích.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 20 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

(Nguyễn Thị Thu Thủy và Nguyễn Công Hà, 2009)

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

3.1.2. Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu

Mục đích: phân lập những dòng vi khu ẩn sống trong dạ cỏ cừu có kh ả năng sử

dụng cơ chất bã mía làm nguồn cacbon.

Tiến hành thí nghiệm:

Vi khuẩn dạ cỏ được cấy chuyển nhiều lần trên môi tr ường M1 (c ơ chất bã mía)

cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc ròng.

- Đối với vi sinh vật hiếu khí: Mẫu được ủ ở 38oC trong 48 giờ.

- Đối với vi sinh vật kỵ khí: Mẫu được ủ trong bình hút ẩm kỵ khí, ủ ở 38oC trong

48 giờ.

Mô tả khu ẩn lạc: Nuôi c ấy mỗi vi khu ẩn trên t ừng đĩa petri riêng ở điều ki ện 38oC, trong 48 gi ờ. Quan sát và mô t ả khuẩn lạc bằng kính lúp ở độ phóng đại 5X dựa

vào một số đặc điểm sau.

+ Hình dạng: dạng tròn có kích th ước nhỏ (punctiform) và l ớn (circular);

dạng không đều (irregular), d ạng thoi (spindle), r ễ cây d ạng sợi (filamentous) và r ễ

(rhizoid).

+ Độ nổi: Dạng ph ẳng (flat) th ường th ấp và ngang v ới mặt môi tr ường;

dạng lài (raised) có chi ều cao khu ẩn lạc khá hơn dạng ph ẳng nhưng có hai d ốc (phía

vành khuẩn lạc lài xu ống; dạng mô (convex) th ường nổi mô cao lên trên môi tr ường

đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có

dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate).

+ Dạng bìa: có 5 d ạng bìa ph ổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa g ợn

sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa r ăng cưa (erose), bìa sợi (filamentous).

+ Màu sắc: Khu ẩn lạc th ường có màu tr ắng trong, tr ắng đục, xám, đỏ,

vàng, lục, ...

Mô tả vi khu ẩn: Một số đặc điểm hình thái c ủa vi khu ẩn bao g ồm hình d ạng,

trạng thái, khả năng chuyển động của vi khuẩn.

+ Hình dạng, trạng thái vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép ở vật

kính 100X (phụ lục 1).

+ Khả năng di động vi khuẩn: vi khuẩn được chuyển vào môi tr ường thạch bán lỏng (0,3 - 0,6% th ạch); đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ 38oC và quan sát sau

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 21 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

3 ngày (Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thị Thúy Hằng, 2006).

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

+ Gram vi khu ẩn được kh ảo sát d ựa theo ph ương pháp nhu ộm Gram c ủa nhà

khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938) (phụ lục 1).

3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính thủy phân cơ chất CMC của vi khuẩn

thủy phân.

Mục đích: Khảo sát vi khu ẩn có kh ả năng th ủy phân c ơ ch ất CMC trong điều

kiện hiếu khí và kỵ khí.

- Nguyên tắc: Vi khuẩn phân hủy cellulose trong c ơ chất sẽ tạo thành vòng halo

bao quanh khuẩn lạc khi nhuộm với thuốc nhuộm Congo Red.

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên, 1 nhân t ố (nhân tố là từng dòng vi

khuẩn riêng biệt), 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 3.

Bảng 4. Bảng bố trí thí nghiệm 3

NT 1

. ......

NT n

NT: nghiệm thức.

1, ... n: dòng vi khuẩn thứ 1 đến n.

Nghiệm thức lặp lại 1 lặp lại 2 lặp lại 3

Mỗi 20 µl d ịch mỗi dòng vi khu ẩn được chủng vào gi ếng thạch môi tr ường M1

(cơ chất CMC) có đường kính 5mm; kh ảo sát vòng tròn đường kính thủy phân sau khi ủ 72 giờ ở 380C.

Hoạt tính thủy phân = đường kính vòng tròn thủy phân – đường kính lỗ đục

Chỉ tiêu đánh giá:

- Hoạt lực của các dòng vi khu ẩn được đánh giá thông qua kh ả năng tạo vòng

tròn đường kính thủy phân trên môi trường M1 (cơ chất CMC).

3.1.4. Thí nghi ệm 4: Kh ảo sát ho ạt tính th ủy phân c ơ ch ất bã mía c ủa vi

khuẩn

Mục đích: Khảo sát và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng thủy phân mạnh cơ chất

bã mía trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí.

Nguyên tắc: Vi khu ẩn phân h ủy cellulose trong c ơ chất sẽ tạo thành vòng halo

bao quanh khuẩn lạc khi nhuộm với thuốc nhuộm Congo Red.

Bố trí thí nghiệm:

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 22 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Thí nghiêm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên, 1 nhân t ố (nhân tố là từng dòng vi

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

khuẩn riêng biệt), 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 3.

Bảng 5. Bảng bố trí thí nghiệm 4

Nghiệm thức lặp lại 1 lặp lại 2 lặp lại 3

- - - NT 1

- - - . ......

NT: nghiệm thức.

1, ... n: dòng vi khuẩn thứ 1 đến n.

- - - NT n

Mỗi 20 µl d ịch mỗi dòng vi khu ẩn được chủng vào gi ếng thạch môi tr ường M1

(cơ ch ất bã mía) có đường kính 5mm; kh ảo sát vòng tròn đường kính th ủy phân sau khi ủ 72 giờ ở 380C.

Hoạt tính thủy phân = đường kính vòng tròn thủy phân – đường kính lỗ đục

Chỉ tiêu đánh giá:

Ho ạt lực của các dòng vi khu ẩn được đánh giá thông qua kh ả năng tạo vòng tròn

đường kính thủy phân trên môi trường M1 (cơ chất bã mía).

3.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hiệu suất thủy phân CMC

Mục đích: Đánh giá hoạt lực của một số dòng vi khu ẩn được tuyển chọn để thủy

phân CMC.

Mẫu thử: 6 dòng vi khu ẩn hiếu khí và 6 dòng vi khu ẩn kỵ khí được tuyển chọn

trong thí nghiệm 3.

Tiến hành thí nghiệm

Chủng 1% dịch vi khu ẩn mật số khoảng 10 7 CFU/ml vào 50 ml môi tr ường M2 (cơ chất CMC), ủ ở 38 oC trong 5 ngày ( ủ lắc vận tốc 100 vòng/phút đối với vi khu ẩn

hiếu khí, ...).

Chỉ tiêu đánh giá

- S ự giảm độ nhớt của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn (phụ lục 1.4)

3.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía

Mục đích: Đánh giá hoạt lực của một số dòng vi khu ẩn được tuyển chọn để thủy

phân bã mía.

Mẫu thử: 4 dòng vi khu ẩn hiếu khí và 4 dòng vi khu ẩn kỵ khí được tuyển chọn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 23 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

trong thí nghiệm 3.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Tiến hành thí nghiệm

Chủng 1% dịch vi khu ẩn mật số khoảng 10 7 CFU/ml vào 50 ml môi tr ường M2 (cơ chất bã mía), ủ ở 38oC trong 5 ngày ( ủ lắc vận tốc 100 vòng/phút đối với vi khuẩn

hiếu khí, ...).

Chỉ tiêu đánh giá:

Hiệu suất thủy phân bã mía = % xơ ban đầu – % xơ sau nuôi cấy

3.1.7. Thí nghiệm 7: Định danh vi khuẩn

Mục tiêu thí nghiệm: Định danh dòng vi khuẩn được chọn lọc

Nguyên tắc: Mỗi loài vi khuẩn có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau

(chủ yếu là nhi ều loại đường), trong tr ường hợp chúng sử dụng cùng một loại đường

thì nhu cầu về hàm lượng đường cũng khác nhau ở từng loài.

Tiến hành thí nghiệm:

- Vi khuẩn đã được chọn có khả năng đường hóa mạnh bã mía được dùng để xác

định tên loài c ủa vi khu ẩn bằng hệ th ống định danh vi sinh v ật Biolog Gen II

Microbial Identification System t ại phòng thí nghi ệm VSV Công nghi ệp, Viện NC &

PT Công Nghệ Sinh Học.

- Mỗi dòng vi khu ẩn được nuôi c ấy riêng trên đĩa petri v ới thành ph ần môi

trường bã mía-agar. Dùng que có đầu bông gòn vô trùng lấy vi khuẩn chuyển vào dung

dịch chuyên biệt sao cho dung d ịch sau khi lấy vi khuẩn đạt độ đục nhất định (đo bằng

máy đo độ đục). Bơm rút 100 μl dung dịch sau khi lấy vi khuẩn chuyển vào mỗi giếng

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 24 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

trên khay 96 gi ếng chuyên dùng để định danh vi khu ẩn do công ty Victory (Hà N ội) cung cấp. Ủ ở 33oC trong 18-24 giờ, lấy khay ra đọc kết quả.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả khảo sát thành phần bã mía

Nhận xét: theo kết quả từ bảng 6 cho thấy:

Sau khi phân tích 1 gram bã mía b ằng máy phân tích x ơ, lượng xơ bã mía còn

lại là 58,57% . Kết qu ả này cao h ơn so v ới kết qu ả của Issay (1980) v ới lượng ch ất

cellulose trong xơ mía là 56,5%, cao h ơn thành phần cellulose trong bã mía c ủa Hồ Sĩ

Tráng (2003) là 40-50%. M ặt khác, kết quả này cũng cho thấy hàm lượng xơ trong bã

mía cao h ơn 7,27% so v ới hàm l ượng xơ bã mía c ủa Nguyễn Thị Thanh Trúc et al.

(2011). Có th ể là do s ự khác nhau v ề giống mía nguyên li ệu dẫn đến sự khác bi ệt về

thành phần chất xơ.

Thành ph ần cellulose trong bã mía khá cao, h ơn nhi ều so v ới thành ph ần

cellulose trong các ngu ồn nguyên li ệu khác nh ư: vỏ trấu (32,1 %), lá cây (15-20%)…

do đó, bã mía r ất thích h ợp để làm ngu ồn nguyên li ệu cho quá trình th ủy phân

cellulose của vi khuẩn.

Bột bã mía sử dụng có chứa 7,96 % nước.

Bã mía sau xử lý có 3,59% ch ất khoáng. Kết quả này cao hơn kết quả của Issay

(1980) là 1,3 %. Cao h ơn hàm l ượng khoáng trong x ơ dừa là 2,22% (Sudhakaran và

Vasudev, 2001).

Bảng 6: kết quả khảo sát thành phần của bã mía sau xử lý

Hàm lượng Cellulose Hàm lượng ẩm độ Hàm lượng tro

(%) (%) (%)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 25 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

58,57 7,96 3,59

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Hình 7: Bã mía thô và bột bã mía trước và sau xử lý

4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ cừu

Quá trình phân l ập đã tách ròng được 46 dòng vi khu ẩn từ dạ cỏ cừu, bao gồm

21 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí và 25 dòng vi khu ẩn trong điều kiện kỵ khí. Tất cả 46 dòng vi khuẩn đều phát triển tốt ở 38oC sau 48 giờ.

Bảng 7: Kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí từ dạ cỏ cừu

Stt Tên dòng vi khuẩn hiếu khí Stt Tên dòng vi khuẩn hiếu khí

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 26 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

CD 2 CD 4 CD 6 CD 8 CD 10 CD 12 CD 14 CD 16 CD 18 CD 20 CD22 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 CD 24 CD 26 CD 28 CD 30 CD 32 CD 34 CD 36 CD 38 CD 40 CD42 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Bảng 8: Kết quả phân lập vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ cừu

Stt Tên dòng vi khuẩn kỵ khí Stt Tên dòng vi khuẩn kỵ khí

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CD 1 CD 3 CD 5 CD 7 CD 9 CD 11 CD 13 CD 15 CD 17 CD 19 CD 21 CD 23 CD 25 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 CD 27 CD 29 CD 31 CD 33 CD 35 CD 37 CD 39 CD 41 CD 43 CD 45 CD 47 CD 49

4.2.1 Kết quả mô tả đặc điểm khuẩn lạc

Bảng 9: Kết quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí

Tên dòng vi khuẩn

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 27 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Stt 1 CD 2 2 CD 12 3 CD 14 4 CD 6 5 CD 18 6 CD 32 7 CD 34 8 CD 40 9 CD8 10 CD 20 11 CD 26 12 CD28 13 CD 38 14 CD 4 15 CD 10 16 CD 16 17 CD 22 18 CD 24 19 CD 30 20 CD 36 21 CD 42 Hình dạng khuẩn lạc tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn không đều hình thoi tròn không đều tròn tròn tròn tròn Độ nổi khuẩn lạc lài lài lài lài lài lài lài lài lài lài lài lài lài phẳng phẳng lài lài Cầu chồng mô phẳng mô Dạng bìa khuẩn lạc nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên Gợn sóng gợn sóng Gợn sóng Gợn sóng gợn sóng chia thùy gợn sóng nguyên gợn sóng nguyên nguyên nguyên nguyên Màu sắc khuẩn lạc Xám Xám Xám Xám Xám Xám Xám Xám xám Xám Xám Xám Xám trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục Trong trắng đục Xám Trong

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Bảng 9 cho thấy: đa số khuẩn lạc các dòng vi khuẩn hiếu khí có dạng hình tròn,

bìa nguyên, lài, chuyển màu xám khi vi khu ẩn già. Có thể phân nhóm sơ bộ 19 dòng vi

khuẩn hiếu khí này này như sau: nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, lài, nguyên, xám có

8 dòng bao g ồm CD 2, CD 6, CD 12, CD 14, CD 18, CD 32, CD 34 và CD 40; nhóm

vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, lài, bìa gợn sóng màu xám có 5 dòng CD 8, CD 20, CD 38,

CD 26 và CD 28, 8 dòng vi khuẩn còn lại đều có những đặc điểm khuẩn lạc riêng biệt.

CD 28 CD 22

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 28 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Hình 8: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn CD 22 và CD 28

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Bảng 10: Kết quả quả mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn kỵ khí

Tên dòng vi khuẩn CD 1 CD 5 CD 21 CD 3 CD 39 CD 45 CD 7 CD 49 CD 9 CD 15 CD 11 CD 13 CD 27 CD 29 CD 47 CD 31 CD 17 CD 19 CD 23 CD 25 CD 33 CD 35 CD 37 CD 41 CD 43 Hình dạng khuẩn lạc tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn không đều không đều tròn tròn không đều không đều tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn tròn Độ nổi khuẩn lạc lài lài lài mô mô mô phẳng phẳng lài lài phẳng phẳng cầu chồng cầu chồng phẳng phẳng lài phẳng lài phẳng lài phẳng phẳng lài mô Dạng bìa khuẩn lạc nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên nguyên răng cưa răng cưa chia thùy chia thùy nguyên nguyên chia thùy chia thùy răng cưa Gợn sóng nguyên răng cưa nguyên chia thùy nguyên nguyên nguyên Màu sắc khuẩn lạc Xám Xám Xám Trong Trong Trong Xám Xám Xám Xám trắng đục trắng đục trắng đục trắng đục Trong Trong Xám Xám trắng đục Trong trắng đục trắng đục Trong Trong Xám Stt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Dựa vào kết quả bảng 10 cho th ấy 25 dòng vi khu ẩn kỵ khí có s ự đa dạng hơn

rất nhi ều so v ới 21 dòng vi khu ẩn hi ếu khí. S ơ bộ chúng có th ể thu ộc 15 nhóm vi

khuẩn khác nhau. Phần lớn mỗi dòng vi khuẩn có đặc điểm khuẩn lạc riêng; chỉ có một

số dòng vi khu ẩn có đặc điểm giống nhau như nhóm CD 3, CD 39, CD 45; nhóm CD

15, CD 9; nhóm CD 1, CD 5, CD 21; nhóm CD 11, CD 13; nhóm CD 7, CD 49, nhóm

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 29 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

CD 31, CD 47; nhóm CD 27, CD 29.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

4.2.2 Kết quả mô tả đặc điểm vi khuẩn

Bảng 11: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn hiếu khí

Tên dòng vi khuẩn Gram vi khuẩn Stt Hình dạng vi khuẩn Catalase Chuyển động Kích thước vi khuẩn (μm)

* (5) có ho

ạt tính catalase (+), không có hoạt tinh catalase (-)

* (6) Chuy

ển động (+), không chuyển động (-)

(2) CD 2 CD 4 CD 6 CD 8 CD 10 CD 12 CD 14 CD 16 CD 18 CD 20 CD 22 CD 24 CD 26 CD 28 CD 30 CD 32 CD 34 CD 36 CD 38 CD 40 CD 42 (4) + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - - (5) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + (6) - + - + + + - - - + + - - + - + - - - - - (1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 (3) 0,989 cầu 1,484 cầu 1,187 cầu 1,484-0,989 Que ngắn 1,088 cầu 1,484 cầu 0,989 cầu 1,978-1,187 que ngắn 1,978-1,484 que ngắn 1,187 cầu 1,78 cầu 1,484- 0,79 que ngắn 1,78-2,769 que ngắn 2,474 cầu 1,78 cầu 5,934-1,187 que 0,989 cầu 1,088-1,978 que ngắn 0,989 cầu 4,451-0,989 que 3,956-0,989 que * (4): Vi khuẩn Gram dương (+), vi khuẩn Gram âm (-)

Theo k ết quả ở bảng 11, 21 dòng vi khu ẩn hiếu khí có 3 d ạng: cầu, que ng ắn và

que. Vi khuẩn hình cầu tồn tại ở 3 trạng thái là c ầu đơn (CD 2, CD 6, CD 10, CD 34),

cầu đôi (CD 30), ho ặc cả cầu đơn và đôi (CD 4, CD 12, CD 20, CD 22, CD 28, CD

38). Vi khuẩn hình que ng ắn (CD 4, CD 16, CD 18, CD 24, CD 26, CD 36). Vi khu ẩn

hình que (CD 32, CD 40, CD 42).

Khi ti ến hành nhuộm Gram vi khuẩn, ta nhận thấy tất cả vi khuẩn hình cầu và que

ngắn đều thuộc Gram dương, trong khi đó, 3 dòng vi khuẩn hình que là CD 32, CD 40,

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 30 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

CD 42 đều thuộc Gram âm.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Thí nghi ệm xác định ho ạt tính catalase cho k ết qu ả 21 dòng vi khu ẩn hi ếu khí

phân lập được đều dương tính với catalase, kết quả này phù hợp, chứng tỏ, 21 dòng vi

khuẩn đều sử dụng Oxi trong quá trình sinh trưởng.

Qua k ết quả khảo sát 21 dòng vi khu ẩn hiếu khí ta nh ận thấy phần lớn chúng đều

không di động; chỉ có 6 trong 19 dòng vi khu ẩn là có kh ả năng chuyển động thể hiện

qua kh ả năng mọc lan r ộng quanh v ết cấy trên môi tr ường th ạch bán l ỏng (Nguy ễn

Lân Dũng và Đinh Thị Thúy Hằng, 2006).

CD 32

CD 42

CD 26

CD 8

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 31 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Hình 9: Vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Bảng 12: Kết quả mô tả một số đặc điểm vi khuẩn kỵ khí

Catalase Chuyển động Gram vi khuẩn Stt Tên dòng vi khuẩn Hình dạng vi khuẩn

+ + + +

- - - - - + + + - + + + +

CD 1 1 CD 3 2 CD 5 3 CD 7 4 CD 9 5 CD 11 6 CD 13 7 CD 15 8 9 CD 17 10 CD 19 11 CD 21 12 CD 23 13 CD 25 14 CD 27 15 CD 29 16 CD 31 17 CD 33 18 CD 35 19 CD 37 20 CD 39 21 CD 41 22 CD 43 23 CD 45 24 CD 47 25 CD 49 cầu cầu cầu cầu que ngắn cầu cầu que cầu cầu cầu cầu cầu cầu cầu cầu cầu cầu que ngắn que ngắn cầu que cầu cầu que Kích thước vi khuẩn (μm) 1,484 1,187 1,187 0,989 1,978-1,088 - 1,978 1,978 0,79-5,44 1,484 0,989 1,484 1,78 1.484 1.978 1.978 0,989 1,484 1,78 1,178-1,978 + 0,989-2,474 - 0,989 3,462-0,989 - 1,484 1.484 1,978 - + - + + + + - + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - + + + + + - - - - + - + + + + - - - - + +

Theo k ết quả bảng 12, 25 dòng vi khuẩn kỵ khí có 3 dạng: vi khuẩn hình cầu, vi

khuẩn que ngắn và vi khu ẩn hình que. Ở dạng cầu khuẩn, tồn tại 3 trạng thái vi khuẩn,

cầu đơn (CD 1, CD 3, CD 21, CD 23, CD 25, CD 27, CD 29, CD 31, CD 33, CD 41),

cầu đôi và đơn (CD 5, CD 7, CD 17, CD 19, CD 35, CD 45) c ầu chùm (CD 11, CD

13). Vi khu ẩn dạng que ng ắn gồm có các dòng CD 9, CD 37, CD 39. Vi khu ẩn dạng

que có các dòng CD 15, CD 45, CD 49.

Khi ti ến hành nhu ộm Gram vi khu ẩn, trong nhóm 18 c ầu khu ẩn đa số thu ộc

nhóm Gram d ương, có 5 dòng c ầu khuẩn thu ộc nhóm Gram âm: CD 11, CD 13, CD

17, CD 19, CD 45. Trong khi đó, 6 dòng vi khu ẩn thuộc nhóm vi khu ẩn hình que và

que ngắn, đa số thuộc nhóm Gram âm, chỉ có dòng CD 37 thuộc nhóm Gram dương.

Kết quả bảng 11 cho th ấy phần lớn vi khu ẩn 23 trong 25 dòng vi khu ẩn đều có

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 32 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

hoạt tính catalase; điều này ch ứng tỏ 24 dòng vi khu ẩn này là nhóm vi khu ẩn kỵ khí

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

không bắt buộc. Duy chỉ có 02 dòng vi khu ẩn CD 9 và CD 15 là âm tính catalase điều

này cho thấy CD 9 và CD 15 là 2 dòng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.

Qua kết quả khảo sát khả năng di động của 25 dòng vi khu ẩn kỵ trên môi tr ường

thạch bán l ỏng cho th ấy chúng c ũng chia làm 02 nhóm. M ột nhóm có kh ả năng di

động thể hiện qua kh ả năng mọc lan rộng quanh vết cấy bao gồm CD 11, CD 13, CD

15, CD 17, CD 27, CD 31, CD 33, CD 35, CD 37, CD 47, CD 49 trong đó 6 dòng vi

khuẩn hình que đều có khả năng di động; nhóm còn lại không có khả năng di động.

4.3. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất CMC

Cơ ch ất cellulose nhân t ạo có nhi ều lo ại, trong đó, CMC là c ơ ch ất cellulose

thường được dùng để xác định sự hiện diện và ho ạt lực của enzyme endoglucanases.

(Lee et al., 2002).

Qua kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC c ủa 46 dòng vi khu ẩn, trong đó

có 21 dòng vi khu ẩn hiếu khí (bảng 16, phụ lục 2), 25 dòng vi khu ẩn kỵ khí (bảng 17,

phụ lục 2), cho th ấy có 14 dòng vi khu ẩn hiếu khí và 11 dòng vi khu ẩn kỵ khí có kh ả

năng thủy phân cơ chất CMC ở nhiều mức độ khác nhau.

hoạt tính thủy phân CMC hiếu khí

)

m m

( n â h p y ủ h t h n í k g n ờ ư đ

CD 2CD 4CD8

CD 10

CD 14

CD 16

CD 18

CD 20

CD 22

CD 26

CD28 CD 32

CD 34

CD 38

CD 42

dòng vi khu ẩn hiếu khí

Hình 10: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí

Trong 21 dòng vi khu ẩn hi ếu khí, thì có 14 dòng vi khu ẩn có kh ả năng th ủy

phân cơ chất CMC bao g ồm CD 4, CD 8, CD 10, CD 14, CD 16, CD 18, CD 20, CD

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 33 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

22, CD 26, CD 28, CD 32, CD 34, CD 38, CD 42, trong đó, dòng CD 10, CD 20, CD

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

26, CD 22 có đường kính thủy phân (đktp) lớn nhất vào khoảng 40,3-41,3 mm và khác

biệt không ý nghĩa với dòng CD28 (39.3mm) nh ưng khác biệt ý nghĩa với các dòng vi

khuẩn còn lại ở mức độ tin cậy 95%. Các dòng vi khu ẩn CD 2, CD 6, CD 12, CD 24,

CD 30, CD 36, CD 40 điều chưa có khả năng thủy phân cơ chất CMC.

Kết qu ả này cho th ấy dòng vi khu ẩn CD 28 v ới đktp 41,3mm có ho ạt lực

endoglucanase cao hơn kết quả khảo sát vòng tròn đường kính thủy phân của vi khuẩn

hiếu khí có kh ả năng th ủy phân cellulose được phân l ập từ bã mía đang phân h ủy

(Nguyễn Văn Chắc et al., 2009) v ới đường kính thủy phân lớn chất là 30mm, cao h ơn

kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC của các dòng vi khu ẩn hiếu khí phân lập từ

con sùng (Nguy ễn Phú C ường và Võ V ăn Song Toàn, 2011) v ới kết quả đường kính

thủy phân lớn nhất là 26,67mm.

Dòng CD220

Dòng CD 26

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 34 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Hình 11: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 20 và CD 26

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

HOẠT TÍNH THỦY PHÂN CMC CỦA VI KHUẨN KỴ KHÍ

)

m m

(

Í

N Â H P Y Ủ H T H N K G N Ờ Ư Đ

CD 1 CD 5 CD 9CD 11CD 13CD 15CD 17CD 19CD 21CD 29CD 35CD 49

DÒNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

Hình 12: Hoạt tính thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn kỵ khí

Trong 25 dòng vi khu ẩn kỵ khí có 11 dòng vi khu ẩn có kh ả năng thủy phân cơ

chất CMC, bao g ồm: CD 5, CD 9, CD 11, CD 13, CD 15, CD 17, CD 19, CD 21, CD

29, CD 35, CD 49. Trong đó, dòng CD 11 có vòng tròn đường kính thủy phân lớn nhất

là 56mm, khác bi ệt ở mức ý nghĩa 95 % v ới các dòng vi khu ẩn còn lại. Các dòng CD

1, CD 3, CD 7, CD 25, CD 27, CD 29, CD 33, CD 35, CD 39, CD 41, CD 43, CD 45,

CD 47, CD 49 đều chưa thể hiện khả năng thủy phân cơ chất CMC.

Kết quả này cho th ấy dòng vi khu ẩn CD 11 v ới đường kính thủy phân 56mm có

hoạt lực endoglucanase cao h ơn kết qu ả kh ảo sát ho ạt tính th ủy phân CMC c ủa các

dòng vi khu ẩn kỵ khí được phân l ập từ dạ cỏ trâu bò (Võ Chí Đức et al., 2009) v ới

đktp lớn chất là 23,35mm, cao h ơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân CMC của các

dòng vi khuẩn kỵ khí được phân lập từ con sùng (Nguyễn Phú Cường và Võ Văn Song

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 35 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Toàn, 2011) với kết quả đường kính thủy phân lớn nhất là 24mm.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Dòng CD 21 Dòng CD 35

Hình 13: Đường kính thủy phân trên cơ chất CMC của dòng CD 21 và CD 35

Ł T ừ kết quả thí nghi ệm 3, ch ọn được 6 dòng vi khu ẩn hiếu khí (CD 10, CD 20,

CD 22, CD 26, CD 28, CD 34) và 6 dòng vi khu ẩn kỵ khí (CD 11, CD 15, CD 17, CD

21, CD 35, CD 49) có ho ạt tính thủy phân CMC cao và khác bi ệt có ý nghĩa với nhóm

vi khuẩn còn lại, để tiến hành khảo sát hiệu suất thủy phân CMC ở thí nghiệm 5.

4.4. Kết quả khảo sát sơ bộ hoạt tính vi khuẩn trên môi trường cơ chất bã mía

Để thủy phân hoàn toàn bã mía c ũng như các cơ chất cellulose tự nhiên khác, vi

khuẩn cần có đầy đủ hệ enzyme cellulase, đặc biệt là enzyme exoglucanases để phá vỡ

cấu trúc vùng tinh th ể của cellulose. Do đó các cơ chất cellulose thường được dùng để

đánh giá s ự hi ện di ện của enzyme exocellulase và ho ạt lực của toàn b ộ hệ enzyme

cellulase. (Yung et al., 2009)

Qua kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của 46 dòng vi khuẩn, trong đó

có 21 dòng vi khu ẩn hiếu khí (bảng 18, phụ lục 2), 25 dòng vi khu ẩn kỵ khí (bảng 19,

phụ lục 2), cho th ấy có 11 dòng vi khu ẩn hi ếu khí và 8 dòng vi khu ẩn kỵ khí có kh ả

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 36 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

năng thủy phân cơ chất CMC ở nhiều mức độ khác nhau.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

HOẠT TÍNH THỦY PHÂN BÃ MÍA

)

m m

(

Í

N Â H P Y Ủ H T H N K G N Ờ Ư Đ

CD 2 CD 10CD 14CD 16CD 20CD 22CD 24CD 26

CD28 CD 30CD 32CD 38CD 40

DÒNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Hình 14: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn hiếu khí

Khảo sát 21 dòng vi khu ẩn hiếu khí thì có 10 dòng vi khu ẩn có xu ất hiện vòng

halo trên đĩa thạch gồm: CD 10, CD 14, CD 16, CD 20, CD 22, CD 24, CD 26, CD 28,

CD 30, CD 38, CD 40. Trong đó, dòng vi khu ẩn CD 22 và CD 26 có đktp lớn nhất lần

lượt là 37mm và 36 mm, khác bi ệt không ý ngh ĩa với dòng vi khu ẩn CD 24 và CD 28

nhưng khác biệt nghĩa ở mức 5% với các dòng vi khuẩn còn lại.

Kết qu ả này cho th ấy dòng vi khu ẩn CD 22 v ới đktp 37mm có ho ạt lực thủy

phân bã mía cao h ơn kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân của các dòng vi khu ẩn phân

hủy cellulose được phân lập từ bã mía đang phân hủy (Nguyễn Thị Thanh Trúc et al.,

2011) với đường kính th ủy phân lớn chất là 5mm, cao h ơn kết quả khảo sát ho ạt tính

thủy phân của các dòng vi khu ẩn hiếu khí được phân lập từ ruột mối trên cơ chất bột

gỗ xoài (Nguyễn Phú Cường et al., 2011) với kết quả đường kính thủy phân lớn nhất là

25mm.

Kết quả khảo sát ho ạt lực thủy phân trên c ơ chất bã mía c ủa 21 dòng vi khu ẩn

hiếu khí có sự khác biệt so với hoạt lực thủy phân trên cơ chất CMC. Các dòng CD 4,

CD 8, CD 18, CD 32, CD 34, CD 42 đều có ho ạt tính endocellulase, nh ưng chưa thể

hiện vòng tròn đường kính th ủy phân trên c ơ chất bã mía; có kh ả năng vì các dòng vi

khuẩn này không có enzyme exoglucanase; Tuy nhiên, dòng CD 24 và CD 30 không

có hoạt tính trên CMC l ại có hoạt tính cellulose trên c ơ chất bã mía; nh ư vậy, hoạt lực

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 37 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

thủy phân bã mía, không phụ thuộc nhiều vào hoạt lực của enzyme endoglucanase.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

HOẠT TÍNH THỦY PHÂN CƠ CHẤT BÃ MÍA

)

m m

(

Í

N Â H P Y Ủ H T H N K G N Ờ Ư Đ

CD 1

CD 5

CD 11

CD 15

CD 17

CD 21

CD 25

CD 31

CD 43

DÒNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

Hình 15: Hoạt tính thủy phân bã mía của nhóm vi khuẩn kỵ khí

Có 8 trong 25 dòng vi khuẩn vi khuẩn kỵ khí có khả năng tạo vòng halo trên đĩa

thạch với cơ chất bã mía g ồm: CD 5, CD 11, CD 15, CD 17, CD 21, CD 25, CD 31,

CD 43. Trong đó, dòng CD 15 có vòng halo l ớn nh ất với đường kính là 49,33mm

khác biệt ý nghĩa ở mức 95 % với các dòng vi khuẩn còn lại.

Kết quả này cho th ấy đường kính thủy phân của dòng vi khu ẩn CD 15 cao h ơn

so với kết quả khảo sát ho ạt tính th ủy phân của các dòng vi khu ẩn kỵ khí được phân

lập từ dạ cỏ dê trên c ơ chất bộ rơm (Nguyễn Thị Thanh Thúy và Võ V ăn Song Toàn,

2010) với kết quả đường kính thủy phân cao nhất là 32mm.

Kết quả này cũng tương tự kết quả khảo sát ho ạt tính th ủy phân bã mía c ủa vi

khuẩn hiếu khí. Các dòng vi khu ẩn CD 9, CD 13, CD 19, CD 29, CD 35, CD 49 có

hoạt tính endocellulase ch ưa thể hiện vòng tròn đường kính th ủy phân trên c ơ chất bã

mía, và các dòng vi khu ẩn CD 25, CD 31, CD 43 th ể hiện vòng tròn đường kính th ủy

phân trên bã mía nhưng không có hoạt tính endocellulase.

Ł Từ kết quả thí nghi ệm 4, ch ọn được 4 dòng vi khu ẩn hiếu khí (CD 22, CD

24, CD 26, CD 28) và 4 dòng vi khu ẩn kỵ khí (CD 11, CD 15, CD 21, CD 43) thu ộc

nhóm vi khu ẩn có ho ạt tính th ủy phân bã mía cao, và khác bi ệt ý ngh ĩa với nhóm vi

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 38 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

khuẩn còn lại, để tiến hành khảo sát hiệu suất thủy phân ở thí nghiệm 6.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CD 11

CD 26

CD 15 CD 22

Hình 16: Đường kính thủy phân trên cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn

4.5. Kết qu ả kh ảo sát hi ệu su ất th ủy phân c ơ ch ất CMC c ủa một số dòng vi

khuẩn được tuyển chọn

Cơ chất CMC là cơ chất cellulose nhân tạo có khả năng hòa tan tốt vào nước, ở

mỗi tỉ lệ hòa tan và ở mỗi nhi ệt độ pH khác nhau, dung d ịch CMC có m ột độ nh ớt

khác nhau ( http://www.wattpad.com/1352640-bao-cao-tn?p=25, 15/03/2012 ). Do đó, dựa vào độ

nhớt của dung d ịch CMC ở cùng m ột nhi ệt độ và pH, ta có th ể xác định tỉ lệ ph ần

trăm CMC có trong dung dịch.

Kết qu ả kh ảo sát m ối tương quan gi ữa nồng độ CMC trong dung d ịch và độ

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 39 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

nhớt cho phép xây dựng đường biểu diễn tương quan y = 118,09x - 61,604 v ới phương sai R2 = 0,975

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Chủng 1% dịch vi khu ẩn với mật số 10 7CFU/ml của lần lượt 6 dòng vi khu ẩn

hiếu khí CD 10, CD 20, CD 22, CD 26, CD 28, CD 34 và 6 dòng vi khu ẩn kỵ khí CD

11, CD 15, CD 17, CD 21, CD 35, CD 49 vào 150 ml canh tr ường 1% cơ chất CMC và tiến hành ủ ở 38 oC trong 5 ngày. Độ nhớt của môi tr ường nuôi cấy vi khu ẩn được

kiểm tra bằng thiết bị Handheld Viscometer SKF TMVM 1.

HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CMC

25.00

20.00

15.00

10.00

I

N Â H P Y Ủ H T T Ấ U S U Ệ H

5.00

0.00

CD 26

CD 28

CD 22

CD 20

CD 10

CD 34

ĐC

DÒNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TUYỂN CHỌN

Hình 17: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn hiếu khí tuyển chọn

Kết quả khảo sát hi ệu su ất thủy phân CMC c ủa nhóm vi khu ẩn hi ếu khí được

tuyển chọn từ thí nghi ệm 3 cho th ấy, cả 6 dòng vi khu ẩn được chọn có hi ệu suất thủy

phân từ 11,137-21,581% và khác biệt có nghĩa với mẫu đối chứng không có vi khuẩn.

Hiệu suất thủy phân của các dòng vi khu ẩn CD 26, CD 20, CD 22, CD 10, CD

34 không có khác bi ệt ý nghĩa với nhau ở mức 5%, ngoại trừ dòng CD 28 nh ỏ nhất và

khác biệt ý nghĩa với các dòng còn l ại với độ tin cậy 95%. Trong đó, dòng CD 22 có

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 40 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

hiệu suất thủy phân cao nhất là 21,581 %.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CMC

35.00

abc

30.00

bcd

25.00

20.00

15.00

10.00

I

N Â H P Y Ủ H T T Ấ U S U Ệ H

5.00

0.00

CD 21

CD 15

CD 35

CD 17

CD 49

ĐC

CD 11 DÒNG VI KHUẨN KỴ KHÍ TUYỂN CHỌN

Hình 18: Hiệu suất thủy phân CMC của các dòng vi khuẩn kỵ khí tuyển chọn

Kết qu ả kh ảo sát hi ệu su ất th ủy phân CMC c ủa nhóm vi khu ẩn kỵ khí được

tuyển chọn từ thí nghi ệm 3 cho th ấy, cả 6 dòng vi khu ẩn được chọn có hi ệu suất thủy

phân 19,323-31,179% và khác bi ệt nghĩa với mẫu đối chứng không có vi khu ẩn. Kết

quả này cao hơn kết quả hiệu suất thủy phân CMC của nhóm vi khuẩn hiếu khí.

Hiệu suất thủy phân CMC c ủa các dòng vi khu ẩn kỵ khí khác bi ệt với nhau ở

mức tin cậy 95%. Trong đó, 2 dòng có hi ệu suất thủy phân mạnh nhất là CD 35 và CD

11 với kết quả lần lượt là 31,179% và 30,049%.

4.6. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía của một số dòng vi khuẩn

Bốn dòng vi khu ẩn hiếu khí gồm: CD 22, CD 24, CD 26, CD 28 và 4 dòng vi

khuẩn kỵ khí gồm: CD 13, CD 17, CD 23, CD 45 có ho ạt tính th ủy phân bã mía cao

thể hi ện qua vòng halo tuy ển ch ọn từ thí nghi ệm 4 được nuôi c ấy trong 100ml môi trường lỏng 2% c ơ ch ất bã mía đồng nh ất với nhau. Sau 5 ngày nuôi ủ ở 38 oC ti ến

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 41 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

hành lọc lấy phần cặn và phân tích thành phần xơ bằng máy phân tích xơ VELP.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

HIỆU SUẤT THỦY PHÂN XƠ BÃ MÍA

I

N Â H P Y Ủ H T T Ấ U S U Ệ H

10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00

CD11

CD15

CD43

CD21

ĐC

DÒNG VI KỴ KHÍ TUYỂN CHỌN

Hình 19: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn kỵ khí được tuyển chọn Kết quả sau 5 ngày nuôi lỏng, các dòng vi khuẩn đã thủy phân được từ 2,9343%

đến 8,8867 % c ơ chất bã mía và khác bi ệt có ý ngh ĩa với mẫu đối chứng không chủng

vi khuẩn. Đặc biệt dòng vi khu ẩn CD 15 có hi ệu suất thủy phân cao nh ất là 8,8867%

khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% với 3 dòng vi khu ẩn còn lại. Kết quả này

phù hợp với kết quả khảo sát đường kính thủy phân trên cơ chất bã mía.

HIỆU SUẤT THỦY PHÂN XƠ BÃ MÍA

10.00

8.00

6.00

4.00

2.00

I

N Â H P Y Ủ H T T Ấ U S U Ệ H

0.00

CD26

CD28

CD24

CD22

ĐC

DÒNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TUYỂN CHỌN

Hình 20: Hiệu suất thủy phân cơ chất bã mía của một số dòng vi khuẩn hiếu khí

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 42 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

được tuyển chọn

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Kết quả sau 5 ngày nuôi l ỏng, hiệu suất thủy phân bã mía c ủa 4 dòng vi khu ẩn

hiếu khí được tuyển chọn vào khoảng 5,7287% – 9,3147% trong s ố đó dòng vi khu ẩn

CD 22 có hiệu suất thủy phân cao nhất với 9,3147% bã mía được thủy phân.

4.7. Kết qu ả định danh m ột số dòng vi khu ẩn được tuy ển ch ọn bằng ph ương

pháp định danh sinh hóa

Từ kết quả thí nghi ệm 5 và thí nghi ệm 6 tuy ển chọn được 4 dòng có hi ệu suất

thủy phân cao:

Bảng 13: hiệu suất thủy phân các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh

Hiệu suất Hiệu suất thủy Tên dòng thủy phân CMC phân bã mía STT vi khuẩn (%) (%)

1 CD 22 21,58 9,31

2 CD 26 16,22 7,49

3 CD 11 21,30 8,89

4 CD 15 30,05 2,93

DÒNG CD 22

Kết qu ả định danh: dòng CD 22 có kh ả năng sử dụng các lo ại đường : L-

Arabinose, Palatinose, D-Rhamnose, D-xylose, L- Fucose, D-Melezitose, D-Ribose,

Glycyl-L-Glutamic acid, Tween 80, Gentiobiose, làm ngu ồn carbon trong quá trình

phát triển, tương đồng ở mức 99% với dòng vi khuẩn Pediococcus pentosaceus.

(Karna et al., 2007) có dòng Pediococcus pentosaceus EL-5 d ạng cầu khu ẩn Gram

Theo nghiên c ứu về vi khu ẩn acid lactic t ừ sữa và các ph ụ ph ẩm lên men

dương, khuẩn lạc màu tr ắng đục và ch ảy lan trên b ề mặt môi tr ường thạch, đặc điểm

này giống với đặc điểm về hình dạng khuẩn lạc và vi khuẩn của dòng CD 22. Và dòng

Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 thu ộc nhóm vi khu ẩn Pediococcus

pentosaceus có kh ả năng th ủy phân cellulose ( http://ecocyc.org/PPEN278197/NEW-

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 43 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

IMAGE?object=Cellulose-Degradation, 25/04/2012)

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Hình 21: K ết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 22

DÒNG CD 26

Kết quả định danh: dòng vi khu ẩn CD 26 có kh ả năng sử dụng các lo ại đường

L-Arabinose, D- Xytose, D-Ribose làm ngu ồn carbon, t ương đồng ở mức 73% v ới

dòng vi khuẩn Clavibacter agropygi (Corynebacterium).

Theo kết qu ả nghiên c ứu của Wan và Lau Abdullah (2010), dòng vi khu ẩn

Clavibacter agropygi phân l ập được có dạng khuẩn lạc cầu, nổi mô ở giữa, vi khu ẩn

qua Gram dương, kết quả này cũng tương đồng với kết quả từ thí nghiệm 2.

Theo kết quả nghiên cứu của M. Ramin et al. (2008 ) đã phân lập được 3 dòng

vi khuẩn từ mối có kh ả năng sử dụng CMC và Cellulose làm ngu ồn cacbon trong đó

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 44 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

có dòng vi khuẩn Clavibacter agropygi.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CD

Hình 22: Kết quả định danh sinh hóa dòng vi khuẩn CD 26

DÒNG CD 11 và CD 15

Qua kết quả định danh cho thấy: dòng CD 11 và CD 15 không có k ết quả tương

đồng ý ngh ĩa về khả năng sử dụng đường với các dòng vi khu ẩn có trong ngân hàng

của hệ thống Biolog.

Tuy nhiên, vì vi khuẩn nhóm GP2 trong ngân hàng h ệ thống Biolog chỉ có 310

dòng, do đó, có th ể vi khu ẩn dòng CD 11 không thu ộc nhóm nh ững dòng có s ẵn, nên

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 45 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

kết quả định danh không chính xác.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

CHƯƠNG V:

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

Đề tài đã phân l ập được 46 dòng vi khu ẩn, trong đó có 21 dòng vi khu ẩn trong

điều ki ện hi ếu khí, và 25 dòng vi khu ẩn trong điều ki ện kỵ khí. T ất cả các dòng vi khuẩn đều phát triển tốt trong nhiệt độ 38oC sau 48 giờ.

Qua kh ảo sát đường kính th ủy phân và hi ệu suất thủy phân trên cơ chất CMC và

bã mía, đã tuyển chọn được 4 dòng vi khu ẩn CD 22, CD 26, CD 11, CD 15 có ho ạt

tính enzyme cellulase cao v ới hiệu su ất thủy phân sau 5 ngày nuôi trong môi tr ường

lỏng với cơ chất CMC lần lượt là 21,58%, 16,22%, 30,05% và 21,3%, hi ệu suất thủy

phân sau 5 ngày nuôi trong môi tr ường lỏng cơ chất bã mía l ần lượt là 9,31%, 7,49%,

2,93% và 8,89%.

Định danh bằng hệ thống Biolog Microlog Microstation Automated Identification

System cho th ấy dòng vi khu ẩn CD 22 t ương đồng ở mức 99% v ới dòng vi khu ẩn

Pediococcus pentosaceus và dòng CD 26 t ương đồng ở mức 73% v ới dòng vi khu ẩn

Clavibacter agropygi (Corynebacterium).

5.2. Đề nghị

Gi ải trình tự các dòng vi khu ẩn có ho ạt tính th ủy phân cellulose cao: CD 22, CD

26, CD 11 và CD 15.

ảo sát hệ enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn tuyển chọn. Kh

ảo sát kh ả năng thủy phân một số cơ chất tự nhiên khác nh ư rơm rạ, giấy … Kh

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 46 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

của các dòng vi khuẩn được phân lập từ đề tài.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Cao Ng ọc Điệp và Nguy ễn Hữu Hi ệp. 2008. Bài gi ảng th ực hành vi sinh v ật đại

cương. Viện NC và PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

Hà Thanh Toàn, Trương Thị Nhật Tâm, Cao Ngọc Điệp. 2010. Khả năng phân hủy rác

thải hữu cơ của vi khuẩn phân giải cellulose (cellulolytic bacteria). Tạp chí khoa

học Đại học Cần Thơ. 16b. 189 – 198.

Hồ Sĩ Tráng. 2003. Cơ sở hóa học gỗ và cellulose t ập 1. Nhà xu ất bản Khoa h ọc và

Kỹ thuật, trang 1 – 31.

Hồ Sĩ Tráng. 2004. Cơ sở hóa học gỗ và cellulose t ập 2. Nhà xu ất bản Khoa h ọc và

Kỹ thuật, trang 185 – 191.

Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành

phố Hồ Chí Minh, trang 377 – 389.

Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền, Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm công nghệ

vi sinh v ật tập 2 _ thí nghi ệm vi sinh v ật học. Nhà xu ất bản Đại học Qu ốc gia

Thành phố Hồ Chí Minh, trang 121 – 124.

Nguyễn Hoài Phong, Nguy ễn Thành Lâm, Ph ạm Tấn Vi ệt, Nguy ễn Khánh Hoàng.

2003. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose

từ nguyên liệu mạt dừa ở Bến Tre.

Nguyễn Lân D ũng. Nguy ễn Đình Quy ến, Ph ạm Văn Ty. 2008. Vi sinh v ật học. Nhà

xuất bản Giáo dục, trang 240.

Nguyễn Th ị Thu Th ủy. 2011. Giáo trình th ực tập hóa h ọc th ực ph ẩm. Khoa NN và

SHUD, trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Lân D ũng, Đinh Th ị Thúy H ằng. 2006. Ph ương pháp th ực nghi ệm dùng để

định tên các loài vi khuẩn. Vietsciences.

Nguyễn Phú C ường, Võ V ăn Song Toàn, Nguy ễn Châu Tu ấn, Nguy ễn Th ị Thanh

Thúy. 2011. Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khu ẩn phân hủy cellulose từ hệ

tiêu hóa của con mối. Đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Thị Thanh Trúc, Võ V ăn Song Toàn, D ương Thị Hương Giang. 2011. Tuy ển

chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy các dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy

phân bã mía. Luận văn tốt nghi ệp đại học chuyên ngành Công ngh ệ Sinh h ọc,

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 47 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

trường Đại học Cần Thơ.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Nguyễn Văn Ch ắc, Võ V ăn Song Toàn, Nguy ễn Hữu Hi ệp. 2009. Phân l ập một số

dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong bã mía đang phân hủy. Luận

văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Văn Ch ương, Đỗ Th ị Hoài Anh. 2007. Chuyên đề năng lượng ch ương 10 _

Năng lượng sinh khối. Vnggenergy.

Nguyễn Vũ Hoàng Sơn, Võ Văn Song Toàn, Dương Thị Hương Giang. 2010. Khảo sát

điều ki ện nuôi c ấy một số dòng vi khu ẩn kỵ khí sinh t ổng hợp cellulase th ủy

phân mụn dừa. Luận văn tốt nghiệp đại học chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học,

trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Vũ Minh H ạnh. 2011. B ước đầu nghiên c ứu enzyme xylanolytic và

cellulolytic từ một ch ủng vi khu ẩn ưa nhiệt. Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên.

Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban. 2008. Giáo trình chăn nuôi trâu bò.

Trường Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội, trang 58 – 62.

Phạm Thị Ánh Hồng. 2003. Kỹ thu ật sinh hóa . Trường Đại học Khoa h ọc Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trang 102 – 117.

Võ Chí Đức, Võ Văn Song Toàn, Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Phân lập vi khuẩn từ dạ cỏ

và phân trâu bò. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học, trường

Đại học Cần Thơ

Võ Hoài Bắc, Lê Thị Hương Thủy, Lê Thị Lan Anh. 2010. Phân l ập chủng vi sinh vật

sinh cellulase sử dụng trong thủy phân bã thải agar. Viện Nghiên cứu Hải sản.

Võ Văn Phước Quệ, Cao Ng ọc Điệp. 2011. Phân l ập và nh ận diện vi khu ẩn phân hủy

cellulose. Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ. Tập18a. Trang 177-184.

Tài liệu tiếng Anh

Barbara S. Shane L. Gouws and A. Kistner. 1969. Cellulolytic Bacteria Occurring in

the Rumen of Sheep Conditioned to Low-protein Teff Hay. J. gen. Microbiol. pp

445-457.

B.K.L. Karna, O.C. Emata, V.L. Baraquio. 2007. Lactic acid and probiotic bacteria

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 48 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

from fermented and probiotic dairy products. Science diliman. 19:2. pp. 23 – 34.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Chen J, Weimer P. 2001. Competition among three predominant ruminal cellulolytic

bacteria in the absence or presence of non-cellulolytic bacteria. FEMS

Microbiology Letters. Vol 147. pp. 20 – 30.

Issay Isaias and Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1980.

Small-scale cane sugar processing and residue utilization . Rome : Food and

Agriculture Organization of the United Nations.

Jindou. S, Brulc. J. M., Levy-Assaraf. M, Rincon MT, Flint HJ, Berg ME, Wilson MK,

White BA, Bayer EA, Lamed R, Borovok I. 2008. Cellulosome gene cluster

analysis for gauging the diversity of the ruminal cellulolytic bacterium

Ruminococcus flavefaciens. FEMS Microbiology Letters . Volume: 285. pp. 188

– 194.

J. Ryckeboer, J. Mergaert, J. Coosemans, K. Deprins and J. Swings. 2002.

Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost

bin. Journal of Applied Microbiology. 127–137.

Lee R. Lynd, Paul J. Weimer, Willem H. van Zyl, and Isak S. Pretorius. 2002.

Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology . American

Society for Microbiology. pp. 506–577.

M. Rainin, A.R.Alimon, N.Abdullah, J.M.Panandam and K.Sijam. 2008. Isolation and

identification of three species of bacteria from the termite Coptotermes

Curvignathus (Holmgren). Research Journal of Microbiology 3 (4). pp 288-292.

Oyeleke, S. B. and Okusanmi, T. A. 2008. Isolation and characterization of cellulose

hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants. African Journal of

Biotechnology Vol. 7 (10). pp. 1503-1504.

Sudhakaran Pillai. M., Vasudev. R.. 2001. “Applications of Coir in Agricultural

Textiles”. Proceeding International Seminar On Technical Textiles .

Theodorou. M. K. & France, J. (1993). Rumen microorganisms and their interactions.

In Quantitative Aspects of Ruminan Digestion and Metabolism. Wallingford:

CAB International. pp. 145-163.

Wan Azlina Ahmad and Nur Humaira’ Lau Abdullah. 2003. Biosorption of Cr(VI) by

Non-Living Acinetobacter calcoaceticus genospecies 3 and Clavibacter agropyri

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 49 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Isolated from A Textile Effluent. Universiti Teknologi Malaysia.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012

Trường ĐHCT

Yung-Chung Loa, Ganesh D. Saratalea,Wen-Ming Chenb, Ming-Der Baic, Jo-Shu

Changa,d. 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the

cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme and

Microbial Technology . pp. 417–425.

Trang web

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

http://biofilmbook.hypertextbookshop.com, ngày 13/12/2011

http://mpronovost.ep.profweb.qc.ca/BIONP1/bionp1_molecules_glucides.html , Ngày

15/03/2012.

http://www.lsbu.ac.uk/water/hycmc.html , ngày 15/03/2012.

http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Cellulases&lang=1 , ngày

15/03/2012.

http://www.sheep101.info/cud.html , ngày 25/11/2011.

http://www.wattpad.com/1352640-bao-cao-tn?p=25 , 15/03/2012.

http://ecocyc.org/PPEN278197/NEW-IMAGE?object=Cellulose-Degradation , ngày

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

- 50 -

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

25/04/2012.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

PHỤ LỤC 1

1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn

Nguyên tắc: Phương pháp phân lập giống thuần đều dựa trên các bước: chuẩn bị

mẫu, cấy trãi lên môi tr ường M1 (c ơ ch ất bã mía), quan sát và c ấy chuy ển nh ững

khuẩn lạc khác nhau v ề hình dạng, màu sắc đặc trưng, tiếp tục cấy ria để tách ròng vi

khuẩn.

Cách chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Đĩa petri và môi tr ường M1 được khử trùng nhiệt ướt ở 1210C, 1 atm trong 20 phút; Khi nhi ệt độ nồi khử trùng đã hạ xuống khoảng 45 0C – 50 0C thì ti ến hành phân ph ối môi tr ường vào đĩa petri; sau đó kh ử trùng bằng tia UV, để môi trường nguội ta đem ủ ở 38oC trong 48 giờ để chọn đĩa petri

không nhiễm dùng cho quá trình phân lập.

Đồng nhất mẫu:

Đồng nhất mẫu dịch dạ cỏ: Dịch dạ cỏ thu ở ba vị trí khác nhau ở cùng một địa

điểm thu mẫu cho vào ống falcon 50ml (b ổ sung 10ml nước muối sinh lý), wotex ống

mẫu, để lắng khoảng 10 phút, thu dịch huyền phù của mẫu và tiến hành pha loãng, c ấy

trải.

Sau khi đồng nhất mẫu xong thì tiến hành pha loãng mẫu như sau

Thể tích mẫu (µl) : 100 100 100 100 100

Nồng độ pha loãng: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Th ể tích nước cất (µl): 900 900 900 900 900

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

(Nguồn: http://biofilmbook.hypertextbookshop.com, ngày 13/12/2011)

Hình 23: Sơ đồ phương pháp pha loãng mẫu

Cấy trải vi sinh vật

Chọn 4 nồng độ pha loãng là 10 -5, 10 -4, 10 -3 và 10 2 để tiến hành cấy trải. Dùng

micropipet hút 15µl d ịch vi khu ẩn ở mỗi nồng độ, nhỏ vào gi ữa đĩa petri (môi tr ường

M1), sau đó dùng que trải dàn đều giọt vi khuẩn trên khắp mặt thạch đĩa để mẫu khô tự

nhiên. Mỗi nồng độ cấy trãi lên 2 đĩa, một đĩa ủ ở điều kiện hiếu khí và một đĩa còn lại

ủ ở điều kiện kỵ khí.

Đối với vi sinh vật hiếu khí: Mẫu được ủ ở 38oC trong 48 giờ.

Đối với vi sinh v ật kỵ khí: Mẫu được ủ trong bình hút ẩm kỵ khí, ủ ở 38oC trong

48 giờ.

Tiếp tục cấy trãi lần thứ 2 để tiếp tục chọn lọc những khuẩn lạc khác nhau

Chọn những khuẩn lạc khác nhau về hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa để cấy

trải lần thứ 2.

Tiếp tục cấy chuyển vi khuẩn theo phương pháp cấy ria 3-5 lần nữa.

Lưu ý: Tất cả các thao tác trên ( đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển) phải được

thực hiện trong tủ cấy vô trùng.

¶ Mô t ả đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Mục tiêu thí nghi ệm: mô tả một số đặc điểm hình thái c ủa khuẩn lạc bao gồm:

hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước khuẩn lạc.

Nguyên tắc: khuẩn lạc là tập đoàn vi khu ẩn được sinh ra t ừ một tế bào hay m ột

bào tử có trước. Mỗi loại vi khuẩn có đặc điểm riêng tùy theo cách phát tri ển của từng

nhóm vi khu ẩn mà hình thái c ủa khuẩn lạc có hình d ạng, độ nổi, dạng bìa, màu s ắc,

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

kích thước khuẩn lạc khác nhau.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Các bước tiến hành thí nghiệm:

Cấy vi khuẩn lên đĩa petri, vi khu ẩn phát triển tạo thành những khuẩn lạc sau 2-4 ngày ủ ở 38oC. Khi quan sát d ưới kính lup, mỗi khuẩn lạc được mô tả dựa vào các đặc

điểm sau:

+ Hình dạng: dạng tròn có kích th ước nhỏ (punctiform) và l ớn (circular);

dạng không đều (irregular), d ạng thoi (spindle), r ễ cây d ạng sợi (filamentous) và r ễ

(rhizoid).

+ Độ nổi: Dạng ph ẳng (flat) th ường th ấp và ngang v ới mặt môi tr ường;

dạng lài (raised) có chi ều cao khu ẩn lạc khá hơn dạng ph ẳng nhưng có hai d ốc (phía

vành khuẩn lạc lài xu ống; dạng mô (convex) th ường nổi mô cao lên trên môi tr ường

đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có

dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate).

+ Dạng bìa: có 5 d ạng bìa ph ổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa g ợn

sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa r ăng cưa (erose), bìa sợi (filamentous).

Màu sắc: Khu ẩn lạc th ường có màu tr ắng trong, tr ắng đục, xám, đỏ, +

vàng, lục, ...

Kích th ước khu ẩn lạc: Ph ản ánh tu ổi của khu ẩn lạc, khi b ắt đầu hình +

thành ch ỉ bằng đầu kim (1-2 mm) và khu ẩn lạc phát tri ển ngày càng r ộng ra có th ể

chiếm hết bề mặt đĩa petri.

Ch ỉ tiêu theo dõi:

- Khuẩn lạc: hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước khuẩn lạc

¶ Mô t ả đặc điểm của vi khuẩn

Mục tiêu thí nghi ệm: Mô tả một số đặc điểm hình thái c ủa vi khu ẩn bao g ồm

hình dạng (cầu, que, xo ắn, hay hình d ấu phẩy), kích th ước (khoảng 0,2 –2 µm), tr ạng

thái (đơn lẻ, kết đôi, kết chuỗi, hay kết chùm), khả năng chuyển động của vi khuẩn.

Các bước tiến hành thí nghiệm:

a) Quan sát hình dạng bằng phương pháp giọt ép.

ỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Nh

ử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn. - Kh

ấm đầu kim cấy vào khu ẩn lạc, hòa lẫn vi khu ẩn vào gi ọt nước trên kính - Ch

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

mang vật.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

đậy vật (lamelle) đậy lên giọt nước bằng cách cho c ạnh kính đậy

- Dùng kính vật một góc 45o, rồi hạ từ từ kính đậy vật sao cho đừng có bọt khí trong mẫu.

- Quan sát hình d ạng của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 100X.

¶ Nhuộm Gram vi khuẩn

Phương pháp này được đặt tên theo ng ười phát minh ra nó, nhà khoa h ọc người

Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 – 1938). Ông phát tri ển kỹ thuật này vào n ăm

1884 để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumoniae

Mục đích: Xác định loại Gram của vi khuẩn.

Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc

nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai lo ại phức chất khác nhau

Bảng 14: Tóm tắt các giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn

Giai đoạn Gram dương Gram âm

Crystal violet Tế bào nhuộm tím xanh Tế bào nhuộm tím xanh

Dung dịch iod Iod dán crystal violet Crystal violet vẫn không bám

bám chặt vào vách tế bào chặt vào tế bào

Rữa bằng cồn Không tẩy Crystal violet Tẩy crystal violet ra khỏi vách

aceton tế bào

Safranin hay Vì vách tế bào còn Vì vách tế bào khồng còn

Fuchsin Crystal violet nên có màu tím Crystal violet nên có màu hồng của

xanh Fuchsin

(* Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2008)

Các bước nhuộm Gram vi khuẩn:

Chuẩn bị mẫu vật:

Nhỏ 1 gi ọt nước đã khử trùng ( trong chai có ống đếm giọt) lên gi ữa kính mang

vật.

Hơ nóng đầu kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

Dùng kim c ấy lấy một ít khu ẩn lạc cho vào gi ọt nước, tr ải ra cho đều và th ật

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

mỏng theo hình xoắn ốc.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Lướt mặt dưới của kính mang vật trên ngọn lửa cách khoảng 10 cm khoảng 3 lần

để giết chết vi sinh vật và dàn chúng lên kính mang vật.

Sau khi đã cố định mẫu vật, tiếp lục các bước sau:

Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định, để 60 giây.

Rửa nước từ 2 – 3 giây; chậm nhẹ cho khô bớt nước.

Nhỏ dung dịch iod trong 60 giây.

Rửa nuớc, châm nhẹ.

Rửa cồn + aceton th ật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, để khi gi ọt

cồn + aceton không còn màu tím nữa.

Rửa nước vài giây, chậm nhẹ.

Nhỏ Fuchsin haay Safranin từ 1 – 2 giọt để trong 60 giây.

Rửa nước vài giây.

Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nuớc.

Quan sát dưới kính hiển vi.

( Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2008)

¶ Kiểm tra khả năng di động

Vật liệu, hoá chất:

Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường thạch bán lỏng (0,3-0,6% thạch).

Các bước tiến hành:

- Dùng que c ấy có đầu nh ọn cấy vi khu ẩn theo ki ểu chích sâu vào môi tr ường

thạch bán lỏng.

- Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có

khi lâu hơn.

Kết quả:

- Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động.

- Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Chú ý: với vi khuẩn hiếu khí chỉ quan sát ở phần trên của vết cấy.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

1.2. Phương pháp khảo sát đường kính thủy phân

Nguyên tắc:

Khảo sát kh ả năng th ủy phân cellulose c ủa vi khu ẩn trên môi tr ường có Congo

Red Ind.

Congo red có khả năng tạo tạo liên kết với cầu nối β 1-4 glucosid, và bắt màu đỏ.

Trên môi tr ường cơ ch ất cellulose có b ổ sung congo red vi khu ẩn sẽ phân h ủy

cellulose trong c ơ ch ất tạo thành vòng tròn trong su ốt bao quanh khu ẩn lạc của vi

khuẩn.

Khi enzyme cellulase tác d ụng lên c ơ ch ất cellulose trong môi tr ường

thạch, cơ chất bị phân hủy làm cho độ đục của môi tr ường bị giảm đi, môi tr ường trở

nên trong su ốt. Độ trong su ốt được tạo ra c ủa môi tr ường tỉ lệ với độ họat động của

enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Bố trí thí nghi ệm: thí nghi ệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên, 1 nhân t ố (mỗi

dòng vi khuẩn), 2 thừa số (2 cơ chất), 3 lần lặp lại.

Tiến hành thí nghiệm:

Bước 1: Vi khu ẩn đã phân l ập ròng c ấy chuyển ra đĩa petri (có b ổ sung yeast

extract 0,1%) , ủ 2 ngày ở 38oC.

Bước 2: Rút 2ml nước muối sinh lý đã khử trùng cho vào đĩa vi khuẩn, dùng kim

cấy gạt trên bề mặt môi tr ường cho toàn b ộ khuẩn lạc vi khu ẩn tan vào n ước, sau đó,

Bước 3: Nhỏ 15- 20 µl d ịch vi khu ẩn trên gi ếng thạch môi tr ường M1 có đường

rút dịch vi khuẩn vào ống ependorf 1,5ml.

kính 5-6mm, để dịch khu ếch tán đều xung quanh gi ếng th ạch và khô t ự nhiên, úp

ngược đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 gi ờ; sau đó được nhuộm với dung dịch

Congo Red 0,1 % trong 60 phút và rửa bằng nước muối 1M, sau đó để qua đêm ở nhiệt

độ phòng. Đo vòng tròn hoạt tính bắt màu nhạt hơn xung quanh giếng thạch

Chỉ tiêu quan sát: Hoạt tính thủy phân được tính theo công thức:

Hoạt tính = đường kính thủy phân – đường kính lỗ đục

1.3. Kh ảo sát hiệu suất thủy phân bã mía

Mục đích: khảo sát hàm l ượng cellulose bị mất đi trong quá trình vi khu ẩn

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

sử dụng bã mía làm nguồn carbon trong quá trình sinh trưởng và phát triển.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Tiến hành thí nghiệm

(cid:216) Bước 1: Cân khối lượng mẫu ban đầu

(cid:216) Bước 2: Cân kh ối lượng mẫu khi k ết thúc quá trình nuôi c ấy vi khu ẩn

(sau 5 ngày).

(cid:216) Bước 3: Tính hiệu suất thủy phân cellulose

Hi ệu suất = Go – G1

G0: phần trăm cellulose ban đầu

G1: phần trăm cellulose sau thủy phân

1.4. Kh ảo sát sự giảm độ nhớt của dung dịch CMC sau nuôi cấy

Nguyên tắc: Máy đo độ nh ớt handheld Viscometer SKF TMVM1 được sử

dụng để đo độ nhớt của dung dịch cơ chất trước và sau khi nuôi c ấy. Sau đó, dựa vào

độ nhớt của dung dịch và đường chuẩn tỉ lệ giữa độ nhớt và phần trăm CMC, tính toán

và đưa ra kết quả phần trăm CMC có trong mẫu

Tiến hành: Đo biên độ và vận tốc quay của mẫu bằng máy SKF TMVM1. Mẫu

đối chứng được tiến hành với dung dịch môt trường không chủng vi khuẩn.

Hiệu suất thủy phân CMC = (1 - Cm) (%)

Trong đó:

- 1: phần trăm CMC cho vào môi trường lỏng lúc đầu

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

- Cm: phần trăm CMC trong dịch nuôi vi khuẩn sau 5 ngày

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

1. Kết quả hoạt tính thủy phân CMC

Bảng 15: Kết quả khảo sát thành phần ẩm độ và khoáng của bã mía nguyên liệu

lặp lại

lần 1 lần 2 lần 3 khối lượng bã mía ban đầu (g) 3 3 3 Hàm lượng ẩm độ (%) 7,9 8,02 7,95 Hàm lượng khoáng (%) 3,67 3,53 3,58

Bảng 16: Kết quả phân tích xơ bã mía nguyên liệu

lặp lại Hàm lượng xơ (%)

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

lần 1 lần 2 lần 3 bã mía ban đầu (g) 1 1 1 khối lượng xơ sau phân tích (g) 0, 5766 0,5731 0,6073 57,66 57,31 60,73

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 17: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn hiếu khí

đường kính thủy phân CMC (mm) STT Tên dòng vi khuẩn

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 CD 2 CD 4 CD 6 CD8 CD 10 CD 12 CD 14 CD 16 CD 18 CD 20 CD 22 CD 24 CD 26 CD28 CD 30 CD 32 CD 34 CD 36 CD 38 CD 40 CD 42 lần 1 0 38 0 36 40 0 30 23 13 40 39 0 40 43 0 30 41 0 34 0 37 lần 2 0 35 0 37 43 0 34 24 11 42 40 0 41 40 0 31 41 0 38 0 37 lần 3 0 38 0 37 41 0 26 24 14 40 39 0 40 41 0 33 40 0 39 0 32 TB 0 37bc 0 36,6bc 40,7a 0 30d 23,7e 12,7f 40,7a 39,3ab 0 40,3a 41,3a 0 33d 40,7a 0 37bc 0 35,3c

%Cv = 5,341%

Các ký t ự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

tin cậy 95%.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 18: Kết quả đường kính thủy phân trên CMC của vi khuẩn kỵ khí

đường kính thủy phân CMC (mm) STT Tên dòng vi khuẩn

%Cv = 8,49%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 CD 1 CD 3 CD 5 CD 7 CD 9 CD 11 CD 13 CD 15 CD 17 CD 19 CD 21 CD 23 CD 25 CD 27 CD 29 CD 31 CD 33 CD 35 CD 37 CD 39 CD 41 CD 43 CD 45 CD 47 CD 49 Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 0 42 0 40 58 37 43 40 40 44 0 0 0 11 0 0 43 0 0 0 0 0 0 41 0 0 40 0 43 50 38 41 42 42 42 0 0 0 10 0 0 42 0 0 0 0 0 0 52 0 0 42 0 44 60 36 40 48 38 44 0 0 0 10 0 0 41 0 0 0 0 0 0 37 TB 0 0 41,3bc 0 42,3bc 56a 37c 41,3bc 43,3b 40bc 43,3b 0 0 0 10,3d 0 0 42bc 0 0 0 0 0 0 43,3b

Các ký t ự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

tin cậy 95%.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

2. Kết quả hoạt tính thủy phân bã mía

Bảng 19: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí:

đường kính thủy phân (mm) STT

lần 1 0 0 0 0 20 0 20 23 0 22 38 30 39 32 26 lần 2 0 0 0 0 18 0 21 24 0 22 36 36 33 44 32 lần 3 0 0 0 0 20 0 19 24 0 24 37 35 36 30 34

30 29 25

%Cv = 11,37%

Tên dòng vi khuẩn CD 2 CD 4 CD 6 CD 8 CD 10 CD 12 CD 14 CD 16 CD 18 CD 20 CD 22 CD 24 CD 26 CD28 CD 30 CD 32 CD 34 CD 36 CD 38 CD 40 CD 42 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 0 0 26 12.5 0 0 0 30 14 0 0 0 28 12 0 TB 0 0 0 0 19,3e 0 20e 23,7de 0 22,7e 37a 33,7ab 36a 35,3ab 30,7bc 28cd 0 0 28cd 12,8f 0

Các ký t ự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

tin cậy 95%.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 20: Kết quả khảo sát hoạt tính thủy phân bã mía của vi khuẩn kỵ khí:

đường kính thủy phân bã mía (mm) STT

Tên dòng vi khuẩn CD 1 CD 3 CD 5 CD 7 CD 9 CD 11 CD 13 CD 15 CD 17 CD 19 CD 21 CD 23 CD 25 CD 27 CD 29 CD 31 CD 33 CD 35 CD 37 CD 39 CD 41 CD 43 CD 45 CD 47 CD 49 lần 1 0 0 24 0 0 44 0 48 32 0 40 0 30 0 0 33 0 0 0 0 0 38 0 0 0 lần 2 0 0 29 0 0 46 0 48 32 0 37 0 23 0 0 30 0 0 0 0 0 40 0 0 0 lần 3 0 0 24 0 0 45 0 52 34 0 38 0 30 0 0 30 0 0 0 0 0 40 0 0 0 TB 0 0 17,67 f 0 0 45,00 b 0 49,33 a 32,67d 0 38,33 c 0 27,67 ef 0 0 31,00 de 0 0 0 0 0 39,33 c 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

%Cv = 6,302%

Các ký t ự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

tin cậy 95%.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

3. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn

đường chuẩn độ nhớt

ĐƯỜNG CHUẨN TƯƠNG QUAN GIỮA ĐỘ NHỚT VÀ PHẦN TRĂM CMC TRONG MÔI TRƯỜNG

200

y = 118.09x - 61.604 R2 = 0.975

150

100

) s a P m

( t

ớ h n ộ đ

0.5

1.5

2.5

-50

phần trăm CMC

Hình 24: Đường chuẩn phần trăm CMC theo độ nhớt của môi trường

Bảng 21: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí sau 5 ngày

DÒNG LẦN 1 LẦN 2 LẦN 3

ĐC CD21 CD15 CD35 CD11 CD 17 CD 49 43 37 32 21 20 26 25 53 30 32 29 18 22 30 55 34 30 9 25 22 25 Bảng 22: Kết quả đo độ nhớt của dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau 5 ngày

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

DÒNG LẦN 1 LẦN 2 50 31 37 36 35 36 36 ĐC CD26 CD28 CD22 CD20 CD 10 CD 34 48 37 47 28 38 36 38 LẦN 3 63 44 46 29 37 31 38

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 23: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí

DÒNG LẦN 1 LẦN 2 92,81 94,51 83,5 78,42 91,97 83,50 75,88 82,65 84,35 81,81 82,65 82,65 84,35 82,65 ĐC CD26 CD28 CD22 CD20 CD 10 CD 34 LẦN 3 -5,52 89,43 91,12 76,72 83,5 78,42 84,35

Bảng 24: Kết quả phần trăm CMC còn lại trong dịch nuôi vi khuẩn kỵ khí

DÒNG LẦN 1 LẦN 2 LẦN 3 98,74 80,96 77,57 59,79 73,34 70,80 73,34 ĐC CD21 CD15 CD35 CD11 CD 17 CD 49 88,58 83,50 79,26 69,95 69,10 74,18 73,34 97,05 77,57 79,26 76,72 67,41 70,80 77,57

Bảng 25: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí:

%Cv = 20,98%

DÒNG LẦN 1 LẦN 2 11,42 16,50 20,74 30,05 30,90 25,82 26,66 ĐC CD21 CD15 CD35 CD11 CD 17 CD 49 2,95 22,43 20,74 23,28 32,59 29,20 22,43 LẦN 3 1,26 19,04 22,43 40,21 26,66 29,20 26,66 TB 5.21e 19.32d 21.30cd 31.18a 30.05ab 28.07abc 25.25bcd

%Cv = 27,06%

Bảng 26: Hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu khí DÒNG LẦN 1 LẦN 2 5,49 21,58 16,50 17,34 18,19 17,34 17,34 LẦN 3 -5,51 10,57 8,88 23,27 16,50 21,58 15,65 ĐC CD26 CD28 CD22 CD20 CD 10 CD 34 7,18 16,50 8,03 24,12 15,65 17,34 15,65 TB 2,38c 18,75a 16,78ab 21,58a 16,21ab 11,13b 16,21ab

Các ký t ự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với độ

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

tin cậy 95%

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

4. Kết quả khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía của vi khuẩn

Bảng 27: Số liệu khảo sát hiệu suất thủy phân bã mía các dòng vi khuẩn tuyển

chọn

DÒNG VK Khối lượng mẫu bã mía (%) Hiệu suất thủy phân chất xơ (%) Hàm lượng chất xơ của mẫu (%) Khối lượng xơ sau thủy phân (g)

2,0052 1,1020 54,958 3,612 CD11

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

2,0087 2,0043 2,004 2,0025 2,0035 2,0023 2,0021 2,0014 2,0093 2,0024 2,0013 2,0096 2.000 2.000 2,0024 2,0013 2,0035 2,0066 2,0023 2,0011 2,0015 2,0024 2,0021 2,0015 2,0012 2,0012 2,0015 2,0023 2,0014 1,1229 1,1234 1,0527 0,9605 0,9729 1,0888 1,1104 1,0768 1,1230 1,0713 1,1093 1,1149 1,1845 1,1540 1,1401 1,0121 1,0117 1,0446 1,0326 1,0504 1,0647 1,0718 1,0475 0,9640 0,9930 1,0006 1,0352 1,1745 1,1341 55,902 56,047 52,528 47,963 48,559 54,375 55,460 53,801 55,891 53,500 55,427 58,944 57,698 57,003 50,547 50,551 52,139 51,461 52,458 53,206 53,552 52,311 52,662 48.164 49.621 50.002 58,682 56,637 57,205 2,668 2,523 6,042 10,607 10,011 4,195 3,110 4,769 2,679 5,070 3,143 -0,374 0,872 1,567 8,023 8,019 6,431 7,109 6,112 5,364 5,018 6,259 5,908 10.406 8.949 8.568 -0,112 1,933 1,365 CD11 CD11 CD15 CD15 CD15 CD43 CD43 CD43 CD21 CD21 CD21 ĐC ĐC ĐC CD26 CD26 CD26 CD28 CD28 CD28 CD24 CD24 CD24 CD22 CD22 CD22 ĐC ĐC ĐC

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

Bảng 28: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất CMC

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 29: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất CMC

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 30: Kết quả phân tích thống kê đường kính vòng tròn thủy phân của

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

vi khuẩn hiếu khí trên cơ chất bã mía

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 31: Kết quả phân tích th ống kê đường kính vòng tròn th ủy phân của vi

CD5 CD25 CD31 CD17 CD21 CD43 CD11 CD17

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

khuẩn kỵ khí trên cơ chất bã mía

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 32: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn hiếu

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

khí

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

DC CD21 CD15 CD49 CD17 CD11 CD35

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Bảng 33: Kết quả thống kê hiệu suất thủy phân CMC của vi khuẩn kỵ khí

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 34: K ết qu ả phân tích th ống kê hi ệu su ất th ủy phân bã mía c ủa vi

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

khuẩn hiếu khí sau 5 ngày

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 34 – 2012 Tr

ường ĐHCT

Bảng 35: K ết qu ả phân tích th ống kê hi ệu su ất th ủy phân bã mía c ủa vi

DC CD11 CD21 CD43 CD15

Chuyên ngành Công ngh ệ Sinh học Vi

ện NC & PT Công nghệ sinh học

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

khuẩn kỵ khí sau 5 ngày

Luận văn tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng thủy phân bã mía và carboxymethyl Cellulose của vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu (Ovis aries)

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn này nhằm phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao trên cơ chất CMC và bã mía. Mời các bạn cùng tham khảo luận văn để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN BÃ MÍA VÀ CARBOXYMETHYL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ CỎ CỪU (Ovis aries)

SINH VIÊN TH Phan Th

ị Mỹ Dung

MSSV:3082499 LỚP:CNSH K34

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. Võ Văn Song Toàn TS. Trần Nhân Dũng

Cần Thơ, Tháng 5/2012

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN TH

ỰC HIỆN

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

(cid:154)(cid:155) & (cid:157)(cid:156)

¶¶¶

TÓM LƯỢC

khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu” được tiến hành nhằm khảo sát và tuyển chọn các

Từ khóa: Clavibacter agropygi (Corynebacterium), Pediococcus pentosaceus, dạ cỏ

cừu, thủy phân cellulose,...

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................

LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................

TÓM LƯỢC ................................................................................................................. i

MỤC LỤC ................................................................................................................... ii

DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. v

DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................... viii

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................1

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................3

2.1. Tổng quan về cellulose, CMC, bã mía ................................................................. 3

2.1.1. Cellulose..................................................................................................3

2.1.2. CMC.........................................................................................................5

2.1.3. Bã mía......................................................................................................6

2.2. Hệ enzyme cellulase............................................................................................. 7

2.2.1. Phân loại.................................................................................................. 7

2.2.2. Cơ chế tác động thủy phân cellulose.......................................................9

2.2.3. Nguồn enzyme cellulase..........................................................................9

2.2.4. Ứng dụng enzyme cellulase.................................................................. 10

2.3. Tổng quan về dạ cỏ cừu ......................................................................................10

2.3.1. Cấu tạo chung dạ cỏ cừu .......................................................................10

2.3.2. Vi sinh vật phân hủy cellulose trong dạ cỏ .......................................... 12

2.4. Các phương pháp vi sinh.....................................................................................13

2.5. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................... 15

2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước .........................................................15

2.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................................... 16

CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 17

3.1.2.1. Bã mía ....................................................................................... 18

3.1.2.2. Dạ cỏ cừu ...................................................................................18

3.1.3.1. Môi trường đặc Delafield (2002) cải tiến ..................................18

3.1.3.2. Môi trường lỏng Delafield (2002) cải tiến ................................ 19

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................25

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 47

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

CÁC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG I. GI

ỚI THIỆU

CHƯƠNG II.

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

(Nguồn: http://mpronovost.ep.profweb.qc.ca/BIONP1/bionp1_molecules_glucides.html

2.1.2. C

¶ Một số phương pháp phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose:

CHƯƠNG III. PH

ƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CD 32

CD 42

CD 26

CD 8

hoạt tính thủy phân CMC hiếu khí

)

m m

( n â h p y ủ h t h n í k g n ờ ư đ

dòng vi khu ẩn hiếu khí

Dòng CD220