TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
DIỆP THỊ DIỆU
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75)
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
i
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học
Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học và
Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp
đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội
học tập và nắm bắt thêm các phương pháp nghiên cứu khoa học.
Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình
hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Xin cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao
đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy
Sản
Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức
khỏe và thành đạt.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
ii
TÓM TẮT
Bệnh do tác nhân là virus gây ra trên tôm đang là một vấn đề nan giải cho nuôi
trồng thủy sản Việt Nam và thế giới. Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot
syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi.
Các nghiên cứu về đặc điểm dịch tể của WSSV được thực hiện nhằm đề ra những
biện pháp phòng ngừa hiệu qủa nhất để hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do
WSSV gây ra. Và kỹ thuật PCR là một trong những công cụ quan trọng trong
nghiên cứu dịch tể học của WSSV. Do vậy đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR-
genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot
syndrome virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện.
Qui trình PCR genotyping (ORF75) thực hiện với kết quả được ghi nhận: (i) thành
phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ là 1X, nồng độ MgCl2 là
1,5 mM, nồng độ dNTPs là 200µM, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 20 pmol,
nồng độ taq ADN polymerase là 2 U, nồng độ ADN chiết tách 1 µl. Tổng thể tích
cho mỗi phản ứng là 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng được thực hiện theo chu kỳ
nhiệt là: máy được làm nóng đến 85oC. Sau đó đến giai đoạn 94oC trong 3 phút,
94oC trong 30 giây, 49oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và
cuối cùng là 72oC trong 7 phút. Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... i
TÓM TẮT ............................................................................................................. ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ v
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................ vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .................................................................................... 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................ 3
2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới ................................................. 3
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ................................................................... 3
2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới ............................................................... 3
2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta ..................................................... 4
2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam .................................................................... 4
2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam ................................................................... 6
2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng ............................................................................ 8
2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV ........................................................................ 9
2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý ......................................................................................... 10
2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm ...................................................................... 10
2.3.4 Phương thức lây nhiễm .............................................................................. 11
2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV...................................................... 12
2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng ...................... 12
2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................... 14
2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR ................................................................... 14
2.4. 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 15
2.4.3 Ứng dụng của PCR ............................................................................... 16
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
iv
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 18
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ...................................................................... 18
3.1.1 Địa điểm ............................................................................................... 18
3.1.2 Thời gian thực hiện .............................................................................. 18
3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 18
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm ............................................................................. 18
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm .............................................................................. 18
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19
3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV ................................................................... 19
3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) .................................................... 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................... 22
4.1. Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) .............................................. 22
4.2 Chu kỳ nhiệt ..................................................................................................... 23
4.2.1 Chu kỳ phản ứng .................................................................................. 23
4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi .................................................................................. 24
4.3 Hàm lượng ADN khuôn .................................................................................. 25
4.4. Nồng độ mồi ................................................................................................... 25
4.5 Nồng độ MgCl2 ................................................................................................ 26
4.6. Nồng độ taq ADN polymerase ....................................................................... 27
4.7 Điều kiện phản ứng .......................................................................................... 28
4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu .................................... 29
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................ 32
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 32
5.2 Đề xuất ............................................................................................................ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 33
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 38
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com