Luận văn: Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Carol123 Carol123 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:76

Thêm vào BST

Báo xấu

157
lượt xem 43
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích 22 triệu ha [12]. Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa các vitamin nhóm B và một lượng hydratcacbon nhất định.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh t ế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích 22 triệ u ha [12]. Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và protein c ần thiết cho khẩu phần ăn c ủa con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa các vitamin nhóm B và một lượng hydratcacbon nhất định. Hạ t lạc là nguyên liệu chính đ ể s ản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomát... và là mặt hàng xuất khẩ u có giá tr ị. Các phụ phẩm c ủa lạc (khô d ầu, thân, lá) dùng làm thức ăn cho gia s úc hay phân bón đ ều tốt và rẻ tiền. Trồng lạc có tác d ụng c ải tạo đất và phù hợp với cơ c ấu chuyển đổi kinh tế nông nghiệp hiện nay [11], [12]. Ở Việ t Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ c ấu cây nông nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện canh tác còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn và ứng dụng khoa học tiên tiế n vào s ản xuất đã góp phần tăng năng suất lạc một cách đáng kể [15]. Năm 2005, năng suất bình quân đ ạt 18 tạ/ha, s ản lượ ng đạt 485,610 nghìn tấn, so với 1995 năng suất mớ i chỉ là 13 tạ /ha. Tuy nhiên, s ản xuất lạc ở nước ta v ẫn còn nhiề u yếu tố hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và c hất lượ ng lạc là khô hạn [16]. Để hạn chế ảnh hưởng c ủa hạn tớ i năng suất cây trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tướ i tiêu hợp lý c ần s ử dụng các giống có khả năng ch ịu hạn cao, đ ặc biệt ở những vùng đ ất không chủ động nước. Vì vậy, nghiên c ứu khả năng ch ịu hạn c ủa các giống lạc là rất c ần thiết. Kỹ thuật chọn dòng biến d ị soma cho phép thu được những dòng tế bào có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợ i c ủa môi trường [ 30], [43]. Đây là hướng nghiên c ứu có nhiều triể n vọng đã được s ử dụng ở nhiều S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
2 nước trên thế giớ i và tạo ra những giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao trong một thời gian rút ng ắn so với các phương pháp truyền thống [30], [51]. Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên c ứu: “ Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi c ấy in vitro”. 2. Mục tiêu nghiên c ứu - Đánh giá khả năng chịu hạn c ủa các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK ở giai đo ạn hạt nảy mầm, giai đo ạn cây non và ở mức độ mô s ẹo. - Tạo vật liệu khở i đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK 3. Nội dung nghiên c ứu - Phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh trong hạt tiềm sinh c ủa các giống L08, L23, L24, LTB LCB, LBK - Xác đ ịnh ảnh hưởng c ủa hạn sinh lý đ ến hoạt độ của một s ố enzym và chất tan tương ứng ở giai đo ạn hạt nảy mầm. - Đánh giá khả năng ch ịu hạn ở giai đo ạn cây non 3 lá b ằng phương pháp gây hạn nhân tạo. - Đánh giá khả năng ch ịu hạn c ủa các giống lạc ở mức độ mô s ẹo thông qua xử lý bằng thổi khô . - Tạo vật liệu khở i đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi c ấy in vitro : Xác đ ịnh ngưỡng chọn lọc, tái s inh cây, tạo cây hoàn chỉ nh, trồng ngoài đ ồng ruộng. - Sử dụng kỹ thuật RAPD đ ể đánh giá ADN genome một s ố dòng có nguồn gốc từ mô s ẹo chịu mất nước so với giống gốc. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giá trị kinh tế , đặc điểm nông sinh học và tình hình s ản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Giá trị kinh tế c ủa cây lạc Hạt lạc chiếm 40% – 58% lipit, 16% – 43% protein, 6% – 24% gluxit, 2,5% cellulose. Trong 100g lạc có 60 UI vitamin A, 300 UI vitamin B, một lượ ng PP đ ủ dùng cho người lớ n trong 1 ngày và cung c ấp 578,6 calo [5]. Protein c ủa lạc có đ ủ 8 loại axit amin không thay thế, đặc biệt trong hạt lạc có chất lecithin (phosphattidyl choline) có tác d ụng làm giảm lượng cholesterol trong máu, chống hiện tượng xơ vữa mạch máu [9]. Thức ăn b ằng lạc có thể khắc phục tình trạng thiếu protein cho con người [ 8]. Dầu lạc là một hỗn hợp glyxerin chứa 80% axit béo không no, có đ ộ nhớt thấp, mùi thơm. Dầu lạc được s ử dụng trong y học, kỹ nghệ dầu máy, s ản xuất xà phòng...[5]. Hạt lạc là mặt hàng xu ất khẩu có giá tr ị cao, mỗi năm nước ta xuất khẩu khoảng 80 – 120 ngàn t ấn, chiếm 30%– 50% tổng s ản lượng [11]. Các phụ phẩm c ủa lạc như khô d ầu, thân lá dùng đ ể chế biến thức ăn cho gia súc hay phân bón đ ều có giá tr ị dinh dưỡng cao và rẻ t iề n. Một kg khô d ầu lạc chứa 400 gam protein, 80 gam lipit [9], [11]. Trồng lạc còn có tác d ụng chống sói mòn và c ả i tạo đ ất. Nhờ s ự hoạt động c ủa vi khuẩn nốt s ần mà sau một vụ lạc s ẽ để lại trong đ ất từ 40 – 60 kg N/ha [ 38]. Mặt khác, cây lạc có thời gian sinh trưởng ngắn (từ 90 – 125 ngày), nên có thể xen canh, gối vụ vớ i các c ây trồng khác làm tăng giá tr ị kinh tế trên một đơn vị diện tích đ ất trồng. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây lạc Rễ lạc thuộc loại rễ cọc, có nhiều rễ phụ. Trên rễ lạc có nhiều nốt s ần, được tạo thành do vi kh ẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả năng c ố định nitơ phân tử trong không khí thành đ ạm cung c ấp cho cây và đ ất trồng [38]. Thân chính c ủa cây lạc thường chỉ cao kho ảng 25cm - 50cm, lúc S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
4 còn non thân lạc hình tròn, về già có c ạnh và rỗng [12]. Lá lạc là lo ại lá kép lông chim, có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược [38]. Hoa lạc mọc thành chùm, có từ 2 – 15 hoa. Lạc là cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi hoa nở là đã tự thụ phấn xong [9]. Quả lạc có hình kén, dài 1 – 8 cm, rộng 0,5 – 2cm, một đầu dính với tia, quả t hắt ở giữa ngăn các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng, chứa từ 1 – 3 hạt; hạt được bọc trong vỏ lụa mỏng, hình trứng [11]. Về mặ t sinh thái học, cây lạc chịu ả nh hưở ng nhiều c ủa các nhân tố s inh thái như: Nhiệt độ, nước, độ ẩm, ánh sáng, đ ất và các chất khoáng [8], [9], [15], [38]. Dựa vào thờ i gian sinh trưởng, cây lạc được chia làm hai lo ạ i: giống chín s ớm có thời sinh trưởng từ 90 – 125 ngày, giống chín muộn có thời gian s inh trưởng từ 140 – 160 ngày. Dạng chín muộn trội hoàn toàn so với dạng chín s ớm [8]. 1.1.3. Tình hình s ản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam Trong các cây lấy dầu, lạc có diện tích, s ản lượng đứng thứ hai sau đỗ tương và được trồng khắp các châu lục. Châu Á, là nơi có diện tích trồng, s ản lượng lạc cao nhất, chiếm trên 60% s ản lượng lạc c ủa thế giới. Châu Phi đ ứng thứ hai chiếm 30%, các châu lục khác rất ít (châu Mỹ 5%, châu Âu 0,22%) [9]. Trong số các nước trồng lạc thì Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ là những nước có s ản lượng lạc hàng năm cao nhất (trên 1triệu tấn/năm). Một số nước như Dimbabue, Camơrun (Châu Phi) có s ản lượng lạc rất thấp, chỉ đạt 0,17 triệu tấn/năm [11]. Ấn Độ là quốc gia có diện tích trồng lạc đứng đầu thế giớ i (8,1 triệu ha) song s ản lượng hàng năm th ấp, chỉ đạt 5,4 triệu tấn vì năng suấ t lạc chỉ đạt 6,9 – 9,98 tạ/ha. Trung Quốc có diện tíc h trồng lạc chỉ hơn nửa Ấn Độ (4,3 triệu ha) nhưng hàng năm đ ạt 11,89 triệ u tấn, đứng đầu thế giớ i. Còn Mỹ tuy có diện tích gieo trồng thấp (0,59 triệu ha) nhưng nhờ có các giống lạc cao s ản nên s ản lượng hàng năm cao (đ ạt 1,8 triệu tấn/năm) đ ứng thứ 3 trên thế giớ i [9], [11], [12]. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
5 Trong 25 nước trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng ở vị trí thứ năm về s ản lượng lạc hàng năm. Trong các thập kỷ 60, 70, 80 c ủa thế kỷ XX diện tích, năng suất và s ản lượng lạc c ủa nước ta còn thấp. Đến thập kỷ 90 c ủa thế kỷ XX, diện tích, năng suất, s ản lượng lạc c ủa nước ta tăng nhanh, trong vòng 10 năm năng suất lạc tăng gần 30% [12]. Ở Việt Nam cây lạc có mặt ở 59/61 tỉ nh thành, chia thành 5 khu vực chính: Vùng Trung du miền núi phía Bắc, với tổng diện tích 41.000 ha; Khu vực Bắc Trung Bộ là vùng trọng điểm s ản xuất lạc với 71.000 ha, đ ạt 68,7 – 93,4 nghìn tấn lạc/năm; Khu vực Nam Trung Bộ có kho ảng 29.000 ha; Vùng Cao nguyên Nam Bộ với 18.680 ha; và Vùng Đông Nam Bộ có 6.800 ha [38]. 1.2. Tính chịu hạn ở thực vật 1.2.1. Hạn và các hình thức hạn ảnh hƣởng đến cây trồng Hạn là tác đ ộng c ủa môi trường gây nên s ự mất nước c ủa thực vật [18]. Có 3 hình thức hạn ả nh hưởng đến cây trồng là hạn đất, hạn không khí và hạn tổ hợp [18]. Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đ ất thiếu nhiều không đủ cho rễ hút để cung c ấp cho cây. Vì thế, cây có thể bị héo và chết. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp đủ nước mà cây vẫn héo, nguyên nhân là do hạn sinh lý gây nên. Hạn không khí thường xảy ra khi không khí môi trường có nhiệt độ cao và đ ộ ẩm thấp, ví dụ như gió nóng Israel, gió Lào ở miền Trung nước ta...làm cho cây thoát hơi nước quá mạnh, vượt xa mức bình thường và d ẫn tới hiện tượng mất nước, do rễ hút vào không bù đ ủ lượng nước mất đi, làm các bộ phận non c ủa cây thiếu nước. Hạn tổ hợp là s ự phối hợp thiếu nước trong đ ất và trong không khí . 1.2.2. Tác hại c ủa hạn lên thực vật 1.2.2.1. Tác hại c ủa hạn lên thực vật Thiếu nước s ẽ gây nên các hậu quả rất lớn đối với hoạt động sống c ủa cây. Trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước c ủa cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và cuối S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
6 cùng là ảnh hưởng đến s ự sinh trưởng phát triển c ủa thực vật dẫn đến giảm năng suất. Khi gặp hạn trạng thái c ủa chất nguyên sinh c ủa tế bào thay đ ổi mạnh, ảnh hưởng đ ến tính chất hoá lý c ủa chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thuỷ hoá c ủa keo, thay đ ổi pH, đ ộ nhớt, dẫn đến s ự thay đổi vị trí các thành phần c ấu tạo nên chất nguyên sinh, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình thường c ủa cơ thể [13]. Trong thời gian cây bị hạn, hàm lượng nước tự do trong lá giả m xuống nhưng hàm lượng nước liên kết lại tăng lên. Chất nguyên sinh c ủa tế bào có tính đàn hồi lớn t hì cây có khả năng ch ịu hạn cao [42]. Hạn còn ảnh hưởng đến hô hấp. Trong thời gian khô hạn, ở những cây trung sinh thường tăng cường hô hấp. Nhờ gia tăng hô hấp mà cây giữ được độ ngậm nước c ủa keo nguyên sinh chất [13]. Sự tăng cường quá trình thuỷ phân khi gặp điề u kiện khô hạn là nguyên nhân tăng cường hô hấp trong cây. Khi mất nước ban đầu hô hấp tăng, nhưng sau đó giảm đột ngột, nếu tình trạng thiếu nước kéo dài [42]. Thiếu nước ảnh hưởng đến quang hợp. Hạn hán đã ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá ho ại lạp thể nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng. Theo Buxigon, cây trúc đào khi b ị hạn thì cường độ quang hợp giảm 40% [42]. Hạn ảnh hưở ng đến hoạt động hút khoáng c ủa hệ r ễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đ ổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [13]. Hạn ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưở ng các tế bào, đ ặc biệt là trong pha giãn c ủa tế bào, từ đó mà ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng c ủa toàn cây [42]. 1.2.2.2 Ảnh hƣởng c ủa hạn đến cây lạc Trong mỗi thờ i kỳ s inh trưởng, cây lạc chỉ có khả năng ch ịu hạn ở một mức độ nhất định. Biểu hiện bề ngoài nhận thấy rõ rệt nhất khi cây lạc bị hạn ở tất c ả các thời kỳ sinh trưởng là ở bộ lá. Khi đ ộ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
7 dày, màu lá từ xanh đ ậm chuyển dần sang xanh nh ạt do diệp lục bị phá hủy [15]. Trong điều kiện bị hạn tức thờ i, lá vẫn giữ nguyên kích thước nhưng s ức trương tế bào giảm, khí khổng khép lại, lá b ị rũ xuống [8]. Thời kỳ t rước ra hoa là thờ i kỳ cây lạc chịu được hạn lớn nhất, vì trong giai đo ạn này nhu c ầu về nước c ủa cây lạc không lớn lắ m, độ ẩm thích hợp từ 60% - 65%. Bị hạn trong thời kỳ trước ra hoa ảnh hưởng đ ến tốc độ s inh trưởng c ủa cây lạc, làm cho quá trình phát triển bị chậm lại [ 38]. Ở giai đo ạn ra hoa, thiếu nước s ẽ làm giảm s ố hoa, tỷ lệ hoa có ích, các đợt rộ không được hình thành, kéo dài thờ i gian ra hoa - chín c ủa lạc, gây ảnh hưởng đáng kể tớ i năng suất. Tuy nhiên, nếu được tưới kịp thờ i lượng hoa nở hàng ngày có thể phục hồi nhanh chóng [8]. Trong giai đo ạn hình thành quả, do diện tích lá đ ạt cao nhất, tốc độ chất khô tích lũy cũng cao cho nên c ần lượng nước lớn nhất. Nếu thiếu nước trong giai đo ạn này s ẽ làm giảm s ố quả chắc, giảm trọng lượng hạt, dẫn đến giảm năng suất [38]. 1.2.3. Cơ s ở sinh lý, sinh hóa và di truyền c ủa tính chịu hạn ở thực vật 1.2.3.1. Cơ s ở sinh lý c ủa tính chịu hạn Nước có ý nghĩa quyết định đến đời s ống c ủa thực vật. Thiếu nước cây s ẽ chết non ho ặc giảm s ức sống, giả m năng suất. Do s ự thiếu nước c ủa môi trường, nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao...có thể gây ra hiện tượng mất nước của cây. Để đáp ứng s ự thiếu hụt nước trong điều kiện c ực đoan, cây b ắt buộc phải có những cơ chế thích ứng đặc biệt giúp cây duy trì s ự tồn tại khi b ị hạn. Ở thực vật, khi đ ề c ập cơ chế chịu hạn ngườ i ta thườ ng chú ý đ ến vai trò c ủa bộ rễ và khả năng điều chỉ nh áp s uất thẩm thấu của tế bào. Về vai trò c ủa bộ rễ: Những cây chịu hạn có bộ rễ khoẻ, dài, mập, có s ức xuyên sâu giúp cây hút được nước ở tầng đất sâu. Bộ rễ lan rộng, có nhiều rễ phụ và có nhiều mô thông khí, cùng với hệ mạch dẫn phát triển giúp cho việc thu nhậ n và cung c ấp nước tới các bộ phận khác c ủa cây trong điều kiện khó khăn về nước. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
8 Về khả năng điều chỉ nh áp suất thẩm thấu: Khi tế bào b ị mất nước dần dần, các chất hòa tan s ẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, axit hữu cơ, axit amin, các io n chủ yế u là ion K+...), các chất này có tác d ụng điều chỉ nh áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đ ất. Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể chịu được s ự mất nước trong thời gian ngắn [18]. Ngoài ra, thực vật còn có khả năng chống chịu hạ n bằng những biến đổi về hình thái như lá cuộn lại thành ống, lá có nhiều lông, cu tin dày đ ể giảm thoát hơi nước [13]. 1.2.3.2. Cơ s ở sinh hóa và di truyền c ủa tính chịu hạn Khi phân tích thành phần hóa sinh c ủa các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng, khi cây g ặp hạn có hiệ n tượng tăng lên về hoạt độ enzyme, hàm lượ ng ABA, hàm lượ ng proline, nồng độ ion K+, các lo ại đường, axit hữu cơ,... giảm CO2, protein và axit nucleic [1], [6],[ 19], [31]. Nghiên c ứu s ự đa d ạng và ho ạt động c ủa enzyme trong điều kiện gây hạn đã được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa sinh c ủa một s ố giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét r ằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tớ i thành phần và hoạt độ protease, kìm hãm s ự phân giải protein d ự trữ [18]. Một s ố nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đ ậu xanh, đ ậu tương...cho thấy, có mối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và ho ạt độ enzyme α - amylase, giữa hàm lượng protein và ho ạt độ protease [17], [27], [35]...Đường tan là một trong những chất tham gia điều chỉ nh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự tăng hoạt độ α - amylase s ẽ làm tăng tăng hàm lượng đường tan do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng kh ả năng chịu hạn của cây trồng [20], [31]. Những thay đ ổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên c ứu, trong đó có s ự biến đổi hàm lượng axit amin proline. Nghiên c ứu khả năng ch ịu hạ n c ủa một s ố giống lúa c ạn địa phương ở vùng núi phía Bắc, tác giả Chu Hoàng Mậu và Cs (2005) đã nhận xét, khả S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
9 năng ch ịu hạn c ủa cây lúa c ạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline [25]. Xử lý hạn bằng dung d ịch sorbitol 5% đối với một số dòng lúa tái sinh từ mô s ẹo chịu mất nước, tác giả Đinh Thị Phòng (2001) cho thấy, hàm lượng proline c ủa các dòng chọn lọc khi b ị xử lý sorbitol tăng lên và vượt xa so với đối chứng (không b ị xử lý) [31]. Tính chống chịu là tính trạ ng đa gen, được biểu hiện khác nhau trong các giai đo ạn phát triển c ủa cây. Trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực s ự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đ ến tính chịu hạn. Vì vậy nghiên c ứu cơ chế phân tử của tính chịu hạn chủ yếu đi vào hướng chính đó là nghiên c ứu biểu hiện và chức năng c ủa các chất và c ác gen tương ứng liên quan đ ến khả năng b ảo vệ của tế bào khỏi tác đ ộng c ủa stress. Một trong những nhóm gen liên quan đ ến các điều kiệ n mất nước là các gen mã hóa nhóm protein có tên gọi là LEA (Late embryogenesis abundant protein). LEA không những đóng vai trò điều chỉ nh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín, mà còn hạn chế s ự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợ i như hạn, nóng lạnh... Mức độ phiên mã c ủa LEA được điều khiển bở i ABA và đ ộ mất nước c ủa tế bào. Ngoài ra, nhữ ng nhóm chất như protein s ốc nhiệt (HSP - heat shock protein), MGPT (molecular chaperone), ubiquitin...cũng được đặc biệt quan tâm nghiên c ứu [18]. Như vậy, cơ chế chịu hạn c ủa thực vật rất phức tạp, nó không chỉ liên quan đ ến đặc điểm hình thái giả i phẫu c ủa thực vật, mà còn liên quan đ ến những thay đổi về thành phần hoá sinh trong tế bào, s ự điểu chỉ nh hoạt động c ủa gen. 1.3. Một s ố thành tựu nuôi c ấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá khả năng chịu hạn và chọn dòng biến dị xoma Kỹ thuật nuôi c ấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên c ứu về khả năng chống chịu c ủa cây trồng như ch ịu hạn, chịu muố i, chịu nhôm [2 2], [24], [41]. Chu Hoàng Mậu, Ngô Thị Liêm, Nguy ễn Th ị Tâm (2006) tiến hành xử lý thổi khô mô s ẹo các giống lạc MĐ7, L17, L14, L18, ĐBG, đã nhận thấy mô S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
10 s ẹo c ủa 5 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước c ủa các giống có s ự khác nhau rõ rệt, cao nhất là giống ĐBG và thấp nhất là L18 [24]. Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Th ị Muộ i (1994) tiến hành đánh giá khả nă ng chịu muố i (NaCl) c ủa các giống lúa CR203, Lốc, C8, Co ở mức độ mô s ẹo, sau khi chuy ển vào môi trường có b ổ sung NaCl 1% và 2%. Sau 12 tuần theo dõi cho thấy khả năng ch ịu muố i c ủa giống Co là cao nhất và giống CR203 có khả năng ch ịu muố i thấp nhất [40]. Bằng kỹ thuậ t nuôi c ấy mô s ẹo in vitro, Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy Thành và cộng s ự (1995) nghiên c ứu khả năng chịu nhôm và axit c ủa các giống lúa: ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, CR203, NN8, OM 861- 20, OM 296 và Tép lai, đã thu được các dòng mô s ẹo của giống Pokaly và Cườm có khả năng ch ịu được AlCl3 ở 600ppm và pH là 2,71. Mô s ẹo c ủa giống Tép lai, CR203 chịu được AlCl3 ở 400ppm và pH 2,98 [41]. Tác giả Bùi Thu Thuỷ (2006) tiến hành thổi khô mô s ẹo c ủa 5 giống lúa TM, CR 203, U17, KD18 và BT nh ận thấy các giống lúa đ ều b ị mất nước nhanh khi xử lý bằng thổi khô. Khả năng chịu mất nước có s ự khác nhau rõ rệt, cao nhất là giống TM, thấp nhất là giống U17 [36]. Nguyễn Thị Tâm (2004), xử lý nhiệt độ cao ở giai đo ạn mô s ẹo c ủa một số giống lúa đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây xanh. T ừ 33 dòng qua 5 thế hệ đã chọn được 2 dòng nổi bật là HR128 vớ i đặc điểm thấp cây, số hạt chắc/bông cao, hàm lượng protein, đường tan, axit amin liên k ết trong hạt cao, có khả năng ch ịu nóng, cứng cây và dòng HR499 với khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, s ố hạt chắc/bông, năng suất khóm, có khả năng chịu nóng cao hơn so với giống gốc [33]. Vớ i s ự hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi c ấy đã mở ra nhiều triển vọng cho việc nghiên c ứu khả năng ch ịu hạn và chọn dòng chịu hạn cho nhiều đối tượng cây trồng. Sự ra đời c ủa các giống lúa DR1, DR2 có khả năng ch ịu hạn cao trong một thờ i gian ngắn bằng kỹ t huật nuôi c ấy mô tế bào thực vật là b ằng chứng cho chọn tạo dòng chống chịu bằng k ỹ thuật in vitro [30]. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
11 1.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) trong phân tích hệ gen thực vật Kỹ thuật RAPD là kỹ t huật phân tích s ự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân b ản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên c ứu c ủa Williams và Cs (1990), Welsh và McCle lland (1991) đ ồng thời xây d ựng. Thành phần và các bước của phản ứng RAPD d ựa trên cơ sở c ủa phản ứng PCR, chỉ khác ở kích thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi c ủa phản ứng RAPD vào kho ảng 350C- 450C. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ s ử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit. Mồ i có thể bám vào bất kỳ vị t rí nào có trình tự nucleotit b ổ sung trên phân tử ADN khuôn [21]. Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu là rất lớn. Sự khác nhau về vị trí và s ố lượng các đo ạn ADN có thể ghép c ặp bổ s ung với mồi chính là cơ s ở của s ự đa hình về phổ băng ADN được nhân b ản. Sản phẩm được phân tích b ằng điện di trên gel agarose ho ặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hóa chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra là do s ự có mặt hay vắ ng mặt c ủa một s ản phẩm nhân b ản từ một locus [48]. Từ khi ra đ ờ i kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nhau như đ ậu xanh, đ ậu tương, đu đ ủ, lạc, lúa, chuối...trong việc đánh giá đa d ạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [34], [47] phân tích và đánh giá b ộ genome thực vật nhằm xác đ ịnh nhữ ng thay đ ổi c ủa các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [10], [47]. Ngoài ra còn được ứng dụng hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau... Raina và Cs (2001) đã s ử dụng kỹ thuật RAPD và SSR đ ể phân tích s ự đa dạng hệ gen, xác định mố i quan hệ họ hàng giữ a các giống lạc trồng và lạc dại [50]. Đánh giá s ự đa d ạng c ủa một số dòng lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ s ắt, s ử dụng với 11 mồ i ngẫ u nhiên, tác giả Bùi Văn Thắng, Đinh Th ị Phòng đã thu được 66/109 phân đo ạn ADN đa hình [34]. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
12 Lê Xuân Đắc và CS (1999) s ử dụng 10 mồi ngẫu nhiên đ ể phân tích đa hình và chỉ ra s ự sai khác ở mức độ phân tử của các dòng lúa tái sinh từ mô s ẹo chịu mất nước [10]. Với 10 mồ i ngẫu nhiên, Nguyễ n Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ mô s ẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay đ ổi ở mức độ phân tử [33]. Cũng bằng kỹ t huật RAPD, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên c ứu đa d ạng di truy ền c ủa một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41 - 0,80 [32]. Bùi Thị Thu Thủy (2006) s ử dụng 5 mồi ngẫu nhiên đ ể so s ánh hệ gen c ủa các dòng lúa chọn lọc R1 với giống gốc U17 cho thấy c ả 5 mồi đều thể hiện tính đa hình, các dòng chọn lọc có mức độ khác biệt di truyền so với giống gốc từ 0,18 - 0,40 [37]. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
13 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên c ứu Sử dụng 3 giống lạc (L08, L23, L24) thu hoạch ở vụ Thu Đông năm 2006 do Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam cung c ấp và các giống lạc địa phương (LTB LCB, LBK) do s ở Nông nghiệp và PTNT các tỉ nh Thái Bình, Cao Bằng, Bắc Kạn cung c ấp. 2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điể m nghiên c ứu 2.2.1. Hoá chất Các chất kích thích sinh trưởng BAP; 2,4-D; NAA, hóa chất s ử dụng tách chiết ADN: Tris -base1M, BME14M, NaCl5M; SDS5%; EDTA0,5M; Cholorofo rm:isoamyl (24:1); STAB; isopropanol; Ethanol; TE (10mM Tribase+1mM EDTA), các chất khoáng đa lượ ng, vi lượng, vitamin, proline chuẩn, gelatin... 2.2.2. Thiết bị Cân phân tích điện tử (Thụy Sĩ), máy ly tâm lạnh c ủa hãng Hettich (Đức), máy quang phổ Uvis Cintra 40 (Úc), máy đo pH, tủ s ấy Cabrolite (Anh), box c ấy, máy điện di, máy PCR... 2.2.3. Địa điểm nghiên c ứu - Thí nghiệm nuôi c ấy in vitro được thực hiệ n tạ i phòng Công nghệ Tế bào- khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. - Thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu hóa sinh, phân tử được thực hiệ n tạ i phòng Di truy ền học, Công nghệ gen, khoa Sinh - KTNN Trường Đạ i học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. - Thí nghiệm nghiên c ứu ngoài đồng ruộng được thực hiện tại phường Tân Thịnh- Thành phố Thái Nguyên từ tháng 2/2008 đ ến 6/2008. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
14 2.3. Phƣơng pháp nghiên c ứu 2.3.1. Phƣơng pháp hóa sinh 2.3.1.1. Phƣơng pháp phân tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiề m sinh Xác định hàm lượng lipit: Dựa vào tính chất hòa tan c ủa dung môi hữu cơ để chiết lipit, dung môi hữu cơ được s ử dụng là petroleum ether. Cách làm: Mẫu được s ấy khô đ ến khối lượ ng không đ ổi. Bóc vỏ lụa, nghiền nhỏ, cân 0,05g mẫu cho vào tube. Sau đó cho 1,5ml petroleum ether, l ắc nhẹ 10 phút, để qua đêm ở 4oC, ly tâm 20 phút vớ i tốc độ 12.000 vòng/phút ở 4oC, bỏ dịch, lặp lạ i 3 lần như vậy. Sấy khô mẫu còn lại ở tube ở 70oC đến khối lượng không đ ổi. Hàm lượng lipit được tính b ằng hiệu c ủa khố i lượ ng mẫu trước và sau khi chiết theo công thức sau: AB Hàm lượng lipit (%) = x100% A Trong đó : A: Khố i lượng mẫu trước khi chiết (mg) B: Khố i lượng mẫu sau khi chiết (mg) Xác định hàm lượng protein: Hàm lượng protein tan xác đ ịnh theo phương pháp Lowry được mô tả trong tà i liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [3]. Mẫu sau khi lo ại lipit được s ử dụng chiết protein. Chiết protein b ằng dung d ịch đệm photphat citrat (pH=10), đ ể trong 24h ở 4oC, đem ly tâm 20 phút (12.000 vòng/phút), thu lấy dịch. Lặp lạ i thí nghiệm 3 lần. Dịch thu được c ủa mỗi lần chiết đ ịnh mức bằng dung d ịch đệm lên 10ml và đo hấp thụ quang phổ trên máy UV ở bước sóng 750nm vớ i thuốc thử folin. Hàm lượng protein được tính theo công thức: a HSPL X (%) 100% m Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô) a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: Hệ s ố pha loãng m: Khố i lượng mẫu (mg) S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
15 2.3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh ở giai đoạn hạt nảy mầm (1) Chuẩn bị mẫu: Hạt lạc sau khi bóc vỏ gỗ được ngâm nước 2 giờ, sau đó ủ ẩm bằng dung d ịch MS pha loãng 10 lần chứa sorbitol 5%. Hạt nảy mầm sau các kho ảng thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày được lấy để xác đ ịnh hoạt độ enzyme amilase và hàm lượng đường tan, ho ạt độ enzyme protease và hàm lượng protein tan. Đ ối chứng là h ạt lạc được ủ bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần không chứa sorbitol. (2) Xác đ ịnh hàm lượng đường tan b ằng phương pháp vi phân tích Xác đ ịnh hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tà i liệu c ủa Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [3]. - Nguyên tắc : Trong môi trường kiềm, đường khử kaliferixianua thành kaliferoxianua. Với s ự có mặt c ủa gelatin, kaliferoxianua kết hợp với s ắt s unphat axit tạo thành phức chất màu xanh b ền. - Cách tiến hành: Hạt nảy mầ m bóc vỏ lụa, cân khối lượng, chiết bằng nước cất, ly tâm 12.000 vòng/phút, d ịch thu được s ử dụng làm thí nghiệm. Đo cường độ màu dung d ịch trên máy so màu vớ i bước sóng 585nm. Hàm lượng đường tan được tính theo công thức : a b HSPL X (%) = x 100% m Trong đó: X: Hàm lượng đường tan ( % khối lượng tươi) a: Số đo trên máy (mg/ml) b: Số ml dịch chiết HSPL: Hệ s ố pha loãng m: Khố i lượng mẫu (mg) (3) Xác đ ịnh hoạt độ của enzyme α - amylase Xác đ ịnh hoạt độ của enzyme α - amylase theo phương pháp Heinkel mô tả trong tài liệu c ủa Nguyễn Lân Dũng (1979) [7]. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
16 - Nguyên tắc: Dựa vào tính chất hòa tan c ủa enzyme α - amylase trong dung dịch đệm photphat 0,2M (pH=6,8). - Cách tiế n hành: Hạt lạc nảy mầ m, bóc vỏ lụa, cân khố i lượng, nghiền nhỏ trong đ ệm photphat 0,2M (pH=6,8), ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu được s ử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích ho ạt độ enzyme α - amylase được tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra. Sau đó đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm. Công thức xác đ ịnh hoạt độ enzyme α- amylase: (C1 C 2) xHSPL ĐVHĐ/mg = m Trong đó: C1: Lượng tinh b ột còn lại c ủa mẫ u kiểm tra (mg/ml) C2: Lượng tinh b ột còn lại c ủa mẫ u thí nghiệ m (mg/ml) HSPL: Hệ s ố pha loãng m: Khối lượng mẫu (mg) Định tính hoạt độ enzyme α- amylase Thành phần hỗn hợp dịch gồm thạch aga 2%, tinh b ột 1%, H2O 100ml, cho hỗn hợp dịch vào bình nón và đun cách thủy cho đ ến tan thạch, đ ổ vào đĩa petri dày 4mm đ ể nguội, đục lỗ. Nhỏ 100 µl d ịch chiết chứa enzyme vào mồi lỗ, để tủ lạnh qua đêm đ ể enzyme khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24h. Sau đó nhuộm lugol trong 5 phút và tráng b ằng NaCl 1N. (4) Xác đ ịnh hàm lượng protein tan Hàm lượng protein tan được xác đ ịnh như mô tả ở mục 2.3.1.1. (5) Xác đ ịnh hoạt độ enzyme protease Hoạt độ enzyme protease xác đ ịnh theo phương pháp Anson c ải tiến theo mô tả c ủa Nguyễn Văn Mùi (2001) [2 6]. - Cách tiến hành: Hạt nảy mầ m đã bóc vỏ lụa, nghiền nhỏ, chiết bằng đệm photphat pH=6,5, li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu được s ử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệ m phân tích ho ạt độ enzyme protease được tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra, đo trên máy quang phổ ở bước s óng 750nm. Ho ạt độ enzyme được tính d ựa trên đ ồ thị đường chuẩn xây dựng bằng tyrozin. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
17 Hoạt độ protease được tính theo công thức: (n k ) xHSPLxD ĐVHĐ/mg= Txm Trong đó: n: Số đo trên máy ống kiểm tra(mg/ml) k: Số đo trên máy ống thí nghiệ m(mg/ml) HSPL: Hệ s ố pha loãng D: Số ml dịch chiết T: Thời gian ủ enzyme vớ i cơ chất m: Khố i lượng mẫu (mg) Định tính hoạt độ enzyme protease: Tiến hành tương tự như đ ịnh tính hoạt độ α- amylase, cơ chất là gelatin 1%. 2.3.2. Phƣơng pháp sinh lý Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đo ạn cây non theo Lê Trần Bình (1998) [2]. - Chuẩn bị mẫu: Hạt lạc nảy mầ m gieo vào các chậu (kích thước 30cm x 30cm) chứa cát vàng đã rửa s ạch mỗi chậu trồng 40 cây, 3 chậu cho mỗi giống, thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc như nhau. Thời gian đ ầu tưới nước cho đ ủ ẩm, khi cây lạc được 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo. - Đánh giá khả năng chịu hạn c ủa các giống lạc thông qua xác đ ịnh: + Chỉ số hạn tương đối (S): Chỉ số chịu hạn tương đối được xác đ ịnh thông qua tỉ lệ cây sống sót (%), khả năng giữ nước (%) c ủa cây non trước và sau hạn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Chỉ số chịu hạn được xác đ ịnh bằng diện tích đồ thị hình s ao gồm 6 trục mang các trị số tương ứng a, b, c, d, e, g c ủa một giống. Chỉ số chịu hạn tương đ ối được tính theo công thức: 1 S = sin α (ab + bc + cd + de + eg + ga) 2 Trong đó: α : % cây sống sau 3 ngày hạn; b : % khả năng giữ nước sau 3 ngày hạn; c: % cây sống sau 5 ngày hạn; d: % khả năng giữ nước sau 5 ngày hạn; e: % cây s ống sau 7 ngày hạn; g: % khả năng giữ nước sau 7 ngày hạn; α: Góc tạo bởi ha i trục mang tr ị s ố gần nhau và tính b ằng 360/n; S: Chỉ số chịu hạn tương đ ối c ủa các giống lạc. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
18 + Khả năng giữ nước c ủa cây lạc 3 lá trong điều kiện hạn được xác đ ịnh theo công thức: W (%)= Wxl x 100% Wkxl Trong đó: W (%): Khả năng giữ nước c ủa cây sau khi xử lý hạn. Wxl : Khố i lượng tươi c ủa cây xử lý(g) Wkxl : Khối lượng tươi c ủa cây không xử lý(g) - Xác đ ịnh hàm lượng prolin Đánh giá s ự biến đổi hàm lượng axit amin proline ở thân lá và rễ cây non 3 lá trước và sau xử lý hạn nhân tạo. Hàm lượng proline được xác đ ịnh theo phương pháp c ủa Bates và c ộng s ự (1973) 44 . Tách chiết proline: Nghiền 0,5 gam thân, lá cây lạc đã xử lý hạn ở ngưỡng 1, 3, 5 ngày trong cốc và đũa thuỷ tinh bằng nitơ lỏng, thêm 10 ml dung d ịch axit sunfosalixilic 3%, li tâm 8000 vòng/phút. Thu d ịch làm thí nghiệ m. Đo hấp phụ quang phổ ở bước sóng 520 nm. Hàm lượng prolin được tính theo công thức: AxHSPL X%= x100% m Trong đó: X: Hàm lượng prolin(%) A: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: Hệ s ố pha loãng m: Khố i lượng mẫu (mg) 2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy i n vitro 2.3.3.1. Tạo mô s ẹo từ phôi lạc Khử trùng hạt Củ lạc được rửa s ạch bằng nước máy, phơi khô, bóc vỏ gỗ, hạt lạc được khử trùng trong điều kiệ n vô trùng b ằng c ồn 700 trong thời gian 2 phút, tráng lại bằng nước c ất khử trùng 1 đ ến 2 lần. Thêm Javen 60% lắc đều trong 25 phút, sau đó rửa bằng nước c ất khử trùng 2 – 3 lần. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn
19 Tạo mô sẹo Hạt lạc đã khử trùng đ ặt lên giấy thấm khử trùng bóc b ỏ vỏ lụa, phôi tách ra được c ấy lên môi trường mô s ẹo cơ b ản bổ sung 2,4-D12mg/l, s accharose 3%, agar 0,8%, pH từ 5,5 – 5,8. Nuôi trong tố i một tuần, sau đó đưa ra dưới ánh sáng đèn phòng nuôi c ấy vớ i cường độ 2000lux, thời gian chiếu sáng 12/24 giờ, nhiệt độ 250C trong 3 ngày. 2.3.3.2. Xử lý bằng thổi khô Mô s ẹo sau khi đ ể trong tối 10 ngày, được chuyển lên đĩa petri trả i giấy lọc vô trùng và thổi khô b ằng luồng khí vô trùng c ủa bàn c ấy ở các ngưỡng thờ i gian 3, 6, 9 giờ, sau đó được chuyển lên môi trường tái sinh cây. Xác đ ịnh độ mất nước c ủa mô s ẹo thông qua cân trọng lượng c ủa mô s ẹo các giống trước và sau khi thổ i khô. Độ mất nước c ủa mô s ẹo được tính theo công thức: W f Wd W L (%) x100% Wf Trong đó: WL: Độ mất nước (%); Wf: Trọng lượng mô tươi (mg) Wd: Trọng lượng mô khô (mg) 2.3.3.3. Tái sinh cây Mô s ẹo sau khi x ử lý b ằng thổ i khô được c ấy lên môi trường tái sinh cây có thành phần MS cơ b ản, bổ sung BAP 2mg/l. Tỷ lệ s ống sót sau 3 tuần được tính theo công thức: N sv S v (%) x100% NT Trong đó: Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%); Ssv: Số mô sống sót; NT : Tổng số mô xử lý. Tỉ lệ tái sinh cây được đánh giá sau 6 tuần nuôi c ấy, theo công thức : Nr Rc (%) x100% N sv Trong đó: R c: Khả năng tái sinh cây (%); Nr: Số mô tái sinh cây; Nsv: Số mô sống sót. S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đạ i học Thái Nguyên http://www.lrc -tnu.edu.vn