Luận văn: Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị

kinh tế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích

22 triệu ha [12].

Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và

protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa

các vitamin nhóm B và một lượng hydratcacbon nhất định. Hạt lạc là nguyên

liệu chính để sản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomát... và là mặt hàng xuất khẩu có

giá trị. Các phụ phẩm của lạc (khô dầu, thân, lá) dùng làm thức ăn cho gia

súc hay phân bón đều tốt và rẻ tiền. Trồng lạc có tác dụng cải tạo đất và phù

hợp với cơ cấu chuyển đổi kinh tế nông nghiệp hiện nay [11], [12].

Ở Việt Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây nông

nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện

canh tác còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, việc tổng kết

kinh nghiệm thực tiễn và ứng dụng khoa học tiên tiến vào sản xuất đã góp

phần tăng năng suất lạc một cách đáng kể [15]. Năm 2005, năng suất bình

quân đạt 18 tạ/ha, sản lượng đạt 485,610 nghìn tấn, so với 1995 năng suất

mới chỉ là 13 tạ/ha. Tuy nhiên, sản xuất lạc ở nước ta vẫn còn nhiều yếu tố

hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và chất

lượng lạc là khô hạn [16]. Để hạn chế ảnh hưởng của hạn tới năng suất cây

trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tưới tiêu hợp lý cần

sử dụng các giống có khả năng chịu hạn cao, đặc biệt ở những vùng đất

không chủ động nước. Vì vậy, nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống

lạc là rất cần thiết.

Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma cho phép thu được những dòng tế

bào có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trường [30],

[43]. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng đã được sử dụng ở nhiều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

nước trên thế giới và tạo ra những giống cây trồng mới có khả năng chống

chịu cao trong một thời gian rút ngắn so với các phương pháp truyền thống

[30], [51].

Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Đánh giá

khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ

các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK ở

giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non và ở mức độ mô sẹo.

- Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L08, L23, L24,

LTB LCB, LBK

3. Nội dung nghiên cứu

- Phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh trong hạt tiềm sinh của các giống L08, L23,

L24, LTB LCB, LBK

- Xác định ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của một số enzym và chất

tan tương ứng ở giai đoạn hạt nảy mầm.

- Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây

hạn nhân tạo.

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc ở mức độ mô sẹo thông qua

xử lý bằng thổi khô.

- Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L08, L23, L24,

LTB LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro: Xác định ngưỡng chọn lọc, tái

sinh cây, tạo cây hoàn chỉnh, trồng ngoài đồng ruộng.

- Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá ADN genome một số dòng có nguồn

gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giá trị kinh tế, đặc điểm nông sinh học và tình hình sản xuất lạc trên

thế giới và ở Việt Nam

1.1.1. Giá trị kinh tế của cây lạc

Hạt lạc chiếm 40% – 58% lipit, 16% – 43% protein, 6% – 24% gluxit,

2,5% cellulose. Trong 100g lạc có 60 UI vitamin A, 300 UI vitamin B, một

lượng PP đủ dùng cho người lớn trong 1 ngày và cung cấp 578,6 calo [5].

Protein của lạc có đủ 8 loại axit amin không thay thế, đặc biệt trong hạt lạc có

chất lecithin (phosphattidyl choline) có tác dụng làm giảm lượng cholesterol

trong máu, chống hiện tượng xơ vữa mạch máu [9]. Thức ăn bằng lạc có thể

khắc phục tình trạng thiếu protein cho con người [8]. Dầu lạc là một hỗn hợp

glyxerin chứa 80% axit béo không no, có độ nhớt thấp, mùi thơm. Dầu lạc

được sử dụng trong y học, kỹ nghệ dầu máy, sản xuất xà phòng...[5]. Hạt lạc

là mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao, mỗi năm nước ta xuất khẩu khoảng 80 –

120 ngàn tấn, chiếm 30%– 50% tổng sản lượng [11]. Các phụ phẩm của lạc

như khô dầu, thân lá dùng để chế biến thức ăn cho gia súc hay phân bón đều

có giá trị dinh dưỡng cao và rẻ tiền. Một kg khô dầu lạc chứa 400 gam

protein, 80 gam lipit [9], [11].

Trồng lạc còn có tác dụng chống sói mòn và cải tạo đất. Nhờ sự hoạt

động của vi khuẩn nốt sần mà sau một vụ lạc sẽ để lại trong đất từ 40 – 60 kg

N/ha [38]. Mặt khác, cây lạc có thời gian sinh trưởng ngắn (từ 90 – 125

ngày), nên có thể xen canh, gối vụ với các cây trồng khác làm tăng giá trị

kinh tế trên một đơn vị diện tích đất trồng.

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây lạc

Rễ lạc thuộc loại rễ cọc, có nhiều rễ phụ. Trên rễ lạc có nhiều nốt sần,

được tạo thành do vi khẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả

năng cố định nitơ phân tử trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất

trồng [38]. Thân chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm, lúc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

còn non thân lạc hình tròn, về già có cạnh và rỗng [12]. Lá lạc là loại lá kép

lông chim, có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược [38]. Hoa lạc mọc

thành chùm, có từ 2 – 15 hoa. Lạc là cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi hoa nở

là đã tự thụ phấn xong [9]. Quả lạc có hình kén, dài 1 – 8 cm, rộng 0,5 – 2cm,

một đầu dính với tia, quả thắt ở giữa ngăn các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng,

chứa từ 1 – 3 hạt; hạt được bọc trong vỏ lụa mỏng, hình trứng [11].

Về mặt sinh thái học, cây lạc chịu ảnh hưởng nhiều của các nhân tố

sinh thái như: Nhiệt độ, nước, độ ẩm, ánh sáng, đất và các chất khoáng [8],

[9], [15], [38].

Dựa vào thời gian sinh trưởng, cây lạc được chia làm hai loại: giống

chín sớm có thời sinh trưởng từ 90 – 125 ngày, giống chín muộn có thời gian

sinh trưởng từ 140 – 160 ngày. Dạng chín muộn trội hoàn toàn so với dạng

chín sớm [8].

1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam

Trong các cây lấy dầu, lạc có diện tích, sản lượng đứng thứ hai sau đỗ

tương và được trồng khắp các châu lục. Châu Á, là nơi có diện tích trồng, sản

lượng lạc cao nhất, chiếm trên 60% sản lượng lạc của thế giới. Châu Phi đứng

thứ hai chiếm 30%, các châu lục khác rất ít (châu Mỹ 5%, châu Âu 0,22%) [9].

Trong số các nước trồng lạc thì Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ là những

nước có sản lượng lạc hàng năm cao nhất (trên 1triệu tấn/năm). Một số nước

như Dimbabue, Camơrun (Châu Phi) có sản lượng lạc rất thấp, chỉ đạt 0,17

triệu tấn/năm [11].

Ấn Độ là quốc gia có diện tích trồng lạc đứng đầu thế giới (8,1 triệu

ha) song sản lượng hàng năm thấp, chỉ đạt 5,4 triệu tấn vì năng suất lạc chỉ

đạt 6,9 – 9,98 tạ/ha. Trung Quốc có diện tích trồng lạc chỉ hơn nửa Ấn Độ

(4,3 triệu ha) nhưng hàng năm đạt 11,89 triệu tấn, đứng đầu thế giới. Còn Mỹ

tuy có diện tích gieo trồng thấp (0,59 triệu ha) nhưng nhờ có các giống lạc

cao sản nên sản lượng hàng năm cao (đạt 1,8 triệu tấn/năm) đứng thứ 3 trên

thế giới [9], [11], [12].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

Trong 25 nước trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng ở vị trí thứ năm về

sản lượng lạc hàng năm. Trong các thập kỷ 60, 70, 80 của thế kỷ XX diện

tích, năng suất và sản lượng lạc của nước ta còn thấp. Đến thập kỷ 90 của thế

kỷ XX, diện tích, năng suất, sản lượng lạc của nước ta tăng nhanh, trong

vòng 10 năm năng suất lạc tăng gần 30% [12].

Ở Việt Nam cây lạc có mặt ở 59/61 tỉnh thành, chia thành 5 khu vực

chính: Vùng Trung du miền núi phía Bắc, với tổng diện tích 41.000 ha; Khu

vực Bắc Trung Bộ là vùng trọng điểm sản xuất lạc với 71.000 ha, đạt 68,7 –

93,4 nghìn tấn lạc/năm; Khu vực Nam Trung Bộ có khoảng 29.000 ha; Vùng

Cao nguyên Nam Bộ với 18.680 ha; và Vùng Đông Nam Bộ có 6.800 ha [38].

1.2. Tính chịu hạn ở thực vật

1.2.1. Hạn và các hình thức hạn ảnh hƣởng đến cây trồng

Hạn là tác động của môi trường gây nên sự mất nước của thực vật [18].

Có 3 hình thức hạn ảnh hưởng đến cây trồng là hạn đất, hạn không khí

và hạn tổ hợp [18].

Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đất thiếu nhiều không đủ cho rễ

hút để cung cấp cho cây. Vì thế, cây có thể bị héo và chết. Tuy nhiên, cũng

có những trường hợp đủ nước mà cây vẫn héo, nguyên nhân là do hạn sinh lý

gây nên. Hạn không khí thường xảy ra khi không khí môi trường có nhiệt độ

cao và độ ẩm thấp, ví dụ như gió nóng Israel, gió Lào ở miền Trung nước

ta...làm cho cây thoát hơi nước quá mạnh, vượt xa mức bình thường và dẫn

tới hiện tượng mất nước, do rễ hút vào không bù đủ lượng nước mất đi, làm

các bộ phận non của cây thiếu nước. Hạn tổ hợp là sự phối hợp thiếu nước

trong đất và trong không khí .

1.2.2. Tác hại của hạn lên thực vật

1.2.2.1. Tác hại của hạn lên thực vật

Thiếu nước sẽ gây nên các hậu quả rất lớn đối với hoạt động sống của

cây. Trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến

các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và cuối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

6

cùng là ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật dẫn đến giảm

năng suất.

Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh của tế bào thay đổi mạnh,

ảnh hưởng đến tính chất hoá lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ

thuỷ hoá của keo, thay đổi pH, độ nhớt, dẫn đến sự thay đổi vị trí các thành

phần cấu tạo nên chất nguyên sinh, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao

đổi chất bình thường của cơ thể [13]. Trong thời gian cây bị hạn, hàm lượng

nước tự do trong lá giảm xuống nhưng hàm lượng nước liên kết lại tăng lên.

Chất nguyên sinh của tế bào có tính đàn hồi lớn thì cây có khả năng chịu hạn

cao [42].

Hạn còn ảnh hưởng đến hô hấp. Trong thời gian khô hạn, ở những cây

trung sinh thường tăng cường hô hấp. Nhờ gia tăng hô hấp mà cây giữ được

độ ngậm nước của keo nguyên sinh chất [13]. Sự tăng cường quá trình thuỷ

phân khi gặp điều kiện khô hạn là nguyên nhân tăng cường hô hấp trong cây.

Khi mất nước ban đầu hô hấp tăng, nhưng sau đó giảm đột ngột, nếu tình

trạng thiếu nước kéo dài [42].

Thiếu nước ảnh hưởng đến quang hợp. Hạn hán đã ảnh hưởng xấu đến

quá trình hình thành diệp lục, phá hoại lạp thể nên hiệu suất quang hợp giảm

xuống nhanh chóng. Theo Buxigon, cây trúc đào khi bị hạn thì cường độ

quang hợp giảm 40% [42].

Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của hệ rễ, dẫn đến tình trạng

thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng

hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [13]. Hạn ảnh hưởng

trực tiếp đến quá trình sinh trưởng các tế bào, đặc biệt là trong pha giãn của

tế bào, từ đó mà ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của toàn cây [42].

1.2.2.2 Ảnh hƣởng của hạn đến cây lạc

Trong mỗi thời kỳ sinh trưởng, cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn ở một

mức độ nhất định. Biểu hiện bề ngoài nhận thấy rõ rệt nhất khi cây lạc bị hạn

ở tất cả các thời kỳ sinh trưởng là ở bộ lá. Khi độ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

7

dày, màu lá từ xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá hủy

[15]. Trong điều kiện bị hạn tức thời, lá vẫn giữ nguyên kích thước nhưng

sức trương tế bào giảm, khí khổng khép lại, lá bị rũ xuống [8].

Thời kỳ trước ra hoa là thời kỳ cây lạc chịu được hạn lớn nhất, vì trong

giai đoạn này nhu cầu về nước của cây lạc không lớn lắm, độ ẩm thích hợp từ

60% - 65%. Bị hạn trong thời kỳ trước ra hoa ảnh hưởng đến tốc độ sinh

trưởng của cây lạc, làm cho quá trình phát triển bị chậm lại [38].

Ở giai đoạn ra hoa, thiếu nước sẽ làm giảm số hoa, tỷ lệ hoa có ích, các

đợt rộ không được hình thành, kéo dài thời gian ra hoa - chín của lạc, gây ảnh

hưởng đáng kể tới năng suất. Tuy nhiên, nếu được tưới kịp thời lượng hoa nở

hàng ngày có thể phục hồi nhanh chóng [8].

Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ

chất khô tích lũy cũng cao cho nên cần lượng nước lớn nhất. Nếu thiếu nước

trong giai đoạn này sẽ làm giảm số quả chắc, giảm trọng lượng hạt, dẫn đến

giảm năng suất [38].

1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn ở thực vật

1.2.3.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn

Nước có ý nghĩa quyết định đến đời sống của thực vật. Thiếu nước cây

sẽ chết non hoặc giảm sức sống, giảm năng suất. Do sự thiếu nước của môi

trường, nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao...có thể gây ra hiện tượng mất nước

của cây. Để đáp ứng sự thiếu hụt nước trong điều kiện cực đoan, cây bắt buộc

phải có những cơ chế thích ứng đặc biệt giúp cây duy trì sự tồn tại khi bị hạn.

Ở thực vật, khi đề cập cơ chế chịu hạn người ta thường chú ý đến vai

trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào.

Về vai trò của bộ rễ: Những cây chịu hạn có bộ rễ khoẻ, dài, mập, có

sức xuyên sâu giúp cây hút được nước ở tầng đất sâu. Bộ rễ lan rộng, có

nhiều rễ phụ và có nhiều mô thông khí, cùng với hệ mạch dẫn phát triển giúp

cho việc thu nhận và cung cấp nước tới các bộ phận khác của cây trong điều

kiện khó khăn về nước.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

8

Về khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Khi tế bào bị mất nước dần

dần, các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, axit hữu cơ, axit amin, các ion chủ yếu là ion K+...), các chất này có tác dụng điều

chỉnh áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu

nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đất. Bằng cơ chế như vậy, thực

vật có thể chịu được sự mất nước trong thời gian ngắn [18].

Ngoài ra, thực vật còn có khả năng chống chịu hạn bằng những biến

đổi về hình thái như lá cuộn lại thành ống, lá có nhiều lông, cu tin dày để

giảm thoát hơi nước [13].

1.2.3.2. Cơ sở sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn

Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên

cứu đều cho rằng, khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hoạt độ enzyme, hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit

hữu cơ,... giảm CO2, protein và axit nucleic [1], [6],[19], [31].

Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây

hạn đã được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên

cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng,

hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần

và hoạt độ protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [18]. Một số nghiên

cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương...cho thấy, có mối

tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ enzyme α - amylase,

giữa hàm lượng protein và hoạt độ protease [17], [27], [35]...Đường tan là

một trong những chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự

tăng hoạt độ α - amylase sẽ làm tăng tăng hàm lượng đường tan do đó làm

tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng [20], [31].

Những thay đổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nhiều tác

giả quan tâm nghiên cứu, trong đó có sự biến đổi hàm lượng axit amin

proline. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương

ở vùng núi phía Bắc, tác giả Chu Hoàng Mậu và Cs (2005) đã nhận xét, khả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

9

năng chịu hạn của cây lúa cạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline

[25]. Xử lý hạn bằng dung dịch sorbitol 5% đối với một số dòng lúa tái sinh

từ mô sẹo chịu mất nước, tác giả Đinh Thị Phòng (2001) cho thấy, hàm lượng

proline của các dòng chọn lọc khi bị xử lý sorbitol tăng lên và vượt xa so với

đối chứng (không bị xử lý) [31].

Tính chống chịu là tính trạng đa gen, được biểu hiện khác nhau trong

các giai đoạn phát triển của cây. Trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự

quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu

hạn. Vì vậy nghiên cứu cơ chế phân tử của tính chịu hạn chủ yếu đi vào

hướng chính đó là nghiên cứu biểu hiện và chức năng của các chất và các gen

tương ứng liên quan đến khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động của stress.

Một trong những nhóm gen liên quan đến các điều kiện mất nước là các gen

mã hóa nhóm protein có tên gọi là LEA (Late embryogenesis abundant

protein). LEA không những đóng vai trò điều chỉnh quá trình mất nước sinh

lý khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại

cảnh bất lợi như hạn, nóng lạnh... Mức độ phiên mã của LEA được điều

khiển bởi ABA và độ mất nước của tế bào. Ngoài ra, những nhóm chất như

protein sốc nhiệt (HSP - heat shock protein), MGPT (molecular chaperone),

ubiquitin...cũng được đặc biệt quan tâm nghiên cứu [18].

Như vậy, cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, nó không chỉ liên

quan đến đặc điểm hình thái giải phẫu của thực vật, mà còn liên quan đến những

thay đổi về thành phần hoá sinh trong tế bào, sự điểu chỉnh hoạt động của gen.

1.3. Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá

khả năng chịu hạn và chọn dòng biến dị xoma

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi

trong lĩnh vực nghiên cứu về khả năng chống chịu của cây trồng như chịu

hạn, chịu muối, chịu nhôm [22], [24], [41].

Chu Hoàng Mậu, Ngô Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006) tiến hành xử lý thổi khô mô sẹo các giống lạc MĐ7, L17, L14, L18, ĐBG, đã nhận thấy mô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

10

sẹo của 5 giống lạc đều bị mất nước nhanh, khả năng chịu mất nước của các

giống có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là giống ĐBG và thấp nhất là L18 [24]. Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994) tiến hành đánh

giá khả năng chịu muối (NaCl) của các giống lúa CR203, Lốc, C8, Co ở mức

độ mô sẹo, sau khi chuyển vào môi trường có bổ sung NaCl 1% và 2%. Sau

12 tuần theo dõi cho thấy khả năng chịu muối của giống Co là cao nhất và

giống CR203 có khả năng chịu muối thấp nhất [40].

Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo in vitro, Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy

Thành và cộng sự (1995) nghiên cứu khả năng chịu nhôm và axit của các

giống lúa: ĐC3, CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, CR203, NN8, OM 861-

20, OM 296 và Tép lai, đã thu được các dòng mô sẹo của giống Pokaly và

Cườm có khả năng chịu được AlCl3 ở 600ppm và pH là 2,71. Mô sẹo của

giống Tép lai, CR203 chịu được AlCl3 ở 400ppm và pH 2,98 [41].

Tác giả Bùi Thu Thuỷ (2006) tiến hành thổi khô mô sẹo của 5 giống

lúa TM, CR 203, U17, KD18 và BT nhận thấy các giống lúa đều bị mất nước

nhanh khi xử lý bằng thổi khô. Khả năng chịu mất nước có sự khác nhau rõ

rệt, cao nhất là giống TM, thấp nhất là giống U17 [36].

Nguyễn Thị Tâm (2004), xử lý nhiệt độ cao ở giai đoạn mô sẹo của một số giống lúa đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây xanh. Từ 33 dòng qua 5 thế hệ đã chọn được 2 dòng

nổi bật là HR128 với đặc điểm thấp cây, số hạt chắc/bông cao, hàm lượng

protein, đường tan, axit amin liên kết trong hạt cao, có khả năng chịu nóng,

cứng cây và dòng HR499 với khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, số hạt chắc/bông,

năng suất khóm, có khả năng chịu nóng cao hơn so với giống gốc [33].

Với sự hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi cấy đã mở ra nhiều

triển vọng cho việc nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn cho

nhiều đối tượng cây trồng. Sự ra đời của các giống lúa DR1, DR2 có khả

năng chịu hạn cao trong một thời gian ngắn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

thực vật là bằng chứng cho chọn tạo dòng chống chịu bằng kỹ thuật in vitro

[30].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

11

1.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) trong phân

tích hệ gen thực vật

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân

đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams

và Cs (1990), Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng.

Thành phần và các bước của phản ứng RAPD dựa trên cơ sở của phản

ứng PCR, chỉ khác ở kích thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng RAPD vào khoảng 350C- 450C. Kỹ thuật RAPD có ưu

điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit. Mồi có thể bám vào

bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN khuôn [21].

Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu là rất

lớn. Sự khác nhau về vị trí và số lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ

sung với mồi chính là cơ sở của sự đa hình về phổ băng ADN được nhân bản.

Sản phẩm được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide

và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hóa chất đặc trưng. Vì

vậy, tính đa hình thường được nhận ra là do sự có mặt hay vắng mặt của một

sản phẩm nhân bản từ một locus [48].

Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối

tượng khác nhau như đậu xanh, đậu tương, đu đủ, lạc, lúa, chuối...trong việc

đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [34], [47]

phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của

các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [10], [47]. Ngoài ra còn được ứng dụng

hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các

loài khác nhau...

Raina và Cs (2001) đã sử dụng kỹ thuật RAPD và SSR để phân tích sự

đa dạng hệ gen, xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc

dại [50]. Đánh giá sự đa dạng của một số dòng lạc trong tập đoàn giống

chống chịu bệnh gỉ sắt, sử dụng với 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả Bùi Văn

Thắng, Đinh Thị Phòng đã thu được 66/109 phân đoạn ADN đa hình [34].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

12

Lê Xuân Đắc và CS (1999) sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa hình

và chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo

chịu mất nước [10]. Với 10 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho

thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4,

ML107 đã có những thay đổi ở mức độ phân tử [33]. Cũng bằng kỹ thuật

RAPD, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của

một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31,

RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động

từ 0,41 - 0,80 [32]. Bùi Thị Thu Thủy (2006) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để so

sánh hệ gen của các dòng lúa chọn lọc R1 với giống gốc U17 cho thấy cả 5

mồi đều thể hiện tính đa hình, các dòng chọn lọc có mức độ khác biệt di

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

truyền so với giống gốc từ 0,18 - 0,40 [37].

13

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng 3 giống lạc (L08, L23, L24) thu hoạch ở vụ Thu Đông năm 2006

do Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam cung cấp và các giống lạc

địa phương (LTB LCB, LBK) do sở Nông nghiệp và PTNT các tỉnh Thái Bình,

Cao Bằng, Bắc Kạn cung cấp.

2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.2.1. Hoá chất

Các chất kích thích sinh trưởng BAP; 2,4-D; NAA, hóa chất sử dụng

tách chiết ADN: Tris-base1M, BME14M, NaCl5M; SDS5%; EDTA0,5M;

Choloroform:isoamyl (24:1); STAB; isopropanol; Ethanol; TE (10mM

Tribase+1mM EDTA), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, proline

chuẩn, gelatin...

2.2.2. Thiết bị

Cân phân tích điện tử (Thụy Sĩ), máy ly tâm lạnh của hãng Hettich

(Đức), máy quang phổ Uvis Cintra 40 (Úc), máy đo pH, tủ sấy Cabrolite

(Anh), box cấy, máy điện di, máy PCR...

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu

- Thí nghiệm nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng Công nghệ Tế

bào- khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

- Thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu hóa sinh, phân tử được thực hiện tại

phòng Di truyền học, Công nghệ gen, khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư

phạm - Đại học Thái Nguyên.

- Thí nghiệm nghiên cứu ngoài đồng ruộng được thực hiện tại phường

Tân Thịnh- Thành phố Thái Nguyên từ tháng 2/2008 đến 6/2008.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

14

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phƣơng pháp hóa sinh

2.3.1.1. Phƣơng pháp phân tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiềm sinh

Xác định hàm lượng lipit: Dựa vào tính chất hòa tan của dung môi hữu cơ

để chiết lipit, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether.

Cách làm: Mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi. Bóc vỏ lụa, nghiền

nhỏ, cân 0,05g mẫu cho vào tube. Sau đó cho 1,5ml petroleum ether, lắc nhẹ 10 phút, để qua đêm ở 4oC, ly tâm 20 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút ở 4oC, bỏ dịch, lặp lại 3 lần như vậy. Sấy khô mẫu còn lại ở tube ở 70oC đến

khối lượng không đổi.

Hàm lượng lipit được tính bằng hiệu của khối lượng mẫu trước và sau

khi chiết theo công thức sau:

Hàm lượng lipit (%) =

Trong đó: A: Khối lượng mẫu trước khi chiết (mg)

B: Khối lượng mẫu sau khi chiết (mg)

Xác định hàm lượng protein: Hàm lượng protein tan xác định theo phương pháp

Lowry được mô tả trong tà i liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [3].

Mẫu sau khi loại lipit được sử dụng chiết protein. Chiết protein bằng dung dịch đệm photphat citrat (pH=10), để trong 24h ở 4oC, đem ly tâm 20

phút (12.000 vòng/phút), thu lấy dịch. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dịch thu

được của mỗi lần chiết định mức bằng dung dịch đệm lên 10ml và đo hấp thụ

quang phổ trên máy UV ở bước sóng 750nm với thuốc thử folin.

Hàm lượng protein được tính theo công thức:

Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô)

a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng

m: Khối lượng mẫu (mg)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

15

2.3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua phân tích một số chỉ tiêu

hóa sinh ở giai đoạn hạt nảy mầm

(1) Chuẩn bị mẫu: Hạt lạc sau khi bóc vỏ gỗ được ngâm nước 2 giờ, sau đó ủ

ẩm bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần chứa sorbitol 5%. Hạt nảy mầm sau

các khoảng thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày được lấy để

xác định hoạt độ enzyme amilase và hàm lượng đường tan, hoạt độ enzyme

protease và hàm lượng protein tan. Đối chứng là hạt lạc được ủ bằng dung

dịch MS pha loãng 10 lần không chứa sorbitol.

(2) Xác định hàm lượng đường tan bằng phương pháp vi phân tích

Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được

mô tả trong tà i liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1998) [3].

- Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử kaliferixianua thành

kaliferoxianua. Với sự có mặt của gelatin, kaliferoxianua kết hợp với sắt

sunphat axit tạo thành phức chất màu xanh bền.

- Cách tiến hành: Hạt nảy mầm bóc vỏ lụa, cân khối lượng, chiết bằng nước

cất, ly tâm 12.000 vòng/phút, dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Đo

cường độ màu dung dịch trên máy so màu với bước sóng 585nm.

Hàm lượng đường tan được tính theo công thức :

X (%) = x 100%

Trong đó: X: Hàm lượng đường tan ( % khối lượng tươi)

a: Số đo trên máy (mg/ml)

b: Số ml dịch chiết

HSPL: Hệ số pha loãng

m: Khối lượng mẫu (mg)

(3) Xác định hoạt độ của enzyme α - amylase

Xác định hoạt độ của enzyme α - amylase theo phương pháp Heinkel

mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (1979) [7].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

16

- Nguyên tắc: Dựa vào tính chất hòa tan của enzyme α - amylase trong dung

dịch đệm photphat 0,2M (pH=6,8).

- Cách tiến hành: Hạt lạc nảy mầm, bóc vỏ lụa, cân khối lượng, nghiền nhỏ

trong đệm photphat 0,2M (pH=6,8), ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ

enzyme α - amylase được tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra. Sau đó

đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm.

Công thức xác định hoạt độ enzyme α- amylase:

ĐVHĐ/mg =

Trong đó:

C1: Lượng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra (mg/ml) C2: Lượng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm (mg/ml)

HSPL: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu (mg) Định tính hoạt độ enzyme α- amylase

Thành phần hỗn hợp dịch gồm thạch aga 2%, tinh bột 1%, H2O 100ml, cho hỗn hợp dịch vào bình nón và đun cách thủy cho đến tan thạch, đổ vào

đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ. Nhỏ 100 µl dịch chiết chứa enzyme vào

mồi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24h. Sau đó nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1N. (4) Xác định hàm lượng protein tan

Hàm lượng protein tan được xác định như mô tả ở mục 2.3.1.1.

(5) Xác định hoạt độ enzyme protease

Hoạt độ enzyme protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến

theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [26]. - Cách tiến hành: Hạt nảy mầm đã bóc vỏ lụa, nghiền nhỏ, chiết bằng đệm photphat pH=6,5, li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzyme protease được tiến hành trên ống thí nghiệm, ống kiểm tra, đo trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm. Hoạt độ enzyme được tính dựa trên đồ thị đường chuẩn xây dựng bằng tyrozin.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

17

Hoạt độ protease được tính theo công thức:

ĐVHĐ/mg=

Trong đó: n: Số đo trên máy ống kiểm tra(mg/ml)

k: Số đo trên máy ống thí nghiệm(mg/ml)

HSPL: Hệ số pha loãng

D: Số ml dịch chiết

T: Thời gian ủ enzyme với cơ chất

m: Khối lượng mẫu (mg)

Định tính hoạt độ enzyme protease: Tiến hành tương tự như định tính

hoạt độ α- amylase, cơ chất là gelatin 1%.

2.3.2. Phƣơng pháp sinh lý

Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non theo Lê

Trần Bình (1998) [2].

- Chuẩn bị mẫu: Hạt lạc nảy mầm gieo vào các chậu (kích thước 30cm x

30cm) chứa cát vàng đã rửa sạch mỗi chậu trồng 40 cây, 3 chậu cho mỗi

giống, thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc như

nhau. Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm, khi cây lạc được 3 lá tiến hành gây

hạn nhân tạo.

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc thông qua xác định:

+ Chỉ số hạn tương đối (S): Chỉ số chịu hạn tương đối được xác định thông qua

tỉ lệ cây sống sót (%), khả năng giữ nước (%) của cây non trước và sau hạn 3

ngày, 5 ngày, 7 ngày. Chỉ số chịu hạn được xác định bằng diện tích đồ thị hình

sao gồm 6 trục mang các trị số tương ứng a, b, c, d, e, g của một giống.

Chỉ số chịu hạn tương đối được tính theo công thức:

S = sin α (ab + bc + cd + de + eg + ga)

Trong đó: α : % cây sống sau 3 ngày hạn; b: % khả năng giữ nước sau 3 ngày hạn; c: % cây sống sau 5 ngày hạn; d: % khả năng giữ nước sau 5 ngày hạn; e: % cây sống sau 7 ngày hạn; g: % khả năng giữ nước sau 7 ngày hạn; α: Góc tạo bởi hai trục mang trị số gần nhau và tính bằng 360/n; S: Chỉ số chịu hạn tương đối của các giống lạc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

18

+ Khả năng giữ nước của cây lạc 3 lá trong điều kiện hạn được xác định theo

công thức:

x 100%

W (%)=

Trong đó: W (%): Khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý hạn.

Wxl: Khối lượng tươi của cây xử lý(g)

Wkxl : Khối lượng tươi của cây không xử lý(g)

- Xác định hàm lượng prolin

Đánh giá sự biến đổi hàm lượng axit amin proline ở thân lá và rễ cây non

3 lá trước và sau xử lý hạn nhân tạo. Hàm lượng proline được xác định theo

phương pháp của Bates và cộng sự (1973) 44 .

Tách chiết proline: Nghiền 0,5 gam thân, lá cây lạc đã xử lý hạn ở

ngưỡng 1, 3, 5 ngày trong cốc và đũa thuỷ tinh bằng nitơ lỏng, thêm 10 ml

dung dịch axit sunfosalixilic 3%, li tâm 8000 vòng/phút. Thu dịch làm thí

nghiệm. Đo hấp phụ quang phổ ở bước sóng 520 nm.

Hàm lượng prolin được tính theo công thức:

X%=

Trong đó: X: Hàm lượng prolin(%)

A: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml)

HSPL: Hệ số pha loãng

m: Khối lượng mẫu (mg)

2.3.3. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro

2.3.3.1. Tạo mô sẹo từ phôi lạc

Khử trùng hạt

Củ lạc được rửa sạch bằng nước máy, phơi khô, bóc vỏ gỗ, hạt lạc được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn 700 trong thời gian 2 phút,

tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm Javen 60% lắc đều trong

25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 2 – 3 lần.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

19

Tạo mô sẹo

Hạt lạc đã khử trùng đặt lên giấy thấm khử trùng bóc bỏ vỏ lụa, phôi

tách ra được cấy lên môi trường mô sẹo cơ bản bổ sung 2,4-D12mg/l,

saccharose 3%, agar 0,8%, pH từ 5,5 – 5,8. Nuôi trong tối một tuần, sau đó

đưa ra dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000lux, thời gian chiếu sáng 12/24 giờ, nhiệt độ 250C trong 3 ngày.

2.3.3.2. Xử lý bằng thổi khô

Mô sẹo sau khi để trong tối 10 ngày, được chuyển lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của bàn cấy ở các ngưỡng thời gian 3, 6, 9 giờ, sau đó được chuyển lên môi trường tái sinh cây. Xác định độ mất nước của mô sẹo thông qua cân trọng lượng của mô sẹo các giống trước và sau khi thổi khô. Độ mất nước của mô sẹo được tính theo công thức:

Trong đó: WL: Độ mất nước (%);

Wf: Trọng lượng mô tươi (mg) Wd: Trọng lượng mô khô (mg)

2.3.3.3. Tái sinh cây

Mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô được cấy lên môi trường tái sinh

cây có thành phần MS cơ bản, bổ sung BAP 2mg/l.

Tỷ lệ sống sót sau 3 tuần được tính theo công thức:

Ssv: Số mô sống sót; NT: Tổng số mô xử lý.

Trong đó: Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%); Tỉ lệ tái sinh cây được đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy, theo công thức :

Trong đó: Rc: Khả năng tái sinh cây (%);

Nr: Số mô tái sinh cây; Nsv: Số mô sống sót.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

20

2.3.3.4. Tạo cây hoàn chỉnh

Cây tái sinh thu được sau đó chuyển lên môi trường ra rễ, có thành

phần MS cơ bản, bổ sung NAA 0,3mg/l. Mật độ cấy 6 chồi/bình, theo dõi khả

năng tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy.

2.3.3.5. Ra cây và chế độ chăm sóc

Khi cây con trong bình nuôi cấy đạt 3-4 lá, rễ dài, dùng panh lấy cây ra

khỏi bình cấy, rửa lớp thạch agar bám quanh gốc và rễ bằng nước sạch. Cấy

cây vào lỗ của miếng xốp. Đặt các miếng xốp vào khay chứa dung dịch MS

pha loãng 10 lần, đặt khay ở nơi có ánh sáng khuyếch tán và ít gió. Sau 2 -3

ngày chuyển ra đất và tiếp tục tưới bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần.

2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu trên đồng ruộng

Ngoài đồng ruộng, các dòng lạc của mỗi giống và giống gốc được

trồng thành từng dảnh riêng. Chế độ chăm sóc các dòng và giống gốc là như

nhau. Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn phát

triển trong vụ xuân. Đánh giá đặc điểm nông học của các dòng qua các chỉ

tiêu: Chiều cao cây, số cành/cây, số quả/cây…Quả của mỗi dòng được đánh

dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng cho vụ tiếp theo.

Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần, sử dụng toán thống kê để xác định

trị số thống kê như trung bình mẫu ( ), phương sai ( 2), độ lệch chuẩn ( ),

và sai số trung bình mẫu ( ), hệ số biến động (Cv). Các số liệu được xử lý

trên máy vi tính theo tµi liÖu Nguyễn Hải Tuất vµ Ngô Kim Khôi (1996)

[40].

2.3.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử

2.3.5.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ lá lạc

- Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá lạc theo phương pháp

của Doyle J.J và J.L. Doyle [46].

- Xác định hàm lượng ADN trên máy quang phổ model 825-2A của hãng

Hewlett Packarrd.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

21

- Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%.

2.3.5.2. Phân tích tính đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD

Phản ứng RAPD được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên, các mồi có trình

tự dài 10 nucleotit, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi

ARA42 5’GGAAGCTTGG3’ DTN19 5’GGAAGCCAAC3’

CUM43 5’CAATCGCCGT3’ OPE10 5’GGGAAGGACA3’

DTN05 5’TCGGCGATAG3’ OPM46 5’CCAGACCCTG3’

DTN13 5’ACTGAACGCC3’ USP31 5’AACCGACGGG3’

DTN15 5’GGAGTGGACA3’ UPH04 5’GGAAGTCGCC3’

Mỗi phản ứng PCR có 25 l dung dịch chứa 10mM buffer PCR 1X;

2,5 mM MgCl2; 25 M mỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 200 nM mồi;

0,125 đơn vị Taq polymerase và 10 ng ADN khuôn. Phản ứng PCR-RAPD

thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt: Bước 1: 940C trong 3 phút; Bước 2: 920C trong 1 phút; Bước 3: 350C trong 1 phút; Bước 4: 720C trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì; Bước 5: 720C trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 40C. Điện di sản phẩm PCR trên

gel agarose 1,8%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.

2.2.5.3. Phân tích số liệu RAPD

Phân tích số liệu theo qui ước: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 =

phân đoạn ADN không xuất hiện, khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn

mồi ngẫu nhiên. So sánh hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp:

Jaccard và phân nhóm UPGMA. Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị tương

quan kiểu hình (r) cao nhất trong chương trình NTSYSpc 2.0. Hàm lượng

thông tin tính đa hình (Polymorphism information content = PIC) của mỗi

2. Trong đó Pij là tần số của allen thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình)

mồi xác định theo công thức: PICi = 1 - Pij

tới 1 (đa hình hoàn toàn).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

22

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hàm lƣợng protein và lipit của các giống lạc nghiên cứu

Để đánh giá chất lượng hạt của các giống lạc nghiên cứu, chúng tôi

tiến hành phân tích hàm lượng protein và lipit trong hạt tiềm sinh ở các giống

lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hàm lượng protein, lipit của các giống lạc nghiên cứu

(% khối lượng khô)

Giống Hàm lượng lipit Hàm lượng protein

45,72 0,02 30,86 0,03 L24

43,86 0,01 29,84 0,04 L23

49,65 0,01 31,22 0,01 L08

46,18 0,03 25,43 0,02 LTB

48,68 0,04 24,21 0,01 LCB

46,03 0,02 26,51 0,03 LBK

Bảng 3.1 cho thấy, hàm lượng protein trong hạt các giống lạc dao động

từ 24,21% đến 31,22%. Giống L08 có hàm lượng protein cao nhất (31,22%),

thấp nhất là LCB (24,21%).

Hàm lượng lipit của 6 giống lạc dao động từ 43,86% đến 49,65%.

Giống có hàm lượng lipit cao nhất là L08 (49,65%), tiếp đến là giống LCB

(48,68%). Giống có hàm lượng lipit thấp nhất L23 (43,86%).

Lipit là thành phần cấu tạo quan trọng của màng sinh học, nguồn

nguyên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể. Lipit trong lạc dễ tiêu hóa

không chứa cholesterol nên việc sử dụng chúng còn có tác dụng phòng và

chống một số bệnh xơ cứng động mạnh, bệnh chảy máu mũi. Do vậy, những

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

23

giống lạc có hàm lượng lipit cao có thể phát triển vùng trồng để làm nguyên

liệu sản xuất dầu lạc cung cấp cho đời sống con người.

3.2. KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG LẠC L24 L23, L08, LTB,

LCB, LBK

3.2.1. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK ở giai

đoạn hạt nảy mầm

3.2.1.1. Ảnh hƣởng của sorbitol 5% đến hoạt độ enzyme - amylase của

các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Khi hạt nảy mầm, enzyme - amylase được tổng hợp và hoạt động

mạnh, giúp quá trình phân giải tinh bột diễn ra mạnh mẽ để tổng hợp các chất

hữu cơ cho sự hình thành cây non, làm cho hàm lượng đường tăng lên kéo

theo sự gia tăng áp suất thẩm thấu, dẫn đến tăng khả năng chống lại sự mất

nước của lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong

quá trình nảy mầm của hạt, đồng thời thúc đẩy quá trình sinh trưởng, phát

triển của mầm, đảm bảo cho cây non có thể sinh trưởng bình thường trong

điều kiện thiếu nước. Do đó việc khảo sát đặc điểm phản ứng của các giống

lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm là một trong những cơ sở để đánh giá tính chịu

hạn của cây lạc. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đánh giá

tính chịu hạn của các giống lạc thông qua sự thay đổi hoạt độ - amylase và

sự biến động hàm lượng đường tan trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn

nảy mầm.

Kết quả phân tích sự biến động hoạt độ của

- amylase ở giai đoạn hạt

nảy mầm khi xử lý dung dịch sorbitol 5% được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.1.

Kết quả cho thấy, hoạt độ của

- amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm

sau khi bị xử lý bởi sorbitol 5% biểu hiện khác nhau giữa các giống lạc và giữa

các ngày tuổi. Xu hướng chung của sự biến động này là hoạt độ của - amylase

tăng từ giai đoạn 1 ngày tuổi và cao nhất ở 7 ngày tuổi sau đó giảm dần ở 9 ngày

-amylase cao nhất so với các giống

tuổi. Trong đó, giống L24 có hoạt độ của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

24

còn lại. Ở các giai đoạn 1, 3, 5, 7, 9 ngày tuổi giống L24 có hoạt độ enzyme

tương ứng là 0,45 ĐVHĐ/mg, 1,02 ĐVHĐ/mg, 2,13 ĐVHĐ/mg, 2,64

ĐVHĐ/mg, 1,82 ĐVHĐ/mg. Ở 7 ngày tuổi, giống L24 có hoạt độ enzyme

amylase tăng 5,87 lần so với giai đoạn 1 ngày tuổi, tiếp đến là giống LCB (5,48

lần), và thấp nhất là giống L08 (tăng 4,53 lần) so với 1 ngày tuổi.

Bảng 3.2. Hoạt độ của - amylase trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử

lý bởi sorbitol 5%

7 ngày

3 ngày

1 ngày

9 ngày

ĐC

L24

0,41 0,04

0,79 0,11

1,62 0,04

1,78 0,04

1,52 0,06

TN

0,45 0,04 109,75

1,02 0,24 129,11

2,13 0,04 131,48

2,64 0,05 148,31

1,82 0,09 119,73

% so ĐC ĐC

L23

0,38

0,01

0,71 0,04

1,42 0,02

1,62 0,02

1,58 0,05

TN

2,21 0,03 1,76 0,11

0,41 0,03 107,89

0,93 0,16 130,99

1,88 0,03 132,39

136,42

111,39

% so ĐC ĐC

0,32 0,01

0,41 0,09

1,02 0,04

1,35 0,19

0,73 0,03

L08

TN

0,39 0,07 121,87

0,52 0,02 126,83

1,31 0,04 128,43

1,77 0,07 131,11

0,94 0,07 128,77

% so ĐC ĐC

LT B

0,32 0,01

0,48 0,22

1,15 0,04

1,36 0,02

1,09 0,09

TN

0,39 0,07 121,89

0,59 0,03 122,92

1,47 0,04 127,83

1,79 0,03 131,62

1,38 0,06 126,61

% so ĐC ĐC

LCB

0,39 0,05

0,46 0,04

1,56 0,03

1,76 0,03

1,41 0,10

TN

0,44 0,12 112,82

0,58 0,16 126,08

2,06 0,03 132,05

2,41 0,03 136,93

1,67 0,13 118,43

% so ĐC ĐC

LBK

0,33 0,12

0,52 0,12

1,31 0,04

1,42 0,03

1,30 0,08

TN

% so ĐC

0,41 0,13 124,24

0,63 0,04 121,15

1,65 0,05 125,95

1,87 0,04 131,69

1,65 0,12 126,92

Giống Hoạt độ của - amylase (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) 5 ngày

Kết quả phân tích ở bảng 3.2 đã chứng tỏ, sorbitol 5% ảnh hưởng đến

hoạt độ của

- amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm của các giống lạc. Bùi Thị

Thu Thủy (2005), phân tích hoạt độ của - amylase ở giai đoạn hạt nảy mầm của

một số giống lúa đã nhận thấy, những giống có khả năng chịu hạn đều có hoạt độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

25

- amylase cao hơn các giống có khả năng chịu hạn kém [35]. Kết quả này cũng

phù hợp với những nghiên cứu công bố trên đối tượng lúa cạn, lạc [17], [27].

4 1 2 3

ở giai đoạn hạt

Hình 3.1. Định tính hoạt độ - amylase của giống L24 và LTB

A - LTB ĐC

B - L24 ĐC

C - LTB TN

D - L24 TN

nảy mầm 1, 3, 5, 7 ngày

3.2.1.2. Ảnh hƣởng của sorbitol 5% đến sự biến động hàm lƣợng đƣờng

tan của các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Đường tan trong tế bào có vai trò trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong dịch bào khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Vì vậy, khảo sát

hàm lượng đường tan ở giai đoạn hạt nảy mầm để tìm mối liên quan với khả năng chịu hạn của lạc là rất cần thiết. Kết quả xác định hàm lượng đường tan trong giai đoạn hạt nảy mầm được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.2.

Kết quả bảng 3.3 cho thấy, ở cả mẫu thí nghiệm và đối chứng hàm lượng đường tan đều tăng ở giai đoạn hạt nẩy mầm 1 ngày tuổi và tăng cao nhất ở giai đoạn 7 ngày tuổi, bắt đầu giảm ở giai đoạn 9 ngày tuổi. Sự biến

động hàm lượng đường tan ở các giống lạc có sự khác nhau. Hàm lượng đường ở các mẫu xử lý hạn luôn cao hơn so với đối chứng từ 3,72% - 32,94%. Ở giai đoạn 7 ngày tuổi, giống L24 hàm lượng đường tan cao nhất (7,99%) tăng 1,75 lần so với 3 ngày tuổi và tăng 32,94% so với đối chứng ở giai đoạn 7 ngày tuổi. Giống L08 có hàm lượng đường tan thấp nhất (đạt 5,29% tăng 28,40% so với đối chứng).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) phân tích sự biến động hàm lượng đường ở 9 giống đậu xanh cho thấy, giống HB1 là giống chịu hạn nên có hàm lượng đường tan cao nhất trong các giống nghiên cứu [32]. Kết quả nghiên

26

cứu của chúng tôi về hàm lượng đường tan trong giai đoạn nảy mầm của các

giống lạc có xử lý bởi sorbitol 5%, phù hợp với những nhận định trước đây về tăng áp suất thẩm thấu của tế bào thông qua các phân tử đường tan làm tăng khả năng chịu hạn [20], [35].

B¶ng 3.3. Hàm lượng đường tan của các giống nghiên cứu

Giống

L24

L23

L08

LT B

LCB

LBK

ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC

1 ngày 2,95 0,29 3,29 0,08 111,53 2,53 0,02 2,63 0,24 103,95 2,15 0,24 2,45 0,09 113,95 2,16 0,11 2,48 0,06 114,81 2,60 0,14 2,75 0,16 105,76 2,33 0,30 2,49 0,21 106,87

Hàm lượng đường tan (%) 5 ngày 5,79 0,13 7,61 0,06 131,43 5,52 0,12 6,26 0,32 113,41 3,68 0,26 4,54 0,32 123,37 4,01 0,26 4,82 0,10 120,20 5,41 0,25 6,34 0,14 117,19 4,71 0,16 5,16 0,37 109,55

7 ngày 6,01 0,25 7,99 0,11 132,94 5,63 0,29 6,54 0,23 116,16 4,12 0,09 5,29 0,02 128,40 4,18 0,06 5,31 0,15 127,03 5,46 0,28 6,68 0,09 122,34 4,25 0,23 5,43 0,17 127,76

9 ngày 4,12 0,05 4,54 0,21 110,19 3,96 0,28 4,36 0,31 110,10 3,13 0,26 3,49 0,23 111,50 3,34 0,26 3,50 0,16 104,79 4,02 0,25 4,35 0,33 108,20 3,49 0,12 3,62 0,13 103,72

ở giai đoạn nảy mầm

3 ngày 3,98 0,32 4,56 0,17 114,57 4,01 0,15 4,24 0,21 105,73 3,12 0,17 3,68 0,32 117,62 3,41 0,36 4,08 0,06 119,65 3,76 0,26 4,25 0,39 113,03 3,83 0,11 4,18 0,34 109,14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

27

H×nh 3.2. Biến động hàm lượng đường tan của các giống lạc

ở giai đoạn nảy mầm

3.2.1.3. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ enzyme - amylase và hàm lƣợng

đƣờng tan của các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Chúng tôi tiếp tục khảo sát mối tương quan giữa hoạt độ của -

amylase và hàm lượng đường tan, kết quả phân tích thể hiện ở bảng 3.4.

B¶ng 3.4. Tương quan giữa hoạt độ của - amylase và hàm lượng đường

ở giai đoạn hạt nảy mầm

Phương trình hồi quy Hệ số tương quan (R)

Y = 1,88X+1,65 Y = 1,84X+1,86 Y= 1,65X+1,95 Y= 1,09X+ 2,50 Y = 1,42X+2,64 Y= 1,12X+2,50 0,96 0,89 0,92 0,83 0,90 0,87 Giống L24 L23 L08 LTB LCB LBK

Kết quả bảng 3.4 cho thấy, hệ số tương quan (R) của các giống trong

khoảng 0,83≤ R≤ 0,96. Điều này chứng tỏ hàm lượng đường tan và hoạt độ

của - amylase có tương quan chặt chẽ và liên quan đến khả năng nảy mầm

của hạt.

Nghiên cứu đã cho thấy, hàm lượng đường tan phụ thuộc tuyến tính

vào hoạt độ của - amylase. Hoạt độ của enzyme - amylase càng cao thì

hàm lượng đường tan được hình thành do quá trình phân giải tinh bột càng

lớn, cung cấp cho quá trình này mầm của hạt, sự sinh trưởng của mầm cũng

như điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào trong điều kiện cực đoan. Có thể

xếp theo thứ tự giảm dần hoạt độ enzyme

- amylase và hàm lượng đường

tan giữa các giống như sau: L24> LCB> L23 > LBK> LTB> L08.

3.2.1.4. Ảnh hƣởng của sorbitol 5% đến hoạt độ của protease của các

giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

28

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sorbitol 5% đến hoạt độ của

protease ở giai đoạn hạt nảy mầm được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.3.

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hoạt độ của protease của các giống biểu

hiện rất khác nhau, dao động từ 0,33 ĐVHĐ/mg đến 0,85 ĐVHĐ/mg. Các

giống lạc nghiên cứu đều có hoạt độ protease thấp nhất ở giai đoạn 1 ngày

tuổi và cao nhất ở giai đoạn 7 ngày tuổi. Trong 6 giống nghiên cứu, giống L24

có hoạt độ của protease cao nhất đạt 0,85 ĐVHĐ/mg, thấp nhất là giống L08

0,61 ĐVHĐ/mg, cùng ở giai đoạn 7 ngày tuổi. Tương tự như sự biến đổi hoạt

độ của amylase, hoạt độ của protease ở mẫu thí nghiệm (xử lý sorbitol 5%)

luôn cao hơn đối chứng (không xử lý sorbitol 5%) từ 5,66% - 39,22%.

Bảng 3.5. Hoạt độ của protease trong các giai đoạn hạt nảy mầm

khi xử lý sorbitol 5%

L24

L23

L08

LT B

LCB

LBK

ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC ĐC TN % so ĐC

Giống

Hoạt độ enzyme protease (ĐVHĐ/ mg hạt nảy mầm) 5 ngày 0,61 0,01 0,80 0,02 131,14 0,57 0,05 0,70 0,05 122,80 0,46 0,10 0,55 0,09 119,57 0,45 0,01 0,59 0,06 131,11 0,59 0,07 0,74 0,02 125,42 0,51 0,03 0,66 0,09 129,41 7 ngày 0,68 0,06 0,85 0,12 125,00 0,62 0,07 0,81 0,09 130,65 0,47 0,10 0,61 0,12 129,79 0,51 0,12 0,71 0,04 139,22 0,65 0,12 0,83 0,05 127,69 0,59 0,10 0,77 0,04 130,51 3 ngày 0,56 0,01 0,64 0,20 114,28 0,53 0,04 0,56 0,04 105,66 0,41 0,27 0,47 0,05 114,63 0,38 0,11 0,46 0,02 121,05 0,55 0,02 0,59 0,08 107,27 0,41 0,06 0,48 0,08 117,07 9 ngày 0,65 0,09 0,80 0,06 123,08 0,61 0,05 0,72 0,07 118,03 0,43 0,05 0,52 0,01 120,93 0,46 0,09 0,62 0,03 134,78 0,62 0,07 0,78 0,09 125,80 0,48 0,03 0,67 0,12 125,00 1 ngày 0,45 0,01 0,54 0,06 120,00 0,41 0,07 0,50 0,03 121,95 0,29 0,06 0,33 0,06 113,79 0,33 0,03 0,39 0,06 118,18 0,42 0,09 0,48 0,06 106,67 0,36 0,05 0,42 0,06 116,67

Enzyme protease trong hạt có thể được tổng hợp từ trước ở dạng tiền

chất và tồn tại song song với protein dự trữ, nhưng cũng có một số được tổng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

29

hợp trong qua trình nảy mầm của hạt. Nhiều nghiên cứu đã cho rằng tăng

ASTT của tế bào thông qua các phân tử chất tan làm tăng khả năng chống

chịu của cây trồng, các chất hòa tan sẽ dần được tích lũy trong tế bào chất

nhằm chống lại sự mất nước và tăng khả năng giữ nước của chất nguyên sinh

[18]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với những nhận định của các

tác giả trước đây khi nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ

của protease trên các đối tượng lúa, lạc, đậu tương [17], [19].

1 4 2 3

H×nh 3.3. Định tính hoạt độ protease của giống L24 và LTB ở giai đoạn nảy mầm

A - L24 ĐC ; B - LTB ĐC ; C - LTB TN ; D - L24 TN

3.2.1.5. Ảnh hƣởng của sorbitol 5% đến hàm lƣợng protein của các giống

lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Kết quả phân tích ảnh hưởng của sorbitol 5% đến hàm lượng protein ở

giai đoạn hạt nảy mầm được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.4.

Hàm lượng protein trong hạt nảy mầm của các giống lạc tăng mạnh từ

giai đoạn 3 ngày tuổi và đạt cao nhất ở giai đoạn 7 ngày tuổi, đến 9 ngày tuổi

hàm lượng protein bắt đầu giảm. Ở tất cả các giống nghiên cứu, mẫu thí

nghiệm luôn cao hơn mẫu đối chứng. Cụ thể, hàm lượng protein của giống

L24 ở giai đoạn 1 ngày tuổi chỉ đạt 16,51%, đến giai đoạn 5 ngày tuổi đạt

22,34%, tiếp tục tăng đến giai đoạn 7 ngày tuổi đạt 28,79% và giảm xuống

chỉ còn 26,33% ở giai đoạn 9 ngày tuổi. Trong đó, giống L24 có hàm lượng

protein cao nhất đạt 28,79% (tăng 43,31% so với ĐC), thấp nhất là giống L08

đạt 22,61% (tăng 39,48% so với ĐC) cùng ở giai đoạn 7 ngày tuổi. Điều này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

30

cũng phù hợp với kết quả mà chúng tôi thu được về sự biến động hoạt độ

enzyme protease.

B¶ng 3.6. Hàm lượng protein tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm

Hàm lƣợng protein tan (%)

Giống

1 ngày

3 ngày

5 ngày

7 ngày

9 ngày

ĐC

13,28 0,26

14,04 0,16

16,08 0,19

20,09 0,17

19,07 0,42

TN

L24

16,51 0,23

18,04 0,12

22,34 0,15

28,79 0,25

26,33 0,47

% so ĐC

124,32

128,49

138,93

143,31

138,07

ĐC

12,34 0,12

13,37 0,46

15,82 0,25

19,62 0,11

18,71 0,16

TN

L23

15,28 0,06

17,42 0,33

21,23 0,11

27,07 0,19

25,34 0,18

% so ĐC

123,82

130,29

134,19

137,97

135,44

DC

11,25 0,09

11,48 0,09

13,42 0,15

16,21 0,24

15,53 0,23

L08

TN

13,28 0,35

15,21 0,25

18,25 0,18

22,61 0,17

21,07 0,12

% so ĐC

122,67

132,49

135,89

139,48

135,67

ĐC

10,40 0,04

12,62 0,29

14,22 0,31

18,05 0,10

18,60 0,17

LT B

TN

13,20 0,15

16,80 0,36

19,01 0,40

24,95 0,04

22,80 0,49

% so ĐC

126,92

133,12

133,68

138,22

122,58

ĐC

12,60 0,15

14,01 0,21

16,20 0,31

19,52 0,28

18,90 0,28

LCB

TN

15,66 0,28

17,96 0,48

21,47 0,02

27,30 0,16

25,65 0,13

% so ĐC

124,28

127,92

132,53

139,86

135,71

ĐC

11,28 0,18

13,14 0,25

15,12 0,37

19,50 0,37

19,20 0,25

LBK

TN

14,71 0,03

17,30 0,41

19,81 0,01

26,80 0,18

23,60 0,14

% so ĐC

130,41

131,65

131,02

137,40

122,91

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

31

Hình 3.4. Biến động hàm lượng protein của các giống lạc ở giai đoạn nảy mầm

Tuy vậy, khi xử lý hạn bằng dung dịch sorbitol 5% thì hàm lượng

protein tan cũng chỉ đạt đến giới hạn nhất định tùy thuộc vào khả năng chịu

hạn của giống.

3.2.1.6. Mối tƣơng quan giữa hoạt độ enzyme protease và hàm lƣợng

protein của các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn hạt nảy mầm

Phân tích mối tương quan giữa biến động hoạt độ enzyme protease với

sự thay đổi hàm lượng protein trong hạt ở giai đoạn hạt nảy mầm cho thấy

hàm lượng protein phụ thuộc tuyến tính vào hoạt độ enzyme protease. Hệ số

tương quan giữa hàm lượng protein và hoạt độ enzyme protease, phương

trình hồi quy của sự phụ thuộc đó được trình bày ở bảng 3.7

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, hàm lượng protein phụ thuộc chặt chẽ vào

hoạt độ của protease với hệ số tương quan dao động từ 0,81 đến 0,99. Hoạt độ

của protease càng cao thì quá trình phân giải protein dự trữ càng lớn, cung cấp

nguyên liệu cho quá trình nảy mầm của hạt cũng như điều chỉnh áp suất thẩm

thấu của tế bào trong điều kiện cực đoan. Có thể xếp theo thứ tự giảm dần hoạt

độ enzyme protease và hàm lượng protein tan giữa các giống như sau: L24>

LCB> L23 > LBK> LTB> L08.

Bảng 3.7. Tương quan giữa hoạt độ của protease và hàm lượng protein

ở giai đoạn hạt nảy mầm

Giống

Phương trình hồi quy Hệ số tương quan (R)

Y = 30,93X- 4,18

0,99

L24

Y = 37,40X- 3,79 0,92 L23

Y= 19,90X+ 6,90

0,97

L08

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

32

Y=24,00X+ 5,63 0,92 LTB

Y = 24,50X+ 5,04 0,81 LCB

Y= 25,50X+ 4,52 0,93 LBK

3.2.1.7. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống lạc trong điều kiện

hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm

(1) Ảnh hưởng của dung dịch sorbitol 5% đến các chỉ tiêu nghiên cứu của các

giống lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm có sự khác biệt và phụ thuộc vào khả năng

chịu hạn của từng giống. Trong đó, ở tất cả các chỉ tiêu theo dõi giống L24

đều đạt mức cao nhất và thấp nhất là giống L08. Các mẫu thí nghiệm luôn cao

hơn so với đối chứng.

(2) Hàm lượng đường tan và hoạt độ enzyme - amylase, hàm lượng protein

tan và hoạt độ enzyme protease có mối tương quan thuận chặt chẽ.

3.2.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24 L23, L08, LTB, LCB, LBK ở

giai đoạn cây non 3 lá bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo

3.2.2.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc ở giai đoạn cây non 3 lá

Nghiên cứu khối lượng rễ, thân, lá ở giai đoạn cây còn non là cơ sở để

đánh giá khả năng chống chịu của cây. Kết quả nghiên cứu về khối lượng

tươi của rễ, của thân lá, khối lượng khô của rễ, của thân lá được trình bày

trong bảng 3.8 và 3.9.

Khối lượng rễ tươi (g)

Khối lượng rễ khô (g)

Giống

TGXL (ngày)

ĐC

ĐC

Xử lý hạn

Xử lý hạn

% so ĐC

L24

L23

L08

LTB

3 5 7 3 5 7 3 5 7 3 5

% so ĐC 0,58±0,02 0,52±0,04 89,66 0,106±0,001 0,078±0,003 70,00 0,61±0,01 0,25±0,03 40,98 0,113±0,003 0,054±0,001 45,45 0,68±0,01 0,12±0,02 17,65 0,132±0,002 0,035±0,001 23,08 0,56±0,03 0,45±0,02 80,36 0,091±0,002 0,061±0,002 66,67 0,58±0,03 0,23±0,03 39,66 0,103±0,001 0,053±0,001 50,00 0,65±0,04 0,10±0,01 15,38 0,118±0,003 0,026±0,001 27,27 0,45±0,02 0,39±0,02 86,67 0,063±0,001 0,051±0,001 71,43 0,56±0,01 0,15±0,01 26,79 0,091±0,002 0,030±0,001 33,33 0,61±0,01 0,06±0,01 9,83 0,102±0,001 0,021±0,001 20,00 0,44±0,03 0,39±0,03 88,64 0,074±0,001 0,061±0,002 85,71 0,57±0,02 0,17±0,03 29,83 0,082±0,001 0,043±0,001 50,00

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.8. Khối lượng tươi, khô của rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn

LCB

LBK

7 3 5 7 3 5 7

0,63±0,01 0,08±0,01 12,70 0,100±0,012 0,022±0,001 30,00 0,58±0,01 0,50±0,02 86,20 0,097±0,002 0,072±0,004 77,77 0,65±0,02 0,27±0,01 41,54 0,108±0,004 0,063±0,001 60,00 0,71±0,01 0,12±0,01 16,90 0,131±0,001 0,030±0,013 23,07 0,50±0,02 0,40±0,02 80,00 0,072±0,001 0,060±0,002 85,71 0,55±0,03 0,20±0,04 36,36 0,091±0,006 0,051±0,014 55,55 0,61±0,01 0,10±0,07 16,39 0,112±0,004 0,020±0,006 27,27

Kết quả cho thấy, các giống lạc đều có sự khác nhau về các chỉ tiêu

nghiên cứu. Trong đó giống L24 có các chỉ tiêu đạt giá trị cao nhất. Ở giai đoạn

hạn 5 ngày trọng lượng rễ tươi giống L24 gấp 1,67 lần so với giống L08. Giống

L24 và giống LCB có khối lượng khô của rễ lớn nhất đạt 0,03g ở giai đoạn 7 ngày

hạn. Các giống L08, L23, LTB, LBK đều đạt 0,02 g.

Qua các giai đoạn xử lý bởi hạn, ở tất cả các giống đều quan sát thấy trọng

lượng rễ tươi và thân lá tươi, trọng lượng rễ khô, thân lá khô giảm đi nhanh

chóng. Giống L24 ở thời điểm hạn 3 ngày có trọng lượng rễ tươi là 0,52g, sau hạn

7 ngày là 0,12g, trọng lượng thân lá tươi từ 4,46g (hạn 3 ngày) giảm xuống còn

2,46g (hạn 7 ngày). Trọng lượng rễ và thân lá tươi ở các giống nghiên cứu đều

giảm so với đối chứng, ở 7 ngày hạn trọng lượng thân lá tươi giảm từ (44,61% -

53,18%), trọng lượng rễ giảm từ (82,55%-90,17%) so với đối chứng. Khối lượng

của rễ và thân lá giảm đi nhanh chóng là do hiện tượng mất nước của cây qua các

giai đoạn xử lý bởi hạn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số

33

nghiên cứu trước đây trên lúa, lạc, ngô [23], [28], [29].

Khối lượng thân lá tươi (g)

Khối lượng thân lá khô (g)

Giống

TGXL (ngày)

ĐC

Xử lý hạn % so ĐC

ĐC

Xử lý hạn

L24

L23

L08

LT B

3 5 7 3 5 7 3 5 7 3 5 7

4,84±0,04 4,46±0,01 4,86±0,10 3,05±0,01 4,92±0,11 2,46±0,02 4,45±0,06 3,53±0,02 4,76±0,07 3,68±0,08 4,82±0,03 2,67±0,09 3,25±0,06 2,23±0,07 3,96±0,05 2,18±0,14 4,28±0,01 2,12±0,02 3,29±0,12 2,41±0,10 3,86±0,10 2,18±0,05 4,25±0,03 1,99±0,04

92,15 62,76 50,00 79,33 77,31 55,39 68,62 55,05 49,53 73,25 56,48 46,82

% so ĐC 0,65±0,01 0,46±0,02 95,91 0,78±0,02 0,32±0,03 41,03 0,82±0,03 0,31±0,01 40,80 0,58±0,01 0,38±0,02 65,52 0,62±0,02 0,30±0,02 48,39 0,78±0,03 0,28±0,05 35,90 0,48±0,03 0,32±0,01 66,67 0,60±0,02 0,26±0,03 43,33 0,64±0,01 0,23±0,01 35,94 0,50±0,01 0,33±0,02 66,00 0,58±0,02 0,28±0,03 48,28 0,64±0,02 0,24±0,01 37,50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.9. Khối lượng tươi, khô của thân lá cây non 3 lá sau khi xử lý hạn

LCB

LBK

3 5 7 3 5 7

4,53± 0,05 3,57±0,06 4,78±0,07 2,61±0,09 4,85±0,09 2,48±0,04 4,27±0,13 3,35±0,05 4,45±0,03 2,42±0,04 4,78±0,05 2,35±0,03

78,80 54,60 51,13 78,45 54,38 49,16

0,60±0,03 0,41±0,02 68,33 0,72±0,01 0,32±0,03 44,44 0,79±0,03 0,28±0,02 35,44 0,54±0,02 0,35±0,03 64,81 0,60±0,02 0,28±0,02 46,67 0,67±0,01 0,22±0,01 32,84

34

3.2.2.

L24, L23, L08, LTB, LCB,

LBK ở giai đoạn cây non

. Ở

ề khả năng số

L24, LCB, L23, LBK, LTB, L08. Kết

quả 3.10 và hình 3.5.

Theo dõi thí nghiệm cho thấy, ở 3 ngày sau khi bị xử lý hạn đã bắt đầu

ảnh hưởng tới cây lạc 3 lá nhưng mức độ thấ ắt đầ . Sau 5

và 7 ngày xử lý hạn, mức độ ảnh hưởng đã tăng lên rõ rệt. Đặc biệt, sau 7

ngày hạn tất cả các giống lạc nghiên cứu đều bị héo lá, số lượng cây bị chết

cũng tăng cao. Cao nhất là giống L24 có tỷ lệ cây sống (đạt 45,23% ) và khả năng giữ nước (đạt 46,07%) và giống L08 có tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước thấp nhất tương ứng là 35,65% và 44,58%. Điều này chứng tỏ mức độ

ảnh hưởng của hạn đến các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn cây non 3 lá có

sự khác nhau.

Từ kết quả thu được ở bảng 3.10, chúng tôi tính toán khả năng chịu

hạn tương đối của các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn cây 3 lá. Những

giống có chỉ số chịu hạn tương đối càng lớn thì có khả năng chịu hạn càng

cao và ngược lại. Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, giống L24 có chỉ số chịu hạn cao nhất (10540,90) tiếp đến là LCB (9806,62) và thấp nhất là giống L08 (7275,19). Chỉ số chịu hạn tương đối được xác định bằng diện tích đồ thị

hình rada, đó chính là tổng diện tích các tam giác hợp thành hình đa giác 6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

35

cạnh liên quan đến 6 tính trạng nghiên cứu của mỗi giống lạc. Hình 3.5 cho

thấy, giống L24 có diện tích đồ thị hình rada lớn nhất do vậy có khả năng chịu

hạn tốt nhất, giống L08 có diện tích đồ thị hình rada nhỏ nhất nên có khả năng chịu hạn kém nhất.

Bảng 3.10. Tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối

của 6 giống lạc

Tỷ lệ cây sống ( %)

Giống

3 ngày 5 ngày 7 ngày 3 ngày 5 ngày 60,33 45,23 80,56 55,06 40,29 78,92 51,55 35,65 67,89 53,05 37,50 70,00 53,04 42,50 80,00 52,40 37,50 72,50

Khả năng giữ nƣớc (%) Chỉ số chịu hạn 7 ngày 46,07 50,64 44,58 42,41 46,76 45,45

tƣơng đối (S) 10540,90 9531,55 7275,19 7884,88 9806,62 8462,37

60,26 55,67 45,28 50,00 62,50 52,50

91,88 79,44 70,81 75,07 79,65 78,62

L24 L23 L08 LT B LCB LBK

Hình 3.5. Đồ thị hình rada thể hiện khả năng chịu hạn

của các giống lạc ở giai đoạn cây non

a. Tỷ lệ sống sau 3 ngày hạn; b. Khả năng giữ nước sau 3 ngày hạn; c. Tỷ lệ sống sau 5 ngày hạn; d. Khả năng giữ nước sau 5 ngày hạn; e. Tỷ lệ sống sau 7 ngày hạn; d. Khả năng giữ nước sau 7 ngày hạn. 3.2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn thông qua sự biến đổi hàm lƣợng

proline ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

ơ

36

, chúng tôi thu được kết quả

3.11, b 3.12 và hình 3.6, hình 3.7.

24

24 m

, đạ

08

h

ạ ạ ạt

0,85%). S

.

ng 3.11. Biến độ

điều kiện hạn nhân tạo

Giống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trước hạn 0,52±0,03 0,48±0,01 0,34±0,02 0,36±0,02 0,49±0,01 0,40±0,03 hạn 3 ngày 0,91±0,02 0,87±0,01 0,65±0,03 0,72±0,02 0,86±0,01 0,79±0,02 hạn 5 ngày 1,05±0,01 0,96±0,05 0,78±0,02 0,86±0,01 1,00±0,02 0,91±0,01 ) hạn 7 ngày 1,25±0,03 1,04±0,02 0,85±0,01 0,95±0,03 1,16±0,01 1,00±0,02 L24 L23 L08 LTB LCB LBK

37

Hình 3.6. ều kiện hạn nhân tạo

ừ

.

CB (0,55%), L23 (0,45%), LBK, (0,41%), LTB

L24

08

t 0,27%).

ng 3.12. Biến độ

trong điều kiện hạn nhân tạo

) Giống

Trước hạn 0,14±0,001 3 ngày 0,30±0,012 5 ngày 0,47±0,008 7 ngày 0,59±0,059

0,08±0,003 0,04±0,001 0,20±0,013 0,07±0,021 0,39±0,001 0,18±0,004 0,45±0,087 0,27±0,076

0,04±0,007 0,11±0,002

0,09±0,017 0,28±0,005

0,21±0,004 0,44±0,003

0,35±0,014 0,55±0,016

0,06±0,002

0,12±0,002

0,35±0,009

0,41±0,004

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

L24 L23 L08 LTB LCB LBK

38

Hình 3.7. ễ của các giống lạc nghiên cứu trong điều

kiện hạn nhân tạo

, sự

biến đổi e trong thân, lá cao hơn sự biến đổi hàm lượng

proline trong rễ. ứu về sự biến động hàm lượng proline trong

các bộ phận thân lá và rễ trong điều kiện hạn nhân tạ ới nhận định

của một số tác giả về khả năng proline hòa tan mạnh trong nước và được tích

lũy nhiều ở lá cây trên nhiề

[14]. Sự gia tăng hàm lượng proline của các giống lạc sau khi gây hạn đã chứng

tỏ cây lạc có một phản ứng tích cực trước sự thay đổi của điều kiện môi trường.

Một số kết quả nghiên cứu tiến hành trên các đối tượng khác cũng cho thấy,

hàm lượng proline trong lá, rễ cây sống trong điều kiện khô hạn tăng lên gấp

nhiều lần so với cây sống trong điều kiện bình thường [6], [45], [49].

3.2.2.4. Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng proline và chỉ số chịu hạn

Phân tích mối tương quan giữa khả năng chịu hạn và hàm lượ

ễ của cây lạc 3 lá ở giai đoạn trước khi gây hạn và

sau khi gây hạn cho thấy, khả năng chịu hạn của mỗi giống lạc phụ thuộc

tuyến tính vào hàm lượng proline. Hệ số tương quan giữa chỉ số chịu hạn

tương đối với hàm lượng proline và phương trình của sự phụ thuộc đó được

trình bày ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Tương quan giữa hàm lượng proline và chỉ số chịu hạn

Giai đoạn Phương trình hồi quy Hệ số tương quan (R)

Trước hạn Y=20542,99X+4460,87 Hạn 3 ngày Y=11153,03X+6274,93

0,99 0,97

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

39

Hạn 5 ngày Y=9643,25X+3812,84 0,95

Hạn 7 ngày Y=8551,18X+4582,75 0,94

Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, khả năng chịu hạn có mối tương quan

thuận với hàm lượng proline, với hệ số tương quan khá chặt chẽ là R=0,99

(trước hạn), và R=0,95 (hạn 5 ngày), R=0,94 (hạn 7 ngày). Kết quả này phù

hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khi nghiên cứu trên đậu xanh

[14] và các giống lạc khác [28]. Có thể xem proline như là một chất chỉ thị về

khả năng chịu hạn của thực vật, hay sự tích lũy proline là biểu hiện của phản

ứng thích nghi của thực vật với điều kiện cung cấp nước khó khăn.

3.2.2.5. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống lạc nghiên cứu ở

giai đoạn cây non

(1) Gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây non 3 lá cho thấy, ở các giống nghiên

cứu đều có sự gia tăng hàm lượng proline ở cả thân, lá và rễ qua các thời gian

gây hạn. Hàm lượng proline ở thân lá lớn hơn so với hàm lượng proline ở rễ.

Giống L24 có hàm lượng proline cao nhất, giống L08 có hàm lượng proline

thấp nhất.

(2) Các giống lạc có phản ứng khác nhau đối với hạn. Giống L24 có tỷ lệ cây

sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối là cao nhất, thấp nhất

là giống L08.

3.2.3. Khả năng chịu hạn của các giống lạc ở giai đoạn mô sẹo

Để phục vụ cho các nghiên cứu liên quan đến đánh giá khả năng chịu

hạn của các giống lạc ở giai đoạn mô sẹo, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm

thăm dò khả năng tạo mô sẹo của 6 giống lạc nghiên cứu. Kết quả cho thấy,

tất cả các giống đều có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây đáp ứng cho các

thí nghiệm liên quan đến nuôi cấy in vitro.

3.2.3.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo các giống lạc sau xử lý bằng thổi khô

Để đánh giá khả năng chịu hạn của mô sẹo phôi lạc, chúng tôi đã tiến

hành xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 6, 9 giờ xử lý thổi khô liên tục.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

40

Mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, được chuyển lên đĩa petri trải giấy lọc vô

trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của box cấy ở các ngưỡng thời gian

3h, 6h, 9h. Kết quả theo dõi độ mất nước của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.14.

Bảng 3.14 cho thấy độ mất nước của mô sẹo tăng theo thời gian xử lý

bằng thổi khô ở tất cả các giống. Trong 3 giờ thổi khô đầu tiên lượng nước

của mô sẹo giảm đi nhanh ở tất cả các giống (từ 33,90% đến 65,90%). Sau 6

giờ thổi khô lượng nước của mô tiếp tục giảm từ 68,80% đến 83,38%. Sau 9

giờ thổi khô độ mất nước giảm tối đa, giống có độ mất nước cao nhất là LTB

đạt 87,79% và thấp nhất là L24 đạt 72,00%.

Bảng 3.14. Độ mất nước của mô sẹo phôi lạc (%)

Giống

3h 33,90±0,03 64,40±0,02 65,90±0,01 56,90±0,06 45,61±0,01 47,74±0,06

Độ mất nƣớc (%) 6h 76,80±0,02 82,30±0,02 68,80±0,01 83,38±0,02 75,78±0,03 79,13±0,05

9h 72,00±0,01 84,20±0,05 76,70±0,02 87,79±0,09 84,43±0,04 86,08±0,03 L24 L23 L08 LTB LCB LBK

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.8. Độ mất nước của mô sẹo phôi lạc khi xử lý bằng thổi khô

41

Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng, độ mất nước của mô sẹo phôi các

giống lạc sau khi thổi khô thay đổi khác nhau tùy thuộc vào giống. Kết quả

nghiên cứu của chúng tôi thu được tương tự kết quả của tác giả Bùi Thị Thu

Thủy (2006) trên đối tượng lúa. Xử lý mô sẹo các giống lúa ở các ngưỡng

thời gian 2, 4, 6, 8h tác giả cho thấy, giống có khả năng chịu hạn có độ mất

nước của mô sẹo thấp sau các ngưỡng thổi khô, trong 6 giống nghiên cứu thì

giống TM là giống có khả năng chịu hạn nhất [36].

3.2.3.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo các giống lạc sau khi xử lý

mất nƣớc

Khả năng chịu mất nước của mô sẹo được đánh giá thông qua tỷ lệ

sống sót của mô sẹo trong thời gian phục hồi 3 tuần. Tỷ lệ sống sót của mô

sẹo sau khi xử lý thổi khô là một trong những chỉ tiêu đánh giá khả năng chịu

hạn của các giống lạc.

Theo dõi khả năng phục hồi của mô sẹo sau các ngưỡng xử lý thổi khô:

3h, 6h, 9h trên môi trường tái sinh chúng tôi thấy, sau 2 đến 3 ngày những

mô sống sót đã có khả năng hút nước và sinh trưởng bình thường, có màu

xanh. Sau 2- 3 tuần những mô sẹo sống sót sinh trưởng mạnh. Những mô

chết có màu đen hoặc nâu.

Bảng 3.15. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau xử lý mất nước (%)

Giống

Thời

gian

L24

L23

L08

LT B

LCB

LBK

100±0,00

100±0,00

100±0,00

100±0,00

100±0,00

100±0,00

0h

100±0,00

96,51±0,06 91,01±0,04 93,33±0,05

100±0,00

95,83±0,02

3h

91,24±0,12 87,50±0,21 80,03±0,09 82,14±0,06 97,43±0,02 83,33±0,11

6h

85,06±0,18 80,40±0,09 45,04±0,11 51,67±0,10 79,48±0,08 72,22±0,13

9h

Qua bảng 3.15 thấy rằng, tỷ lệ sống sót của mô sẹo tỷ lệ nghịch với

thời gian xử lý thổi khô. Thời gian xử lý càng dài, tỷ lệ sống sót của mô sẹo

càng giảm. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo giống L24 là lớn nhất ở hầu hết các

ngưỡng xử lý (0 giờ là 100%, 3 giờ là 100%, 6 giờ là 91,01%, 9 giờ là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

42

85,06%). Tiếp đến là giống L23, tỷ lệ sống sót của mô sẹo qua các ngưỡng xử

lý 0h, 3h, 6h, 9h tương ứng là 100%; 96,51%; 87,50%; 80,40%. Thấp nhất là

giống LTB và giống L08 ở ngưỡng 9h tỷ lệ sống sót của mô sẹo chỉ còn 51,67%

và 45,04%. Còn hai giống LCB và LBK , tỷ lệ sống sót của mô sẹo ở tất cả các

ngưỡng xử lý không có sự sai khác nhau lớn. Như vậy mức độ chịu mất nước

của mô sẹo các giống khác nhau là khác nhau, những giống có khả năng chịu

mất nước trong điều kiện cực đoan thì có khả năng chịu hạn tốt.

Hình 3.9. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô

3.2.3.3. Khả năng tái sinh cây của mô sẹo sống sót sau xử lý mất nƣớc

Theo dõi khả năng tái sinh cây của mô sẹo sống sót sau thời gian 6

tuần nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.16.

Kết quả cho thấy, mô sẹo các giống sau xử lý ở các ngưỡng thời gian

khác nhau đều có khả năng tái sinh cao dao động từ 40,64% đến 100%. Một

số nghiên cứu chỉ ra rằng, khả năng tái sinh của cây phụ thuộc vào nguồn gốc

mô sẹo và mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng mầm nên dễ

tái sinh thành cây hơn [43].

Bảng 3.16. Khả năng tái sinh của mô sẹo sống sót sau xử lý thổi khô (%)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

43

Thời gian thổi khô (h)

Giống

0

3

6

9

90,92 0,03

100 0,00

95,80 0,02 84,12 0,06

89,14 0,04

91,18 0,06 73,56 0,01 71,42 0,12

77,01 0,03

85,00 0,01 50,51 0,01 40,64 0,06

80,00 0,09

88,33 0,05 71,67 0,15 51,69 0,21

100 0,00

100 0,00

90,00 0,03 81,68 0,07

91,67 0,05

93,33 0,04 84,21 0,05 70,00 0,11

L24 L23 L08 LTB LCB LBK

Thời gian xử lý càng cao thì tỷ lệ tái sinh càng giảm. Giống L24 có tỷ lệ

tái sinh cao nhất, ở ngưỡng 3h tỷ lệ tái sinh đạt 100%, ở 9h thổi khô đạt

84,12%, còn giống L08 có tỷ lệ tái sinh thấp nhất ở 3h đạt 85,00%, nhưng đến

ngưỡng 9h khả năng tái sinh chỉ còn 40,64%. Như vậy, khả năng tái sinh

không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen mà còn chịu ảnh hưởng của thời gian xử lý

thổi khô mô sẹo.

Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy, mô của tất cả 6 giống lạc nghiên cứu qua

xử lý mất nước ở ngưỡng 3 giờ thổi khô, khi sống sót thường có khả năng tái

sinh cây cao hơn so với đối chứng (không bị xử lý) từ 1,01 đến 1,10 lần. Trong

đó giống lạc L24, LCB có khả năng tái sinh cao so với các giống còn lại. Theo Lê

Trần Bình và Cs (1995) nguyên nhân là do quá trình xử lý đã giết chết những tế

bào mẫn cảm, chọn ra những tế bào có sức sống và khả năng tái sinh cao [1].

3.2.3.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, L23, L08, LTB,

LCB, LBK ở mức độ mô sẹo

(1) Mô sẹo của 6 giống lạc đều bị mất nước nhanh khi thời gian xử lý thổi

khô kéo dài. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của

các giống nghiên cứu có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là giống L24, thấp nhất

là giống L08.

(2) Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh cây. Khả năng tái sinh

của mô sẹo sống sót sau khi xử lý ở ngưỡng 3 giờ cao hơn so với các ngưỡng

còn lại.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

44

(3) Khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo của các giống lạc có sự khác nhau,

thứ tự từ cao xuống thấp như sau: L24 > LCB > L23 > LBK > LTB > L08.

3.2.4. Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu dựa trên sự phản ứng ở giai

đoạn mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non

Dựa trên những phân tích về khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo, giai

đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non, bằng chương trình NTSYS pc2.02i

chúng tôi đã xác định được hệ số khác nhau giữa các cặp giống lạc và thiết lập

mối quan hệ giữa các giống dựa trên cơ sở của sự biểu hiện các tính trạng của

các giống lạc đối với hạn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.17 và hình 3.10

Bảng 3.17. Hệ số khác nhau về sự biểu hiện các tính trạng của các giống lạc

đối với hạn (%)

L08

LTB LCB

LBK 0,00 L24 0,00 1,58 8,97 6,43 9,56 3,46 L24 L23 L08 LTB LCB LBK

L23 0,00 4,35 0,00 2,84 1,46 0,00 9,32 5,79 3,58 0,00 1,57 3,09 1,07 1,25 Bảng 3.17cho thấy hệ số khác nhau giữa các giống lạc nghiên cứu dao

động từ 1,07 đến 9,56. Cặp giống có hệ số khác nhau cao nhất là L24 - LCB

(9,56), thấp nhất là LTB - LBK (1,07).

Từ sự phân tích hệ số khác nhau căn cứ vào sự biểu hiện của 72 tính

trạng sơ đồ hình 3.10 cho thấy, 6 giống lạc chia thành 2 nhóm chính. Nhóm

chính thứ nhất gồm 3 giống L24, L23, LCB , nhóm chính thứ hai gồm 3 giống

còn lại L08, LBK, LTB. Kết hợp các kết quả phân tích ở giai đoạn mô sẹo, giai

đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non với sự phân nhóm dựa trên hệ số khác

nhau về sự phản ứng của các giống lạc biểu hiện ở 72 tính trạng đã xác định

được giống L24 có khả năng chịu hạn cao nhất trong các giống nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

45

Hình 3.10. Sơ đồ mô tả quan hệ giữa các giống lạc dựa trên sự biểu hiện kiểu hình của 72 tính trạng 3.3. TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở

CÁC GIỐNG LẠC BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

3.3.1. Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu hạn bằng kỹ thuật thổi khô, tái

sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh

Sau khi đánh giá khả năng chịu hạn của các giống, chúng tôi đặt ra vấn

đề cần nghiên cứu chọn dòng chịu hạn của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK

là những giống có khả năng chịu hạn kém. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu

khả năng chịu hạn của các giống L23, L08, LTB, LCB, LBK ở mức độ mô sẹo,

chúng tôi đã xác định được ngưỡng chọn dòng tế bào chịu hạn đối với giống

L23, LCB, LBK là 9h thổi khô và giống L08, LTB là 6h thổi khô. Tuy nhiên để

khẳng định được chắc chắn đó là các ngưỡng xử lý có hiệu quả đối với các

giống cần phải tiếp tục theo dõi ở ngoài đồng ruộng, đánh giá các dòng cây

thu được ở các thế hệ R0, R1, R2 ...bằng các phương pháp sinh lý, sinh hóa và

các đặc điểm nông sinh học.

Từ việc xác định ngưỡng chọn dòng ở trên, chúng tôi đã tiến hành sàng

lọc hàng loạt dòng tế bào chịu hạn của 5 giống L23, L08, LTB, LCB, LBK bằng

kỹ thuật thổi khô luồng khí vô trùng của box cấy. Các khối mô sau thổi khô ở

các ngưỡng chọn dòng được chuyển lên môi trường tái sinh cây để tiếp tục

theo dõi khả năng sống sót và tái sinh cây. Kết quả thu được 159 dòng mô

chịu mất nước và tái sinh được 315 dòng cây xanh phục vụ cho cho các

nghiên cứu tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

46

3.3.2. Phân tích mức độ biến động di truyền một số đặc điểm nông học

quần thể R0

Cây tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước của 5 giống nghiên cứu là L23,

L08, LTB, LCB và LBK được chuyển vào môi trường tạo rễ, khi rễ dài từ 3cm -

4cm cấy chuyển trồng ngoài đồng ruộng trong vụ xuân 2008. Tiến hành chăm

sóc dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và đối chứng trong điều

kiện như nhau. Kết quả nghiên cứu ngoài đồng ruộng cho thấy, có sự sai khác

về các đặc điểm nông học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo

chịu mất nước so với giống gốc.

Sự sai khác về các đặc điểm như chiều cao cây, số cành/cây, số

quả/cây, thời gian sinh trưởng, kích thước quả, kích thước lá, số rễ và chiều

dài rễ...ở quần thể R0 của các giống lạc L23, L08, LTB, LCB và LBK có xu hướng

biến thiên gần như nhau. Vì vậy chúng tôi chọn kết quả của giống lạc LCB làm

đại diện để trình bày trong bảng 3.18

Bảng 3.18. Mức độ biến động di truyền quần thể R0 của giống lạc LCB

STT Chỉ tiêu theo dõi

Chiều cao cây (cm) Số cành/cây Số quả chắc/cây Chiều dài quả (mm)

LCB đối chứng ± mx 49,44±2,65 1 8,56±0,44 2 22,33±1,74 3 4 33,92±1,53 5 Chiều rộng quả (mm) 14,83±0,17 13,22±0,68 6 16,33±1,96 7 Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Cv (%) 3,37 5,58 6,68 7,83 2,06 5,48 3,60 Quần thể R0 ± mx 48,96±1,88 2,03±0,27 2,63±0,45 28,30±3,36 16,57±1,52 1,39±0,21 3,57±0,57 Cv (%) 22,11 76,38 80,12 20,59 15,86 56,51 85,20

Chiều cao cây

Chiều cao của cây lạc là kết quả của sự kết hợp giữa quá trình sinh

trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực [38]. Tính trạng chiều cao cây

chủ yếu do đặc tính di truyền quyết định. Trong 5 giống nghiên cứu, quần thể

R0 giống LTB và L08 có chiều cao cây giảm so với giống gốc, từ 8,32% -

17,49%. Còn 2 giống LCB, L23 chiều cao cây không có sự sai lệch so với đối

chứng, chiều cao cây của quần thể R0 có nguồn gốc từ giống LCB đạt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

47

48,96cm, đối chứng đạt 49,44cm. Riêng quần thể R0 có nguồn gốc từ mô sẹo

chịu mất nước giống LBK có chiều cao cây lớn hơn giống gốc, gấp 1,45 lần

(tăng 44,91% so với đối chứng).

Số cành/ cây

Số cành/cây liên quan trực tiếp đến số quả, thường các giống lạc chỉ có

hai cấp cành với tổng số từ 6 - 10 cành. Số cành/cây phụ thuộc khá lớn vào

điều kiện ngoại cảnh [12]. Kết quả theo dõi thí nghiệm cho thấy, ở cả 5 quần

thể R0 có nguồn gốc từ mô sẹo xử lý thổi khô đều có số cành/cây giảm,

giảm từ 55,53% - 78,13% so với giống gốc. Cụ thể giảm nhiều nhất là các

dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống L23 (giảm 78,13%),

tiếp đến là giống LCB (giảm 76,28%). Số cành/cây là một trong các chỉ

tiêu biến đổi mạnh nhất ở thế hệ R0 (Cv%=76,38% so với đối chứng

Cv%=5,58%). Số lượng cành/cây của thí nghiệm giảm, điều này chứng tỏ

rằng trong quá trình tạo mô sẹo, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh, các

dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước đã chịu các tác động cơ

học, ảnh hưởng tới các mầm nách ở các đốt trên thân, làm cho các đốt

ngắn lại hoặc trùm lên nhau, đặc biệt là các đốt thứ nhất và thứ hai, đây là

các đốt có vai trò quan trọng trong sự phân cành và tạo quả lạc [38].

Số quả/cây, kích thƣớc quả

Quần thể R0 của 5 giống nghiên cứu đều có số quả/cây giảm rất lớn

so với giống gốc, giảm >80%. Số quả chắc/cây có mối tương quan thuận

và chặt chẽ với năng suất, chỉ tiêu này phụ thuộc vào kiểu gen của từng

giống và sự tác động của điều kiện ngoại cảnh. Trong 7 chỉ tiêu theo dõi

thì số quả/cây của các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo được xử lý thổi khô

biến đổi mạnh nhất (Cv%=80,12%, ĐC Cv%=6,68). Số quả/cây của các

dòng thí nghiệm biến thiên từ 0-6 (quả), đối chứng biến thiên từ 20-28

(quả). Xuất hiện các biến dị về hình dạng quả như: eo thắt, mỏ quả,

đường vân trên vỏ quả...Các đặc điểm về mỏ quả, độ thắt, kích thước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

48

trọng lượng quả và số hạt là những chỉ tiêu để phân loại các giống lạc

[38].

Kích thước quả (chiều dài và chiều rộng quả) đều giảm so với đối

chứng, nhưng giảm không nhiều. Chiều dài giảm từ 4,57% - 26,79%,

chiều rộng giảm từ 7,56% - 33,52%. Các dòng lạc có nguồn từ mô sẹo

chịu mất nước của giống LCB có chiều dài quả giảm 16,56% so với giống

gốc, nhưng lại có chiều rộng quả tăng 11,73% so với đối chứng. Nhìn

chung ở cả 5 quần thể R0 kích thước quả không có sự biến động lớn so với

đối chứng (Cv% thí nghiệm dao động từ 5,15% - 21,20%, đối chứng dao

động từ (1,64%-7,51%).

Số lƣợng rễ và chiều dài rễ

Số lượng rễ và chiều dài rễ của các dòng lạc thí nghiệm đều giảm rất

nhiều so với giống gốc (số lượng rễ giảm 89,49%, chiều dài rễ giảm 78,14%).

Quan sát quần thể R0 của cả 5 giống nghiên cứu đều nhận thấy rằng, rễ được

tạo thành trong nuôi cấy in vitro khi cấy chuyển ra đồng ruộng đa số là bị

đứt, để hình thành rễ mới. Tuy nhiên, số lượng rễ mới được hình thành ở mỗi

dòng lại rất ít. Theo chúng tôi, kết quả thu được này là phù hợp vì rễ lạc phát

triển mạnh từ lúc cây bắt đầu mọc cho đến khi có 5 lá, sau đó giảm dần, đến

khi ra hoa và hình thành quả, hạt tốc độ phát triển của rễ giảm tối đa [38].

Những biến đổi về các đặc điểm nông học ở quần thể R0 đã chứng tỏ,

mô sẹo sống sót sau khi xử lý thổi khô ở các ngưỡng chọn dòng đều có sự biến

đổi lớn về các đặc tính sinh lý dẫn tới sự biến động về các tính trạng hình thái.

Đây là cơ sở cho công tác tạo nguồn vật liệu khởi đầu và chọn ra được các

dòng chịu hạn bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Sự sai khác về các đặc điểm

nông sinh học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

so với giống gốc mà chúng tôi thu được phù hợp với những nghiên cứu trước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

đây trên nhiều đối tượng như lúa, lạc, thuốc lá [31], [33], [40], [43]...

49

Qua phân tích và chọn lọc ở quần thể R0 của 5 giống nghiên cứu là L23,

L08, LTB, LCB và LBK chúng tôi có một số nhận xét sau:

- Mô chọn lọc từ giống lạc L08 thu được biến dị về thời gian sinh

trưởng (ra hoa muộn hơn 15 ngày so với các giống L23, L08, LTB, LCB ), chiều

cao cây thấp.

- Mô chọn lọc từ giống lạc LCB thu được biến dị về chiều rộng quả,

thời gian sinh trưởng (ra hoa sớm hơn).

- Mô chọn lọc từ giống lạc LTB thu được biến dị về kích thước quả

(chiều dài và chiều rộng quả đều lớn hơn so với đối chứng). Chiều dài đạt

29,08mm tăng 19,18%, chiều rộng đạt 12,9mm tăng 11,97% so với giống gốc.

- Mô chọn lọc từ giống lạc LBK thu được biến dị về chiều cao cây,

chiều cao cây tăng gấp 1,45 lần so với đối chứng.

+ Dòng 15(D15), dòng 32(D32) quả có eo thắt đặc biệt.

+ Dòng 4 (D4), dòng 12 (D12) quả có 3 hạt.

A

B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

50

C D

Hình 3.11. Một số hình ảnh về biến dị quả của các dòng chọn lọc từ giống LBK

A. Quả đối chứng B. Biến dị eo thắt quả

C. Biến dị quả 3 hạt D. Biến dị mỏ quả

A D

B

E

A: Giống gốc LCB

B: Các dòng thuộc quần thể R0 khi ra hoa

C: Quần thể R0 khi tạo quả

D: Quả lạc đối chứng

E: Quả lạc thuộc các dòng có nguồn gốc

C

từ mô sẹo mất nước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

51

Hình 3.12. Một số hình ảnh các dòng tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu

mất nước giống LCB ngoài đồng ruộng

3.3.3. Nhận xét về chọn dòng tế bào chịu mất nƣớc và đặc điểm nông học

quần thể R0

(1) Ngưỡng chọn lọc các dòng mô chịu hạn ở 5 giống lạc nghiên cứu

L23, LCB, LBK là 9h thổi khô và giống L08, LTB là 6h thổi khô.

(2) Đã tiến hành sàng lọc được 159 dòng mô có khả năng chịu hạn và

315 dòng cây xanh của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK phục vụ cho các

nghiên cứu tiếp theo.

(3) Quần thể R0 có mức độ biến động di truyền lớn về các đặc điểm

nông học (chiều cao cây, số cành/cây, số quả chắc/cây, kích thước quả, số

lượng và chiều dài rễ, thời gian sinh trưởng...). Đây là đặc điểm thuận lợi cho

việc chọn ra các cá thể đầu dòng theo yêu cầu tạo giống.

Tuy nhiên, để khẳng định được khả năng di truyền, tính chịu hạn của

các dòng và những biến dị có lợi xuất hiện ở quần thể R0 thì cần phải tiếp tục

theo dõi, đánh giá bằng các phương pháp sinh lý, hóa sinh ở các thế hệ tiếp

theo.

3.4. ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÒNG

LẠC CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC

Trong những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã và

đang được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong các nghiên cứu như:

Phân tích và đánh giá bộ genome của thực vật nhằm xác định những thay đổi

của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [10], [47] , sử dụng các chỉ thị phân

tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống,

đánh giá một cách hữu hiệu tính đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

vi một loài [33], [47]... Sự ra đời và phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử

52

hiện đại là những công cụ đắc lực ngày càng được áp dụng rộng rãi và hiệu

quả trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng.

Các dòng lạc tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước được trồng ở vụ xuân

2008, chúng tôi đã chọn được 5 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước

của giống lạc địa phương Cao Bằng (LCB). Đây là những dòng có một số đặc

điểm nông học sai khác so với giống gốc để phân tích đặc điểm genome bằng

kỹ thuật RAPD, làm cơ sở cho các nghiên cứu chọn lọc tiếp theo.

3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

Kết quả tách chiết ADN từ lá lạc của các dòng lạc có nguồn gốc từ mô

sẹo chịu mất nước được trình bày ở bảng 3.19.

Bảng 3.19 cho thấy tỷ lệ OD260/OD280 dao động từ 1,83-1,92 và

OD260/OD230 dao động từ 1,80-1,87. Khoảng biến động này đều nằm trong

giới hạn cho phép (1,8 - 2,0). Điều này khẳng rằng định các mẫu ADN tách

chiết được đều sạch.

Bảng 3.19. Độ sạch và hàm lượng ADN của các mẫu lạc nghiên cứu

Tên mẫu OD260 OD260/OD230 OD260/OD280

LCB D2 D18 D21 D67 D121 0,02640 0,02475 0,02578 0,02514 0,02637 0,02352 1,82 1,83 1,80 1,80 1,87 1,81 1,86 1,92 1,83 1,90 1,87 1,85 Hàm lƣợng ADN (ng/ l) 264,0 247,5 257,8 251,4 263,7 235,2

Ngoài phương pháp đo quang phổ hấp thụ, chúng tôi còn sử dụng

phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di trên cho thấy, các

mẫu ADN tách chiết từ lá lạc cho một băng duy nhất, sắc nét, có phân tử

lượng cao, ở gần giếng và không có sự đứt gãy của các phân tử ADN.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD

53

ADN tổng số của 5 dòng chọn lọc và giống gốc được phân tích với 10

mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (Polymorphism

information content), giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao,

tính khoảng cách di truyền thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây.

3.4.2.1. Số phân đoạn, tần số xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN

đƣợc nhân bản

Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose

1,8% để phân tích tính đa hình ADN của 6 mẫu cây nghiên cứu.

Bảng 3.20 cho thấy, số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi

cặp mồi dao động từ 29-62 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn ADN được

nhân bản trong khoảng từ 250-2000bp. Tổng số phân đoạn ADN nhân bản

được của 10 đoạn mồi RAPD khi phân tích 6 mẫu lạc là 404. Trong số 10 mồi

phân tích, số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lạc với mồi DTN15 là

nhiều nhất (62 phân đoạn ADN) và ít nhất là mồi DTN19 (29 phân đoạn).

Tổng số phân đoạn được nhân bản của các mẫu lạc dao động từ 61-71 phân

đoạn. Trong đó, hai dòng D21 và D67 cùng nhân được 71 phân đoạn ADN

Bảng 3.20. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lạc khi phân

tích với 10 mồi ngẫu nhiên

Mồi LCB D2 D18 D21 D67 D121

ARA42 CUM43 DTN05 DTN13 DTN15 DTN19 OPE10 OPM46 OSP31 UPH04

6 5 5 7 9 7 5 6 7 6

6 5 5 7 9 5 5 6 7 6

6 5 6 7 11 2 8 6 9 8

6 5 6 7 11 5 8 6 9 8

6 5 6 7 11 5 8 6 9 8

Tổng số phân đoạn 36 30 34 42 62 29 42 36 49 44

6 5 6 7 11 5 8 6 8 8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

54

61 68 71 71 70 404 Tổng số 63

Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân

đoạn khi so sánh giữa các dòng với nhau và với giống gốc trong cùng 1 mồi.

Kết quả ở bảng 3.21 cho biết, tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc

khi phân tích 10 mồi ngẫu nhiên là 74 phân đoạn. Trong đó số phân đoạn đa

hình là 16 (chiếm 21,62%) và không đa hình là 58 (78,38%). Trong số 10

mồi nghiên cứu có 4 mồi không cho tính đa hình. Mồi DTN19 cho tính đa

hình cao nhất (75%), 4 mồi ARA42, CUM 43, DTN13 và OPM46 không cho

tính đa hình (0%).

Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình

(giá trị PIC). Cụ thể: giá trị PIC của mồi ARA42, CUM 43, DTN13 và

OPM46 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi DTN19 là 0,55 (đa hình

cao nhất). Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn

ADN đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa

hình lớn hay nhỏ. Hầu hết các mồi đều cho tính đa hình không cao (PIC <

0,5). Mặc dù vậy, với 10 mồi ngẫu nhiên này cũng đã thể hiện được tính đa

hình của 6 mẫu nghiên cứu.

Bảng 3.21. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi

ngẫu nhiên

Mồi Số phân đoạn ADN Giá trị PIC

ARA42

6

Số phân đoạn đa hình 0 Số phân đoạn đơn hình 6 % phân đoạn đa hình 0,00

0,00

CUM43

5

0

0,00

5

0,00

DTN05

6

1

0,09

5

1,67

DTN13

7

0

0,00

7

0,00

DTN15

11

2

0,10

9

18,18

DTN19 8 6 0,55 2 75,00

OPE10 8 3 0,21 5 37,50

OPM46

6

0

0,00

6

0,00

USP31

9

2

0,15

7

22,22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

55

UPH04 8 2 6 25,00 0,14

74 16 58 21,62 1,24 Tổng số

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% của

4 mồi DTN15, DTN19, USP31 và UPH04 được thể hiện ở hình 3.13, hình 3.14.

Mồi DTN15: Trong phạm vi vùng phân tích thu được nhiều nhất 11

phân đoạn ADN với kích thước nằm trong khoảng 250-9000bp. Ở kích thước

khoảng 1500bp và 9000bp ở mẫu đối chứng (LCB) và dòng D2 đều không

xuất hiện phân đoạn ADN. Trong 6 mẫu lạc nghiên cứu thu được tổng số 62

phân đoạn ADN, dao động giữa các mẫu từ 9-11 phân đoạn.

Mồi DTN19: Mồi DTN19 cho tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc

thu được là 29. Kích thước các phân đoạn ADN thu được dao động trong

khoảng 250bp -1500bp. Trong đó, có tới 6 phân đoạn ADN được nhân bản

thể hiện tính đa hình. Điển hình ở kích thước khoảng 1200bp và 1500bp ở hai

mẫu D18 và D21 không xuất hiện phân đoạn ADN được nhân bản. Trong khi

đó, ở kích thước khoảng 300bp, hai mẫu LCB và D2 có phân đoạn ADN được

nhân lên trong khi đó các mẫu còn lại không xuất hiện.

M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Hình 3.13: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD

của 6 mẫu lạc với mồi DTN15 và DTN19

M-Marker 1kb; 1.LCB; 2. D2; 3. D18; 4. D21; 5. D67; 6. D121

(←: xuất hiện; →: không xuất hiện)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

56

Mồi USP31: Trên phạm vi vùng phân tích thu được 49 phân đoạn

ADN với kích thước dao động trong khoảng 300bp-1500bp. Ba dòng D18,

D21và D67 cho số phân đoạn lớn nhất (9 phân đoạn), ở kích thước khoảng

1500bp, giống LCB, D2, D121 không xuất hiện phân đoạn ADN và ở kích thước khoảng 1000bp, hai mẫu LCB và D2 cũng không xuất hiện phân đoạn ADN. Các phân đoạn còn lại đều xuất hiện ở tất cả các mẫu.

Mồi UPH04: Tổng số có 8 phân đoạn ADN xuất hiện, trong đó có 2

phân đoạn cho tính đa hình. Kích thước các phân đoạn được nhân bản dao

động từ 300bp-1800bp. Các dòng D18, D21, D67 và D121 xuất hiện các

phân đoạn ADN với kích thước 1500bp và 1800bp.

M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Hình 3.14: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi

USP31và UPH04

M-Marker 1kb; 1.LCB; 2. D2; 3. D18; 4. D21; 5. D67; 6. D121 (←: xuất hiện; →: không xuất hiện)

Sự xuất hiện hay biến mất các phân đoạn ADN chứng tỏ các dòng lạc

có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước đã có sự thay đổi ở mức độ gen.

3.4.2.2. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở

mức độ phân tử

Các số liệu số phân tích PCR-RAPD được xử lý và phân tích trong

chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các

mẫu lạc nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

57

Để kiểm tra phương pháp phân nhóm, chúng tôi đã tiến hành xác định

giá trị tương quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền

(phương pháp của Jaccard, của Nei & Li, của Sokal) với bốn kiểu phân nhóm

(WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ). Biểu đồ hình cây

được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r 0,9:

tương quan rất chặt, r = 0,8 - 0,9: tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: tương quan

tương đối chặt, r 0,7: tương quan không chặt.

Bảng 3.22. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính

về hệ số tương đồng

Kiểu phân nhóm

Phương pháp UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn

SM Dice Jaccard 0,98848 0,98844 0,98689 0,98686 0,98860 0,98856 0,98801 0,98646 0,98809 Liên kết đơn lẻ 0,98828 0,98669 0,98838

Bảng 3.22 cho thấy, với ba cách tính hệ số di truyền giống nhau và bốn

kiểu phân nhóm đều phản ánh mối tương quan kiểu hình của 6 mẫu lạc là rất

chặt (hệ số r đạt từ 0.98646 tới 0.98860). Trong đó giá trị tương quan kiểu

hình (r) lớn nhất 0.98860 khi tính theo hệ số di truyền Jaccard và kiểu phân

nhóm UPGMA. Vì vậy, sơ đồ hình cây được thiết lập theo hệ số di tryền

giống nhau Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA.

Kết quả bảng 3.23 cho thấy, hệ số sai khác di truyền của 5 dòng tạo

được so với giống gốc từ 0,0318 - 0,2055. Dòng D2 có độ sai khác thấp nhất

so với giống gốc (0,0318), dòng D18 có sự sai khác lớn nhất so với giống gốc

(0,2055). Như vậy, cả 5 dòng cây mới tạo được đã thể hiện mức độ sai khác

về sự tương đồng so với giống gốc tuy không lớn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

58

So sánh hệ số sai khác di truyền giữa các dòng cho thấy, sự khác biệt

lớn nhất tìm thấy ở dòng D2 và D121, hai dòng D21 và D67 không có sự sai

khác. Như vậy, trong 6 mẫu lạc nghiên cứu đã có sự phân tách giữa các dòng

mới tạo được và giống gốc đồng thời giữa các dòng mới tạo được cũng có sự

khác biệt nhất định.

Bảng 3.23. Hệ số sai khác di truyền của các dòng và giống gốc

D2 D18 D21

D67 D121

Giống LCB D2 D18 D21 D67 D121

LCB 0,0000 0,0318 0,0000 0,2055 0,1831 0,0000 0,1644 0,1918 0,0423 0,0000 0,1644 0,1918 0,0423 0,0000 0,0000 0,1781 0,2056 0,0564 0,0417 0,0417 0,0000 Hình 3.15 cho thấy mức độ sai khác giữa các dòng và giống gốc. Các dòng

và giống có hệ số tương đồng di truyền gần nhau được xếp vào một nhóm, sự liên

hệ giữa các nhóm cũng được thể hiện.

- Nhánh 1: Bao gồm giống gốc LCB và dòng D2, có sự sai khác so với 4

dòng còn lại là 19% (1- 0,81).

- Nhánh 2: Bao gồm 4 dòng D18, D21, D67 và D121, được chia thành

2 nhóm phụ: nhóm phụ 1 chỉ có dòng D18, nhóm phụ 2 gồm các dòng D21,

D67, D121. Trong đó hai dòng D21 và D67 không có sự khác biệt về mặt di

truyền khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên, hai dòng này có sự tương đồng

với dòng D121 là 0,9583 và dòng D18 là 0,9577. Tuy nhiên để có thể kết

luận hai dòng mới trên có giống nhau hoàn toàn hay không thì nên sử dụng

nhiều mồi để phân tích tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

59

Hình 3.15. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền

A. LCB gốc; A-1. D2; A-2. D18; A-3. D21; A-4. D67; A-5. D121

giữa các dòng chọn lọc và giống gốc

Như vậy, mặc dù chỉ sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích nhưng

cũng chỉ ra sự đa dạng di truyền của cả 5 dòng lạc so với giống gốc .

Sự đa hình các sản phẩm của RAPD là kết quả của sự thay đổi các

điểm gắn của primer (ví dụ: đột biến điểm) hoặc do sự thay đổi nhiễm sắc thể

trong các vùng được nhân bản sẽ gây ra sự thay đổi về kích thước hay ngăn

cản sự nhân bản của ADN mẫu. Do đó các đa hình thường được nhận ra do

sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus [48]. Các

nghiên cứu gần đây cho thấy RAPD là một phương pháp hiệu quả trong việc

phân tích nguồn gốc các loài, xác định các đặc tính của cây có nguồn gốc từ

nuôi cấy mô tế bào [10], [47].

3.4.3. Nhận xét về sự đa hình ADN của một số dòng lạc có nguồn gốc từ

mô sẹo chịu mất nƣớc

(1) Phân tích tính đa hình của 6 mẫu lạc với 10 mồi ngẫu nhiên thì có 6/10

cho tính đa hình. Trong đó mồi DTN19 cho tính đa hình cao nhất với giá trị

PIC=0,55; các mồi còn lại giá trị PIC<0,5.

(2) Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc

LCB từ 0,0318 - 0,2055. So sánh hệ số sai khác di truyền giữa các dòng cho

thấy, sự khác biệt lớn nhất tìm thấy ở dòng D2 và D121.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

60

(3) Biểu đồ hình cây và hệ số tương đồng di truyền của 6 mẫu lạc nghiên cứu

được xếp thành 2 nhánh chính:

- Nhánh 1: gồm giống gốc LCB và dòng D2.

- Nhánh 2: gồm 2 nhóm phụ (nhóm phụ 1: dòng D18; nhóm phụ 2: Dòng

D21, D67, D121).

Những kết quả này chứng tỏ các dòng tạo ra từ mô sẹo chịu mất nước

của giống lạc địa phương Cao Bằng đã có những thay đổi ở mức phân tử

trong bộ gen.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Khả năng chịu hạn của 6 giống lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây

non 3 lá và ở mức độ mô sẹo được sắp xếp theo thứ tự sau: L24> LCB> L23 >

LBK> LTB >L08.

2. Ngưỡng chọn dòng chịu hạn của các giống lạc phụ thuộc vào khả năng

chịu mất nước của mô sẹo từng giống. Đối với các giống LBK, LCB, L23 là 9

thổi khô và giống LTB, L08 là 6h thổi khô. Đã tiến hành sàng lọc được 159

dòng mô và 315 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn.

3. Quần thể R0 có mức độ biến động cao ở nhiều tính trạng nông học, cho

phép lựa chọn được những dòng có tính trạng mong muốn.

4. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của một

số dòng R1 có nguồn gốc từ giống LCB cho thấy:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

61

(a) Có 6/10 cho tính đa hình

(b) Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống

gốc LCB từ 0,0318 - 0,2055. Điều đó khẳng định các dòng có nguồn gốc từ

mô sẹo chịu mất nước có sự thay đổi trong ADN genome.

2. Đề nghị

Tiếp tục theo dõi, phân tích các dòng của các giống lạc L24, LCB, L23,

LBK, LTB, L08 ở các thế hệ tiếp theo về các đặc điểm nông học, hóa sinh, khả

năng chịu hạn... để chọn ra các dòng triển vọng có khả năng chịu hạn cao.

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Thu Giang, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2008), "Đặc

điểm phản ứng của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 trong điều kiện

hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số

2(46), tr. 97- 104.

2. Nguyễn Thu Giang, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2008), "

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu

ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội.

2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Hồ Hữu Nhị (1997), Công nghệ sinh học thực

vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực

hành hóa sinh học, Nxb Giáo dục, tr. 3 - 27.

4. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1999), Hóa sinh học, NXB Giáo dục,

tr.14 - 77.

5. Nguyễn Khoa Chi (1987), Cây đậu phộng, Nxb Thành phố Hồ Chí Minh,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

tr. 4 - 59

63

6. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị

Muội, Lê Trần Bình (2003), " Mối tương quan giữa hàm lượng proline và

tính chống chịu ở cây lúa", Tạp chí Công nghệ sinh học 1 (1), tr. 85 - 95.

7. Nguyễn Lân Dũng (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

học, tập 3, Nxb Hà Nội, tr. 116 - 120.

8. Ngô Thế Dân, Nguyễn Xuân Hồng, Đỗ Thị Dung, Nguyễn Thị Chinh,

Trần Đình Long, Nguyễn Thị Đào, Phạm Văn Toản, Gowda C. L. (2000),

Kỹ thuật đạt năng suất lạc cao ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội,

tr. 2 - 138.

9. Lê Song Dự, Nguyễn Thế Côn (1979), Giáo trình cây lạc, Nxb Nông

nghiệp, Hà Nội, tr. 7 - 44.

10. Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999). "Sử

dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình ADN của một số dòng

chọn lọc từ mô sẹo của giống lúa C71". Hội nghị Công nghệ Sinh học

toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1341-1347.

11. Trần Văn Điền (1990), Giáo trình cây lạc, Trường Đại học Nông nghiệp ,

Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 6 - 81.

12. Nguyễn Danh Đông, Ngô Ngọc Đăng, Nguyễn Thế Côn, Dương Văn

Nghĩa, Lê Quang Hanh, Ngô Đức Dương (1984), Cây lạc, Nxb Hà Nội,

tr. 3 - 239.

13. Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa (1991), Giáo trình sinh

lý cây trồng, Nxb Giáo dục.

14. Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền (2007), "Sự biến đổi hàm

lượng amino acid proline ở rễ và lá đậu xanh dưới tác động của tress

muối NaCl", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, Nxb KH&KT, tr.

482-485.

15. Nguyễn Xuân Hồng, Đỗ Thị Dung, Nguyễn Thị Chính, Vũ Thị Đào,

Phạm Toàn Thắng, Trần Đình Long (2000), Kỹ thuật đạt năng suất lạc

cao, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

64

16. Trần Văn Lài (1991), Yếu tố sinh học hạn chế sản xuất lạc ở Việt Nam, tiến

bộ kỹ thuật về trồng lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

17. Ngô Thị Liêm, Chu Hoàng Mậu (2006), "Đặc điểm phản ứng các giống

lạc trong điều kiện hạn sinh lý", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (84), tr

82-87.

18. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học

phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở

Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, tr. 18 - 36.

19. Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2005), "Protein dự trữ và protease

hạt cây trồng", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(4), tr. 37 -45.

20. Trần Thị Phương Liên, Lê Thị Muội (2004), Nghiên cứu thành phần

đường tan trong chọn giống ở đậu tương, Báo cáo khoa học - Những vấn

đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học & Kỹ thuật,

tr. 473 -475.

21. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng,

Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội.

22. Nguyễn Hoàng Lộc, H. T. T Ngọc, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1992),

"Nghiên cứu khả năng chịu mất nước ở mô sẹo thuốc lá nuôi cấy in

vi tro", Tạp chí sinh học, (14), tr. 31- 37.

23. Nguyễn Văn Mã, Cao Bá Cường, Nguyễn Thị Thanh Hải (2005), Một số

chỉ tiêu sinh lý của giống lạc chịu hạn, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản

trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học & Kỹ thuật, tr. 504 - 507.

24. Chu Hoàng Mậu, Ngô Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006), "Đánh giá khả

năng chịu hạn của một số giống lạc bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro", Hội

nghị Khoa học và Công nghệ Toàn quốc 2006, Nxb KH&KT, tr. 202 -209.

25. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Vân Anh (2005), "Khảo sát chất lượng hạt

và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương ở vùng núi

phía Bắc", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (17), tr. 19 -23.

26. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc

Gia, Hà Nội, tr. 86 - 127

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

65

27. Nguyễn Thị Thu Ngà, Nguyễn Thị Tâm (2007), "Ảnh hưởng của hạn sinh

lý đến một số chỉ tiêu sinh hóa ở giai đoạn nảy mầm của một số giống

lạc", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (6), tr. 34 - 39.

28. Nguyễn Thị Thu Ngà, Nguyễn Thị Tâm (2007), "Đánh giá khả năng chịu

hạn ở mức độ mô sẹo và giai đoạn cây non của các giống lạc", Báo cáo

khoa học tại hội nghị toàn quốc 2007 - Những vấn đề nghiên cứu cơ bản

trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT, tr. 805 - 808

29. Phạm Thị Thanh Nhàn, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2007), "Một

số đặc trưng chịu hạn của một số giống ngô nếp (Zea may L.) địa phương

ở giai đoạn mô và cây non", Báo cáo khoa học tại hội nghị toàn quốc

2007 - Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb

KH&KT, tr. 784 - 787.

30. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Văn Tĩnh, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998),

"Kết quả chọn tạo và triển khai sản xuất hai giống lúa mới DR1 và DR2

bằng công nghệ tế bào thực vật", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, (36),

tr. 1- 9.

31. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng

chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học,

Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.

32. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt và

tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn

khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm- Đại học

Thái Nguyên, tr. 48 - 67.

32. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng

chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật", Luận án Tiến sĩ Sinh

học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.

34. Bùi Văn Thắng, Trần Văn Dương, Đinh Thị Phòng, Nguyễn Văn Thắng,

Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), "Đánh giá tính đa dạng của một số

dòng lạc trong tập đoàn chống chịu bệnh gỉ sắt bằng kỹ thuật RAPD",

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

66

Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn Quốc, Nxb

KH&KT, Hà Nội, tr. 805-809.

35. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Quỳnh (2006), "Ảnh

hưởng của hạn sinh lý đến một số chỉ tiêu hóa sinh ở hạt nảy mầm của

một số giống lúa", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 12(2), tr. 29 - 33.

36. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm (2006), "Tạo vật liệu khởi đầu cho

chọn dòng chịu hạn ở một số giống lúa bằng công nghệ tế bào thực vật",

Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (17), tr. 29 - 32.

37. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm (2006), "Đánh giá sự đa hình ADN

của một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo thổi khô giống U17", Tạp

chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 39, tr. 65 - 71

38. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kỹ thuật trồng và

chăm sóc cây lạc, Nxb Lao Động, Hà Nội, tr. 2 - 86.

39. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên

cứu thực nghiệm trong nông, lâm, ngư nghiệp trên máy vi tính, Nxb

Nông nghiệp, Hà Nội.

40. Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994), Chọn dòng chịu

muối ở lúa bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật, Kỷ yếu viện CNSH,

Nxb KH&KT, Hà Nội, tr. 19 - 27.

41. Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995),

"Nghiên cứu khả năng chịu nhôm và acid của các giống lúa

DDC3,CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, C202, NN8, OM861-20,

OM296 và Tép lai", Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, (4), tr. 23 - 26.

42. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997), Sinh lý học thực

vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr. 125 - 224.

Tiếng nƣớc ngoài

43. Adkind S. W., Kunanuvatchaidach R., Godwin I. D., 1995. Somaclonal

variation in rice- drought tolerant and other agronomic characters.

Australia journal of Botany, 4 (2), tr.201-209.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

67

44. Bates L.S., (1973), Rapid determination of free protein for water-stress

studies, Plant and Soil, 39, pp.205-207.

45. Delauney A., Verma DPS., (1993), Proline biosynthesis and

osmoregulation in plan, Plant J, 4, pp. 215 – 223.

46. Doyle J.J and J.L. Doyle, 1987. Phytochemistry Bulletin, pp. 11-15.

47. Dinh Thi Phong, Le Thi Muoi, Le Tran Binh (2001), RAPD variability in

rice (Oryza sativa L.) plants derived from desisccation-tolerance calli,

Euphytica 00, pp.1-7.

48. Foolad M. R., Siva A., and Rodriguer L. R, (1995). Application of

polymerase chain reaction (PCR) to plant genome analysis. In: Plant

Cell, Tissue and Organ Culture. Fundamental methods. Springer Verlag,

Berlin, Heideberg, p. 281-298.

49. Hu ACA., Delauney AJ., Verma DPS. (1992), A bifunctional enzyme

(P5CS) catalyses the first two steps in proline biosynthesis in plants,

Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp. 1203 – 1207.

50. Raina SN V, Kojima T, Ogihara Y, Singh KP, Devarumath RM (2001),

"RAPD and ISSR figerprints as useful genetic markers for analysis of

genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in

peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species" Genome, 44(5),

763- 772.

51. Zheng K L., Zhou Z. M., Wang G. L., Lou Y. K., Xiong Z. M., (1989).

Somatic cell culture of rice cultivars with difference grain types:

Somaclonal variation in some grain quality characters. Plant cell, tissue

and organ culture 18: 201 - 208.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

68

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số

liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công

bố.

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

69

Nguyễn Thu Giang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình

nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành c ảm ơn PGS. TS Chu Hoàng Mậu - Đại học Thái

Nguyên, Ban lãnh đ ạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban

chủ nhiệm khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của

Khoa, sự giúp đỡ của Ths. Nguyễn Thị Thu Ngà, KTV Đào Thu Thủy (Phòng

thí nghiệm Công nghệ Tế bào), CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di

truyền học) và CN Nguyễn Thị Hồng Liên đã giúp đỡ tôi hoàn thành công trình

nghiên cứu này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tôi xin cảm ơn Trung tâm thực nghiệm đậu đỗ - Viện Khoa học Nông

nghiệp Việt Nam, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các tỉnh Cao Bằng,

Bắc Kạn, Thái Bình đã cung c ấp các giống lạc có chất lượng cao làm vật liệu

nghiên cứu cho đề tài luận văn này.

Tôi xin chân thành c ảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Y khoa Thái

Nguyên, Bộ Môn Hóa Sinh - Khoa Khoa học cơ bản, gia đình, bạn bè cùng đồng

nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình

học tập và hoàn thành luận văn.

Tác giả luận văn

Trang

3

70

MỞ ĐẦU........................................................................................................................................ 1 Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu.................................................................................. 3 1.1. Giá trị kinh tế, đặc điểm nông sinh học và tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam................................................................................................................................................. 1.2.Tính chịu hạn ở thực vật.......................................................................................................... 5

1.3. Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá khả năng

9

chịu hạn và chọn dòng biến dị soma…………………………......................................

11

1.4. Kỹ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật…………………….......... Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp........................................................................................ 13 2.1. Vật liệu.................................................................................................... .............. 13

2.2.. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu……………………………………… 13

14

2.3. Phương pháp nghiên c ứu……………………………………………………......

2.3.1. Phương pháp hóa sinh………………………………………............................. 14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.3.2. Phương pháp sinh lý………………………………………............................... 17

2.3.3. Phương pháp nuôi c ấy in vitro………………………………………................ 18

20

2.3.4. Phương pháp nghiên c ứu trên đồng ruộng …………………………………...

20

2.3.5. Phương pháp sinh học phân tử ……………………………………………….

71

Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận……………………………………….................... 22

3.1. Hàm lượng protein và lipit của các giống lạc nghiên cứu ……………................ 22

3.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB, L08 …………… 23

23

32

39

43

3.2.1. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn hạt nảy mầm………………………………………………………………………….. 3.2.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây hạn nhân tạo..................................................................................... 3.2.3. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn mô sẹo............................................ 3.2.4. Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu dựa trên sự phản ứng ở giai đoạn mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non………………………………………………….

3.3. Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc bằng kỹ thuật

45

nuôi cấy in vitro..................................................................... ...................................

3.3.1 Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu hạn bằng kỹ thuật thổi khô, tái sinh cây và

45

45

tạo cây hoàn chỉnh............................................................................................... ......... 3.3.2. Phân tích mức độ biến động di truyền một số đặc điểm nông học quần thể R0 ......................................................................................................................................

50

3.3.3. Nhận xét về chọn dòng tế bào chịu mất nước và đặc điểm nông học quần thể R0 ................................................................................................................................ 3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN genome của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô

51

sẹo chịu mất nước.........................................................................................................

51

3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

52

3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD

3.4.3. Nhận xét về sự đa hình ADN của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo

58

chịu mất nước KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................................... 60 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 62

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trang 21 22

72

Bảng 2.1. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu......... Bảng 3.1. Hàm lượng protein, lipit c ủa các giống lạc nghiên cứu ......................... Bảng 3.2. Hoạt độ của

24 26

- amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 5%................................................................................................ Bảng 3.3. Hàm lượng đường tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm.... Bảng 3.4. Tương quan giữa hoạt độ của

- amylase và hàm lượng đường ở giai đoạn hạt nảy mầm................................................................................................

27

28 30

Bảng 3.5. Hoạt độ của protease trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 5%.............................................................................................................. Bảng 3.6. Hàm lượng protein tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm... Bảng 3.7. Tương quan giữa hoạt độ của enzyme protease và hàm lượng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm..............................................................................

31 Bảng 3.8. Khối lượng tươi, khô của rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn ......................... 32 Bảng 3.9. Khối lượng tươi, khô của thân lá cây non 3 lá sau khi xử lý hạn ................. 33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

35

73

Bảng 3.10. Tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối của 6 giống lạc ……………………..……………………………………………. ều

Bảng 3.11. Biến độ

kiện hạn nhân tạo ................................................................................................ 36

Bảng 3.12. Biến độ

ều kiện hạn 37 nhân tạo ............................................................................................................... 38 Bảng 3.13. Tương quan giữa hàm lượng proline và chỉ số chịu hạn............................ Bảng 3.14. Độ mất nước của mô sẹo phôi lạc (%)...................................................... 40 Bảng 3.15. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau xử lý mất nước (%)……………………… 41 Bảng 3.16. Khả năng tái sinh c ủa mô sẹo sống sót sau xử lý thổi khô (%)................. 42 Bảng 3.17 Hệ số khác nhau về sự biểu hiện kiểu hình của các giống lạc…………... 44 Bảng 3.18. Mức độ biến động di truyền quần thể R0 giống lạc LCB ................................. 46 Bảng 3.19. Độ sạch và hàm lượng ADN của các mẫu lạc nghiên cứu ............................. 52 Bảng 3.20. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của các mẫu lạc khi phân tích

với 10 mồi ngẫu nhiên................................................................................ 53

Bảng 3.21. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu

nhiên....................................................................... ................................... 54 Bảng 3.22. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương đồng..... 56 Bảng 3.23. Hệ số sai khác di truyền của các dòng và giống gốc.................................. 57

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1. Định tính hoạt độ

- amylase của giống L24 và LT B

ở giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7 ngày .......................................................................

25

Hình 3.2. Biến động hàm lượng đường tan của các giống ở giai đoạn nảy

mầm ........................................................................................................

26

Hình 3.3. Định tính hoạt độ protease của giống L24 và LT B ở giai đoạn hạt

nảy mầm.................................................................................................

29

Hình 3.4

Biến động hàm lượng protein của các giống lạc ở giai đoạn nảy

mầm…..

30

Hình 3.5. Đồ thị hình rada thể hiện khả năng chịu hạn của các giống lạc ở

giai đoạn cây non.............................................................................. 35

Hình 3.6. Hàm lượng proline ở thân và lá trong điều kiện hạn nhân tạo.......... 36

Hình 3.7. Hàm lượng proline ở rễ của các giống lạc nghiên cứu trong điều

kiện hạn nhân tạo.............................................................................

37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

74

Hình 3.8. Độ mất nước của mô sẹo phôi lạc khi xử lý thổi khô (%)...............

40

Hình 3.9. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô (%)……………

42

Hình 3.10 Sơ đồ mô tả quan hệ giữa các giống lạc dựa trên sự biểu hiện kiểu

hình của 72 tính trạng........................................................................ 44

Hình 3.11. Một số hình ảnh về biến dị quả của các dòng chọn lọc từ giống

LBK .................................................................................................... 49

Hình 3.12. Một số hình ảnh các dòng tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu

mất nước giống LCB ngoài đồng ruộng.............................................. 50

Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi

DTN15 và DTN19............................................................................ 55

Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi

USP31và UPH04………………………………………………….

55

Hình 3.15 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn

lọc và giống gốc................................................................................ 58

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D

2,4-Dichlorphenoxyacetic acid

ABA

Axit abscisic

ADN

Axit deoxyribonucleic

ASTT

Áp suất thẩm thấu

bp

Base paire (Cặp bazo)

BAP

6 – Benzyl Amino Purin

Cs

Cộng sự

ĐVHĐ

Đơn vị hoạt độ

ĐVMS

Đơn vị mô sẹo

HSPL

Hệ số pha loãng

kb

Kilobase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Late Embryogenesis Abundant Protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)

LEA

Murashige – Skoog

MS

Naphthyl Acetic Acid

NAA

Polymerase Chain Reaction

PCR

Polymorphism Information Content

PIC

Pellagra Preventive (Vitamin PP)

PP

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên)

TAE

Tris acetate EDTA

TGXL

Thời gian xử lý

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

75