Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính sinh học của Chlorogenic acid từ quả cà phê xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

TRỊNH TRÚC GIANG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT

TÍNH SINH HỌC Chlorogenic acid

TỪ QUẢ CÀ PHÊ XANH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG

TS. VŨ KIM DUNG

Hà Nội, 2020

i

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều

sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn bè và

các cơ quan.

Trước hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.

Nguyễn Việt Phương – Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng

Công nghiệp Thực phẩm và TS. Vũ Kim Dung – Bộ môn Công nghệ Vi sinh-

Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin cảm ơn tới ban lãnh đạo, các thầy cô giáo thuộc Viện Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và tạo

điều kiện cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng,

phản biện, thư ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham

gia hội đồng chấm luận văn với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp

tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận văn.

Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức

nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận văn

nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Trịnh Trúc Giang

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá

nhân tôi và đuợc thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Việt Phương,

Trung tâm Công nghệ sinh học- Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm

và TS. Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường Đại học

Lâm nghiệp Việt Nam.

Các số liệu, những kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là

hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất cứ một công trình

nào khác trước đây. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích

dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Trịnh Trúc Giang

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii

MỤC LỤC ....................................................................................................... iii

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ v

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................ 3

1.1. Tổng quan về Chlorogenic acid ............................................................. 3

1.1.1. Giới thiệu về Chlorogenic acid ....................................................... 3

1.1.2. Công dụng của Chlorogenic acid ................................................... 4

1.2. Tổng quan về cà phê ............................................................................... 8

1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê ở Việt Nam .......................... 8

1.2.2. Cấu tạo quả cà phê xanh............................................................... 10

1.2.3. Thành phần hóa học của quả cà phê ............................................ 11

1.2.4. Cà phê xanh và lợi ích sử dụng ..................................................... 13

1.3. Tổng quan về enzyme pectinase .......................................................... 16

1.3.1. Giới thiệu về Enzyme pectinase .................................................... 16

1.3.2. Ứng dụng của enzyme pectinase ................................................... 17

1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất Chlorogenic acid từ cà phê trên thế giới

và ở Việt Nam ............................................................................................. 17

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ................... 22

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................. 22

2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 22

2.3. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 22

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 22

2.3.2. Hoá chất và thiết bị ....................................................................... 22

2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 23

iv

2.4.1. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết

xuất CGA ................................................................................................. 23

2.4.2. Phương pháp tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA ...................... 30

2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính CGA thu nhận ........................... 32

2.4.4. Phương pháp sấy chân không ....................................................... 33

2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ......................................... 33

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 34

3.1. Kết quả xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA 35

3.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất : dung môi đến quá trình chiết CGA 35

3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA ... 37

3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA ........................ 39

3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA ................ 40

3.1.5. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA 42

3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất

CGA……………………………………………………………………………..44

3.2. Kết quả mô hình hoá và tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA ............ 45

3.2.1. Kết quả ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố ............... 46

3.2.2. Phân tích phương sai .................................................................... 48

3.2.3. Phương trình hồi quy .................................................................... 49

3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh bằng enzyme

pectinase. ................................................................................................. 50

3.2.5. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng

HPLC ....................................................................................................... 52

3.3. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa ................ 54

3.3.1. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn ...................................... 54

3.3.2. Kết quả xác định hoạt tính oxy hóa .............................................. 56

3.4. Kết quả quá trình sấy chân không ........................................................ 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình chiết CGA .. 24

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA. .. 24

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA ......................... 25

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA ................. 26

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA .............. 26

Bảng 2.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA 27

Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn CGA ............................. 28

Bảng 2.8. Thiết kế chế độ chạy hệ thống HPLC ............................................. 29

Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm xây dựng dường chuẩn CGA bằng HPLC ......... 30

Bảng 2.10. Các biến số và khoảng chạy ......................................................... 30

Bảng 2.11. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng

CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau ............................... 31

Bảng 2.12. Lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi trên môi trường lỏng. .............. 32

Bảng 2.13. Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không ........................... 33

Bảng 3.1. Giá trị nồng độ CGA đo ở bước sóng 324 nm ............................... 34

Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng CGA

thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau ......................................... 47

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm

Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova) ............................................................... 48

Bảng 3.4. Kiểm tra mô hình thí nghiệm tối ưu hoá tách chiết CGA .............. 51

Bảng 3.5. Diện tích peak CGA ở các nồng độ ................................................ 52

Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng HPLC ............................. 54

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CGA tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và vi

khuẩn gây hại. ................................................................................................. 55

Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa ...................................... 56

Bảng 3.9. Nhiệt độ và thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA .......... 57

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu trúc của chlorogenic acid .................................................... 3

Hình 1.2. Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa chlorogenic acid. .............. 8

Hình 1.3. Cấu tạo quả cà phê ...................................................................................... 10

Hình 1.4. Tác động của pectinase lên phân tử pectin ............................................... 16

Hình 3.1. Quả cà phê xanh sau khi xử lý (A), sấy (B), nghiền và rây (C) .............. 34

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CGA .......................................................................... 35

Hình 3.3. Đồ thị mối liên hệ tỷ lệ cơ chất – dung môi và hàm lượng chiết xuất

CGA............................................................................................................................... 36

Hình 3.4. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tới

quá trình chiết xuất CGA ............................................................................................. 36

Hình 3.5. Đồ thị mối liên hệ nồng độ enzyme tới hàm lượng chiết xuất CGA ..... 37

Hình 3.6. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới

quá trình chiết xuất CGA ............................................................................................. 38

Hình 3.7. Đồ thị mối quan hệ độ pH dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA ... 39

Hình 3.8. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của pH tới quá trình chiết

xuất CGA ...................................................................................................................... 40

Hình 3.9. Đồ thị mối quan hệ của nhiệt độ và hàm lượng chiết xuất CGA........... 41

Hình 3.10. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình

chiết CGA ..................................................................................................................... 42

Hình 3.11. Đồ thị mối quan hệ của tốc độ lắc và hàm lượng chiết xuất CGA ...... 43

Hình 3.12. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá

trình chiết xuất CGA .................................................................................................... 43

Hình 3.13. Đồ thị mối quan hệ của thời gian thuỷ phân và hàm lượng chiết xuất

CGA............................................................................................................................... 44

Hình 3.14. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân

tới quá trình chiết xuất CGA ....................................................................................... 45

Hình 3.15. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA ... 50

vii

Hình 3.16. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CGA ..................................................... 51

Hình 3.17. Sắc ký đồ kết quả trước và sau tối ưu hoá .............................................. 52

Hình 3.18. Đồ thị đường chuẩn CGA ........................................................................ 53

Hình 3.19. Sắc ký đồ của chất chuẩn CGA ............................................................... 53

Hình 3.20. Sắc ký đồ của mẫu thử CGA ................................................................... 53

Hình 3.21. Chế phẩm CGA dạng bột. ........................................................................ 57

Hình 3.22. Quy trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh. ........................................ 58

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, khi nhu cầu cuộc sống ngày càng cao, các loại sản phẩm

chức năng ra đời với mục đích hỗ trợ, cải thiện, nâng cao sức khỏe của con

người luôn là một vấn đề được xã hội đặc biệt quan tâm. Nhiều nghiên cứu đã

chỉ ra rằng việc sử dụng bột chiết cà phê xanh có rất nhiều tác dụng đối với

sức khỏe con người như: hạ huyết áp, ức chế sự tích tụ chất béo, hạn chế tăng

trọng lượng cơ thể và điều chỉnh hàm lượng đường trong máu (Farah và cộng

sự, 2005). Các tác dụng tích cực này của bột chiết cà phê xanh là do sự có mặt

của Chlorogenic acid. Chất này có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm,

kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp và chống co giật (Santana-Gálvez,

2017). Đặc biệt hơn nữa, những nghiên cứu mới cho thấy tác dụng có lợi của

Chlorogenic acid đối với Hội chứng chuyển hóa (Metabolic syndrome). Hội

chứng này được định nghĩa bao gồm một loạt các yếu tố sinh lý, hóa sinh, lâm

sàng và chuyển hóa làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và tiểu đường

type 2. Các biểu hiện của hội chứng bao gồm: các rối loạn chuyển hóa lipid

máu (tăng cholesterol tổng số trong máu, tăng hàm lượng LDL - cholesterol,

triglycerid, giảm hàm lượng HDL - cholesterol), huyết áp cao, đường máu

cao, dễ viêm, gan nhiễm mỡ và ngưng thở khi ngủ. Hội chứng này được coi

như hội chứng mang tính toàn cầu vì chi phí chữa trị cao và số người mắc

ngày càng tăng ngay cả trong thanh niên và trẻ em (Santana-Gálvez, 2017).

Cà phê xanh là nguồn Chlorogenic acid quan trọng trong thực phẩm

của con người với tổng lượng Chlorogenic acid lên đến 41 – 113 mg/g chất

khô tùy thuộc giống. Việc thu nhận CGA từ quả cà phê xanh làm nguyên liệu

sản xuất thực phẩm chức năng phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính đặc

biệt là hội chứng chuyển hóa giúp đa dạng hóa các sản phẩm từ cà phê và tăng

giá trị kinh tế của cây cà phê.

Pectinase là các enzyme được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì

không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh

2

trưởng và phát triển nhanh, cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi

sinh vật là lựa chọn hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong

muốn giảm giá thành, tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất

pectinase quy mô công nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger

(Yogesh, 2009).

Với rất nhiều các kết quả khả quan về tác dụng dược lý cũng như tiềm

năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm của acid chlorogenic từ quả cà

phê xanh, việc tách chiết axit chlorogenic từ nguyên liệu này cung cấp chế

phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất các thực phẩm chức

năng dùng trong phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính như tăng huyết

áp, tiểu đường và đặc biệt là hội chứng chuyển hóa, những bệnh lý đang tăng

nhanh hiện nay. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính sinh học của Chlorogenic

acid từ quả cà phê xanh”.

3

Chương 1

TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Tổng quan về Chlorogenic acid

1.1.1. Giới thiệu về Chlorogenic acid

- Màu sắc: Màu vàng nhạt đến bột trắng.

- Công thức phân tử: C16I18O9

- Công thức cấu tạo: về cấu trúc, chlorogenic acid là este của caffeic acid

với nhóm 3-hydroxyl của quinic acid.

 Cấu trúc Chlorogenic acid

Chlorogenic acid là este được hình thành giữa acid caffeic và 3-hydroxyl

của acid L -quinic (Clifford, 1999), đồng phân chlorogenic acid bao gồm các

este caffeoyl tại các vị trí hydroxyl khác nhau trên vòng acid quinic: 4 O acid

-caffeoylquinic (acid cryptoChlorogenic hoặc 4-CQA) và 5 Oacid-

caffeoylquinic (acid neoChlorogenic hoặc 5-CQA).

Các cấu trúc có nhiều hơn một nhóm acid caffeic được gọi là acid

isochlorogenic và có thể được tìm thấy trong cà phê (Barnes và cộng sự,

1950). Có một số đồng phân, chẳng hạn như acid 3,4-dicaffeoylquinic và acid

3,5-dicaffeoylquinic và cynarine (acid 1,5-dicaffeoylquinic) (Corse và cộng

sự,1965).

Hình 1.1. Công thức cấu trúc của chlorogenic acid

4

 Sự tổng hợp CGA trong tự nhiên

Tiền chất sinh tổng hợp của chlorogenic acid là 4-coumaroyl-CoA, chứa

một nhóm hydroxyl duy nhất trên vòng aryl. Các hydroxyl của este coumaryl,

tức là gắn các nhóm hydroxy thứ hai, được xúc tác bởi enzyme cytochrome

P450 (Vogt, 2010).

Chlorogenic acid có thể được tìm thấy trong cây tre (Phyllostachys

edulis) (Kweon, 2001) hay trong chồi của cây thạch nam (Calluna vulgaris)

(Jalal và cộng sự, 1982) cũng như trong nhiều loại cây khác (Clifford, 2003).

Trong thực phẩm, chlorogenic acid và các hợp chất liên quan như

cryptochlorogenic acid và neochlorogenic acid đã được tìm thấy trong lá của

cây dâm bụt (Sabdariffa) (Zhen, 2016). Các chất đồng phân của chlorogenic

acid được tìm thấy trong khoai tây. Ngoài ra, chlorogenic acid có trong thịt

quả cà tím, đào, mận khô và quả cà phê.

1.1.2. Công dụng của Chlorogenic acid

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ bột chiết cà phê xanh

có rất nhiều tác dụng đối với sức khỏe con người như hạ huyết áp, tác dụng

ức chế sự tích tụ chất béo, tăng trọng lượng cơ thể và điều chỉnh hàm

lượng đường trong máu (Farah, 2005). Các tác dụng này của bột chiết cà

phê xanh được giải thích bởi sự có mặt của Chlorogenic acid có trong bột

chiết do nó thể hiện các tính chất sinh học quý bao gồm kháng oxi hóa,

kháng viêm, kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp và chống co giật

(Santana-Gálvez, 2017).

- Đối với bệnh béo phì:

Một thí nghiệm trên chuột cho thấy rằng Chlorogenic acid làm giảm

khối lượng cơ thể, chất béo nội tạng, triglycerid trong gan và tim, giảm

cholesterol trong các mô mỡ và trong tim ở các con chuột bị béo phì (Ae-

SimCho, 2010). Chlorogenic acid làm hạn chế sự tăng cân và hạn chế sự tích

tụ các axit béo tự do trong gan của chuột ăn chế độ giàu chất béo. Đối với con

5

người, có nghiên cứu đã chỉ ra rằng người béo phì với chỉ số BMI 27,5–32 khi

dùng chế phẩm Coffee Slender từ cà phê xanh (45 mg CGAs/g), 5 cốc/ngày

đã giảm được 5,4 kg trong vòng 12 tuần (Thom, 2007).

- Đối với các rối loạn chuyển hóa lipid máu:

Chlorogenic acid giảm axit béo tự do triglyceride và cholesterol trong

huyết tương và làm tăng đáng kể tỷ số HDL-cholesterol/cholesterol toàn phần

ở chuột ở nhóm chuột bị gây béo phì (Ae-SimCho, 2010). Khi cho chuột ăn

chế độ giàu cholesterol, Chlorogenic acid (10 mg/kg trong 28 ngày) làm giảm

cholesterol toàn phần và LDL-cholesterol, tăng HDL cholesterol và cải thiện

các chỉ số liên quan đến nguy cơ bệnh động mạch vành và bệnh tim.

- Đối với bệnh tiểu đường:

Ở chuột bị tiểu đường, chế độ ăn có Chlorogenic acid (27 mg/kg trong

11 ngày) làm giảm hàm lượng glucose trong máu (Attila Hunyadi và cộng sự,

2012). Sử dụng Chlorogenic acid (10 hoặc 50 mg/kg thể trọng trong hai tuần)

làm giảm lượng chất béo và nồng độ đường glucose trong máu sau ăn của

chuột bị béo phì đồng thời rút ngắn thời gian lành vết thương của chúng

(Deniz Bagdasa, 2015) (Junghyun Kim, 2011). Đối với con người, việc sử

dụng bột chiết giàu Chlorogenic acid từ hạt cà phê xanh (300 mg chất chiết

chứa 13,9% Chlorogenic acid) cùng với snack giàu glucid làm giảm hàm

lượng glucose trong máu sau khi ăn. Hàm lượng glucose trong máu của người

tình nguyện giảm 6,9% khi được uống nước chứa 25 g đường saccharose và

chế phẩm Coffee Slender từ cà phê xanh so với nhóm đối chứng (Thom,

2007).

- Đối với bệnh cao huyết áp:

Theo Thom (2007), đối với chuột bị cao huyết áp, tác giả đã chỉ ra rằng

chế độ ăn bổ sung 0,5% Chlorogenic acid trong 8 tuần hạn chế đáng kể sự

tăng huyết áp. Đối với người khỏe mạnh, Chlorogenic acid tinh khiết (400

mg) làm giảm huyết áp 1,53-2,41 mm Hg. Trong một thí nghiệm khác, 117

6

tình nguyện viên 30-50 tuổi bị cao huyết áp ở mức độ trung bình dùng súp bổ

sung bột chiết cà phê xanh với hàm lượng Chlorogenic acid tương ứng 0, 25,

50 và 100 mg trong 28 ngày có huyết áp giảm 3,2-4,7 mm Hg (Kazuya

Kozuma và cộng sự, 2005). Một nghiên cứu khác thực hiện đối với 11 đàn

ông và 17 phụ nữ bị cao huyết áp ở mức độ trung bình cho thấy huyết áp giảm

6,9-7,7% khi uống nước rau quả có bổ sung 0,48 g bột chiết cà phê xanh/ngày

(chứa 140 mg Chlorogenic acid) trong 12 tuần (Takuya Watanabe, 2006).

* Vai trò của Chlorogenic acid trong công nghiệp thực phẩm:

Tiềm năng ứng dụng Chlorogenic acid trong công nghiệp chế biến thực

phẩm rất lớn do hợp chất này thể hiện khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa,

hoạt động hiệp đồng với các chất kháng oxi hóa khác trong thực phẩm và có

tính chất prebiotic (Santana-Gálvez, 2017).

- Về khả năng kháng khuẩn:

Việc sử dụng chất bảo quản hóa học tổng hợp trong các sản phẩm thực

phẩm là một mối quan ngại cho người tiêu dùng bởi các tác dụng phụ của

chúng. Do đó, việc xác định các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên có thể

được chấp nhận bởi người tiêu dùng đã trở nên có giá trị và là mối quan tâm

của rất nhiều nhà sản xuất thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định rằng

Chlorogenic acid có thể được sử dụng như một chất bảo quản do có khả năng

kháng vi sinh vật.

Khả năng kháng các vi sinh vật probiotic của Chlorogenic acid cũng

được nghiên cứu. Chlorogenic acid không kìm hãm sự phát triển của

Bifidobacterium lactis, Lactobacillus crispatus (L. crispatus), L. johnsonii, L.

paracasei, L. plantarum, L. reuteri, hay L. rhamnosus khi nồng độ đạt đến 10

mg/m (R. Puupponen‐Pimiä, 2001) .Đây này là một thuận lợi đáng kể cho

việc ứng dụng Chlorogenic acid trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm như

chất kháng khuẩn.

- Về khả năng kháng oxi hóa:

7

Chlorogenic acid có khả năng hạn chế sự oxi hóa trong thực phẩm đặc

biệt là các thực phẩm giàu chất béo và các nhũ tương dầu/nước hay nước/dầu.

Quá trình oxi hóa chất béo trong thực phẩm thường làm giảm giá trị dinh

dưỡng, giá trị sinh học và giá trị cảm quan của các sản phẩm thực phẩm do

các chất béo đặc biệt là các axit béo không no nhiều nối đôi và các vitamin bị

phân giải, các sản phẩm oxi hóa tạo thành (hydroxyperoxide, aldehyde,

polymer) gây nên mùi ôi khét và đôi khi độc cho thực phẩm.

- Về hoạt động hiệp đồng với các chất kháng oxi hóa khác:

Hoạt động hiệp đồng của các chất kháng oxi hóa làm tăng mạnh hiệu quả

kháng oxi hóa của các chất kháng oxi hóa tự nhiên. Cơ chế hiệp đồng có thể

là khử gốc tự do của chất kháng oxi hóa khác sau khi chất này đã cho điện tử

và vô hoạt gốc tự do. Ngoài ra, sự bảo vệ các chất kháng oxi hóa cũng là một

cơ chế hoạt động hiệp đồng. Anthocyanin là một chất kháng oxi hóa rất phổ

biến trong tự nhiên đặc biệt trong các loại rau, quả có màu đỏ, tím, đen, xanh.

Chúng có khả năng kháng oxi hóa mạnh nhưng lại kém bền dưới tác động của

nhiệt độ, ánh sáng và pH kiềm.

- Về tác dụng prebiotic:

Tác dụng prebiotic của Chlorogenic acid thể hiện ở khả năng tăng cường

phát triển của các vi sinh vật có lợi trong đường ruột. Mills và cộng sự. (2015)

trong thí nghiệm in vitro của mình với hệ thống bắt chước ruột già của người

đã chỉ ra rằng Chlorogenic acid tinh khiết hoặc cà phê giàu Chlorogenic acid

tăng cường sự phát triển của vi sinh vật có lợi trong đường ruột bao gồm

Bifidobacterium spp. và nhóm Clostridium coccoides-Eubacterium.

Với rất nhiều các kết quả khả quan về tác dụng dược lý cũng như tiềm

năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm của Chlorogenic acid từ hạt cà

phê xanh, việc tách chiết Chlorogenic acid từ nguyên liệu này cung cấp chế

phẩm hoạt chất tự nhiên quý, làm nguyên liệu sản xuất các thực phẩm chức

năng dùng trong phòng và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính như tăng huyết

8

áp, tiểu đường và đặc biệt là hội chứng chuyển hóa, những bệnh lý đang tăng

nhanh hiện nay.

Ngoài ra Chlorogenic acid cũng có thể tạo ra các phản ứng tích cực với

cơ thể. Theo nghiên cứu mới đây của Carlos Tello (2020), CGA có các tác

dụng sau:

- Ức chế 11-βHSD1 là enzyme tạo ra các hormon gây tăng huyết áp.

- Kích hoạt thụ thể GABAa bằng cách liên kết với vị trí của

benzodiazepine, dẫn đến giảm mức độ lo lắng.

- Tăng Glucagon – một loại hormon làm tăng nồng độ insulin trong

máu và làm giảm glucose.

- Kích hoạt Peroxisome proliferator – Activated receptor alpha dẫn đến

tăng sự gia nhiệt và giảm mỡ cơ thể.

- Ức chế HMG-CoA là enzyme chịu trách nhiệm sản xuất cholesterol

và là mục tiêu chính của thuốc statin.

- Ức chế acetylcholinesterase giúp cải thiện nhận thức và trí nhớ.

Hình 1.2. Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa chlorogenic acid.

1.2. Tổng quan về cà phê

1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê ở Việt Nam

Cà phê là một trong những thức uống phổ biến nhất trên toàn thế giới,

nó được trồng rộng khắp ở hơn 75 nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, là nguồn

lợi xuất khẩu quan trọng cho các quốc gia này.

9

Cây cà phê được người Pháp đưa vào Việt Nam từ khoảng năm 1850.

Do điều kiện khí hậu và đất đai thích hợp nên cây được phát triển trên quy mô

rộng và cho hạt chất lượng tốt không kém sản phẩm của những nước sản xuất

và xuất khẩu cà phê lớn trên thị trường. Tuy nhiên phải đến sau giải phóng

ngành cà phê Việt Nam mới đi vào thời kỳ phát triển, sản lượng sản xuất ra

chủ yếu để xuất khẩu.

Cà phê thuộc họ Rubiaceae với hơn 70 loài khác nhau, nhưng hai loài

có giá trị kinh tế quan trọng đó là: Arabica (Coffea arabica) và Robusta (C.

canephora). Cây cà phê trồng ở nước ta hiện nay có 3 loài là: cà phê chè

(Coffea arabica), cà phê vối (C. canephora) và cà phê mít (C. excelsa). Về

chất lượng thì cà phê chè có vị thơm ngon và dịu, hàm lượng cafein khoảng

1,2%. Cà phê vối hương vị kém hơn cà phê chè nhưng đậm đà hơn, hàm

lượng cafein tương đối cao, khoảng 2,5%. Cà phê mít ít thơm, vị hơi chua, ít

được ưa chuộng nhất.

Tính đến năm 2018, diện tính cà phê của cả nước rất lớn, khoảng

720.000 ha. Trong đó, cà phê Robusta chiếm khoảng 670.000 ha (chiếm 93%

diện tích), đạt khoảng 1,71 triệu tấn (khoảng hơn 96% sản lượng). Cà phê

Arabica, diện tích là 50.000 ha (chỉ gần 7%), sản lượng gần 67.000 tấn (chỉ

gần 4%).

Theo hiệp hội Cà phê ca cao Việt Nam (Vicofa) ước tính tổng lượng

tiêu thụ cà phê của thị trường trong nước chỉ chiếm khoảng 10% sản lượng cà

phê sản xuất, 90% còn lại là xuất khẩu. Trong đó chỉ có 10% xuất khẩu ở

dạng chế biến sâu. Điều này hoàn toàn không có lợi cho ngành cà phê Việt

Nam vì khi tỉ lệ xuất khẩu quá cao nhà sản xuất cà phê dễ bị lệ thuộc vào các

nhà nhập khẩu. Do đó, thúc đẩy tiêu dùng nội địa chính là cách căn bản nhất.

Ngoài ra, do nhiều yếu tố chủ quan và khách quan, vấn đề thu hoạch

cà phê khi quả còn xanh từ vài chục năm nay vẫn chưa được khắc phục, tỉ lệ

quả non xanh chiếm đến 50%. Điều này làm cho cà phê nhân Việt Nam xuất

10

khẩu bị mất giá, có nhiều lô hàng bị trả lại. Mặt khác cà phê Việt Nam còn bị

từ chối ở một số thị trường trên thế giới. Điều đó cho thấy việc loại cà phê

xanh ra khỏi nhân cà phê xuất khẩu là cần thiết.

1.2.2. Cấu tạo quả cà phê xanh

Quả cà phê xanh được cấu tạo từ 3 lớp vỏ, thịt quả và nhân hạt (hình

1.3). Trong đó, 2 thành phần chính giàu hoạt chất sinh học là:

Hình 1.3. Cấu tạo quả cà phê1

 Lớp vỏ trấu (Parchment):

Là lớp ngoài cùng của phần quả, tiếp xúc trực tiếp với phần vỏ quả, vỏ

trấu được hình thành từ ba đến bảy lớp tế bào xơ cứng (tế bào sợi đóng vai trò

chính trong thực vật) nên còn được gọi là vỏ trấu. Các tế bào cấu thành vỏ

trấu sẽ cứng dần trong quá trình trưởng thành của quả cà phê, do đó hạn chế

kích thước cuối cùng của quả nhân cà phê. Trong cà phê Arabica, trọng lượng

trung bình của vỏ trấu với độ ẩm khoảng 11% nằm trong khoảng 3,8% tổng

trọng lượng quả cà phê.

 Lớp vỏ lụa (Silver skin):

Vỏ lụa được hình thành từ nucellus có màu trắng bạc sau khi phơi khô,

nên còn được gọi là vỏ bạc. Lớp vỏ này rất mỏng và có thể được bóc ra khỏi

nhân trong quá trình đánh bóng quả. Tuy nhiên, một số nhà chế biến cà phê

thường để lại vỏ lụa trên quả cà phê như một lớp bảo vệ tự nhiên, lớp vỏ này

sau đó sẽ tự hủy trong quá trình rang cà phê. Ở một số vùng và tùy thuộc vào

giống cà phê lớp vỏ lụa có thể sẫm màu hơn.

1 Nguồn: https://primecoffea.com/cau-tao-hat-cafe-va-thanh-phan-hoa-hoc-trong-hat-ca-phe.html

11

 Nhân cà phê

Phần trong cùng và là quan trọng nhất của quả, chịu trách nhiệm tích

lũy chất dinh dưỡng cho quá trình nẩy mầm của phôi. Một quả cà phê thông

thường có 2 nhân (cá biệt có 1 hoặc 3 nhân). Thành phần hóa học của nhân vô

cùng quan trọng vì đây được xem là tiền thân của các hương vị và mùi thơm

sau này trong cà phê rang. Các hợp chất hóa học được tìm thấy trong nội nhũ

có thể kể đến bao gồm:

- Các hợp chất tan trong nước, như: caffeine, trigonelline, nicotinic

acid (niacin), ít nhất 18 chlorogen acid, các thành phần cacbohydrat (mono-,

di- và oligosacarit) một số protein các khoáng chất và carboxylic acid…

- Trong khi đó các thành phần không hòa tan trong nước bao gồm:

cellulose, polysacaride, lignin và hemicellulose, một số protein, khoáng chất

và lipid.

- Trong lớp nhân cà phê sẽ là phôi (embryo) bao gồm một trục phôi

(hypocotyl) và hai lá mầm dài từ 3 – 4 mm. Khi quả bắt đầu nảy mầm trục

phôi sẽ kéo dài và đẩy quả lên trên mặt đất. Các lá mầm ban đầu ở dưới lòng

đất ngay sau đó các lá mầm mới sẽ hình thành.

1.2.3. Thành phần hóa học của quả cà phê

Nhóm chất cơ bản sau đây đều có mặt ở tất cả các giống loài cà phê, tuy

nhiên tùy theo giống cà phê và phụ thuộc vào điều kiện canh tác mà các thành

phần hóa học trong cà phê có thể thay đổi. Theo trang Coffee Chemistry.com,

thành phần cà phê bao gồm:

 Nhóm chất hữu cơ

Nước: cà phê tươi có độ ẩm tuyệt đối, với hàm lượng nước cao thì các

loại nấm mốc phát triển mạnh làm hỏng quả đồng thời khi rang sẽ tốn nhiều

nhiên liệu và thất thoát hương nhiều hơn. Vì vậy, thông qua các phương pháp

chế biến cà phê hàm lượng nước giảm xuống 10 – 12% cà phê sẽ được bảo

quản lâu hơn. Hàm lượng nước sau khi rang còn khoảng 2 – 3%.

12

 Cacbohydrat (glucid)

Chiếm 50% tổng số chất khô, đại bộ phận không tham gia vào thành

phần nước uống mà chỉ cho màu và vị caramen. Đường có trong cà phê do

quá trình thủy phân dưới tác dụng của acid hữu cơ và các enzyme thủy phân.

Hàm lượng saccharose có trong cà phê phụ thuộc vào độ chín của quả, quả

càng chín thì hàm lượng càng cao. Saccharose bị caramen hóa trong quá trình

rang tạo thành hương vị cho nước cà phê.

 Thành phần protein

Hàm lượng protein không cao nhưng đóng vai trò quan trọng giúp hình

thành hương vị của cà phê trong quá trình rang qua phản ứng Maillard với các

loại đường có trong cà phê. Bằng các phương pháp định tính người ta nhận

thấy trong thành phần protein có những acid amin chính như: cystein, alanie,

phenylalanine, histidine, leucine, lysine, derine.

 Các Acid hữu cơ

Chlorogenic acid (CGA) – Một trong những loại acid quan trọng nhất

trong cà phê, tổng hàm lượng lên tới khoảng 41 – 113 mg/g chất khô tùy

thuộc giống.

Acetic acid là một trong nhiều axit hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong

chất lượng cà phê. Nồng độ acetic acid cao hay thấp còn phụ thuộc vào

phương pháp chế biến ướt hoặc khô, vì vậy đây là loại axit được sinh ra đáng

kể trong quá trình chế biến chứ không nhiều trong chính quả cà phê.

Citric acid - đóng một vai trò như một hợp chất trung gian quan trọng

trong chu trình trao đổi chất của cây cà phê. Trong cà phê xanh, citric acid

chiếm một phần đáng kể trong tổng hàm lượng acid. Khi rang, citric acid đạt

mức tối đa khi rang ở nhiệt độ thấp rồi nhanh chóng giảm đi khi tăng dần

nhiệt độ rang.

Quinic acid: khi rang, quinic acid tăng dần lên theo mức giảm của

Chlorogenic acid (CGA). Trong quá trình rang, một phần quinic acid sẽ tiếp

13

tục phân hủy để tạo thành một số hợp chất thứ cấp bao gồm phenol, catechol,

hydroquinone, pyrogallol và một số diphenols – là những tiền chất quan trọng

cấu thành hương thơm của cà phê.

Phosphoric acid trong cà phê chiếm ít hơn 1% chất khô. Không giống

như một số các acid khác, phosphoric acid có nồng độ cao hơn nhiều lần vì

vậy các nhà nghiên cứu tin rằng phosphoric acid tác động mạnh mẽ hơn đến

hương vị so các loại acid khác trong cà phê.

 Nhóm chất hương, chất khoáng

Chất thơm: trong cà phê hàm lượng chất thơm nhỏ, được hình thành và

tích lũy trong quả. Mặt khác, phần lớn mùi hương cà phê mà ta nhận thấy

được hình thành trong quá trình chế biến cà phê, đặc biệt trong quá trình rang.

Các chất thơm phức tạp bao gồm nhiều phân tử cấu thành như: acid, aldehid,

ceton, rượu, phenol, este… Các chất thơm của cà phê dễ bị bay hơi, biến đổi

và dẫn đến hiện tượng cà phê bị mất mùi thơm nên cần đựng trong bao bì kín

và tiêu thụ nhanh.

Chất khoáng: chỉ từ khoảng 3 - 5% chủ yếu là kali, nito, magie, photpho,

clo. Ngoài ra, còn có các chất nhôm, sắt, đồng, lưu huỳnh. Những chất này

ảnh hưởng không tốt đến mùi hương cà phê. Chất lượng cà phê càng cao thì

khoáng chất càng thấp và ngược lại.

1.2.4. Cà phê xanh và lợi ích sử dụng

1.2.4.1. Cà phê xanh

Cà phê xanh là cà phê chưa rang có chứa nhiều thành phần chống oxy

hóa đặc biệt là chlorogenic acid. Có một điểm cần lưu ý rằng cà phê Arabica

chứa 3,5% - 7,5% (khối lượng khô), trong khi cà phê Robusta chứa 7,0% -

14,0% (khối lượng khô) CGA. Cà phê chưa rang có hàm lượng CGA cao hơn

rất nhiều so với cà phê rang (Belitz và cộng sự, 2009).

Caffeine là thành phần được biết đến nhiều nhất của hạt cà phê. Ở cà

phê Arabica thô, caffein có thể được tìm thấy với các giá trị khác nhau giữa

14

0,8% và 1,4% khối lượng khô, trong khi đối với Robusta các giá trị này thay

đổi từ 1,7% đến 4,0% khối lượng khô (Solange I. Mussatto, 2011).

Hạt cà phê được cấu thành bởi nhiều thành phần khác nhau như

cellulose, khoáng chất, đường, lipid, tannin, và polyphenol. Khoáng chất bao

gồm kali, magiê, canxi, natri, sắt, mangan, kẽm, đồng, crôm, bari, niken,

coban, molybden, titan,... Đường bao gồm sucrose, glucose, fructose,

arabinose, galactose, và mannose. Một số axit amin như alanin, arginine,

asparagine, cysteine, axit glutamic, glycine, histidine, izoleucin, leucine,

lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine, và

valine cũng có thể được tìm thấy trong cà phê xanh. Ngoài ra, hạt cà phê còn

chứa vitamin phức hợp B, niacin (vitamin B3 và PP) và chlorogenic acid từ

7% đến 12%, gấp ba đến năm lần so với caffein (Solange I. Mussatto, 2011).

Trong số các chất có trong thành phần hóa học của cà phê, chỉ có chất

caffein có khả năng chịu nhiệt, nghĩa là không bị phá hủy bởi quá trình rang.

Các chất nhu protein, đuờng, chlorogenic acid, trigonelline và lipid có thể

được bảo quản hoặc thậm chí bị phá hủy và biến thành sản phẩm phản ứng

trong quá trình rang cà phê (Alonso-Salces, 2009).

Hợp chất phenolic chủ yếu được tìm thấy trong hạt cà phê xanh là CGA

(lên tới 12% chất rắn), là este của axit trans-cinnamic và axit quinic. Sự kết

họp giữa axit hydroxycinnamic với các axit amin (cinnamoyl amides) hoặc

glycosides (cinnamoyl glycosides) cũng đã được trình bày cụ thể trong các

nghiên cứu trước đó (Belitz và cộng sự, 2009; Alonso-Salces, 2009). Bên

cạnh đó, CGA còn có các tác dụng khác như bảo vệ gan, hạ đường huyết và

các hoạt động kháng vi-rút (Iwai, 2004). Các hợp chất phenol khác như

tannin, lignan và anthocyanins được tìm thấy trong hạt cà phê xanh với lượng

thấp hơn (Farah, 2008).

Thành phẩn lipid trong hạt cà phê xanh chủ yếu gồm triacylglycerols,

sterol, tocopherols và diterpene, trong đó sterol chiếm đến 20% tổng số lipid

(Speer, 2006).

15

Quá trình rang cà phê sẽ gây ra các thay đổi đối với các thành phần trong

hạt cà phê vì một số hợp chất sẽ bị suy thoái hoặc biến đổi dẫn đến sự biến

đổi về hương thơm, hương vị và màu sắc. Đe tránh mất mát một số hợp chất

có lợi cho sức khỏe, người ta tìm ra các phương pháp chiết xuất cà phê xanh

với nước nóng, rượu hoặc hỗn hợp rượu - nước (Alves, 2010).

1.2.4.2. Tác dụng của cà phê xanh

Lợi ích của cà phê xanh đã bắt đầu được nghiên cứu từ nhiều năm về

trước. Kết quả của các nghiên cứu đã cho thấy cà phê xanh có thể mang lại lợi

ích sức khoẻ nhất định. Dưới đây là một số điểm chính từ những nghiên cứu

sẵn có về cà phê xanh:

• Giảm cân:

Chiết xuất cà phê xanh có thể có lợi cho những người muốn giảm cân

(Igho Onakpoya, 2010).

Các nhà khoa học đã chứng minh rằng chiết xuất cà phê xanh có thể

bảo vệ chống lại sự tăng cân bằng cách chống lại sự hấp thụ chất béo và thúc

đẩy quá trình trao đổi chất béo của gan (Hiroshi Shimoda và cộng sự, 2006).

• Điều chỉnh huyết áp:

Cà phê xanh có lợi cho những người tăng huyết áp. Một số nghiên cứu

chỉ ra rằng những người sử dụng cà phê xanh cho thấy có sự giảm huyết áp

đáng kể so với những người khác.

• Bệnh Alzheimer:

Nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng chiết xuất cà phê xanh có thể

đóng vai trò quan trọng với điều trị bệnh Alzheimer. Trong một nghiên cứu

năm 2012 của Neuroscience về Dinh dưỡng, các cuộc thử nghiệm trên

chuột tiết lộ rằng cà phê xanh không chứa caffeine giúp bảo vệ sự chuyển

hóa năng lượng trong não (một yếu tố nguy cơ cho bệnh Alzheimer) (Lap

Ho và cộng sự, 2013).

Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy rằng chiết xuất cà phê xanh giúp chống

lại sự đề kháng insulin.

16

Có một số lo ngại rằng việc tiêu thụ cà phê xanh lâu dài hoặc thường

xuyên có thể làm tăng mức homocysteine (một loại axit amin liên quan đến

bệnh tim khi nồng độ của nó ở mức cao). Ngoài ra, cà phê xanh có thể cản trở

việc kiểm soát lượng đường trong máu. Với những lo ngại về sức khoẻ này,

điều quan trọng là tìm kiếm lời khuyên y tế trước khi tiêu thụ cà phê xanh.

Cũng cần lưu ý rằng ít người biết đến tính an toàn của việc sử dụng các

sản phẩm bổ sung có chứa chiết xuất cà phê xanh một cách lâu dài hoặc

thường xuyên. Trong một số trường hợp, sản phẩm có thể được sản xuất với

liều lượng chiết xuất cà phê xanh và các chiết xuất thảo mộc khác nhau ở từng

sản phẩm. Trong các trường hợp khác, sản phẩm có thể bị nhiễm với các chất

khác như kim loại. Ngoài ra, tính an toàn của sản phẩm bổ sung chứa chiết

xuất cà phê xanh ở phụ nữ có thai, bà mẹ cho con bú, trẻ em và những người

có tình trạng y tế hoặc đang dùng thuốc vẫn chưa được khẳng định.

1.3. Tổng quan về enzyme pectinase

1.3.1. Giới thiệu về Enzyme pectinase

Pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy pectin và sản phẩm của quá

trình này là galacturonic acid, galactose, arabinose, methanol… Đây là nhóm

enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, chỉ đứng sau amylase và

protease. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.

Những enzyme này có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái

cây và rau quả.

Hình 1.4. Tác động của pectinase lên phân tử pectin2

2 Nguồn: http://thongthai.work/ung-dung-cua-enzyme-pectinase-trong-cong-nghe-thuc-pham/

17

1.3.2. Ứng dụng của enzyme pectinase

Hiện nay, pectinase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp và đem lại

giá trị lợi nhuận rất lớn.

Ứng dụng của pectinase chủ yếu trong các lĩnh vực sau:

- Trong sản xuất thực phẩm, pectinase được sử dụng dạng tinh khiết,

không dùng chế phẩm dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lệ pectinase cô

đặc trong quá trình sử dụng thông thường từ 0,03 – 0,1% trên lượng nguyên

liệu đem chế.

- Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các

nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ

tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ

dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu

nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ

pectinase phân giải pectin có trong dịch quả làm cho sản phẩm nước quả

trong suốt không bị đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzyme

pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tannin và những chất hoà

tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng thành phẩm.

- Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên

cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái cây,

người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm.

Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được màu sắc

tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theo ý muốn bằng cách điều khiển

những phản ứng enzyme.

1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất Chlorogenic acid từ cà phê trên thế

giới và ở Việt Nam

Hiện nay đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về CGA trong cà phê và

thấy rằng hàm lượng của CGA trong cà phê phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong

đó hàm lượng CGA thay đổi nhiều nhất dựa theo yếu tố giống cà phê nhau:

18

Hàm lượng CGA không khác nhau đáng kể ở các khu vực trồng, nhưng

lại khác nhau giữa các mùa vụ đối với giống cà phê Arabica ở Brazil, hàm

lượng CGA đạt khoảng 60 - 65mg/g (6 – 6,5%) chất khô.

Hàm lượng CGA trong mẫu nhân cà phê xanh của 21 giống khác nhau

của hai khu vực Cameroon và Congo có hàm lượng thay đổi từ 0,8% - 11,9%

chất khô (C. Campa và cộng sự, 2005).

Hàm lượng CGA trong cà phê rang có thể bị ảnh hưởng bởi giống cà

phê bởi vi hàm lượng CGA ở cà phê Robusta cao hơn Arabica.

Hàm lượng CGA khác nhau trong các mẫu cà phê rang chỉ đạt từ 5,25 -

17,1mg/g.

Đối với nhân cà phê xanh chất lượng thấp chứa hàm lượng polyphenol

4,5%, hàm lượng CGA là 8,35%.

 Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu về quá trình thu nhận các

hợp chất tự nhiên trong đó có CGA từ cà phê nhân (cà phê xanh) và đã công

bố nhiều phương pháp khác nhau.

Cao cà phê xanh được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt. Tiến hành

nghiên cứu bột và dịch chiết với các dung môi isopropanol và nước với các tỉ

lệ khác nhau. Khả năng chống oxi hóa của bột và dịch chiết này được tìm

thấy. Với dung môi tỉ lệ isopropanol: nước là 60 : 40 hàm lượng của cao chiết

là cao nhất: 27% đối với cà phê arabica và 29% đối với cà phê Robusta. Hàm

lượng polyphenol tổng đạt 31,7% - 32,2% trong cao chiết này.

Với nguồn nguyên liệu là bột cà phê xanh, quá trình tách chiết các hợp

chất được khảo sát. Quá trình tách chiết sử dụng methanol 60% với tỉ lệ dung

môi/nguyên liệu là 40ml/g nguyên liệu trong thời gian 90 giờ cho hàm lượng

CGA thu nhận đạt 16mg/g nguyên liệu.

Rohit Upadhyay và cộng sự đã chứng minh rằng trích ly dưới sự hỗ trợ

của vi sóng (MAE) được coi là sự lựa chọn tiềm năng so với phương pháp ly

trích sử dụng dung môi để ly trích các hợp chất phenol từ thực vật. Đối với

19

nguyên liệu là nhân cà phê xanh, các dịch ly trích với dung môi là cồn và

nước với sự hỗ trợ của vi sóng được xác định hiệu suất trích ly, hàm lượng

chlorogenic acid, caffeine và polyphenol tổng. Dịch trích ly cũng được đánh

giá khả năng khử gốc tự do (1.1 -diphenyl-β-picrylhydrazyl) (Rohit

Upadhyay, 2013). Trong điều kiện tối ưu: nhiệt độ: 50oC, thời gian 5 phút,

điện năng 800W, hàm lượng chlorogenic acid đạt cao nhất với dung môi là

nước; hàm lượng chlorogenic acid là 31 - 62%. Hiệu suất ly trích bằng MAE

trong điều kiện tối ưu cao hơn so với ly trích bằng dung môi trong cùng điều

kiện 5 phút, 50oC. Các dịch chiết có hoạt tính khử gốc tự do >75% ngay cả ở

nồng độ 25vòng/phút. Quá trình MAE có thể dự đoán và kiểm soát được khi

áp dụng vào trong công nghiệp (Santana và cộng sự, 2006).

Phương pháp CO2 siêu tới hạn là một trong những công nghệ sạch và

thân thiện với môi trường mới nhất đối với việc chế biến các sản phẩm thực

phẩm và dược phẩm (Santana và cộng sự, 2006). Phương pháp này đã được

Siti Machmudah và cộng sự thực hiện để chiết chlorogenic acid và cafein

trong cà phê xanh. Các thí nghiệm đã được khảo sát trong các thiết bị chiết

liên tục với tỷ lệ cà phê nhân và nước khác nhau, các tác giả đã thu được

chlorogenic acid có lẫn cafein (Siti Machmudah, 2008).

Nghiên cứu sử dụng phương pháp tách chiết CO2 siêu tới hạn cũng

được Carmen Mihaela Topala đề cập đến để tách các hợp chất tự nhiên có

trong cà phê xanh. Nghiên cứu chứng minh rằng phương pháp này tách chiết

các hợp chất tự nhiên có hiệu suất cao hơn so với các phương pháp sử dụng

dung môi thông thường. Do CO2 là một dung môi xanh, không cháy, có tính

tương đối, độc tính thấp (Carmen M. Topala, 2015).

Quá trình tinh sạch nhằm mục đích nâng cao hàm lượng chlorogenic

acid. Ở quy mô phòng thí nghiệm, các tác giả đã tiến hành các phương pháp

tinh sạch axit Chlorogenic trong nhân cà phê xanh như sau:

20

Phương pháp 1: sử dụng muối (NH4)2SO4 để loại protein, sau đó dùng

petroleum ether để loại lipid và các chất màu, dịch chiết tiếp tục được xử lý

CHCl3 để loại caffeine và sáp. CGA được xử lý với ethyl acetate và làm khan

bằng Na2SO4 sau đó lọc qua giấy lọc và cô đặc.

Phương pháp 2: dịch chiết được lọc qua giấy lọc 0,2µm, rồi lọc gel C18

Sep-Pak 51910, giải hấp bằng methanol 70%.

Dịch chiết CGA từ cà phê xanh được chiết bằng nước nóng 80oC,

methanol 70%, ispropanol 60% cũng tiến hành tinh sạch với than hoạt tính và

theo phương pháp của Rakotomalala cho thấy không có sự khác biệt nhiều

giữa hai phương pháp tinh sạch, hàm lượng CGA trong dịch chiết đạt từ 4,67

– 5,87% chất khô.

Một số phương pháp tinh sạch chlorogenic acid đã được nghiên cứu và

đăng ký bằng sáng chế. Tác giả Patent CN 103232346 A dùng ethanol 75 -

85% để tách chiết chlorogenic acid từ quả cà phê xanh sau đó ly tâm, siêu lọc

tách các chất có khối lượng phân tử lớn. Dịch chứa chlorogenic acid sau đó

được cô đặc, làm sạch trên nhựa D-140. Với quy trình này khoảng 70% tổng

lượng chlorogenic acid trong nguyên liệu được tách chiết.

Tác giả Patent CN 103497106 A dùng 0,1% sodium sulfite tách

chlorogenic acid từ quả cà phê xanh. Dịch chiết sau đó được loại caffein bằng

nhựa XAD-16 macroporous sau đó thu chlorogenic acid bằng hấp thụ trên

nhựa LX-28 macroporous, dịch làm sạch sau đó được tẩy màu bằng than hoạt

tính và kết tinh để thu chế phẩm có độ tinh khiết 90%.

Trong chế biến cà phê, quá trình tách chiết các chất hòa tan có trong cà phê

gặp trở ngại do hai thành phần pectin và cellulose chiếm chủ yếu trong quả cà phê

gây ra. Hai thành phần này là hai thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có cấu trúc sinh

học khá bền vững và chúng vốn là lớp che chở tế bào và chất liên kết tế bào khi

quả cà phê còn sống (R. J. Clarke, 1987). Nhận thấy cấu trúc này khi ở trạng thái

mất nước càng trở nên bền vững, chúng chỉ có thể bị phá hủy khi dùng các tác

nhân axit, bazơ mạnh mà những tác nhân này không được khuyến khích trong chế

21

biến thực phẩm ngày nay (R. J. Clarke, 1987). Để giải quyết vấn đề này, nhận thấy

có thể ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính enzyme pectinase và

cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất pectin và cellulose. Ngày nay

việc hướng đến sử dụng chế phẩm vi sinh vật trong chế biến là hướng đi mới, hiệu

quả vì nâng cao chất lượng sản phẩm và đồng thời tăng khả năng chiết các chất

hòa tan (Lê Hồng Phú và cộng sự, 2008).

Các thử nghiệm để tách chiết CGA từ cà phê xanh cũng đã được nghiên

cứu ở Việt Nam. Trần Phương Thảo (2019) khi nghiên cứu tách chiết CGA từ

cà phê Robusta đã sử dụng phương pháp chiết ngâm và kết quả thu được

5,31%CGA/g chất khô. Trong cùng nghiên cứu đó, ở phương pháp chiết sử

dụng vi sóng, thu được 5,17%CGA/g chất khô.

Một nghiên cứu khác về CGA tại Việt Nam là nghiên cứu thu nhận

CGA từ cây Kim ngân hoa làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm tra chất

lượng thuốc. Kết quả sau khi bỏ tạp chất thu được lượng CGA là 19,66% (Lê

Thị Thu Hiền, 2010).

Hiện nay, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về tách chiết và tinh

sạch CGA còn khá hạn chế. Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của

pectinase trong tách chiết các hợp chất tự nhiên và sản xuất đồ uống lại khá

phong phú.

22

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được điều kiện tối ưu để thu nhận CGA trong quả cà phê xanh.

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Xác định điều kiện thích hợp thu nhận CGA trong quả cà phê xanh:

+ Tỷ lệ cơ chất - dung môi

+ pH dung dịch đệm

+ Nồng độ enzyme

+ Nhiệt độ thuỷ phân

+ Tốc độ khuấy

+ Thời gian thuỷ phân

- Tối ưu hóa quy trình chiết xuất CGA từ quả cà phê xanh.

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính chống oxy hóa của CGA

- Xác định điều kiện sấy chân không thu nhận CGA dạng bột

2.3. Vật liệu nghiên cứu

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Quả cà phê xanh Arabica (Coffea Arabica) được

thu hái vào tháng 8 năm 2019 ở huyện Ia Grai - tỉnh Gia Lai.

Vật liệu nghiên cứu: Cà phê xanh nguyên quả được rửa sạch, sấy ở

50oC tới độ ẩm 15% sau đó nghiền tới kích thước 1 – 2mm.

Chủng Aspergillus niger CF5 từ bộ sưu tập giống của bộ môn Công nghệ

Vi sinh – Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm Nghiệp.

2.3.2. Hoá chất và thiết bị

Hóa chất: Các hóa chất dùng trong thí nghiệm có độ tinh sạch và chất

lượng cao từ các hãng uy tín: chất chuẩn CGA 95% (Sigma Aldrich), ethanol

95%, acid sunfuric đặc (>99%), (NH4)2SO4, 3,5 – Dinitrosalisilic…

23

Thiết bị: Trong quá trình thí nghiệm, một số trang thiết bị và máy móc đã

được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp như: cân phân tích, máy

đo pH, tủ hút hóa chất, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vi sinh vật vô trùng, máy đo

quang phổ, máy vortex, máy lắc ổn nhiệt. Ngoài ra còn sử dụng các dụng cụ cần

thiết như ống eppendorf, pipetman, bình tam giác, bình trụ, nhiệt kế…

2.4. Phương pháp nghiên cứu

Quả cà phê sau khi được thu hái sẽ được loại bỏ tạp chất, rửa sạch sau đó

đem sấy khô và nghiền bột.

2.4.1. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA

Bản chất của quá trình tách chiết là sự chiết rút chất hòa tan trong chất

lỏng hay chất rắn bằng một dung môi nhờ quá trình khuếch tán các chất giữa

các môi trường có nồng độ khác nhau. Hiệu quả của quá trình trích ly phụ

thuộc vào nhiều yếu tố.

CGA được tách chiết từ quả cà phê xanh theo phương pháp của Belay

và cộng sự (2009) có thay đổi một số điều kiện nghiên cứu. Các yếu tố ảnh

hưởng đến quá trình tách chiết CGA bao gồm: tỷ lệ cơ chất – dung môi; nồng

độ enzyme; độ pH; nhiệt độ thuỷ phân; tốc độ lắc và thời gian thuỷ phân.

Toàn bộ thí nghiệm nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase thu nhận

bằng phương pháp nuôi cấy chủng Aspergillus niger CF5 trên môi trường

cám trấu (Nguyễn Việt Phương và cộng sự, 2019).

2.4.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình chiết xuất CGA

Để xác định tỷ lệ cơ chất- dung môi thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử

dụng 1g cà phê xanh nghiền, bổ sung đệm phosphate pH 5,0 theo các tỉ lệ 1 :

10, 1 : 20, 1 : 30, 1 : 40, 1 : 50, 1 : 60, 1 : 70, 1 : 80, bổ sung enzyme tỷ lệ 20

U/g, thuỷ phân ở 40oC trong 60 phút với tốc độ lắc 50 vòng/phút. Gia nhiệt

hỗn hợp tới 100oC trong 5 phút sau đó lọc qua giấy lọc Whatman No1. Xác

định hàm lượng CGA bằng phương pháp đo mật độ quang của dung dịch tại

OD324nm. Bố trí thí nghiệm theo bảng 2.1.

24

Bảng 2.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình

chiết CGA

TT Tỉ lệ cơ chất : dung môi (g/ml) Hàm lượng CGA (mg/g)

1 : 10 1

1 : 20 2

1 : 30 3

1 : 40 4

1 : 50 5

1 : 60 6

1 : 70 7

1 : 80 8

2.4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA

Để xác định nồng độ enzyme thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng

1g cà phê xanh nghiền, bổ sung enzyme với nồng độ thay đổi từ 0 U/g, 10

U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, đệm phosphate pH 5,0, tỉ lệ cơ

chất – dung môi nghiên cứu thích hợp, nhiệt độ thuỷ phân 40oC, thời gian 60

phút, tốc độ lắc 50 vòng/phút. Gia nhiệt hỗn hợp tới 100oC trong 5 phút sau

đó thu dịch lọc. Sản phẩm sau quá trình thủy phân được sắc ký bản mỏng và

xác định hàm lượng chlorogenic acid có trong dung dịch, kết quả được bố trí

theo bảng 2.2.

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA.

TT 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ enzyme (U) 0 10 20 30 40 50 60 Hàm lượng CGA (mg/g)

25

2.4.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA

Để xác định độ pH của dung môi thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử

dụng 1g cà phê xanh nghiền, bổ sung đệm phosphate với pH thay đổi từ 5,0;

5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; tỉ lệ cơ chất – dung môi, nồng độ enzyme nghiên cứu

thích hợp, nhiệt độ thuỷ phân 40oC, thời gian 60 phút, tốc độ lắc 50

vòng/phút. Dừng phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp tới 100oC trong 5

phút. Sản phẩm sau quá trình thủy phân được sắc ký bản mỏng để định tính sự

có mặt của CGA. Xác định hàm lượng chlorogenic acid, thí nghiệm bố trí

theo bảng 2.3.

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA

Hàm lượng CGA (mg/g) TT pH

1 5,0

2 5,5

3 6,0

4 6,5

5 7,0

6 7,5

2.4.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA

Để xác định nhiệt độ thuỷ phân thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng

1g cà phê xanh nghiền, thuỷ phân ở các nhiệt độ khác nhau từ 20, 30, 40, 50 ,

60oC. Bổ sung đệm phosphate với pH nghiên cứu thích hợp; tỉ lệ cơ chất –

dung môi, nồng độ enzyme nghiên cứu thích hợp, thời gian 60 phút, tốc độ lắc

50 vòng/phút. Dừng phản ứng, thu dịch lọc sau đó định tính CGA bằng sắc ký

bản mỏng. Xác định hàm lượng chlorogenic acid trong dịch thủy phân và bố

trí thí nghiệm theo bảng 2.4.

26

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA

TT Nhiệt độ (oC) Hàm lượng CGA (mg/g)

20 1

30 2

40 3

50 4

60 5

2.4.1.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA.

Để xác định tốc độ lắc thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử dụng 1g cà

phê xanh nghiền bổ sung đệm phosphate với pH nghiên cứu thích hợp; tỉ lệ cơ

chất – dung môi, nồng độ enzyme, nhiệt độ nghiên cứu thích hợp, thời gian 60

phút, tốc độ lắc thay đổi từ 0, 40, 80, 120, 160 vòng/phút. Dừng phản ứng và

thu dịch lọc. Định tính CGA trong dịch chiết bằng sắc ký bản mỏng và xác

định hàm lượng chlorogenic acid trong thí nghiệm theo bảng 2.5.

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA

TT Tốc độ lắc (vòng/phút) Hàm lượng CGA (mg/g)

0 1

40 2

80 3

120 4

160 5

2.4.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA

Để xác định thời gian thuỷ phân thích hợp, tiến hành thí nghiệm sử

dụng 1g cà phê xanh nghiền bổ sung đệm phosphate với pH nghiên cứu thích

hợp; tỉ lệ cơ chất – dung môi, nồng độ enzyme, nhiệt độ, tốc độ lắc nghiên

cứu thích hợp, thời gian thuỷ phân thay đổi từ 10, 30, 60, 90, 120 phút. Gia

27

nhiệt hỗn hợp đến 100oC trong 5 phút, thu dịch lọc và định tính CGA. Hàm

lượng chlorogenic acid trong dịch thủy phân được xác định và bố trí thí

nghiệm theo bảng 2.6.

Bảng 2.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình

chiết xuất CGA

TT Thời gian (phút) Hàm lượng CGA (mg/g)

1 10

2 30

3 60

4 90

5 120

2.4.1.7. Phương pháp định tính CGA bằng sắc ký bản mỏng (TLC)

CGA được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) theo

phương pháp của Mirna và cộng sự (2013).

 Nguyên tắc

TLC là phương pháp sắc ký tách hỗn hợp chất bằng cách cho pha động

di chuyển qua pha tĩnh. Pha động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng

chứa pha tĩnh hấp thụ. Tại đây, chất cần phân tích sẽ tương tác với chất hấp

thụ nhờ tính có cực của chúng. Do sự tương tác này mà chất phân tích sẽ

chuyển động chậm hơn trong hệ thống sắc ký. Chất phân tích có ái lực yếu

hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanh hơn và đạt tới khoảng cách chuyển

dịch lớn hơn so với chất có ái lực cao hơn. Nhờ vậy mà các chất được phân

tách trong quá trình chạy sắc ký ở các vị trí khác nhau.

 Tiến hành thí nghiệm

Sấy bản sắc ký ở nhiệt độ 50C trong thời gian 120 phút để pha tĩnh

khô hoàn toàn sau đó phân bổ mẫu phân tích lên bản sắc ký. Thiết kế khoảng

cách các điểm chấm trên bản sắc theo số lượng mẫu phân tích.

28

Dùng ống mao quản chấm 2µl mỗi loại chất cần phân tích lên điểm

chấm trên bản sắc ký theo thứ tự thiết kế kết hợp sấy khô.

Chuyển bản sắc ký vào bình sắc ký bản mỏng có chứa pha động là hệ

dung môi (butanol: axit acetic: nước tỷ lệ 6:2:2) đã bão hòa. Mẫu phân tích

cách pha động khoảng 1cm. Khi pha động đã chạy hết mép trên của pha tĩnh,

lấy bản sắc ký ra và sấy ở 80C tới khô hoàn toàn, tiếp tục nhúng vào dung

dịch hiện màu 10% H2SO4 đậm đặc trong etanol tuyệt đối. Đem sấy ở 100C

trong 10 phút hoặc đến khi hiện màu. Thành phần trong dịch đường được

định tính bằng cách so sánh với đường chạy chất chuẩn.

2.4.1.8 Phương pháp xác định hàm lượng CGA bằng máy đo quang phổ

a. Xây dựng đường chuẩn CGA

Xây dựng đường chuẩn CGA dựa theo Yang Sun và cộng sự (2017).

Theo đó độ hấp thụ của CGA tại bước sóng 324nm là tốt nhất.

Tiến hành lấy từ mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch, lắc đều, sau đó để ổn

định dung dịch trong 10 phút và đo OD324nm (Bảng 2.7).

Đường chuẩn có dạng:

y = ax + b

Trong đó: Y là OD324nm

x là nồng độ chất chuẩn CGA (mg/ml)

Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn CGA

Ống ĐC Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4

0 0,4 0,6 0,8 1 VCGA (ml)

1 0,6 0,4 0,2 0 VNước cất (ml)

OD324nm

b. Xác định hàm lượng CGA bằng máy đo quang phổ

Dựa trên đường chuẩn đã xây dựng, hàm lượng CGA được tính theo

công thức sau:

29

(mg/g)

Trong đó: Cx là hàm lượng CGA trong dịch pha loãng (mg/ml)

f là số lần pha loãng

V là thể tích ban đầu (ml)

100 là hệ số quy đổi đơn vị

2.4.1.9. Xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC

HPLC là phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha

tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc

một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biết

bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp được sử dụng

rộng rãi vì có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp

chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân huỷ nhiệt.

Định lượng CGA thu được trong dịch chiết từ quả cà phê xanh bằng hệ

thống HPLC Agilent 1260 theo thiết kế ở bảng 2.8. sau

Bảng 2.8. Thiết kế chế độ chạy hệ thống HPLC

Pha động: Pha A: H2O siêu lọc, focmic acid 0,1%

Pha B: Acetonitrile 100%.

Mẫu: Chất chuẩn: 5-CGA

Mẫu thử: dịch chiết CGA thí nghiệm kiểm tra

Điều kiện phân tích: Nhiệt độ: 20oC

Detector uv-Vis: 320 và 280 nm

Tốc độ dòng: 1ml/phút

Thể tích bơm 10µl

Thời gian phân tích: 29 phút

 Xây dựng đường chuẩn CGA bằng HPLC.

Tiến hành chạy thử các nồng độ CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao HPLC, đo diện tích peak và lập đường chuẩn CGA.

30

Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm xây dựng dường chuẩn CGA bằng HPLC

Nồng độ CGA (µg/ml) 10 20 50 100 200

Diện tích peak

Đường chuẩn có dạng: y = ax + b

Trong đó: y là Diện tích peak

x là Nồng độ CGA (µ/ml)

2.4.2. Phương pháp tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA

Mô hình tối ưu hoá

Dựa vào khoảng ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả tách chiết

chlorogenic acid từ quả cà phê xanh, tiến hành mô hình hóa và tối ưu hóa quá

trình tách chiết chlorogenic acid bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

bậc hai Box – Behnken.

Bảng 2.10. Các biến số và khoảng chạy

Đơn Giá trị Khoảng biến Biến số Yếu tố ảnh hưởng vị trung tâm đổi

Tỷ lệ NL chất rắn/ g/ml 50 10 X1 dung môi

Nồng độ enzyme U/g 40 10 X2

2

Thời gian phút 60 30 X3

2 + b3X3+ b33X3

Hàm mục tiêu là Y: Hàm lượng chlorogenic acid (mg/g) 2+ b2 X2 + b22 X2 Dạng mô hình: Y = b0 + b1X1 + b11 X1

+ b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3.

Với các mức thì nghiệm như trên, tiến hành thực hiện tách chiết theo mô

hình được xây dựng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box –

Behnken. Ma trận thực hiện được giới thiệu và kết quả được giới thiệu ở bảng

2.11 sau:

31

Bảng 2.11. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng

CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau

Hàm lượng CGA TT X1 X2 X3 (mg/g)

1 40 30 60

2 60 30 60

3 40 50 60

4 60 50 60

5 40 40 30

6 60 40 30

7 40 40 90

8 60 40 90

9 50 30 30

10 50 50 30

11 50 30 90

12 50 50 90

13 50 40 60

14 50 40 60

15 50 40 60

16 50 40 60

17 50 40 60

Các thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp. Từ mô hình thu được, xác

định điều kiện tối ưu để tách chiết chlorogenic acid từ hạt cà phê xanh.

32

2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính CGA thu nhận

2.4.3.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Tiến hành cấy 1% (v/v) canh trường chứa các chủng vi khuẩn thử

nghiệm đã được để qua đêm vào các ống nghiệm riêng biệt có chứa môi

trường thích hợp bổ sung 1% (w/v) glucose hoặc 1% (w/v) CGA. Các ống được nuôi ở 37oC trong tủ nuôi ấm. Sau đó, cấy trang các mẫu canh trường

chứa vi sinh vật đó ở thời điểm ban đầu và sau 24 giờ trên môi trường rắn.

Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa. Thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.12.

Bảng 2.12. Lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi trên môi trường lỏng.

Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi (cfu/ml)

Chủng thử nghiệm

Môi trường + 1% Glucose Môi trường + 1% CGA

Bacillus clausii

Escherichia. coli

2.4.3.2. Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Hoạt động chống oxy hóa: hoạt động loại bỏ gốc tự do được phân tích thông qua thử nghiệm 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH) (Brand Williams 1995, Shela 2003, Kumar 2013) là phương pháp đã được công nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxy hóa. Chất thử được hòa trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và DPPH được pha trong ethanol 96%. Sự hấp thụ của DPPH ở λ=515 nm được xác định sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng. Kết quả các thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình của ít nhất 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05).

Mẫu được pha trong DMSO 100% với nồng độ 4mg/ml đối với dịch chiết thô và 1mg/ml với mẫu tinh sạch. Sử dụng flavonoid 1 mM hoặc axit ascorbic 5 mM trong DMSO 10% làm đối chứng dương.

Mẫu được nhỏ trên phiến vi lượng 96 giếng với dung dịch DPPH để được nồng độ cuối của mẫu thử trong phản ứng từ 200 μg/mL đến 12,5 μg/mL (đối với mẫu chiết thô) và từ 50 μg/mL đến 3,1 μg/mL (mẫu tinh sạch).

Ủ ở 37oC trong 30 phút và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng λ=515

nm trên thiết bị đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ).

33

Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC%): Giá trị trung bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương

trình xử lý số liệu Excel theo công thức: ODThí nghiệm

SC (%) = [100

Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducan.

Xác định SC50:

Mẫu (chất thử) được pha loãng thành các nồng độ giảm dần, lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ. Hiệu quả bẫy gốc tự do tạo bởi DPPH của mỗi mẫu được tính dựa trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank) và đối chứng âm tính. Mẫu có biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH được thực hiện các bước tiếp theo để tìm giá trị IC50 (µg/ml, µM/ml). Giá trị IC50 là nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng.

2.4.4. Phương pháp sấy chân không Dịch CGA sau khi thuỷ phân được cô đặc 20 lần bằng thiết bị cô chân không sau đó sấy chân không tại các nhiệt độ 50oC, 60oC, 70oC với thể tích mẫu 200 ml/mẫu tới độ ẩm 7%. Hàm lượng CGA sau khi sấy chân không được xác định bằng phương pháp HPLC. Thí nghiệm được xây dựng theo bảng 2.13. sau:

Bảng 2.13. Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không

Thời

Nhiệt độ

Chế độ

Độ ẩm

Khối lượng mẫu

Hàm lượng CGA

gian sấy

sấy mẫu

(%)

thu được (g)

(mg/g)

sấy (oC)

(giờ)

50

Chân

60

không

70

2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Số liệu thí nghiệm được thu thập sau 3 lần lặp lại trên mỗi thí nghiệm,

xử lý bằng phần mềm Excel và Design Expert 11.

34

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

 Xử lý nguyên liệu

Quả cà phê sau khi thu hái được loại bỏ tạp chất, rửa sạch dưới nước

máy, tiến hành sấy ở nhiệt độ 50oC tới độ ẩm 15% sau đó nghiền nhỏ tới kích

thước 1 – 2mm và bảo quản lạnh (nhiệt độ 4oC).

B

A

C

Hình 3.1. Quả cà phê xanh sau khi xử lý (A), sấy (B), nghiền và rây (C)

 Xây dựng đường chuẩn CGA

Xây dựng đường chuẩn CGA với chất chuẩn CGA của Sigma Aldrich

tại các nồng độ từ 0,4 – 1,0 mg/ ml thu được kết quả biểu diễn ở bảng 3.1 và

hình 3.2.

Bảng 3.1. Giá trị nồng độ CGA đo ở bước sóng 324 nm

Ống ĐC Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4

0 0,4 0,6 0,8 1 VCGA (ml)

1 0,6 0,4 0,2 0 VNước cất (ml)

0,335 0,569 0,702 0,825 0,942 OD324nm

35

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CGA

Đường chuẩn CGA được xác định là:

Y = 0,6114x + 0,3322

R2 = 0,9975

3.1. Kết quả xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA

3.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất : dung môi đến quá trình chiết CGA

Tỷ lệ cơ chất – dung môi ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân do tỷ lệ

này ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán của chất cần chiết xuất vào dung

môi. Tỷ lệ dung môi - nguyên liệu cao cho phép chiết xuất hoàn toàn chất

chiết từ nguyên liệu nhưng dịch chiết thu được loãng, tốn chi chí để làm đặc

dịch chiết. Ngược lại, tỷ lệ dung môi - nguyên liệu thấp dẫn đến hiệu suất quá

trình chiết xuất không cao bởi lẽ quá trình này sẽ dừng lại khi đạt cân bằng

nồng độ chất chiết trong nguyên liệu và dung môi. Lượng dung môi quá lớn

hoặc quá nhỏ hơn so với lượng cơ chất cũng gây ảnh hưởng lớn tới hiệu suất

của quá trình thuỷ phân. Do vậy, nghiên cứu tỷ lệ cơ chất – dung môi đến quá

trình chiết xuất CGA được thực hiện với tỷ lệ 1 : 10 đến 1 : 80, kết quả thu

được biển diễn trên hình 3.3.

36

Hình 3.3. Đồ thị mối liên hệ tỷ lệ cơ chất – dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA

Qua đồ thị hình 3.3. cho thấy hiệu quả tách chiết CGA cao nhất đạt

34,38 mg/g khi thuỷ phân quả cà phê xanh với tỉ lệ 1 - 50 và giảm dần khi

tăng tỉ lệ này lên 1 - 80 (hàm lượng CGA đạt 28,57 mg/g). Nguyên nhân có

thể do đây là thí nghiệm đầu tiên nên các đơn yếu tố chưa tối ưu dẫn tới lượng

CGA tách được còn giới hạn, tiếp tục tăng tỷ lệ cơ chất – dung môi với cùng

điều kiện thuỷ phân cũng không khiến cho hàm lượng CGA tăng lên.

M: Marker

CGA

1. Tỷ lệ 1-10

2. Tỷ lệ 1-20

3. Tỷ lệ 1-30

4. Tỷ lệ 1-40

5. Tỷ lệ 1-50

6. Tỷ lệ 1-60

7. Tỷ lệ 1-70

8. Tỷ lệ 1-80

Hình 3.4. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tới quá trình chiết xuất CGA

37

Theo kết quả sắc ký đồ hình 3.4, nhận thấy đường chạy của các mẫu thí nghiệm có xuất hiện vạch tương ứng vị trí của CGA chuẩn. Như vậy trong dung dịch thu được sau quá trình thủy phân có chứa CGA.

Trong các nghiên cứu về tách chiết hợp chất tự nhiên có trong thực vật, tỷ lệ cơ chất- dung môi cũng là một yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu suất của quá trình. Theo Vũ Kim Dung (2015), kết quả nghiên cứu các điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS đã xác định tỷ lệ pectin- đệm citrate phosphate ở 3% cho kết quả cao nhất. Trong nghiên cứu về tách chiết polyphenol nhóm tanin từ vỏ keo lá tràm, tỷ lệ rắn:lỏng tối ưu là 2g: 70ml, tương ứng với 3,5% (Lê Tự Hải và cộng sự, 2011). Đỗ Biên Cương và các công sự (2010) trong nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotic MOS đã đề cập đến sự quan trọng của lượng cơ chất trong dung môi, tỷ lệ bã cơm dừa 10% (w/v) được lựa chọn để thực hiện tiếp nghiên cứu.

Theo kết quả thu được ở hình 3.3, lựa chọn tỷ lệ 1-50 cho các thí

nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA

Lựa chọn nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả chiết xuất cao nhất

đồng thời để chi phí sản xuất được hợp lý nhất.

Thí nghiệm được tiến hành với enzyme bổ sung thay đổi theo tỷ lệ nồng độ từ 0 U/g, 10 U/g, 20 U/g, 30 U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, pH 5,0, tỉ lệ cơ chất – dung môi 1 – 50, nhiệt độ thuỷ phân 40oC, thời gian 60 phút, tốc độ lắc 50 vòng/phút. Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị 3.5.

Hình 3.5. Đồ thị mối liên hệ nồng độ enzyme tới hàm lượng chiết xuất CGA

38

Kết quả hình 3.5 cho thấy hàm lượng CGA thu được trong các thí

nghiệm sử dụng enzyme cao hơn so với khi không sử dụng (thí nghiệm 0U/g

thu được 32,63mg/g). Khi nồng độ tăng từ 20 U/g – 40 U/g, hàm lượng CGA

trong dịch thuỷ phân ngày càng tăng lên, đạt cực đại tại 40 U/g (44,642

CGA

mg/g).

M: Marker 1. Nồng độ 0U/g 2. Nồng độ 10 U/g 3. Nồng độ 20 U/g 4. Nồng độ 30 U/g 5. Nồng độ 40 U/g 6. Nồng độ 50 U/g 7. Nồng độ 60 U/g

Hình 3.6. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ

enzyme tới quá trình chiết xuất CGA

Kết quả sắc ký đồ hình 3.6. cho thấy rõ ràng tại đường chạy số 4, số 5

và số 6 cho hình ảnh vết màu tạo ra các vệt nâu nằm trên đường chạy có thể

do thí nghiệm thuỷ phân cho sản phẩm vẫn nâu đậm nét hơn so với các đường

chạy còn lại.

Tỷ lệ enzyme- cơ chất là một yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hưởng lớn

tới quá trình thủy phân. Do đó mà trong những nghiên cứu về điều kiện tách

chiết các hợp chất, thí nghiệm về nồng độ enzyme luôn được tiến hành thực

hiện. Trong nghiên cứu tạo MOS từ bã cơm dừa, nồng độ enzyme endo-β-1,4-

mannanase được thử nghiệm với tỷ lệ từ 25-50 U/g, kết quả nồng độ enzyme

cho hiệu quả sử dụng cao nhất là 40U/g (Đỗ Biên Cương, 2010). Nghiên cứu

của Nguyễn Hồng Ly (2014) về điều kiện chuyển hóa pectin tạo POS cho

thấy, trong thí nghiệm về nồng độ enzyme, khi sử dụng Endo-

polygalacturonase ở nồng độ thấp (20-30U/g) thì hiệu quả tách chiết không

cao. Nồng độ enzyme quá cao (50-60U/g) lại cho ra các sản phẩm không

mong muốn.

39

Dựa vào kết quả hình 3.5, lựa chọn nồng độ enzyme 40 U/g để thực

hiện các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA

Mỗi enzyme đều có khoảng pH tối ưu khác nhau mà tại đó hoạt tính

enzyme đạt cao nhất. Dung dịch đệm chiếm phần thể tích lớn trong dịch thuỷ

phân, ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme vì vậy cũng ảnh hưởng rất lớn tới

kết quả quá trình thuỷ phân. Trong quá trình thủy phân cà phê, enzyme chịu tác

động từ nhiệt độ và thời gian, pH dịch thủy phân thay đổi, khuấy trộn cơ học.

Không chỉ ảnh hưởng tới enzyme, pH còn gây ảnh hưởng tới nguyên

liệu. Vì vậy mỗi loại nguyên liệu lại phù hợp với một độ pH nhất định. Trong

quá trình chiết xuất một số thành phần không mong muốn có thể tan theo dịch

chiết, các glycoside cũng có thể bị thuỷ phân khi sử dụng dung môi có độ pH

thấp. Thông thường dựa trên một số tiêu chí như: khả năng hoà tan chất cần

tách chiết, tính hoà tan của sản phẩm mong muốn… để lựa chọn dung môi với

độ pH phù hợp cho quá trình chiết xuất. Vì vậy, nghiên cứu xác định pH tối

ưu cho quá trình thủy phân cà phê xanh thu nhận CGA là hết sức cần thiết.

Nghiên cứu xác định pH của dung dịch đệm được thực hiện tại pH 5

đến pH 7,5 cho kết quả được biểu diễn theo hình 3.7.

Hình 3.7. Đồ thị mối quan hệ độ pH dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA

40

Đồ thị hình 3.7. cho thấy hàm lượng CGA thu được từ quả cà phê xanh

cao nhất tại điều kiện pH 5,5 (51,69 mg/g) sau đó giảm dần tại pH 7,5 (40,66

mg/g). Các nghiên cứu liên quan tới enzyme pectinase cho thấy enzyme này

hoạt động mạnh tại pH từ 4,5 – 5,5 tuỳ từng loại cơ chất đem thuỷ phân.

M: Marker

CGA

1. pH= 5,0

2. pH= 5,5

3. pH= 6,0

4. pH= 6,5

5. pH= 7,0

6. pH= 7,5

Hình 3.8. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của pH tới quá trình chiết xuất CGA

Nghiên cứu của D.R. Kashyap và P.K. Vohra (2001) cho thấy pectinase

từ Aspergillus niger hoạt động từ pH 4,5 – 6. Do vậy pH = 5,5 sử dụng để

thuỷ phân pectin trong quả cà phê xanh nhằm thu nhận CGA nằm trong

khoảng hoạt động tối ưu của enzyme này. Qua kết quả trên có thể lựa chọn

điều kiện pH 5,5 để tiếp tục tiến hành thí nghiệm tiếp theo.

3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA

Nhiệt độ trích ly làm tăng vận tốc và hiệu quả của quá trình trích ly do

làm tăng hệ số khuếch tán chất chiết và giảm độ nhớt dung môi, từ đó tạo điều

kiện thuận lợi cho quá trình trích ly. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao sẽ gây ra

những bất lợi như: phá hủy các glycoside, thúc đẩy sự oxy hóa và epimer hóa

các polyphenol, tăng chiết các chất khác gây khó khăn cho việc tinh chế.

Nhiệt độ quá thấp thường làm giảm hiệu quả của quá trình trích ly. Vì vậy,

trong nghiên cứu tách chiết cần xác định được nhiệt độ thích hợp cho quá

41

trình tách chiết sao cho không quá cao để tránh sự oxy hóa dịch chiết nhưng

cũng không quá thấp gây giảm hiệu quả quá trình chiết.

Nhiệt độ là yếu tố cốt yếu ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân. Hầu hết

mọi quá trình thuỷ phân với mọi cơ chất đều phải có sự gia nhiệt kể cả không

sử dụng enzyme. Nhiệt độ tác động tới bề mặt và cấu tạo cơ chất, giúp dung

môi hoạt động tốt và dễ dàng phân cắt cơ chất hơn. Do vậy, thí nghiệm xác

định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh được

thực hiện với nhiệt độ 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, 60oC. Kết quả thí nghiệm

được thể hiện tại đồ thị 3.9.

Hình 3.9. Đồ thị mối quan hệ của nhiệt độ và hàm lượng chiết xuất CGA

Kết quả cho thấy hàm lượng CGA ít thay đổi. Khi nhiệt độ thay đổi từ 20oC – 60oC, hàm lượng CGA thu được từ 32,49 – 53,82 mg/g. Đạt cao nhất tại nhiệt độ 50oC (53,82 mg/g). Hàm lượng CGA thu được thấp nhất tại nhiệt độ 20oC (32,49 mg/g) do nhiệt độ thấp làm enzyme hoạt động không hiệu quả

nên hiệu suất quá trình thuỷ phân thấp.

42

Nghiên cứu của Agnan M. Combo và Mario Aguedo (2012) cho thấy pectinase từ Aspergillus niger có phổ hoạt động tối ưu từ 40 – 60oC. Theo kết

quả ở thí nghiệm trên, mức nhiệt đem lại hiệu quả cao nhất cho quá trình chiết xuất CGA là 50oC vẫn nằm trong khoảng nhiệt độ hoạt động tối ưu của

CGA

pectinase.

C

C

C

M: Marker 1. Nhiệt độ 20oC o 2. Nhiệt độ 30 o 3. Nhiệt độ 40 o 4. Nhiệt độ 50 o 5. Nhiệt độ 60 C

Hình 3.10. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình chiết CGA

Các đường chạy của các mẫu thí nghiệm đều xuất hiện vạch tương ứng

vị trí của CGA chuẩn cho thấy sản phẩm dịch thuỷ phân đã tách được CGA từ

quả cà phê xanh. Dựa vào kết quả tại đồ thị hình 3.9 và sắc ký đồ hình 3.10,

chọn điều kiện nhiệt độ 50oC để tiếp tục nghiên cứu.

3.1.5. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA

Việc đảo trộn hỗn hợp bằng thiết bị lắc sẽ giúp cho dung môi và

enzyme khuyếch tán đều vào cơ chất đồng thời tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ

chất với dung môi làm tăng hiệu quả hoạt động của các đơn yếu tố, từ đó tăng

hiệu suất thuỷ phân chung. Tuy nhiên nếu tốc độ lắc quá cao có thể làm vỡ

cấu trúc của enzyme và ảnh hưởng liên kết giữa cơ chất với dung môi, cũng

làm giảm khả năng phân cắt cơ chất. Vì vậy tốc độ lắc cũng là một điều kiện

cần phải xác định trong quá trình thuỷ phân. Thí nghiệm xác định tốc độ lắc

thực hiện với các tốc độ 0, 40, 80, 120, 160 vòng/phút cho kết quả được biểu

diễn ở đồ thị hình 3.11.

43

Hình 3.11. Đồ thị mối quan hệ của tốc độ lắc và hàm lượng chiết xuất CGA

M: Marker

CGA

1. 0 vòng/phút

2. 40 vòng/phút

3. 80 vòng/phút

4. 120 vòng/phút

5. 160 vòng/phút

Hình 3.12. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá trình chiết xuất CGA

Kết quả phân tích cho thấy tại tốc độ lắc 80 vòng/phút thu được hàm

lượng CGA cực đại là 58,25 mg/g. Tại tốc độ lắc 40 vòng/phút thu được là 53,19

mg/g, tại tốc độ lắc 120 vòng/phút thu được là 51,38 mg/g. Có thể thấy sự chênh

lệch hàm lượng CGA tại 80 vòng/phút so với các tốc độ khác là rất lớn.

44

Theo một số nghiên cứu, tốc độ lắc nhiều hay ít phụ thuộc vào độ nhớt

của dung dịch. Với nghiên cứu có cơ chất là pectine, độ nhớt của dung dịch

này là rất lớn nên tốc độ lắc cao, dao động trong khoảng 100-500 vòng/phút

tùy thuộc nồng độ cơ chất (Vũ Kim Dung, 2015). Trong thí nghiệm này, cơ

chất là bột cà phê có lượng pectine không cao nên độ nhớt của dung dịch

thấp, vì vậy tốc độ lắc chọn để nghiên cứu tương đối thấp.

Như vậy chọn tốc độ lắc 80 vòng/phút là để tiếp tục thực hiện cho các

thí nghiệm tiếp theo.

3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất

CGA

Cùng với các yếu tố trên thì thời gian chiết cũng ảnh hưởng đến hiệu

suất thu hồi và chất lượng của dịch chiết. Hiệu quả trích ly thường tăng theo

thời gian trích ly. Thời gian ngắn thì hàm lượng polyphenol thu được thấp.

Tuy nhiên, thời gian dài quá dễ gây oxy hóa polyphenol tạo ra sản phẩm

không mong muốn làm giảm chất lượng của dịch chiết, giảm lượng các hợp

chất polyphenol thu được, tốn năng lượng và làm giảm hiệu suất sử dụng của

thiết bị.

Hình 3.13. Đồ thị mối quan hệ của thời gian thuỷ phân và hàm lượng chiết xuất CGA

CG A

45

M: Marker 1. 10 phút 2. 30 phút 3. 60 phút 4. 90 phút 5. 120 phút

Hình 3.14. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tới quá trình chiết xuất CGA

Kết quả tại đồ thị hình 3.13 và sắc ký đồ hình 3.14 cho thấy hàm lượng

CGA cực đại thu được là 58,18 mg/g không thay đổi nhiều so với thí nghiệm

trước đó (58,25 ± 1,0 mg/g). Kết quả này có thể do CGA trong mẫu cà phê

xanh đã được trích ly hết. Chọn thời gian thích hợp cho phản ứng thuỷ phân

quả cà phê xanh thu nhận CGA là 60 phút.

Trong thí nghiệm của Lê Tự Hải (2011) về ảnh hưởng của thời gian đến

quá trình chiết tách tanin, nhận thấy lượng tanin tách được càng nhiều khi

tăng thời gian thực hiện phản ứng từ 30 lên 75 phút và giá trị lúc này đạt mức

ổn định. Nghiên cứu của Đỗ Biên Cương về sử dụng bã cơm dừa tạo prebiotic

cũng cho thấy thời gian là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả

quá trình chuyển hóa.

3.2. Kết quả mô hình hoá và tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA

Nghiên cứu tách chiết có thể thực hiện bằng cách sử dụng đơn yếu tố -

one factor at a time approach (Chirinos và cộng sự, 2007; Kossah và cộng sự,

2010) hoặc dùng phương pháp bề mặt đáp ứng Response Surface

Methodology (RSM) (Kiassos và cộng sự, 2009; Pompeu và cộng sự, 2009;

Silva và cộng sự, 2007).

46

Phương pháp đơn yếu tố là phương pháp cổ điển, nghiên cứu ảnh

hưởng của từng yếu tố đến hàm mục tiêu. Khi yếu tố này được nghiên cứu thì

các yếu tố khác được giữ cố định. Chính do vậy, đối với cách tiếp cận đơn

yếu tố, ảnh hưởng của tương tác các yếu tố đến hàm mục tiêu không được

tính đến. Kết quả thu được chỉ cho điều kiện thích hợp cho quá trình tách

chiết nằm trong vùng tối ưu (Silva và cộng sự, 2007).

Phương pháp bề mặt đáp ứng là phương pháp thống kê sử dụng dữ liệu

thực nghiệm để xây dựng mô hình mô tả quá trình tách chiết trong đó có tính

đến ảnh hưởng đơn yếu tố và tương tác giữa các yếu tố đến hàm mục tiêu.

Phương pháp bề mặt đáp ứng khắc phục được các nhược điểm của phương

pháp đơn yếu tố và được sử dụng khá phổ biến hiện nay trong tối ưu hóa quá

trình tách chiết các hợp chất thứ cấp từ thực vật (Pompeu và cộng sự, 2009;

Radojkovic và cộng sự, 2012; Silva và cộng sự, 2007). Phương pháp này cũng

được dùng để tối ưu hóa quá trình tách chiết chlorogenic acid từ hạt cà phê

xanh trong nghiên cứu này.

3.2.1. Kết quả ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố

Dựa trên cơ sở đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy

phân cà phê xanh thích hợp thu CGA, đề tài đưa ra các mức thí nghiệm của

mô hình tối ưu hoá. Đối với tỷ lệ nguyên liệu cơ chất – dung môi, tỷ lệ 1 – 50

cho hàm lượng CGA cao nhất vì vậy chọn giá trị trung tâm cho thí nghiệm là

50, khoảng biến đổi là 10. Đối với nồng độ enzyme, chọn nồng độ 40 U/g là

giá trị tại tâm, khoảng biến đổi là 10 U/g. Đối với thời gian thuỷ phân, chọn

60 phút là thời gian thuỷ phân tại tâm, khoảng biến đổi là 30 phút.

Tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố theo phương

pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box – Behnken đến quá trình thủy phân

cà phê xanh nhờ pectinase nhằm tìm điều kiện tối ưu để thủy phân cà phê

xanh thu CGA.

Kết quả thí nghiệm được biểu diễn ở bảng 3.2 sau:

47

Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng

CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau

Tỷ lệ cơ chất - Nồng độ enzyme Thời gian Hàm lượng TT dung môi (X1) (U/g) (X2) (phút) (X3) CGA (mg/g)

1 40 30 60 55,70

2 60 30 60 49,94

3 40 50 60 37,44

4 60 50 60 54,79

5 40 40 30 39,16

6 60 40 30 53,02

7 40 40 90 52,34

8 60 40 90 47,76

9 50 30 30 51,23

10 50 50 30 44,26

11 50 30 90 52,81

12 50 50 90 51,61

13 50 40 60 63,81

14 50 40 60 59,20

15 50 40 60 58,20

16 50 40 60 57,67

17 50 40 60 57,52

48

Kết quả từ bảng trên cho thấy hàm lượng CGA thu được sau thủy phân

cà phê xanh bằng pectinase nằm trong khoảng từ 37,44 mg/g đến 63,81 mg/g

tương ứng với thí nghiệm số 3 và số 13. Điều này cho thấy, trong các khoảng

giới hạn đã chọn, các biến đều có ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân cà phê

xanh thu CGA. Các mức cực tiểu và cực đại của các yếu tố, đều có sự chênh

lệch về hàm lượng CGA thu dược.

Xét mức cực đại của yếu tố tỷ lệ nguyên liệu (thí nghiệm số 4) và mức

cực tiểu (thí nghiệm số 3) sự chênh lệch về hàm lượng CGA khá lớn, khoảng

17,35 mg (từ 37,44 mg đến 54,79 mg). Trong khi đó, với yếu tố nồng độ

enzyme, ở mức cực đại (thí nghiệm số 3) và mức cực tiểu (thí nghiệm số 9),

lượng chênh lệch vào khoảng 13,79 mg. Xét các điểm cực đại và cực tiểu của

yếu tố thời gian (thí nghiệm số 5 và 11) cũng cho thấy có sự chênh lệch đáng

kể về lượng CGA thu được. Như vậy, cả ba yếu tố đã được lựa chọn có sự

liên kết chặt chẽ trong việc tác động tới quá trình thủy phân cà phê xanh thu

nhận CGA.

3.2.2. Phân tích phương sai

Sử dụng phần mềm DX 11 cho kết quả phân tích phương sai mô hình

tối ưu thể hiện trên bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm

Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova)

Thông số SS df MS Chuẩn F Mức có nghĩa

Mô hình 743,26 82,58 18,31 9 0,0005

54,39 54,39 12,06 1 0,0104 Tỷ lệ NL (X1)

58,30 58,30 12,92 1 0,0088 Nồng độ Enzyme (X2)

2

35,53 35,53 7,88 1 0,0263 Thời gian (X3)

144,46 144,46 29,57 1 0,0008 X1

49

2

Thông số SS df MS Chuẩn F Mức có nghĩa

2

65,80 1 65,80 18,85 0,0065 X2

120,52 1 120,52 1,85 0,0013 X3

133,40 1 133,40 32,03 0,0010 X1× X2

85,00 1 85,00 14,59 0,0034 X1× X3

8,33 1 8,33 26,72 0,2164 X2× X3

3 1,40 0,21 0,8879 Độ không tương thích 4,21

Trong đó:

SS: tổng phương sai

df: bậc tự do

MS: trung bình bình phương các sai khác

Chuẩn F: chuẩn Fisher

Kết quả phân tích phương sai của mô hình tối ưu bằng phần mềm DX

11 (State – Ease) trình bày trong bảng trên (bảng ANOVA) cũng cho thấy cả

3 yếu tố là tỷ lệ nguyên liệu, nồng độ enzyme và thời gian đều ảnh hưởng tới

quá trình thủy phân cà phê xanh bằng enzyme pectinase. Giá trị F của mô

hình là 18,31 với p 0,0005 (p<0,05) cho thấy dạng mô hình đã được lựa chọn

đúng. Giá trị p của “Lack of Fit” là 0,8879 (p>0,05) cho thấy dạng mô hình

này tương hợp với thực nghiệm. Giá trị p của X1*X2 và X1*X3 đều nhỏ hơn

0,05 cho thấy sự tác động đồng thời của nồng độ enzyme với tỷ lệ nguyên liệu

và thời gian với tỷ lệ nguyên liệu tới quá tình thủy phân thu nhận CGA.

3.2.3. Phương trình hồi quy

Phương trình hồi quy biểu hiện hàm lượng CGA (Y) mô tả ảnh hưởng

của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn như sau:

Y = + 59,28 + 2,61*X1 – 2,7*X2 + 2,11*X3 + 5,77*X1*X2 –

4,61*X1*X3 + 1,44*X2*X3 – 5,86*X1 2 – 3,95*X2

2 – 5,35*X3

2.

50

Phương trình hồi quy cho thấy trong các hệ số b1, b2, b3 thể hiện tác

động độc lập của từng yếu tố X1, X2, X3, giá trị tuyệt đối của b2 (2,7) là lớn

nhất. Điều này chứng tỏ nồng độ enzyme có ảnh hưởng lớn nhất đến quá trình

thủy phân thu nhận CGA. Ngược lại, giá trị tuyệt đối của b3 (2,11) là nhỏ

nhất, cho thấy sự ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân tác động nhỏ hơn tới

hàm mục tiêu. Khi đánh giá sự tác động đồng thời giữa các yếu tố, giá trị tuyệt

đối của b12 (5,77) là lớn nhất, chứng tỏ sự tương tác giữa tỷ lệ nguyên liệu và

nồng độ enzyme có ảnh hưởng mạnh tới quá trình thủy phân thu nhận CGA.

3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh bằng enzyme pectinase.

Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng CGA thu

được sau quá trình thủy phân bằng phần mềm Design Expert. Kết quả đã tìm

được phương án thí nghiệm để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: Tỷ lệ cơ chất

– dung môi 1 – 60, nồng độ enzyme là 43,548 U/g, thời gian thuỷ phân là

54,4 phút. Khi đó, hàm lượng CGA đạt được trong các điều kiện trên theo

tính toán là 62,3077 mg/g mẫu cà phê nghiền. Kết quả hàm kỳ vọng mối

tương quan giữa các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân quả cà phê

xanh thu nhận CGA được biểu diễn trên hình 3.16 và hình 3.17.

Hình 3.15. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA

 Dạng biểu diễn 3D

51

Hình 3.16. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CGA

Thực nghiệm tại điều kiện dung môi pH 5,5, tỉ lệ cơ chất – dung môi 1

– 60, nồng độ enzyme 44 U/g, nhiệt độ thuỷ phân 50oC với tốc độ lắc khuấy

80 vòng/phút trong thời gian 55 phút, hàm lượng CGA dự đoán thu được là

62,3 mg/g.

Tiến hành kiểm tra mô hình với các điều kiện như trên thu được kết quả

tại bảng 3.4 sau:

Bảng 3.4. Kiểm tra mô hình thí nghiệm tối ưu hoá tách chiết CGA

TT

1 2 3

Tỷ lệ cơ chất – dung môi (g/ml) 1 – 60 1 – 60 1 – 60

Nồng độ enzyme (U) 44 44 44

Thời gian (phút) 55 55 55

Trung bình

Hàm lượng CGA (mg/g) 61,37 62,61 61,52 61,83

Sau khi tiến hành kiểm tra mô hình với các điều kiện tối ưu nhận thấy

hàm lượng CGA thu được nằm trong khoảng 61,37 – 62,61 mg/g, nằm trong

khoảng dự đoán của phương pháp quy hoạch bậc hai Box – Behnken nên mô

hình đúng với thực nghiệm.

52

M: Marker

CGA

1. Mẫu trước tối ưu

2. Mẫu sau tối ưu

Hình 3.17. Sắc ký đồ kết quả trước và sau tối ưu hoá

Theo nghiên cứu của Trần Phương Thảo (2019), khi sử dụng phương

pháp vi sóng và chiết ngâm để tách CGA bằng cà phê Robusta, kết quả thu

được lượng CGA là 5,17- 5,31%/g chất khô. Trong khi đó, các nghiên cứu

khác chỉ ra rằng cà phê Robusta cho hàm lượng CGA cao hơn so với cà phê

Arabica. Từ đó có thể kết luận rằng sử dụng enzyme pectinase cho hiệu suất

tách chiết CGA cao hơn phương pháp chiết ngâm.

3.2.5. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng

HPLC

 Kết quả xây dựng đường chuẩn CGA.

Bảng 3.5. Diện tích peak CGA ở các nồng độ

Nồng độ CGA (µl/ml) 10 20 50 100 200

Diện tích peak 1367,5 1387,5 1565,5 1726,6 2248,9

53

Hình 3.18. Đồ thị đường chuẩn CGA

Đường chuẩn CGA xác định được là:

Y = 4,6287x + 1307.4 R2 = 0,9938

 Kết quả xác định hàm lượng CGA trong dịch thủy phân bằng

phương pháp HPLC

Hình 3.19. Sắc ký đồ của chất chuẩn CGA

Hình 3.20. Sắc ký đồ của mẫu thử CGA

Kết quả sắc ký đồ tại hình 3.20 cho thấy chất chuẩn sử dụng là 5-CGA

phân tích trong 29 phút, CGA xuất hiện ở phút thứ 3, thời gian lưu trong

54

khoảng hơn 1 phút. So sánh với kết quả của mẫu thử hình 3.21, nhận thấy có

sự trùng khớp khi ở phút thứ 3 cũng có đường sắc ký hiện lên và lưu lại đến

qua phút thứ 4. Điều này chỉ ra rằng, trong mẫu thử tồn tại phân tử có cấu tạo

giống với mẫu chuẩn.

Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng HPLC

Hàm lượng CGA (mg/g)

TN

Máy đo quang phổ (324nm) Hệ thống HPLC

1 37,44 35,07

2 63,81 61,40

3 58,25 56,19

Chú thích: TN1- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 3 trong ma trận thực

nghiệm Box-Behnken; TN2- Dịch thủy phân từ thí nghiệm thứ 13 trong ma trận thực

nghiệm Box- Behnken; TN3- Dịch thủy phân trước khi tối ưu; TN4- Dịch thủy phân

sau khi tối ưu.

4 61,83 59,03

Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy hàm lượng CGA trong dịch thủy phân xác

định bằng phương pháp HPLC cho kết quả thấp hơn phương pháp đo bằng

máy quang phổ. Điều này tương tự với kết quả của Abebe Belay và

A.V.Gholap (2009) khi nghiên cứu cho thấy rằng lượng CGA thu được khi đo

bằng máy quang phổ là (6,05-6,25%) cao hơn so với phương pháp đo bằng

HPLC (5,6 – 6,1%).

3.3. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa

3.3.1. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn

Nghiên cứu ảnh hưởng của CGA đến sự phát triển của các chủng vi

khuẩn có lợi được thực hiện trên Bacillus clausii và vi khuẩn gây hại E. coli

trong môi trường chứa glucose hoặc CGA 1% (w/v). Kết quả thu được biểu

diễn ở bảng 3.7.

55

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CGA tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và vi

khuẩn gây hại.

Số lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi

(Tính theo LgCFU/ml) Chủng thử nghiệm STT

Môi trường + 1% Glucose Môi trường + 1% CGA

7,88 ± 0,08 8,16 ±0,09 1

Lactobacillus acidophilus ATCC4356

6,72 ± 0,09 6,85 ± 0,08 2

Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469

Lactobacillus plantarum 299V 7,02 ± 0,09 7,18 ± 0,08 3

Lactobacillus bulgaricus CH-3 6,57 ± 0,08 6,63 ± 0,09 4

Lactobacillus casei Shirota 7,14 ± 0,09 7,28 ± 0,09 5

7,08 ± 0,09 7,13 ± 0,08 6 Bacillus clausii

9,23 ± 0,09 7,31 ± 0,08 7 Escherichia. Coli

7,91 ± 0,09 6,58 ± 0,09 8

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Kết quả bảng 3.7 cho thấy CGA gần như không ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển của các vi khuẩn probiotic. Sau 24 giờ nuôi cấy trong môi

trường lỏng chứa 1% CGA, số lượng khuẩn lạc không khác biệt nhiều so với

khi nuôi trong môi trường lỏng chứa 1% glucose.

Ngược lại, đối với các chủng vi khuẩn có hại như E.coli hay S.aureus,

CGA thể hiện khả năng ức chế nhẹ đến sự sinh trưởng và phát triển của

chúng. Mật độ vi khuẩn sau 24 giờ nuôi trong môi trường chứa 1%CGA giảm

hơn so với khi nuôi ở môi trường đối chứng chứa 1% glucose.

Theo nghiên cứu của Bajko và cộng sự (2016), CGA có khả năng ức

chế sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn gây hại. Khả năng

kháng các vi sinh vật probiotic của CGA cũng được nghiên cứu, kết quả cho

thấy rằng CGA không kìm hãm sự phát triển của các lợi khuẩn khi nồng độ

đạt đến 10mg/ml.

56

3.3.2. Kết quả xác định hoạt tính oxy hóa

Dịch chiết CGA sau khi cô đặc 20 lần bằng cô chân không được đem đi

xác định hoạt tính chống oxy hóa tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa

Mẫu SC50 (µg/ml) Khả năng trung hòa gốc tự do (SC,%)

86,53 ± 0,30 12,6 µg/ml Chứng (+) [ascorbic acid]

0,0 ±0,0 - Chứng (-) [DPPH/EtOH+DMSO]

26,31 ± 0,90 ≥ 1000 µg/ml CGA tách chiết

Theo kết quả ở trên, nhận thấy mẫu CGA tách chiết chưa biểu hiện hoạt

tính chống oxy hóa khử khi thử nghiệm bằng phương pháp DPPH tới nồng độ

thử nghiệm là 1000µg/ml.

3.4. Kết quả quá trình sấy chân không

Sấy chân không là phương pháp sấy ở môi trường áp suất cực thấp, gần

như là chân không. Trong môi trường này, nước sẽ sôi ở nhiệt độ thấp hơn rất

nhiều so với nhiệt độ sôi thông thường. Khi nước sôi, các phân tử nước hoạt

động mạnh nhất đồng nghĩa với sự bốc hơi diễn ra nhanh nhất sẽ làm tăng tốc

độ sấy lên nhiều lần so với sấy khô thông thường.

Sấy chân không có nhiều ưu điểm như giữ nguyên được màu sắc,

hương vị, chất dinh dưỡng cũng như các tính chất đặc trưng của sản phẩm,

hầu như không làm biến đổi tính chất vật lý, hóa học của vật sấy, sản phẩm

được sấy chân không có độ ẩm rất thấp (khoảng 1 - 3%) nên bảo quản được

lâu hơn.

Vì sản phẩm là chế phẩm CGA hướng tới cho mục đích phục vụ sức

khỏe nên sấy chân không là phương pháp lựa chọn thích hợp. Nhiệt độ sấy rất

57

quan trọng vì vậy thí nghiệm này chúng tôi khảo sát điều kiện nhiệt độ sấy

dịch chiết cô đặc để thu được sản phẩm chứa CGA có hàm lượng cao.

Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không thu nhận chế phẩm

CGA cho kết quả được biểu diễn tại bảng 3.9.

Bảng 3.9. Nhiệt độ và thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA

Chế độ sấy mẫu

Độ ẩm (%)

Khối lượng mẫu thu được (g)

Hàm lượng CGA (mg/g)

Thời gian sấy (giờ)

Nhiệt độ sấy (oC)

50

13

6,9

9,15

43,21 ± 1,45

60

10

6,52

9,34

43,51 ±1,82

Chân không

70

8

4,19

9,61

46,01 ± 1,32

Ở chế độ sấy chân không, nhiệt độ 50 và 60oC độ ẩm của sản phẩm thu

được chỉ đạt trên 6,5%, hàm lượng chế phẩm chứa CGA đạt 43,21 ± 1,45

mg/g và 43,51 ±1,82 mg/g, thời gian sấy từ 10 - 13 giờ. Ở 70oC, sau 8 giờ sản

phẩm đã đạt độ ẩm theo yêu cầu (4,41 – 5%), khối lượng mẫu thu được là

9,61g và hàm lượng của CGA cũng vượt hơn hẳn so với sấy ở nhiệt độ thấp

(46,01 ± 1,32 mg/g).

Vì vậy chọn nhiệt độ sấy ở 70oC để sấy tạo sản phẩm CGA. Trong điều

kiện sấy chân không, chế phẩm thu hồi có độ xốp mịn, màu xanh vàng sáng

đẹp, dễ dàng thu hồi chế phẩm.

Hình 3.21. Chế phẩm CGA dạng bột.

58

Sơ đồ thu nhận CGA từ quả cà phê xanh

Sau khi tiến hành nghiên cứu các điều kiện thủy phân quả cà phê xanh,

chúng tôi đã đưa ra quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm CGA bằng

pectinase như hình 3.22 sau.

Quả cà phê xanh

Xử lý (Sấy khô, nghiền bột)

o

Chiết CGA (Tỷ lệ cơ chất- dung môi 1 – 60, pH 5,5; nồng độ

enzyme 44 U/g, 50 C, 80 vòng/phút, 55 phút)

Lọc

o

Cô đặc

(Cô chân không 20 lần, 50 C)

o (70

Sấy chân không

C, 8 giờ)

Chế phẩm CGA

Hình 3.22. Quy trình thu nhận CGA từ quả cà phê xanh.

Quy trình cụ thể như sau:

Bước 1: Xử lý nguyên liệu

59

Quả cà phê sau khi thu hái được loại bỏ tạp chất, rửa sạch với nước rồi

đem sấy ở nhiệt độ 50oC tới độ ẩm 15%. Nghiền nhỏ cà phê thành bột mịn và

bảo quản lạnh (nhiệt độ 4oC).

Bước 2: Chiết CGA từ cà phê xanh bằng pectinase

Bột cà phê được hòa vào dung dịch đệm phosphate pH 5,5 có bổ sung

44U/g pectinase. Đem ủ hỗn hợp trong tủ lắc ở nhiệt độ 50oC với tốc độ lắc

80 vòng/phút. Sau 55 phút, dừng phản ứng bằng cách gia nhiệt hỗn hợp lên

100oC trong 5 phút.

Bước 3: Thu nhận dịch và cô đặc

Hỗn hợp dịch sau thủy phân được lọc bỏ bã, thu dịch CGA thô rồi tiến

hành cô đặc 20 lần bằng phương pháp cô quay chân không ở 50C.

Bước 4: Sấy thu chế phẩm CGA dạng bột. Đóng gói và bảo quản.

60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Sau thời gian nghiên cứu, luận văn đưa ra được một số kết luận sau: 1. Kết quả nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thu nhận

CGA từ quả cà phê xanh:

- Tỷ lệ cơ chất – dung môi: 1 – 50 - pH dung dịch đệm: 5,5 - Nồng độ enzyme: 40 U/g - Nhiệt độ: 50oC - Tốc độ lắc: 80 vòng/phút - Thời gian: 60 phút 2. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất CGA trong cà phê xanh bằng phương pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken. Với tỷ lệ cơ chất – dung môi: 1 – 60, nồng độ enzyme 44 U/g trong thời gian 55 phút, hàm lượng CGA thu được là 62,3077 mg/g.

3. Xác định được dịch chiết CGA khi sử dụng với nồng độ 1% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu với chủng vi khuẩn E.coli nhưng không gây ức chế đến lợi khuẩn Bacillus clausii.

4. Điều kiện sấy chân không thích hợp là: nhiệt độ 70oC, 8 giờ cho sản phẩm đã đạt độ ẩm 4,41 – 5%, khối lượng mẫu thu được là 9,61g và hàm lượng của CGA đạt 46,01 mg/g.

2. Kiến nghị

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi tách chiết khác đối với tách

chiết CGA.

- Chứng minh hoạt tính sinh học của CGA trên một số loại vi khuẩn khác. - Kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa của CGA tách chiết ở các nồng độ

cao hơn.

- Thực hiện tinh sạch CGA.

61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đỗ Biên Cương, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu (2010).

Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotic Mannooligosacharit bằng

Endo-β-1,4-mannanase từ Aspergillus niger BK01. Tạp chí Khoa học và

Công nghệ, 46(3): 43-49.

2. Lê Hồng Phú, Nguyễn Đức Lượng, Đỗ Đại Nghĩa (2008). Nghiên cứu chế

tạo chế phẩm Biocoffee-1 từ Aspergilus niger và ứng dụng lên men các loại

cà phê. Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 12

3. Lê Thị Thu Hiền (2010). Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn acid chlorogenic

từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Luận văn thạc sĩ

dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

4. Lê Tự Hải, Nguyễn Thị Lan Anh, Lưu Vũ Diễm Hằng (2011). Nghiên cứu

chiết tách và xác định thành phần hóa học của hợp chất Polyphenol nhóm

Tanin từ vỏ keo lá tràm. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng,

44(3): 142-149.

5. Nguyễn Hồng Ly (2014), Nghiên cứu chuyển hóa pectin tạo Pectic

oligosaccharide (POS) bằng Endo-polygalacturonase và khảo sát một số hoạt

tính sinh học. Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách

khoa Hà Nội.

6. Nguyễn Việt Phương và Vũ Kim Dung (2017). Tuyển chọn Aspergillus

Niger sinh tổng hợp Pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic từ hạt cà phê

xanh. Vietnam Biological Industries.

7. Trần Phương Thảo (2019). Chiết xuất cao chlorogenic acid từ hạt cà phê

xanh. Luận văn thạc sĩ ngành Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa

TP. Hồ Chí Minh.

62

8. Vũ Kim Dung (2015). Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ

pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase. Luận án tiến sĩ Công nghệ

sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

9. Abebe Belay and A. V. Gholap (2009). Characterization and determination

of chlorogenic acids (CGA) in coffee beans by UV-VIS spectroscopy. African

Journal of Pure and Applied Chemistry, 3(11): 234-240.

10. Ae-Sim Cho, Seon Min Jeon, Myun Joo Kim, Jiyong Yeo (2010).

Chlorogenic acid exhibits anti obesity property and improves lipid

metabolism in high fat diet induced obese mice. Food and Chemical

Toxicology.

11. Agnan Marie Michel Combo, Mario Aguedo (2012). Enzymatic

production of pectic oligosaccharides from polygalacturonic acid with

commercial pectinase preparations. Food and Bioproducts Processing, 90:

588-596.

12. Alonso-Salces, R. M., Serra, F., Reniero, F., Héberger. K (2009).

Botanical and geographical characterization of green coffee (Coffea Arabica

and Coffea canephora): Chemometric evaluation of phenolic and

methylxanthine contents. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57:

4224-235.

13. Alves. R. c., Almeida. I. M. c., Casal. s., Oliveira. M. B. (2010).

Isoflavones in coffee: Influence of species, roast degree, and brewing method.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 3002-3007.

14. Attila Hunyadi, Ana Martins, Tusty-Jiuan (2012). Chlorogenic Acid and

Rutin Play a Major Role in the InVivo Anti-Diabetic Activity of Morus alba

Leaf Extract on Type II Diabetic Rats. PLOS ONE vol 7.

63

15. Barnes, H. M., Feldman, J. R.; White, W. V. (1950). Isochlorogenic Acid.

Isolation from Coffee and Structure Studies. Journal of the American

Chemical Society, 72: 4178-4182.

16. Belitz, H.-D., Grosch, w., & Schieberle (2009). Coffee, tea, cocoa. Food

Chemistry, 4: 938-951.

17. Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E. and Berset C (1995). Use of a Free

Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. Lebensm.-Wiss. u.-

Technol., 28: 25-30.

18. C.Campa et al (2005). Diversity in bean Caffeine content among wild

Coffea species: Evidence of a discontinuous distribution. Food Chemistry, 91:

633-637.

19. Carlos Tello, PhD (2020). 6 Health Benefits of Chlorogenic Acid + Side

Effects. Molecular Biology, pp: 20-26.

20. Carmen M. Topala, Lavinia D. Tataru, Targu d.Vale (2015). Infrared

Spectra of Green Arabica Coffee Extraction using Supercritical Carbon

Dioxide and Soxhlet Technique. Chemistry, pp: 1128-1131.

21. Clifford, M. N. (1999). Chlorogenic acids and other cinnamates –

nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and

Agriculture, 79 (3), pp. 362–372.

22. Clifford, M. N. (2003). The analysis and characterization of chlorogenic

acids and other cinnamates. Methods in Polyphenol Analysis, 14: 314–337

23. Coffee. Edited by R. J. Clarke and R. Macrae. Volume 1. Chemistry

(1985), pp. 306. Volume 2. Technology (1987), pp. 321

24. Corse, J., Lundin, R. E., Waiss, A. C. (1965). Identification of several

components of isochlorogenic acid. Phytochemistry, 4: 527–529.

25. D.R. Kashyap, P.K. Vohra, S. Chopa, R. Tewari (2001). Applications of

pectinases in the commercial sector: a review. Bioresource Technology, 77:

215-227.

64

26. Deniz Bagdasa, Betul Cam Etoz, Zulfiye Gul (2015). In vivo systemic

chlorogenic acid therapy under diabetic conditions: Wound healing effects

and cytotoxicity/genotoxicity profile. Food and Chemical Toxicology. pp: 54-

61.

27. Elias Kiassos, Stefania Mylonaki, Dimitris P. Makris, Panagiotis

Kefalas (2009). Implementation of response surface methodology to optimise

extraction of onion (Allium cepa) solid waste phenolics. Innovative Food

Science & Emerging Technologies, 10(2): 246-252.

28. Ewelina Bajko, Monika Kalinowska, Piotr Borowski, Leszek S. (2016).

5-O-Caffeoylquinic acid: A spectroscopic study and biological screening for

antimicrobial activity. LWT- Food Science and Technology, 65: 471-479.

29. Farah. A., Monteiro. M., Donangelo. c. M., Lafay (2008). Chlorogenic

acids from green coffee extract are highly bioavailable in humans. Journal of

Nutrition, 138: 2309-2315.

30. Farah. A., de Paulis. T., Trugo. L. C., Martin. P. R (2005). Effect of

roasting on the formation of chlorogenic acid lactones in coffee. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 53(5): 1505-1513.

31. Hiroshi Shimoda, Emi Seki, Michio Aitani (2006). Inhibitory effect of

green coffee bean extract on fat accumulation and body weight gain in mice.

BMC Complementary and Alternative Medicine, 9.

32. Igho Onakpoya, Rohini Terry, and Edzard Ernst (2011). The Use of

Green Coffee Extract as a Weight Loss Supplement: A Systematic Review

and Meta Analysis of Randomised Clinical Trials. Volume 2011, Article ID

382852.

33. Iwai. K., Kishimoto. N., Kakino. Y., Mochida. K., Fujita. T (2004). In

vitro antioxidative effects and tyrosinase inhibitory activities of seven

hydroxycinnamoyl derivatives in green coffee beans. Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 52: 4893 -4898.

65

34. Jalal, Mahbubul A. F., Read, David J., Haslam. E. (1982). Phenolic

composition and its seasonal variation in Calluna vulgaris. Phytochemistry

21, p. 1397–1401.

35. Junghyun Kim, Il-Ha Jeong, Chan-Sik Kim, Yun Mi Le (2011).

Chlorogenic acid inhibits the formation of advanced glycation end products

and associated protein cross-linking. Archives of Pharmacal Research.

36. Kazuya Kozuma, Shigemi Tsuchiya, Jun Kohori (2005).

Antihypertensive Effect of Green Coffee Bean Extract on Mildly

Hypertensive Subjects. Hypertension Research.

37. Kumar, G.P., Navyaa, K., Ramya, E.M., Venkataramana, M., Anand,

T., Anilakumar, K.R. (2013). DNA damage protecting and free radical

scavenging properties of Terminalia arjuna bark in PC-12 cells and plasmid

DNA. Free Rad. Antioxid, 3: 35-39

38. Kweon, Mee-Hyang; Hwang, Han-Joon; Sung, Ha-Chin (2001).

Identification and Antioxidant Activity of Novel Chlorogenic Acid

Derivatives from Bamboo (Phyllostachys edulis). Journal of Agricultural and

Food Chemistry.

39. R. Puupponen Pimia, L. Nohynek, C. Meier, M.Kahkonen, M.

Heinonen, A. Hopia (2001). Antimicrobial properties of phenolic compounds

from berries, Journal of Applied Microbiology, 90: 494-507.

40. Rohit Upadhyay, L Jagan Mohan Rao (2013). Critical Reviews in Food

Science and Nutrition. Medicine, Chemistry.

41. Rosana Chirinos, Herve Rogez, David Campos, Romia Pedreschi,

Yvan Larondelle (2007). Optimization of extraction conditions of antioxidant

phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz & Pavón)

tubers. Separation and Purification Technology, 55(2):217-225.

66

42. Santana et al . (2006). Selectivity in the extraction of 2- quinolone

alkaloids with supercritical CO2. Brazilian Journal of Chemical Engineering,

23 (4).

43. Santana-Gálvez, J., Cisneros-Zevallos, L., Jacobo-Velázquez, D. A.

(2017). Chlorogenic acid: Recent Advances on Its Dual Role as a Food

Additive and a Nutraceutical against Metabolic Syndrome. Molecules, 2: 358-

379.

44. Shela G., Olga. M. B., Elena. K., Antonin. L., Milan. C., Nuria. G. M.,

Ratiporn. H., Yong- Seo. P., Soon-Teck. J., and Simon. T (2003). Bioactive

compounds and antioxidant potential in fresh and dried Jaffa sweeties, a new

kind of citrus fruit. J. Nutri. Biolchem., 14: 154- 159.

45. Siti Machmudah, Kiwa Kitada, Mitsuru Sasaki (2008). Caffeine and

chlorogenic acid separation from raw coffee beans using supercritical CO2 in

water.

46. S.L.C. Ferreira, E.G.P. da Silva, H.S. Ferreira, R.E. Bruns et al. (2007).

Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical

methods. Analytica Chimica Acta, 597(2): 179-186.

47. Solange I. Mussatto, Ercília M. s. Machado, Silvia Martins, Jose A.

Teixeria (2011). Production, Composition, and Application of Coffee and Its

Industrial Residues. Food Bioprocess Technol, 4: 661-672.

48. Speer. K., Kolling-Speer. I (2006). The lipid fraction of the coffee

bean. Brazilian Journal of Plant Physiology, 18: 201-216.

49. Takuya Watanabe,Yoichi Arai,Yuki Mitsui (2006). The Blood

Pressure-Lowering Effect and Safety of Chlorogenic Acid from Green Coffee

Bean Extract in Essential Hypertension. Clinical and Experimental

Hypertension.

50. Thom, E. (2007). The Effect of Chlorogenic Acid Enriched Coffee on

Glucose Absorption in Healthy Volunteers and Its Effect on Body Mass

67

When Used Long-term in Overweight and Obese People. Journal of

International Medical Researcher.

51. Vogt, T. (2010). Phenylpropanoid Biosynthesis. Molecular Plant, 3, p

2–20.

52. Yang sun (2017). Ionic liquid-based enzyme-assisted extraction of

chlorogenic acid from Flos Lonicera Japonicae. Bioresources and

Bioprocessing, 45.

53. Yogesh Khairnar , Vamsi Krishna K. , Amol Boraste , Nikhil Gupta ,

Soham Trivedi et al. (2009). Study of pectinase production in submerged

fermentation using different strains of Aspergillus Niger. International

Journal of Microbiology Research, 1: 13-17.

54. Zhen Jing, Villani Thomas S., Guo. Yue, Qi. Yadong, Chin, Kit. Pan,

Min-Hsiung, Ho. Chi-Tang, Simon. James E., Wu. Qingli (2016).

Phytochemistry, antioxidant capacity, total phenolic content and anti-

inflammatory activity of Hibiscus sabdariffa leaves. Food Chemistry, 190:

673–680.