Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi được thực hiện với mục tiêu nhằm bổ sung dinh dưỡng một cách hợp lý cho sự phát triển của gà và giúp cân bằng được dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cũng như cân đối về ngoại hình phục vụ cho mục đích sử dụng. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LÊ ANH TÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ (Bacillus subtilis) VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI CHO GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN 1-14 NGÀY TUỔI CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. VŨ KIM DUNG Hà Nội, 2020
i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ Kim Dung. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, có nguồn gốc rõ ràng và được trích dẫn đầy đủ theo quy định. Công trình chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020 Người cam đoan Lê Anh Tú
ii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Lâm nghiệp, bằng sự biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo đã nhiệt tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Kim Dung - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn sinh viên phòng Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp. Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo bộ phận Feed Technology - Công ty Cổ phần Chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia học tập, nghiên cứu trong 2 năm học và giúp đỡ tôi trong việc thực hiện phần ứng dụng của đề tài nghiên cứu. Một lần nữa cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tuy nhiên điều kiện về năng lực bản thân còn hạn chế, luận văn chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp để bài luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020 Học viên Lê Anh Tú
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................vii ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3 1.1. Tổng quan về levan...........................................................................................3 1.1.1. Giới thiệu về levan .....................................................................................3 1.1.2. Tính chất.....................................................................................................6 1.1.3. Nguồn thu nhận levan ................................................................................7 1.1.4. Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan ....................8 1.1.5. Ứng dụng của levan .................................................................................10 1.2. Thức ăn chăn nuôi gà cảnh .............................................................................12 1.2.1. Giới thiệu về một số giống gà cảnh .........................................................12 1.2.2. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ......15 Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 22 2.1. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................22 2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................22 2.3. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................22 2.3.1. Vi sinh vật .................................................................................................22 2.3.2. Môi trường ...............................................................................................22 2.3.3. Hóa chất ...................................................................................................23 2.3.4. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................23 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................23 2.4.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và cs, 2019) .............................................................................................................23
iv 2.4.2. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013) ..............24 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan .................................25 2.4.4. Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi)..................................................................................26 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................30 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31 3.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp levan ......................................................................................................................31 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose ..............................................................31 3.1.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu .....................................................................32 3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito .......................................................................33 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ nito ....................................................................34 3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp ................................................................36 3.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ........................................................................36 3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan .............................................................38 3.3. Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan .............................................................41 3.3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được .........41 3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm lượng levan thu được ....................................................................................................43 3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được .............44 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được ............45 3.4. Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi) ..........................................................................................................46 3.4.1. Xác định tỷ lệ levan phối trộn ..................................................................46 3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên ......................................................48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52 PHỤ LỤC
v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ B. subtilis Bacillus subtilis Ca Canxi CP Cruide Protein CS Cộng sự Fat Fat FOS Fructo - oligosaccharides Fib Fiber GE Gross Energy GP Glucose trypton M Moisture MTCB Môi trường cơ bản P Photpho QC&Lab Quality Control & Laboratory TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TGA Trypton Glucose Agar
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên ..................................................7 Bảng 2.1. Bảng xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi từng biến số .......................................................................................................................25 Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu trong công thức cám gà con giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ....................................................................................................................26 Bảng 2.3. Thành phần dinh dưỡng sau khi bổ sung levan theo các tỷ lệ ..................27 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên ......................27 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến các chỉ tiêu vi sinh .........................28 Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng levan thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ...........................................................39 Bảng 3.2. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX11 .....41 Bảng 3.3. Kết quả phân tích dinh dưỡng cám trong công thức ................................47 Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng ................................................48 khi bổ sung chế phẩm levan ......................................................................................48 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra cảm quan khi bổ sung chế phẩm levan trong công thức thức ăn chăn nuôi ......................................................................................................49 Bảng 3.6. Kết quả phân tích vi sinh khi bổ sung chế phẩm levan trong thức ăn chăn nuôi ............................................................................................................................49
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của levan .........................................................................3 Hình 1.2. Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea® ....................................................5 Hình 1.3. Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir®............................................................5 Hình 1.4. Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com) ............................6 Hình 1.5. Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên ..............................................13 Hình 1.6. Giống gà Quý phi ......................................................................................13 Hình 1.7. Giống gà lai cá ..........................................................................................14 Hình 1.8. Giống gà lông xù .......................................................................................14 Hình 1.9. Giống gà Serama .......................................................................................15 Hình 1.10. Quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà ...............................16 Hình 1.11. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ......18 Hình 1.12. Lấy mẫu nguyên liệu đầu vào .................................................................18 Hình 1.13. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu bằng máy DS2500F ............................18 Hình 1.14.Kiểm tra nguyên liệu trước khi lưu silo ...................................................19 Hình 1.15. Hệ thống bồn chứa nguyên liệu ..............................................................19 Hình 1.16. Máy móc trong hệ thống sản xuất ...........................................................20 Hình 1.17. Hình ảnh bao cám gà ...............................................................................21 Hình 1.18. Hình ảnh cám gà......................................................................................21 Hình 3.1. Kết quả ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả năng sinh tổng hợp levan .31 Hình 3.2. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ sucrose khác nhau...................................................................................................................31 Hình 3.3. Kết quả ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp levan ...32 Hình 3.4. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ pH khác nhau ...........................................................................................................................33 Hình 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh tổng hợp levan ....34 Hình 3.6. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nguồn nito khác nhau ...........................................................................................................................34 Hình 3.7. Kết quả ảnh hưởng nồng độ nito đến khả năng sinh tổng hợp levan ........35
viii Hình 3.8. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ nito khác nhau ...........................................................................................................................35 Hình 3.9. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp đến khả năng sinh tổng hợp levan ...36 Hình 3.10. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp levan ....37 Hình 3.11. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với tốc độ lắc khác nhau .37 Hình 3.12. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu sinh tổng hợp levan ...........................40 Hình 3.13. Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp levan ...............................40 Hình 3.14. Kết quả ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được .. 42 Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm lượng levan thu được.................................................................................................43 Hình 3.16. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với tỷ lệ thể tích levan và dung môi khác nhau .............................................................................................43 Hình 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được 44 Hình 3.18. Kết quả ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được ....45
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, những nguyên liệu sinh học an toàn dần được sử dụng để thay thế cho các nguyên liệu hóa học. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong cuộc sống. Các nguyên liệu đó có khả năng đáp ứng những nhu cầu cần thiết và đảm bảo an toàn trong các mục đích sử dụng. Vì thế, các nhà khoa học đã và đang tiến hành nghiên cứu thu nhận các hợp chất có nhiều tính năng vượt trội từ vi sinh vật phục vụ cho đời sống con người. Levan là hợp chất polymer sinh học được tổng hợp từ vi khuẩn trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Đây là polymer của fructose được tạo ra bởi liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic, có mặt trong nhiều loại thực vật và các sản phẩm từ vi sinh vật. Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt các ngành công nghiệp trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: y dược, thực phẩm và mỹ phẩm. Ứng dụng tiềm năng của levan để làm chất nhũ hóa dùng trong sữa, chất ổn định, chất làm đặc và đặc biệt là khả năng phục hồi sức khỏe và có giá trị trong các liệu pháp điều trị ung thư... Levan là một polymer của fructose có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm men, nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2001). Levan tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật như: Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp. (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim và cs, 2000), Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998) và B. subtilis (Shin và cs, 2005). Trong đó chủng B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với hiệu suất 40,4 g/l trên môi trường có chứa 200g/l sucrose (Shin và cs, 2005). Nhưng nhìn chung, hiệu suất thu levan từ các nguồn vi sinh vật chưa cao. Vì vậy, các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các nguồn thu nhận mới có khả năng thu được hàm lượng levan cao hơn. Ở Việt Nam, phong trào chơi gà cảnh ngày một phát triển. Một con gà cảnh có trọng lượng 500 g lượng thức ăn tiêu tốn chỉ bằng 1/3 con gà công nghiệp, nhưng giá trị của nó đem lại có thể cao gấp vài chục lần, thậm chí hàng trăm lần gà công nghiệp.
2 Việc bổ sung dinh dưỡng trong chế độ ăn cho gà cảnh hay chế phẩm sinh học trong khẩu phần ăn, đặc biệt là giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi là giai đoạn sức đề kháng kém, nhạy cảm dễ tăng tỷ lệ chết. Bổ sung dinh dưỡng trong giai đoạn này một cách hợp lý sẽ phù hợp với sự phát triển của gà và giúp cân bằng được dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cũng như cân đối về ngoại hình phục vụ cho mục đích sử dụng. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận levan từ Bacillus subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn cho gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi”.
3 Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về levan 1.1.1. Giới thiệu về levan Levan là thuộc một trong hai loại fructans (là các cacbohydrate thường tìm thấy trong thực vật, tảo, vi khuẩn). Fructans gồm có hai loại chính là levan và inulins được phân biệt bởi các loại liên kết. Các đơn phân trong phân tử levan liên kết với nhau bằng liên kết ß (2 - 6) còn trong phân tử inulins là liên kết ß (2 - 1) (Han và cs, 1990). Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai của fructans. Levan là polymer của fructose được tạo ra bởi liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic (Ki- Hyo và cs, 2001; Mardo và cs, 2014). Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B. circulans, E. amylovora, Seraria sp., Acetobacter xylinum NCI 1005, Z. mobilis và B. subtilis (Anwar và cs, 2010; Devi và Alamu, 2013; Oliveira và cs, 2007). Levan là polysaccharide ngoại bào được tổng hợp từ vi khuẩn trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Do các vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp levansucrose để chuyển hóa sucrose thành levan (Mardo và cs, 2014). Năm 2012, một nghiên cứu được thực hiện bởi Esawy và cs cho thấy vi khuẩn Bacillus spp được tách chiết từ mật ong có khả năng sinh tổng hợp levan. Mặc dù cấu trúc của levan được đặc trưng bởi một mạch thẳng của liên kết ß (2 - 6) nhưng có nhiều levan được tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết ß (2 - 1). Các mạch nhánh thường ngắn và đôi khi chỉ có môt đơn phân fructose. Fructans ngắn nhất là 6 - ketose và đây cũng chính là fructan ngắn nhất trong các loại levan. Levan là một trong số ít các polyme tự nhiên của carbohydrate tồn tại dưới dạng furanose. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của levan
4 Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trong lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được tổng hợp từ vi khuẩn có khối lượng phân tử lớn hơn levan thu được từ thực vật khoảng 2 - 100 kDa (Pontis và Campillo, 1985; Keith và cs, 1991). Levan được sản xuất từ thực vật có trong lượng phân tử khoảng 2 - 33 kDa (Rhee và cs, 2002). Levan được sản xuất từ quá trình lên men bởi vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 107 Da, tương ứng với 60000 đơn phân của fructose (Viikari và cs, 1986). Bên cạnh đó, levan được sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa. Levan có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ cần thiết cho từng mục đích cụ thể (Shin và cs, 2005). Trong đó chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với 40 g/l trên môi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005). Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019) cho thấy levan được tổng hợp bởi B. subtilis MTCC 441 sử dụng sucrose làm nguồn carbon. Chiết xuất nấm men (YE) là nguồn nitơ tốt nhất. Nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE 2 g/l, tốc độ lắc 150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan. Kết quả cho thấy năng suất levan thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose. Các nghiên cứu chỉ ra levan có khả năng chống ung thư (Calazans cs, 2000; Yoo và cs, 2004). Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế bào ung thư (El-Safty và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi vai trò của chúng trong điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm cholesterol (Yamamoto và cs, 1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể (Calazans và cs, 1997; Yamamoto và cs, 1999). Levan có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride) với độ ngọt bằng một nửa độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy, levan được ứng dụng như một chất làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho và cs,
5 2001). Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn để tăng cường khả năng tổng hợp levan đã được thực hiện. Oliveira và cs (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương pháp đáp ứng bề mặt với 2 nhân tố thay đổi, thu được hàm lượng levan cao nhất 21,68 g/l. Santos và cs (2013), cũng tối ưu điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto bằng phương pháp này cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/l với nồng độ sucrose (400 g/l) và thời gian nuôi 16 giờ. Hiện nay, levan đang được rất nhiều nhà khoa học và sản xuất quan tâm bởi các đặc tính vượt trội như: khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt, chống ung thư và khả năng tạo màng (Santos và cs, 2013). Vì vậy, levan được ứng dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm (Jaecho và cs, 2001; Santos và cs, 2013). Levan được sử dụng trong chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nanno (Gupta và cs, 2010), nuôi trồng thủy sản và các ứng dụng thực phẩm (Oner và cs, 2016). Natural Polymers Inc. (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., Ltd., (Hàn Quốc) và Advance Co., Ltd., (Nhật Bản) là những nhà sản xuất chính của levan ở quy mô thương mại. Hai ví dụ phổ biến của các sản phẩm thương mại dựa trên levan có sẵn trên thị trường là Proteolea® và Slimexir® (Oner và cs, 2016). Hình 1.2. Sản phẩm dưỡng da mặt Hình 1.3. Sản phẩm dưỡng thể với Proteolea® với Slimexir® Bên cạnh đó, một số các sản phẩm thực phẩm chức năng đã được bày bán tại các hệ thống siêu thị tại Hàn Quốc, Nhật Bản của công ty RealBiotech (www.realbio.com) (Beste và cs, 2016).
6 Hình 1.4. Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com) 1.1.2. Tính chất Levan là một loại bột tinh thể màu trắng có tính chất như một chất kết dính mạnh mẽ. Các hạt có dạng hình cầu đường kính 75 - 200 nm. Các thành phần và tính chất của levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp levan (Khadiga và cs, 2015). Không giống như polysaccharides được sử dụng như chất nhũ hóa và chất làm đặc, levan không trương lên trong nước và độ nhớt thấp 0,38 dl/gm ở 250C (In Young Bae và cs, 2007). Levan rất dễ tan trong nước nóng và gần như không hòa tan (< 0,5%) trong nước ở nhiệt độ phòng. Khả năng hòa tan trong nước nóng của levan cao hơn inulin được đặc trưng bởi liên kết ß (2 - 6) so với liên kết ß (2 - 1) và cấu trúc mạch nhánh có thể chỉ là một yếu tố hỗ trợ (Justin và cs, 2007). Levan là một homopolymer của fructose không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012): - Methanol, ethanol, isopropanol, n - propanol; - Acetone, methylethylketone, toluene; - Ethyl lactate; - N, N - dimethyloctanamide, N, N - dimethyl - decanamide;
7 - Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate; - D - limonene; - Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol; - Dimethyl formamid; - Ethoxyethyl acetate, anhydride acetic; - Furfuryl alcohol; - Dầu hỏa, xăng. Levan không bị phân cắt và thủy phân bởi enzyme invertase và amylase, nhưng rất dễ bị thủy phân bởi acid tạo thành fructose. Levan bị thủy phân hoàn toàn thành các đơn phân fructose trong HCl 1N ở 700C (Kang và Cottrell, 1979). Levan cũng được thủy phân bởi axit oxalic 0,5% (Shin và cs, 2005). Theo Szwengiel và cs (2004) sản phẩm của quá trình thủy phân levan bởi axit yếu là các fructo - oligosaccharides (FOS) ngắn và các đơn phân fructose. Độ kết dính của levan rất mạnh. So với các polymer tự nhiên, levan có độ kết dính mạnh hơn rất nhiều, được thể hiện qua bảng 1.1 (Bruna và cs, 2015). Bảng 1.1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên Polymer tự nhiên Độ kết dính (psi) Levan 991 Carboxymethylcellulose 193 Inulin 124 Guargum 63 Xanthan gum 33 Levan có một số đặc tính sinh học như: ức chế khối u, kích thích và tăng tính thấm tế bào (Leibovici và Stark, 1984). Hơn nữa, levan còn có khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy, levan được ứng dụng nhiều trong y học (Shin và cs, 2005). 1.1.3. Nguồn thu nhận levan Levan là một cacbohydrate có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm men, nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2002). Levan được tìm thấy trong một số loại cỏ như:
8 Dactylis glomerata, Poa secunda và Agropyron cristatum. Levan cũng được chứa trong lúa mì và lúa mạch (Hordeum vulgare), nấm (Aspergillus sydawi và A. versicolor) (Han, 1990). Levan được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật như: Zymomonas mobilis (Muro và cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim và cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer và cs, 1995) và Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998). Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trọng lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần chính là sucrose. Dựa trên chất nền bằng phản ứng chuyển gốc fructose của sucrose trong levan β - 2, 6 - fructan bởi enzyme D - glucose - fructosyl transferare bởi một số vi sinh vật. Nhưng nguồn vi sinh vật để sản xuất levan ở quy mô công nghiệp cho năng suất cao rất hiếm. Gần đây các nhà khoa học đã tìm ra vi khuẩn B. subtilis Natto có khả năng sản xuất ra một hỗn hợp poly acid glutamic và levan. Khi chúng được nuôi cấy trong môi trường có thành phần chính gồm đường sucrose và axit amin L - Glutamic. Tuy nhiên, hỗn hợp poly acid -  - glutamic chủ yếu được sản xuất trong môi trường có chứa acid -  - glutamic và không có đường sucrose. Ngược lại, levan chỉ được sản xuất khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có tới 20% (w/w) đường sucrose nhưng không có glutamate. Các nhà khoa học cho rằng B. subtilis Natto có tiềm năng sản xuất lượng lớn levan và sản phẩm dễ dàng tinh sạch (Shin và cs, 2005). 1.1.4. Một số môi trường nuôi cấy kích thích B. subtilis sinh levan Levan sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần chính là đường cacbonhydrate như sucrose. Năm 2004, Szwengiel và cs, đã nuôi cấy B. subtilis DSM 347 trên môi trường có thành phần như sau: sucrose (150 g/l), acid citric (11,7 g/l), natri sulfat (4,0 g/l), ammonium hydrogen phosphate (4,2 g/l), cao nấm men (5,0 g/l) và 100 ml/l của dung dịch muối (với các thành phần: KCl (7,62 g/l), MgCl2 (4,18 g/l), MnCl2 (5,43 g/l), FeCl3 (0,49 g/l), ZnCl2 (0,21 g/l)). Độ pH của môi trường nuôi cấy đã được điều
9 chỉnh tới 6,8 bằng dung dịch amoniac 25%. Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau 16 giờ nuôi cấy thu được levan với hàm lượng 35 g/l. Năm 2005, Shin và cs đã tổng hợp được 40,4 (g/l) levan từ B. subtilis (Natto) sau 21 giờ lên men trên môi trường có sucrose (200 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), NaH2PO4.2H2O (3 g/l) và Na2HPO4.12H2O (3 g/l) ở pH 7. Năm 2007, theo Oliverira và cs sau 24 giờ nuôi cấy Zymomonas mobilis ATCC 31821 trên môi trường sinh tổng hơp levan có các thành phần như sau: sucrose (350 g/l), cao nấm men (2 g/l), KH2PO4 (1 g/l), (NH4)2SO4 (1 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l) ở 25oC đã sinh tổng hợp được levan 21,7 g/l. Nghiên cứu của Santos và cs (2013), cho thấy từ chủng B. subtilis được phân lập từ thực phẩm Natto thương mại của Nhật Bản có khả năng sinh tổng hợp levan rất cao so với các nghiên cứu trước đây. Chủng B. subtilis Natto được nuôi cấy trên môi trường có hàm lượng sucrose cao (400 g/l) ở 370C. Ngoài sucrose môi trường lên men còn có nhiều thành phần khác như: cao nấm men (2,0 g/l), KH2PO4 (1,0 g/l), (NH4)2SO4 (3,0 g/l), MgSO4. 7H2O (0,06 g/l), MnSO4 (0,02 g/l). Sau 16 giờ nuôi cấy tác giả đã tổng hợp được 111,6 g/l levan từ B. subtilis Natto. Gần đây, Jothi và cs (2019), đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp levan từ chủng Bacillus subtilis MTCC 441 trong điều kiện môi trường dịch chiết nấm men (YE) nồng độ 2 g/l, nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/ phút đã tổng hợp được hàm lượng levan tương ứng là 0,395 g/g sucrose. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ảnh hưởng tới thành phần và tính chất của levan. Theo Guilbert và Combes (1996), nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng phân tử của levan. Nồng độ sucrose trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ nghịch với kích thước chuỗi polymer của fructose. Santos và cs (2013), đã nuôi cấy B. subtilis Natto trên môi trường giàu sucrose (400 g/l) sinh tổng hợp được hai loại levan trọng lượng phân tử khác nhau. Levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa. Điều này được lý giải bởi ban đầu, trong môi trường nuôi cấy nồng độ sucrose cao nên vi khuẩn sẽ tổng hợp được levan có trọng lượng phân tử thấp 11 kDa, còn sau đó trong quá trình nuôi vi sinh vât, vi khuẩn sử dụng nhiều sucrose, làm cho nồng độ sucrose
10 giảm đi rất nhiều nên sẽ tổng hợp được các phân tử levan có trọng lượng cao 1794 kDa (Santos và cs, 2013). 1.1.5. Ứng dụng của levan Trong những năm gần đây, việc sử dụng loại polysaccharide mới từ vi khuẩn đang phát triển mạnh, loại polysaccharide mới này được gọi là một polymer sinh học có tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường và polysaccharide sản xuất từ vi khuẩn này được xem là một nguồn năng lượng tiềm năng trong ngành công nghệ sinh học. Levan là một loại polymer sinh học cũng đang được rất nhiều người quan tâm bởi các đặc tính vượt trội của levan như khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy, levan được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như: mỹ phẩm, thực phẩm, dược phẩm, y học (Hae và cs, 2003). Trong lĩnh vực y học, levan được coi là một sản phẩm tuyệt vời của sinh học bởi khả năng tương thích với hoạt động của cơ thể con người. Do có hoạt tính polymer sinh học nên levan có thể dùng để sản xuất các fructose tinh khiết dùng trong y tế, có khả năng chống ung thư (Calazans và cs, 2000; Yoo và cs, 2004). Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế bào u (El-Safty và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi vai trò của chúng trong điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm cholesterol (Yamamoto và cs, 1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể (Calazans và cs, 1997). Ngoài ra, levan còn tạo ra lượng hypocholesterol lớn (Yamamoto, 1999). Một số levan còn có các hoạt tính sinh học gần giống như huyết tương, vì vậy có khả năng làm tăng khối huyết tương, hạ đường huyết trong điều trị bệnh tiểu đường. Levan có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride). DFA IV thuộc nhóm các hợp chất di - fructose anhydride (DFAs) là kết quả của một phản ứng transfructosylation intramolecular. DFA IV được đặc trưng bởi độ ngọt bằng một nửa độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy, levan được ứng dụng như một chất làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho và cs, 2001).
11 Năm 2009, Kang và cs đã nghiên cứu các khả năng gây độc của levan đối với dòng tế bào nguyên bào sợi người. Kết quả nghiên cứu cho thấy, levan không có khả năng gây độc đối với các dòng tế bào với nồng độ levan 100 mg/ml và 1 mg/ml. Năm 2011, theo Dahech và cs levan có hiệu quả trong việc ức chế tăng đường huyết gây ra bởi bệnh tiểu đường và nghiên cứu cho thấy khi bổ sung levan vào chế độ ăn uống có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa các biến chứng bệnh tiểu đường ở chuột trưởng thành. Năm 2012, Esawy và cs đã nghiên cứu levan được tổng hợp từ Bacillus spp phân lập từ mật ong có khả năng kháng vi rút H5N1 và 40 loại denovirus. Trong ứng dụng dược phẩm, levan được dùng làm màng bao của thuốc viên. Levan có cấu trúc ít phân nhánh thường tạo độ nhớt kém có thể sử dụng như một chất kết dính trong thuốc viên và dùng làm màng bao bên ngoài của viên thuốc (In và cs, 2007). Trong công nghệ thực phẩm, levan được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm có đặc tính prebiotic và hypocholesterol. Prebiotic là những thành phần thức ăn không bị tiêu hóa và hấp thụ bởi dịch dạ dày và ruột non mà có khả năng kích thích sự phát triển và hoạt động của các vi khuẩn có lợi trong đường tiêu hóa (Olano và cs, 2002). Bên cạnh đó, levan cũng được dùng làm chất tạo ngọt, chất nhũ hóa trong sữa và chất kết dính. Ban đầu, levan được coi là một sản phẩm phụ của quá trình lên men sản xuất ethanol, tăng độ nhớt của siro đường mía (Ernandes và Garcia - Cruz, 2005). Ngoài ra, levan được bổ sung vào các sản phẩm mỹ phẩm với vai trò làm ẩm da, giảm các hiệu ứng kích thích da và tăng mùi hương cho sản phẩm (Calazans và cs, 2000). Ứng dụng của levan là một chất ổn định, chất làm đặc, tác nhân bề mặt, tác nhân đóng gói, chất làm gia tăng hương vị, màu sắc ngoài ra còn là chất tạo mùi vị (Selim và cs, 2013). Một số nghiên cứu chỉ ra một số vi khuẩn có tiềm năng sản xuất lượng lớn levan có khối lượng phân tử cao và dễ tinh sạch, không lẫn các sản phẩm phụ polysaccharide khác. Như vậy, chi phí sản xuất levan thấp hơn sẽ làm tăng việc sử dụng levan (Shin và cs, 2005).