Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu các hợp chất ngoại bào của một số vi sinh vật đáy biển Bắc Bộ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:111

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các chất từ dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn Photobacterium sp; khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu các hợp chất ngoại bào của một số vi sinh vật đáy biển Bắc Bộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TSKH. Phạm Văn Cường Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn: Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TSKH. Phạm Văn Cường đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện của luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng Khoa học, Bộ phận đào tạo và các phòng chức năng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hoá Sinh biển đã cổ vũ, động viên, tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc để tôi có thể thực hiện tốt các công việc của luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Thị Mai Hương và TS. Trịnh Thị Thanh Vân cùng các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Tổng hợp Hữu cơ và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt bản luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Vũ Văn Nam
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………… DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………... DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ………………………………………………….. DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………… DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC………………………………………………. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................. 3 1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển ................................................................................ 3 1.1.1. Vi sinh vật ..................................................................................................... 3 1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên ............................................................. 4 1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống............................................................. 5 1.1.4. Vi sinh vật biển.............................................................................................. 5 1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam ............................................... 6 1.3. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới .. 11 1.3.1. Hoạt tính kháng lao ...................................................................................... 13 1.3.2. Hoạt tính chống ung thư............................................................................... 14 1.3.3. Hoạt tính khác.............................................................................................. 16 1.4. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam.............. 18 1.5. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium. ....................... 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học .................................................... 22 2.2. Phương pháp lấy mẫu........................................................................................... 22 2.3. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển ................................................... 22 2.4. Phương pháp nuôi cấy .......................................................................................... 22
2.5. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi sinh vật ......................................................................................................................... 24 2.6. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp.................... 24 2.7. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật. ................................................................ 25 2.8. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ............................................................................................................. 25 2.8.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 25 2.8.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ............................... 26 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 28 3.1. Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. ....................................................................................... 28 3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp............................................ 31 3.2.1. Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH ................................................ 31 3.2.2. Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat .......................................... 33 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 37 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết MeOH ................................................................................................................. 37 4.1.1. Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) ... 37 4.1.2. Hợp chất Uracil (FM7.3).............................................................................. 42 4.1.3. Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2).............................................................. 42 4.2. Các chất phân lập được từ cặn Etyl acetat......................................................... 43 4.2.1. N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) ....................................................... 44 4.2.2. Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) ................................................................. 48 4.2.3. Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) ................................................................. 49 4.2.4. Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1)........................................................ 50 4.2.5. Hợp chất Thymine (F7.2)............................................................................. 51
4.2.6. Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2)............................................. 52 4.2.7. Hợp chất Axit benzoic (F2.2) ....................................................................... 53 4.2.8. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2)............................................... 53 4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được.......................................... 54 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập.................................... 54 4.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập ..................... 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 55 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN ....................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 58
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT NMR: Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 1 H-NMR: Phổ cộng hưởng từ proton 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C DEPT: Distortionles Enhancement by Polarization Transfer (phổ DEPT) COSY: Homonuclear Correlated Spectroscopy HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC) HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (phổ HMQC) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC). NOE: Nuclear Overhauser Effect (hiệu ứng NOE) NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (phổ NOESY) s: singlet qui: quintet b: broad d: doublet sxt: sextet dd: doublet of doublets t: triplet sep: septet dt: doublet of triplets q: quartet o: overlapping dq: doublet of quartets δH, δC: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon. ppm: part per million (phần triệu). EIMS: Electron Inoniziation Mass Spectroscopy (phổ khối phun mù điện tử). HRMS: High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối phân giải cao) DMSO: Dimethylsulfoxide đnc: Điểm nóng chảy TLC: Thin Layer Chromatography (sắc ký bản lớp mỏng) CC: Column Chromatography (sắc ký cột) RP: Reverse Phase (sắc ký pha đảo) IC50 Nồng độ tác dụng ức chế 50% tế bào thử nghiệm MIC Nồng độ ức chế tối thiểu HKTS Hiếu khí tổng số Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà ................................................................................................................ 7 Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà ........................... 8 Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà8 Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam ........................................................................................................ 9 Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà ......................................................................... 11 Bảng 4.1. Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD; 125 MHz) của FM8.4 ................................................................................................... 39 Bảng 4.2. Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD; 125 MHz) của F5.5 ...................................................................................................... 45 Bảng 4.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập ............................. 54 Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập ................ 55
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật....................................................................... 4 Hình 2.1. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật.................... 23 Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. ................ 28 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH ............................................................. 29 Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc .............................................................. 30 Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cặn MeOH ................................ 37 Hình 4.2. Phổ khối của FM8.4 ............................................................................... 38 Hình 4.3. Phổ 1H-NMR giãn rộng của FM8.4 ........................................................ 39 Hình 4.4. Phổ 13C-NMR giãn rộng của chất FM8.4 ............................................... 40 Hình 4.5. Phổ COSY của chất FM8.4 ................................................................... 40 Hình 4.6. Phổ HMBC của chất FM8.4 ................................................................... 41 Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất FM8.4 ....... 41 Hình 4.8. Một số tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất FM4.2 ............... 43 Hình 4.9. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cặn Etyl acetat .......................... 44 Hình 4.10. Phổ khối của chất F5.5 ......................................................................... 45 Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của chất F5.5 .................................................................. 46 Hình 4.12. Phổ 13C-NMR của chất F5.5 ................................................................ 47 Hình 4.13. Phổ COSY của chất F5.5...................................................................... 47 Hình 4.14. Phổ HMBC của chất F5.5 .................................................................... 47 Hình 4.15. Tương tác chính trên phổ COSY ( ) , HMBC ( ) của chất F5.5 ..... 48 Hình 4.16. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.4 ........................... 49 Hình 4.17. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.1 ........................... 50 Hình 4.18. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F3.3.1 ........................ 51
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ của hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) .............................................................................................................. PL1 Phụ lục 2. Phổ của hợp chất Uracil (FM7.3) ....................................................... PL5 Phụ lục 3. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) ....................................... PL7 Phụ lục 4. Phổ của hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5)................ PL11 Phụ lục 5. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) ......................................... PL15 Phụ lục 6. Phổ của hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) ........................................ PL19 Phụ lục 7. Phổ của hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) ............................... PL23 Phụ lục 8. Phổ của hợp chất Thymine (F7.2) .................................................... PL27 Phụ lục 9. Phổ của hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) .................... PL29 Phụ lục 10. Phổ của hợp chất Axit benzoic (F2.2) ............................................ PL31 Phụ lục 11. Phổ của hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) .................... PL34
ĐẶT VẤN ĐỀ Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, nó như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá [1,2]. Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số rất nhiều các hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học đặc biệt đã có nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Trong khi đó, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn nhờ vị trí địa lý tiếp giáp với biển [1,2,10]. Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú. Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển [1]. Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu các hợp chất thứ cấp của nguồn vi sinh vật biển Việt Nam nhằm phát hiện các chất có hoạt tính sinh học cao có thể nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược là hướng nghiên cứu cần thiết, hứa hẹn nhiều triển vọng. Ngoài ra, trong rất nhiều nghiên cứu về các đối tượng sinh vật biển như hải miên, san hô..., các hợp chất phân lập được đã được xác định là do chính các vi sinh vật cộng sinh tạo ra. Việc thu lượng lớn các đối tượng sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và kinh phí. Do vậy, nếu tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật, chỉ cần thu 1 lượng mẫu nhỏ phục vụ việc phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với lượng lớn trong phòng thí nghiệm phục vụ việc nghiên cứu hóa học. 1
Trong khuôn khổ của Đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu phát hiện các hợp chất chống lao từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng đông bắc bộ Việt Nam”, mã số: VAST. TĐ. ĐAB .04/13-15. Kết quả sàng lọc cho chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng Staphylococcus aureus, Echerichia coli và nấm Fusarium oxysporum [50]. Cho đến nay, trên thế giới chưa có công trình nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất ngoại bào của các loài thuộc chi Photobacterium. Do vậy, chúng tôi lựa chọn chủng vi khuẩn Photobacterium sp. này làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục tiêu: - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các chất từ dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn Photobacterium sp. - Khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển 1.1.1. Vi sinh vật Vi sinh vật (Microorganism) là những sinh vật có kích thước rất nhỏ từ vài trăm nm đến vài nm, muốn thấy rõ chúng phải sử dụng kính hiển vi. Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất. Chúng có mặt trên cơ thể người, động vật, thực vật, trong đất, trong nước, trong không khí, trên mọi đồ dùng,vật liệu, từ biển khơi đến núi cao, từ nước ngọt, nước ngầm cho đến nước biển.... Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh - địa - hoá học (biogeochemicalcycles) như vòng tuần hoàn cacbon, vòng tuần hoàn nitơ, vòng tuần hoàn photpho, vòng tuần hoàn lưu huỳnh [2,7].... Dựa vào đặc điểm cấu tạo tế bào, người ta chia ra làm 3 nhóm lớn như sau: - Nhóm chưa có cấu tạo tế bào bao gồm các loại virút. - Nhóm có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân rõ ràng (cấu trúc nhân nguyên thủy) được gọi là nhóm Procaryotes, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và tảo lam. - Nhóm có cấu tạo tế bào và có cấu trúc nhân phức tạp được gọi là Eukaryotes bao gồm nấm men, nấm sợi (gọi chung là vi nấm) một số động vật nguyên sinh và tảo đơn bào. Như vậy, vi sinh vật không có mặt trong hai giới động vật và thực vật. Người ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200000 loài vi sinh vật. Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật [2]. Vi khuẩn - Tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, đôi khi còn được gọi là vi trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước hiển vi) và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và các bào quan như ty thể và lục lạp [2,7]. 3
Virút là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể là những tác nhân gây nhiễm trùng có kích thước nhỏ nhất (đường kính từ 20-300 nm) và trong bộ gen của chúng chỉ chứa 1 loại axit nucleic (RNA hoặc DNA). Axit nucleic được bao bọc trong lớp vỏ protein và bên ngoài cùng có thể được bao quanh 1 màng lipid. Toàn bộ phân tử virút được gọi là virion. Có 3 loại virus chính là Viroid (ARN có tính cảm nhiễm), Virusoid (ARN không có tính cảm nhiễm) và Virino. Số virút đã được đặt tên là khoảng 4000 loài [2,7]. Xạ khuẩn - danh pháp khoa học là Actinobacteria, tiếng Anh là Actinomycetes là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trước kia được xếp vào tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes). Xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm nhưng giống vi khuẩn: có giai đoạn đơn bào và có giai đoạn đa bào, kích thước rất nhỏ, nhân giống với vi khuẩn, không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không chứa cellulose hoặc chitin, giống với vi khuẩn, phân chia tế bào giống với vi khuẩn (kiểu Amitose). Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), hoại sinh và ký sinh [2,5]. Vi khuẩn Escherichia Nấm men Nấm sợi Alternaria Vi tảo Chlorella coli Saccharomyces cerevisae Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật 1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên Phân giải các hợp chất hữu cơ. Làm nguồn thức ăn bổ dưỡng cho các sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ khác, tức là chuyển hóa nhanh các chất hữu cơ trong chu trình thức ăn. Làm nguồn thức ăn cho các loại giun, sâu bọ tạo ra mạng lưới thức 4
ăn. Biến đổi các chất để các cơ thể khác nhau có thể sử dụng được. Biến đổi rất lớn các chất bằng cách hình thành các chất hòa tan và khí, từ đó tạo ra các chất tham gia vào con đường chuyển hóa trực tiếp hoặc biến đổi môi trường một cách gián tiếp. Hình thành các chất ức chế làm giảm hoạt động của các vi sinh vật khác, của thực vật và động vật. Số lượng và chủng vi sinh vật trong tự nhiên là rất lớn, rất đa dạng và luôn biến đổi. Ở một số nơi, số vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn chất dinh dưỡng, các chất độc hại và các tác nhân tới hạn khác. Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, S, P… và có khả năng chuyển hóa các hợp chất độc hại chứa kim loại nặng như bạc, vàng, thủy ngân, đồng… thành các dạng không độc hại hoặc ít độc hơn đối với cơ thể người động vật và cây trồng [7]. 1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống Sử dụng vi sinh vật trong lên men đồ uống, lên men lactic, ủ chua thức ăn gia súc, sử dụng những tác nhân ức chế vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm, giữ vệ sinh môi trường làm việc và hoạt động sống. Vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn – mô hình lý tưởng trong công nghệ di truyền và công nghệ sinh học. Một số vi sinh vật là tác nhân gây bệnh trên người, động vật và cây trồng. Hiện có khoảng 1000 loài virút gây bệnh trên thực vật, gần 90% các bệnh đường hô hấp ở người là do virút, trong đó có bệnh viên đường hô hấp cấp (bệnh SARS), HIV/AIDS vẫn là đại dịch chưa có thuốc chữa khỏi, các bệnh vi khuẩn trên người cũng rất nhiều như viên xoang mũi (Staphylococcus sp), bạch hầu (Corynebacteriumdiphtheria), ho gà (Bordetella pertusis), lao phổi (Mycobacterrium tuberculosis) [7]. 1.1.4. Vi sinh vật biển Biển là môi trường sống rất đặc biệt, vì ở đó nghèo chất dinh dưỡng và độ mặn cao. Biển là một hệ sinh thái tự nhiên lớn nhất địa cầu vì hơn 70% bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước. Vi sinh vật biển có khả năng thích nghi với các điều kiện môi trường biển luôn bị thay đổi, điều này mở ra các triển vọng phát triển các hợp chất hữu cơ thứ cấp duy nhất. Số lượng vi sinh vật biển không cao như trên 5
cạn. Vi sinh vật biển có thể phân lập được từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối tượng mà hoạt động hoặc bất động mà vi sinh vật có thể cộng sinh. Hiểu được qui luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ làm dễ dàng và tạo điều kiện thuận lợi để thu thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho việc phân lập định hướng các nhóm vi sinh vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1,2,10]. Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai trò quan trọng đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản. Những vi sinh vật này có thể tìm thấy ở bất kỳ ngõ ngách nào ở đại dương từ trên bề mặt đến dưới thềm đáy biển, trên các cơ thể sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu. Dưới 5% số tế bào vi khuẩn quan sát được ở các mẫu sinh vật lấy từ biển là có thể phát triển trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo. Và người ta ước tính rằng số vi khuẩn biển hiện giờ đã có thể nuôi cấy và phân lập chỉ chiếm dưới 1% số loài trong thực tế. Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên quan trọng sản sinh các chất với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính sinh học mới. Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng [1,2]. 1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú. Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km 2 vùng biển. Kết quả thống kê đến nay đã thông báo 12000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc tính sinh học tiềm tàng. Tuy nhiên, việc điều tra nghiên cứu để khai thác tiềm năng đó vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu, phát triển, khai thác những nguồn tài nguyên sinh vật biển đang là vấn đề cấp bách không chỉ nước ta mà trên toàn thế giới [1]. Để có thể đánh giá và nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật biển, trong nghiên cứu về đa dạng sinh học vi sinh vật biển thuộc vùng biển Cát Bà, Hải Phòng, tác giả Lại Thúy Hiền và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN) đã khảo 6
sát, phân tích và thống kê sự có mặt của vi sinh vật từ các mẫu nước biển Cát Bà [4]. Kết quả cho thấy khu hệ vi sinh vật ở vịnh Lan Hạ - Cát Bà rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn, vi khuẩn lên men, vi khuẩn chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, vi khuẩn sử dụng các hyđrocacbon và vi khuẩn khử sulphat. Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà Tọa độ Nấm Nấm Xạ Sử dụng Nitrit Nitrat Khử Khử Hiếu khí mốc Men khuẩn Lên men hyđrocacbon hóa hóa nitrat sulphat 20°43’820” 105 4 x 101 0 0 104 104 102 10 5x 101 5 x 101 107°4’480” 2 x 107 8 x 104 0 0 105 105 105 102 102 105 20°45’263” 105 0 0 0 105 104 10l 103 103 10 107°04’02” 1,7 x 107 0 0 0 106 5 x 105 103 103 104 104 20°45’915” 106 2 x 102 0 0 104 5 x 104 102 104 104 10 7 4 5 5 4 4 4 107°03’519” 1,8 x 10 10 0 0 5 x 10 10 10 10 10 105 20°46’175” 106 2 x 102 0 10 105 5 x 104 102 102 5x102 10 107°04’906” 1,6 x 107 4 x 104 0 0 106 5 x 105 104 106 106 105 20°46’886” 106 0 0 0 105 5 x I04 102 103 103 102 107o06’001 1,7 x 107 2 x 102 0 0 107 5 x 105 104 106 106 5 x 105 20°47’563” 106 6x 101 0 10 105 5 x 104 102 102 102 10l 107o06’584” 3,4 x 107 4 x 102 0 0 106 105 104 106 5x105 5 x 105 20°45’702” 106 2 x 101 2 x 101 0 104 5 x 104 102 102 5x102 102 107°07’625” 1,7 X 107 0 0 0 105 105 104 104 104 5 x105 20°45’356” 105 4 x101 0 0 105 5 x104 102 102 102 10 107°07’758” 1,8 X 107 0 0 0 106 105 103 103 103 5 x 105 20°44’161” 106 0 2 x101 0 5 x 104 5 x104 102 104 104 102 107°03’853” 1,7 x 107 8 x102 0 0 107 5 x 105 103 106 106 5 x 105 20°44’496” 106 0 0 10 104 5 x 104 104 102 103 10 107°03’513 1,9 x 107 0 0 0 5 x 105 5 x 105 104 106 106 104 Đánh giá phân loại vi khuẩn từ một số mẫu nước và trầm tích chọn lọc cho thấy các chủng vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế hơn các chủng Gram dương. Các 7
chủng Gram âm phân loại được thuộc các chi: Acinobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Sphingomonas, Ochrobactrum còn vi khuẩn Gram dương chỉ có Bacius, Janibacier. Các loài vi khuẩn phân lập đều có tỷ lệ tương đồng rất cao 93 - 100% so với các chủng trong ngân hàng dữ liệu. Trong khi đó, đối với các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà chủ yếu bao gồm Candida, Rhodotorula, Cladosporium, Penicillium và Steptomyces (bảng 1.2). Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà TT Mẫu Tên Độ tương đồng 1 Nước bề mặt Pseudomonas vesicularis 93,3% 2 Nước bề mặt Flavobacterium indologenes 79,1% 3 Nước bề mặt Pseudomonas vesicularis 93,3% 4 Nước bề mặt Pseudomonas aeruginosa 99,9% 5 Nước bề mặt Sphingomonas paucimobilis 99,7% 6 Nước bề mặt Acinetobacter johnsonii 89% 7 Nước bề mặt Pseudomonas cepacia 99% 8 Trầm tích Ochrobactrum cytisis 100% 9 Trầm tích Bacillus megatherium 100% 10 Nước bề mặt Janibacter marinus 100% Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà TT Mẫu Tên 1 Nước tầng giữa Penicillium duclauxe 2 Trầm tích Penicillium oxalicum 3 Nước bề mặt Cladosporium sphaerospermum 4 Nước bề mặt Penicillium oxalicum 5 Nước bề mặt Candida parasilosis 6 Nước bề mặt Rhodotorula mucilaginosa 2 7 Nước bề mặt Streptomyces celluloflavus 8 Nước bề mặt Streptomyces sclerotialus 8
Cũng trong một nghiên cứu tương tự, Tống Kim Thuần và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học) đã công bố nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trên các mẫu nước biển, động, thực vật và trầm tích ở các vùng biển khác nhau của Việt Nam, như Quảng Bình, Bình Định, Phú Yên, Nha Trang, đảo Trường Sa, Hải Phòng và Nam Định [11]. Từ 10 mẫu nước, 12 mẫu trầm tích, 2 mẫu san hô và 1 mẫu rong ở các địa điểm và các vị trí lấy mẫu khác nhau của biển Việt Nam, tác giả đã phân lập và xác định số lượng các nhóm vi sinh vật biển (bảng 1.4). Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam Địa điểm Vi khuẩn Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Đặc điểm mẫu lấy mẫu CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ Cửa Đà Gần bờ, độ sâu 4,7 m, Rằng độ mặn 2,5% 3,3x101 19 3,7x101 9 0 0 2,3x101 10 Xa bờ, độ sâu 1,7 m, độ mặn 3% 7,2x102 25 0,8x101 5 0,4x101 1 0 0 Vịnh Quy Xa bờ, độ sâu l,5 m, Nhơn độ mặn 3% 5,1x102 29 1,1x101 9 0 0 0,3x101 1 Xa bờ, độ sâu 1,8 m, độ mặn 3% 3,4x102 17 3,3x101 8 0,5x101 2 0 0 Đảo Xa bờ, độ sâu 0,2 m, Trường Sa độ mặn 3% 7,6x103 11 0,7x101 5 0 0 5,0x101 1 Biển Hải Ao nuôi rong tảo, Phòng nước lợ 1,0x103 17 2,0x101 5 0 0 5 1 Nước ở độ sâu 6 m, Đảo Cát Bà độ mặn 3% 7,0x102 30 101 2 0 0 3 1 Nước ven bờ, độ mặn Hạ Long 2% 3,2x103 20 2 x102 4 2 2 5 2 Nước nuôi tôm, độ Nam Định mặn 2% 1,2x101 32 4,2 x102 10 2,0x102 3 2,8x101 4 Nha Trang Cửa sông, nước lợ 5,2x103 15 2,6x101 3 3,2x102 9 8 2 Tổng số chủng: 314 215 60 17 22 Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được 9
Bảng 5. Số lượng và vi sinh vật tách được trong các mẫu trầm tích biển Việt Nam Vi khuẩn Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Địa điểm Đặc điếm mẫu lấy mẫu CFU/g SCTD CFU/g SCTĐ CFU/g SCTĐ CFU/g SCTĐ Gần bờ, độ sâu 0,7 m, độ mặn 2% 4,2x103 23 1,1x102 7 0 0 2x102 1 Gần bờ, ở độ sâu 0,9 m, độ mặn: 2% 1,3x104 12 9,3x101 6 0 0 1,7x102 3 Gần bờ, độ sâu 2,1 m, độ mặn 2% 2x104 13 7,5x101 6 0 0 8,8x10l 2 Gần bờ, độ sâu 1,2 m, độ mặn 2% 2,2x104 9 2x102 4 0 2 0 0 Độ sâu: 2,l m, độ mặn: 2% 2,2x104 7 1,1x102 3 0 0 1,1x103 4 Bình Xa bờ, độ sâu 9,1 m, độ Định mặn 2% 3,7x102 9 1,3x102 2 0 0 0 0 Gần bờ, độ sâu 2 m, độ mặn 2% 1,3x104 44 3,2x102 1 0 0 0 0 Xa bờ, độ sâu 10,3 m, độ mặn 2% 9,6x103 6 2,2x102 8 0 0 0 0 Gần bờ, độ sâu 2,6 m, độ mận 2% 2,1x1o4 23 0 0 0 0 0 0 Xa bờ, độ sâu 11,6 m, độ mặn 2% 3,7x103 6 7,8x102 7 0 0 5x101 1 Xa bờ, độ sâu 33 m, độ mặn 2% 5,6x104 12 0 0 2x103 1 0 0 Quảng Xa bờ, độ sâu 4,8 m, độ Bình mặn 2% 1,2x104 18 6,9x101 3 2,5x101 1 0 0 Tổng số: 244 182 47 4 11 Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được Nhóm xạ khuẩn từ lâu đã được biết đến như là nguồn sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và luôn là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều. Từ các mẫu đất và lá cây mục thu tại Cát Bà đã phân lập được 424 chủng xạ khuẩn [2,6]. Trong số các chủng này, 353 chủng (83,25%) phân lập được từ đất và 71 chủng (16,75%) từ mẫu lá cây mục. Các chủng xạ khuẩn phân lập đã được xác định tên và phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn 10