Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

VÕ THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG TỪ DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

VÕ THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG TỪ DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Hướng dẫn 1: TS. NGUYỄN VĂN KHOA

Hướng dẫn 2: TS: LÊ THỊ ÁNH HỒNG

TP. Hồ Chí Minh - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS. Nguyễn Văn Khoa và cô TS. Lê Thị Ánh Hồng. Đây không phải là bản sao chép của bất kì một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình

bày ở luận văn này.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019

Người cam đoan

Võ Thị Thu Giang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Nguyễn Văn Khoa và cô TS. Lê Thị Ánh Hồng đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học nhiệt đới và Viện Công nghệ Hóa học, thầy cô giảng viên và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin cảm ơn đến tất cả bạn bè, đồng nghiệp, những người luôn động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi xin dành những tình cảm trân trọng nhất cho những người thân trong gia đình đã luôn động viên và giúp tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu.

Võ Thị Thu Giang

iii

DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bộ Y Tế

BYT: NN&PTNT: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn EC: FAO:

Cộng đồng Châu Âu (European Community) Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) Phân tích thị trường đồ uống của Anh Nghiệm thức Tổ chức Rượu vang và Rượu Quốc tế Quy Chuẩn Việt Nam Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) Saccharomyces uvarum 664 (S2) Sabouraud Tiêu Chuẩn Việt Nam IWSR: NT: OIV: QCVN: S1: S2: SBD: TCVN:

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở quả điều……………………… .9

Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều. ....................... 27

Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến hoạt tính của enzym tanase. ............................................................................ 27

Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase. ....................... 28

Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng gelatin đến quá trình tách loại tanin trong dịch ép quả điều. ........................................................................... 29

Bảng 2.5: Lựa chọn môi trường nhân giống nấm men. .................................. 30

Bảng 2.6: Giá trị thay đổi của các thông số trong quá trình lên men chính. .. 31

Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm CCD để tối ưu hóa quá trình lên men chính ở dịch ép quả điều............................................................................................... 32

Bảng 2.8: Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic. ................................... 33

Bảng 2.9: Điểm trung bình và hệ số trọng lượng. ........................................... 37

Bảng 2.10: Bảng điểm chất lượng của sản phẩm. ........................................... 38

Bảng 3.1: Một số các chỉ tiêu dinh dưỡng trong dịch ép quả điều ban đầu. .. 40

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến quá trình thủy phân tanin bằng enzym tanase trong thời gian 30 phút. ............................................................ 42

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase đến tách loại tanin. ....... 43

Bảng 3.4: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch quả điều sau quá trình tách loại tanin. ......................................................................................................... 47

Bảng 3.5: Kết quả phân tích ANOVA đến quá trình hình thành cồn trong lên men chính. ....................................................................................................... 54

Bảng 3.6: Tác động các yếu tố đến quá trình hình thành độ cồn theo phần mềm JMP. ........................................................................................................ 55

Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra thực nghiệm từ thông số của ............................... 58

Bảng 3.8: Kết quả một số chỉ tiêu ở sản phẩm rượu vang điều. ..................... 60

Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ở rượu vang điều. ........... 60

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Cây điều. ........................................................................................... 3

Hình 1.2: Khu vực trồng điều trên thế giới. ...................................................... 5

Hình 1.3: Đóng góp của các nước đối với sản lượng điều thế giới năm .......... 6

Hình 1.4: Thị trường xuất khẩu hạt điều của Việt Nam ................................... 6

Hình 1.5: Quả điều. ........................................................................................... 8

Hình 1.6: Quả điều bị vứt bỏ khi đến mùa thu hoạch. ...................................... 8

Hình 1.7: Phản ứng thủy phân ellagitanin. ...................................................... 11

Hình 1.8: Phản ứng thủy phân gallotanin. ...................................................... 11

Hình 1.9: Cấu trúc của các flavonoic. ............................................................. 12

Hình 1.10: Phản ứng xúc tác thủy phân ở enzym tanase. ............................... 13

Hình 2.1: Quá trình ép quả điều bằng máy ép trục vít………………………24

Hình 3.1: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nồng độ khác nhau….45

Hình 3.2: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nhiệt độ khác nhau. .... 46

Hình 3.3: Dịch ép quả điều trước và sau xử lý bằng enzyme tanase và gelatin. ......................................................................................................................... 48

Hình 3.4: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1). ............................................................................................... 49

Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2). ................................................................................................................. 49

Hình 3.6: Sự biến thiên oBrix .......................................................................... 51

Hình 3.7: Sự biến thiên độ cồn ........................................................................ 51

Hình 3.8: Sự biến đổi hàm lượng axit tổng số trong quá trình lên men chính. ......................................................................................................................... 52

Hình 3.9: Sự biến đổi giá trị pH trong quá trình lên men chính. .................... 52

vii

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của 3 yếu tố khảo sát đến độ cồn tạo thành trong không gian 3 chiều. ...................................................................... 55

Hình 3.11: Kết quả tối ưu hóa ba yếu tố ảnh hưởng theo phần mềm JMP. .... 56

Hình 3.12: Kết quả các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình lên men. ................. 58

Hình 3.13: Rượu vang điều. ............................................................................ 59

Sơ đồ 3.1: Giản đồ phân tích HPLC xác định axit gallic trong dịch ép quả điều trước và sau khi thủy phân bằng enzym tanase............................................... 44

Sơ đồ 3.2: Quy trình sản xuất rượu vang điều……………………………….61

viii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢN, SƠ ĐỒ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. CÂY ĐIỀU ................................................................................................. 3

1.1.1. Khái quát về cây điều ........................................................................... 3

1.1.2. Tình hình sản xuất, chế biến và tiêu thụ hạt điều ................................ 5

2. QUẢ ĐIỀU .................................................................................................... 7

1.3. TANIN ..................................................................................................... 10

1.3.1. Định nghĩa .......................................................................................... 10

1.3.2. Phân loại và cấu trúc ...................................................................... 10

1.4. ENZYM TANASE ................................................................................... 12

1.4.1. Định nghĩa và tính đặc hiệu .............................................................. 12

1.4.2. Thành phần cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzym tanase ................. 12

1.4.3. Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym .................. 13

1.5. GELATIN................................................................................................. 14

1.5.1. Định nghĩa .......................................................................................... 14

1.5.2. Tính chất ............................................................................................ 14

1.5.3. Liên kết hóa học giữa gelatin và tanin ............................................... 15

1.6. RƯỢU VANG .......................................................................................... 16

1.6.1. Giới thiệu chung về rượu vang .......................................................... 16

1.6.2. Phân loại rượu vang .......................................................................... 16

1.6.3. Tình hình sản xuất rượu vang ............................................................ 18

1.6.3.1. Trên thế giới ................................................................................ 18

1.6.3.2. Ở Việt Nam ................................................................................... 18

1.6.4. Cơ chế lên men rượu vang ................................................................. 19

1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .................................... 20

1.6.5.1. Nấm men ...................................................................................... 20

1.6.5.2. Ảnh hưởng của pH ...................................................................... 21

1.6.5.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khí oxy .............................................. 21

1.6.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................... 21

1.6.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường .................................................. 22

1.6.6.6. Ảnh hưởng của nồng độ etanol .................................................... 22

1.6.6.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men ................................................ 22

1.6.6.8. Ảnh hưởng của CO2 .................................................................... 23

Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 24

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ......................................... 24

2.1.1. Thời gian ............................................................................................ 24

2.1.2. Địa điểm ............................................................................................. 24

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................... 24

2.2.1. Dịch ép quả điều ................................................................................ 24

2.2.2. Enzym tanase ..................................................................................... 24

2.2.3. Gelatin ................................................................................................ 25

2.2.4. Vi sinh vật .......................................................................................... 25

2.3. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 25

2.3.1. Môi trường ......................................................................................... 25

2.3.2. Hóa chất ............................................................................................. 25

2.3.4. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 26

2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................... 26

2.4.1. Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu ........... 26

2.4.2. Xác định sự ảnh hưởng của giá trị pH, nhiệt độ ở dịch ép quả điều và hàm lượng enzym tanase đến hiệu suất thủy phân tanin ............................. 26

2.4.3. Xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng gelatin và nhiệt độ ở dịch ép quả điều đến hiệu suất tách loại tanin. ........................................................ 28

2.4.5. Khảo sát môi trường nuôi cấy và xác định chủng nấm men thích hợp cho quá trình lên men dịch ép quả điều ....................................................... 29

2.4.6. Xác định điều kiện tối ưu hóa trong quá trình lên men rượu vang điều ...................................................................................................................... 30

2.4.7. Xây dựng quy trình lên men rượu vang điều ..................................... 32

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 32

2.5.1. Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp Lowenthal ................. 32

2.5.2. Xác định hàm lượng polyphenol ........................................................ 33

2.5.3. Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) ...................................................................................................................... 34

2.4.4. Xác định năng lực khử ....................................................................... 34

2.5.5. Xác định hiệu suất tách loại tanin ...................................................... 35

2.5.6. Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (oBrix) .................................. 35

2.5.7. Xác định pH ....................................................................................... 35

2.5.8. Xác định hàm lượng axit tổng số ....................................................... 35

2.5.9. Xác định tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu ....................... 36

2.5.10. Xác định độ cồn trong rượu ............................................................. 36

2.5.11. Đánh giá cảm quan ........................................................................... 37

2.5.12. Xử lí số liệu ...................................................................................... 38

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 39

3.1. MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU BAN ĐẦU ....................................................................................................... 39

3.2. KHẢO SÁT THỦY PHÂN TANIN BẰNG ENZYM TANASE ........... 41

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁCH LOẠI TANIN BẰNG GELATIN ........ 45

3.4. MỘT SỐ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU SAU XỬ LÝ ......................................................................................... 47

3.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ NẤM MEN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN ................................................ 48

3.5.1. Kết quả xác định môi trường và thời điểm dừng ở quá trình nhân giống nấm men ............................................................................................. 48

3.5.2. Kết quả lựa chọn nấm men để lên men rượu vang điều .................... 50

3.6. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN................................................... 54

3.7. XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG ĐIỀU ............ 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH .......................................................................... 61

KẾT LUẬN .................................................................................................. 62

KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 64

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 71

MỞ ĐẦU

Cây điều (đào lộn hột) có tên khoa học Anacardium occidentale, là cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt ở những quốc gia thuộc khu vực cận xích đạo, nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao. Ở Việt Nam, điều là cây kinh tế vườn quan trọng trong cơ cấu cây trồng của các tỉnh phía Nam như: Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận, Gia Lai, Bình Định...với tổng diện tích thu hoạch hơn 300 nghìn hecta [1]. Theo ước tính năm 2017, lần đầu tiên nước ta vươn lên là nước xuất khẩu hạt điều đứng đầu thế giới với tổng sản lượng xuất khẩu đạt hơn 360 nghìn tấn hạt điều và giá trị đạt hơn 3 tỷ đô la Mỹ [2]. Quả điều gồm hạt điều và cuống điều (hay còn gọi là quả điều giả, trong dân gian gọi là quả điều, ở đề tài này cũng gọi là quả điều). Theo các nghiên cứu tại Ấn Độ, Brasil, Nigeria hàm lượng vitamin C trong dịch ép quả điều đạt tới 219 mg/100mL cao gấp 5 lần cam, 12 lần so với dứa [3,4]. Dịch ép quả điều còn chứa hàm lượng cao các hợp chất tanin, polyphenol là các hợp chất kháng oxy hóa tự nhiên rất có lợi cho sức khỏe giúp ngăn ngừa ung thư và phòng chống các vi khuẩn gây viêm dạ dày [3]. Thế nhưng khi đến mùa thu hoạch hạt điều được giữ lại để chế biến, quả điều bị vứt bỏ, nguyên nhân do chứa hàm lượng tanin (250-470 mg/100mL) cao gây chát, sít lưỡi và khô rát vòm họng khi sử dụng. Theo thống kê, cứ khoảng 8-10 tấn quả điều sẽ thu về khoảng 1 tấn hạt điều thô, như vậy lượng quả điều đang bị bỏ hiện nay của nước ta ước khoảng 2,5-3 triệu tấn [5].

Quả điều rất giàu dinh dưỡng, có khả năng kháng oxy hóa cao là bạn của sức khỏe, nhưng đang bị vứt bỏ vừa gây ô nhiễm môi trường, vừa lãng phí. Nếu loại bỏ được vị chát tận dụng được nguồn nguyên liệu quả điều, mang nhiều ý nghĩa to lớn. Theo các nghiên cứu trước đây, để tách loại hàm lượng tanin thường sử dụng gelatin, casein, lòng trắng trứng, tinh bột gạo, tinh bột sắn… nhằm tạo kết tủa protein-tanin loại ra khỏi dung dịch [4]. Phương pháp truyền thống này có nhược điểm là tiến hành ở nhiệt độ cao 60-80oC làm mất đi các vitamin B, C có trong dịch quả điều. Đồng thời tanin cũng là một polyphenol hữu ích bị loại hẳn ra khỏi dịch ép, làm giảm hàm lượng polyphenol hữu ích và

khả năng kháng oxy hóa của dịch ép quả điều ban đầu. Dịch ép sau xử lý thu được chế biến các loại đồ uống như: nước giải khát, nước lên men,...vẫn còn vị quá chát và sít lưỡi. Do vậy, ở nước ta vẫn chưa có nơi nào sản xuất rượu/nước uống dinh dưỡng từ dịch ép quả điều. Ngược lại các loại nước uống được lên men từ các loại quả cho độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, tốt cho sức khỏe như: kích thích tiêu hóa, giảm stress…thì đang được ưa chuộng và mang lại nhiều giá trị kinh tế.

Từ lý do trên đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều” được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa enzym tanase và gelatin để xử lý tách loại tanin hiệu quả, giảm vị quá chát và tăng hàm lượng polyphenol ở dịch sau xử lý, nhằm làm nguồn nguyên liệu bổ dưỡng tạo ra đặc sản của địa phương, giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập cho người nông dân.

* Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện tối ưu của enzym tanase và gelatin trong quá trình thủy phân và tách loại tanin đạt hiệu suất cao nhất nhưng vẫn giữ được dinh dưỡng trong dịch ép quả điều.

Xây dựng quy trình sản xuất rượu vang điều từ dịch ép quả điều sau khi

tách loại tanin.

* Ý nghĩa khoa học Sử dụng enzym tanase để thủy phân tanin thủy phân trong dịch ép quả điều là nghiên cứu rất mới, vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam và thế giới sử dụng enzym này cho dịch ép điều.

Sử dụng kết hợp phương pháp sinh hóa (enzym tanase và gelatin) đã xử lý tanin hiệu quả cao, giảm vị chát nhưng vẫn giữ được hàm lượng dinh dưỡng trong dịch quả điều.

* Ý nghĩa thực tiễn Tận dụng nguồn nguyên liệu đang bị vứt bỏ tạo thành sản phẩm có ích giúp làm giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập cho nông dân, góp phần đa dạng hóa sản phẩm cho ngành điều.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐIỀU

1.1.1. Khái quát về cây điều

Hình 1.1: Cây điều.

Phân loại thực vật: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp: Hai lá mầm thực sự (Eudicots) Phân lớp: Phân lớp Hoa hồng (Rosids) Bộ: Bồ hòn (Sapindales) Họ: Đào lộn hột (Anacardiaceae) Chi: Đào lộn hột (Anacardium) Loài: Đào lộn hột (Anacardium occidental)

Cây điều (hình 1.1) có tên khoa học là Anacardium occidentale Linn., còn được gọi là cây đào lộn hột có nguồn gốc từ Brasil-khu vực Nam Mỹ. Cây có đặc tính gỗ tốt, gây hiệu ứng cảnh quan. Quả có chứa các thành phần dinh dưỡng tốt cho sức khỏe con người (vitamin, khoáng, hàm lượng polyphenol,...) và có thể ăn được nên nhanh chóng được phổ biến rộng rãi trên khắp thế giới.

Điều là cây công nghiệp lâu năm có tuổi thọ lên tới 40 năm tuổi; cây thường cho năng suất ổn định trong giai đoạn từ 10 đến 20 năm sau khi trồng. Cây điều có thể sinh trưởng và phát triển từ vĩ độ 25o Bắc đến 25o Nam nhưng vùng sản xuất chủ yếu từ vĩ độ 15o Bắc đến 15o Nam. Độ cao so với mặt nước biển của vùng đất trồng phụ thuộc vào vĩ độ, địa hình và vùng khí hậu nhưng thích hợp nhất là dưới 600 m so với mặt nước biển. Độ dài ngày và thời gian chiếu sáng không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển, cây có thể sống từ 5-45oC nhưng nhiệt độ trung bình thích hợp nhất là khoảng 27oC. Đồng thời cây điều thích nghi với lượng mưa hàng năm biến động từ 400-5000 mm, thích hợp nhất là 1000-2000 mm và ở cây cần ít nhất 2 tháng khô hạn hoàn toàn để phân hóa mầm hoa. Độ ẩm tương đối ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển ở cây điều, tuy nhiên nếu độ ẩm quá cao trong thời kỳ ra hoa có thể làm gia tăng bệnh thán thư ở cây do bọ xít và muỗi gây ra. Trong khi đó độ ẩm

tương đối thấp kết hợp với gió nóng sẽ gây khô bông và rụng quả non. Đất trồng cây điều thích hợp nhất là các loại đất giàu chất hữu cơ, pH từ 6,3-7,3 không thích hợp với các loại đất ngập úng, nhiễm phèn, mặn, hay đất có tầng canh tác mỏng [6].

Cây điều phát triển tốt ở những nơi có ánh sáng mạnh, thân cao khoảng từ 3-8 m, trong điều kiện sinh trưởng tốt cây có thể cao tới 10 m. Thân và cành cây thường có nhiều mủ, cành thường phát sinh theo chiều ngang, tán cây có dạng hình dù. Rễ cây điều thuộc loại rễ cọc, các rễ ngang phát triển mạnh, ăn sâu vào trong đất để tìm kiếm chất dinh dưỡng. Khi trồng nơi đất tơi xốp thì chỉ cần sau 2 đến 3 tháng, cây có thể cắm sâu xuống 80 cm, sau khi trồng được 5 tháng, rễ cây ăn sâu vào đất tới 2 m. Tùy vào loại đất và khả năng sinh trưởng của cây, bộ rễ có thể ăn sâu hàng chục mét. Vì vậy mà cây có khả năng chịu hạn rất tốt, có thể sinh trưởng bình thường trong mùa khô từ 5-6 tháng. Bộ lá ở cây thường tập trung ở đầu cành, lá thường có chiều dài từ 10-20 cm, chiều rộng từ 5-10 cm, cuống lá ngắn. Phiến lá khá dày với những đường gân nổi rõ đặc biệt là mặt dưới, khi còn non lá điều thường có màu đỏ hoặc hơi xanh nhạt, khi già lá chuyển sang màu xanh đậm. Bộ tán của cây điều thường rất rộng, khi cây trưởng thành thì bộ tán có thể rộng đến 5 m tính từ gốc [6].

Cây điều thường ra hoa vào lúc kết thúc mùa mưa chuẩn bị chuyển sang mùa khô. Hoa điều có cả hoa đơn tính và hoa lưỡng tính, mọc thành từng chùm, số lượng hoa mỗi chùm có khoảng từ vài chục hoặc hàng trăm. Hoa điều thường có màu vàng hoặc trắng có 5 cánh, đối với hoa đực chỉ có nhị đực còn hoa lưỡng tính thì có tới 8 đến 10 nhị đực và 1 nhụy cái. Thông thường thì chỉ có 1 nhị đực ở hoa lưỡng tính phát triển đầy đủ các chức năng và có khả năng tung phấn. Hoa điều thường mọc ở đầu cành, bao gồm cả hoa đực lẫn hoa lưỡng tính. Hoa thường chỉ thụ phấn bằng côn trùng hoặc gió, nở vào buổi sáng nhưng trong lúc hoa đang nở có xuất hiện mưa thì bao phấn sẽ không thể nứt ra để phấn rớt vào nên quá trình thụ phấn sẽ không xảy ra khiến mất mùa. Cây điều sau 2-3 năm trồng mới thì bắt đầu trổ hoa, thời gian ra hoa thường kéo dài khoảng 3 tháng [6].

1.1.2. Tình hình sản xuất, chế biến và tiêu thụ hạt điều

+ Trên thế giới [7]:

Hình 1.2: Khu vực trồng điều trên thế giới. (Nguồn: Various trade and government, 2016).

Trong những năm gần đây, hạt điều đã qua chế biến trở thành mặt hàng cao cấp ngày càng được ưa chuộng và tiêu thụ mạnh trên khắp thế giới như: Mỹ, Anh, Pháp, Nhật Bản,... Theo thống kê của FAO, hiện nay có 32 quốc gia trồng điều với tổng sản lượng hạt điều thô trên toàn thế giới từ 1.500-1.600 ngàn tấn. Nhưng cây điều sinh trưởng và phát triển tốt ở những quốc gia thuộc khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới - nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao, do vậy việc canh tác cây điều được phân bố chủ yếu ở các nước (hình 1.2): Ấn Độ, Brasil, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Philippin, các nước ở Tây Phi và Đông Phi… Sản lượng điều toàn cầu ở giai đoạn 2015-2016 đạt gần 3,25 triệu tấn hạt điều tươi. Từ hình 1.3, có thể thấy rằng Tây Phi đứng đầu về sản lượng điều toàn cầu (45%), tiếp theo là Ấn Độ (22%), Việt Nam (12%), Đông Phi (9%) sau đó ở các nước: Brasil, Indonesia, Campuchia...Trong số những quốc gia sản xuất và chế biến điều lớn nhất thế giới như: Ấn Độ, Brasil và Việt Nam… Việt Nam lần đầu tiên vươn lên là nước chế biến và xuất khẩu hạt điều đứng đầu thế giới, chiếm thị phần trên 60% tổng giá trị xuất khẩu hạt điều toàn cầu, xếp trên cả Ấn Độ và Brasil. Sản lượng chế biến đạt 1,65 triệu tấn hạt điều thô; xuất khẩu 391.000 tấn nhân điều, đạt kim ngạch xuất khẩu 3,52 tỷ USD, tăng 7,8% về lượng so với năm 2017. Với năng lực chế biến lớn nước ta phải nhập khẩu điều thô từ các nước châu Phi, Campuchia… Trong đó các quốc gia thuộc khu vực châu Phi sản lượng điều chế biến rất ít, hơn 90% lượng điều thô của các

quốc gia thuộc khu vực này đều được xuất khẩu sang Việt Nam, Ấn Độ, Brasil. Hiện nay các quốc gia châu Phi đang có nhiều nỗ lực nhằm gia tăng năng lực chế biến hạt điều.

Theo số liệu của INC Global Statistics Review, nhu cầu về hạt điều nhân trên thế giới giai đoạn 2009-2016 khá cao khoảng 6,1%, trong khi sản lượng điều nhân thế giới giai đoạn 2005-2006 chỉ đáp ứng được khoảng ½ nhu cầu. Nhu cầu tiêu thụ hạt điều chế biến qua nhiều thập niên ngày một gia tăng do ở hạt điều mang lại hàm lượng dinh dưỡng và năng lượng cao. Cụ thể, các quốc gia có mức tăng trưởng tiêu thụ nhanh nhất gồm: Liên Bang Nga, các nước Trung Đông và Canada với lượng tiêu thụ điều nhân lần lượt là 15,6%, 8,7% và 5,6%.

Hình 1.3: Đóng góp của các nước đối với sản lượng điều thế giới năm 2015-2016 (nguồn: Various trade and government, 2016).

+ Ở Việt Nam

Hình 1.4: Thị trường xuất khẩu hạt điều của Việt Nam (nguồn Bộ NN&PTNT, 2017).

Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tổng diện tích trồng điều ở nước ta khoảng 337 nghìn hecta. Trong đó tỉnh Bình Phước có hơn 134 nghìn hecta đang được sử dụng canh tác điều, chiếm khoảng 40% diện tích trồng điều cả nước, cùng với đó là khoảng hơn 200 doanh nghiệp và 400 hộ kinh doanh tham gia vào khâu chế biến và xuất khẩu hạt điều. Điều đó làm cho tỉnh này trở thành “thủ phủ” điều của cả nước [8].

Theo Tổng Cục Hải Quan Việt Nam, kết quả thống kê giá trị xuất khẩu hạt điều của Việt Nam tăng qua các năm. Cụ thể, giá trị xuất khẩu năm 2007 đạt 654 triệu USD, năm 2008 đạt 920 triệu. Đến năm 2010, nước ta xuất khẩu 80.000 tấn hạt điều, đạt 1.136 triệu USD tăng đến 26% giá trị và 6% số lượng so các năm trước. Thống kê của FAO năm 2017, cả nước chế biến hơn 1,6 triệu tấn nguyên liệu nhưng nguồn cung trong nước chỉ đáp ứng được 220 nghìn tấn, phần còn lại phải nhập khẩu và doanh thu vượt mốc 3,5 tỷ USD/năm, lần đầu tiên vươn lên là nước xuất khẩu hạt điều lớn nhất thế giới. Trong các năm gần đây Mỹ trở thành thị trường xuất khẩu lớn nhất chiếm 34% lượng điều xuất khẩu, theo sau là Trung Quốc (14%), Hà Lan (13%), Úc, Anh, Canada và một số nước khác (hình 1.4). Theo Hiệp Hội Điều Việt Nam, nước ta được dự đoán sẽ có doanh thu xuất khẩu điều liên tục tăng trong những năm tới đây [2].

2. QUẢ ĐIỀU

Ở cây điều sau khi hoa được thụ phấn thành công thì quả thật (hạt điều) sẽ phát triển kích thước rất nhanh trong vòng 1,5 tháng đạt kích thước tối đa. Từ đó quả ngừng phát triển chuyển sang phình to phần cuống quả tạo thành quả giả, ở quả điều thường có hai phần là quả giả và quả thật (hình 1.5).

Quả thật (gọi là hạt điều) thường chỉ chiếm 10-15% khối lượng quả. Hạt điều thường có dạng hình hạt đậu lớn, lớp vỏ ngoài thường có màu xám xanh khi còn tươi và sau quá trình phơi khô sẽ chuyển sang màu nâu. Hạt điều thường nhẵn có trọng lượng từ 3-5 g, để lấy được nhân hạt điều cần loại bỏ lớp vỏ hạt (lớp vỏ hạt này thường chiếm tới 70% khối lượng hạt và có vỏ dày đến 2,5-3 mm), vỏ hạt cũng được chia làm 4 phần để bao bọc lấy nhân. Ngoài cùng là vỏ ngoài rất dai và cứng, tiếp đến là vỏ giữa khá xốp, vỏ giữa thường chiếm 30% trọng lượng vỏ, đây là phần chứa dầu của hạt điều. Để lấy được nhân điều chúng

ta cần loại bỏ lớp vỏ này nhưng nó có chứa chất urushion rất độc với da người. Cuối cùng là vỏ trong rất cứng sau đó mới đến lớp vỏ lụa mỏng bên ngoài bao bọc lấy phần nhân màu trắng. Nhân điều có chứa nhiều dầu, chất béo, có hương vị thơm ngon, vị bùi béo nên được sử dụng nhiều trong việc chế biến các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng [9].

Quả giả (thường gọi là quả điều) chiếm trọng lượng rất lớn từ 85-90% khối lượng toàn quả, có dạng hình quả lê, khi chín thường có màu hồng hoặc màu vàng, chiều dài khoảng 3-20 cm, chiều rộng từ 3-12 cm trọng lượng thường từ 30-50 g. Ở quả điều chứa rất giàu đường (glucose, fructose), vitamin, khoáng và một số axit amin, phenolic, axit hữu cơ, chất chống oxy hóa và được xem như nguồn cung cấp năng lượng (bảng 1.1). Tuy nhiên ở quả chứa nhiều hàm lượng tanin gây vị chát gắt, se khít vòm họng khi sử dụng nên sau thu hoạch hạt điều hầu hết quả điều bị vứt bỏ (hình 1.6) [9].

Hình 1.5: Quả điều.

Hình 1.6: Quả điều bị vứt bỏ khi đến mùa thu hoạch.

Bảng 1.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở quả điều [4].

STT Hợp chất

Thành phần

Đơn vị

Giá trị

Sucrose, maltose, raffinose

g/100g

6,3-9,9

Đường

1

Glucose, fructose

g/100g

6,24-9,8

Vitamin

Vitamin C

mg/100mL

126-372

2

Ca, P, Fe

mg/L

0,9-21,4

3

Khoáng

Mg/L

1,53

Mg, Zn, Na

mg/L

16-105

0,88-3,36

4

Axit, amino axit...

mg/100mL

215-412

5

Alanin, phenylalanin, serin, leucin, axit glutamic, axit aspartic, proline, Axit gallic, axit protocatechuic, lutein, zeinoxanthin, b-cryptoxanthin

Tanin

g/100mL

0,22-0,58

6

Polyphenol

Carotene

mg/100g

0,03-0,74

7 Axit tự nhiên

axit mallic, axit citric, axit lactic

g/100mL

0,1-0,36

Tro

g/100g

0,19-0,45

8

Tổng chất khô hòa tan

oBrix

7,4-12,8

9

Ở một số nước đã tận dụng quả điều để tạo ra các sản phẩm có ích nhưng

vẫn còn vị chát, mang lại giá trị kinh tế chưa cao như:

+ Ở Venezuela, quả được dùng làm thực phẩm như: ăn tươi, sử dụng trong các tiệc cocktail quả nhiệt đới nhằm giúp làm tăng hàm lượng vitamin C [10]. + Các loại mứt được chế biến từ quả điều nổi tiếng ở Brasil như: doce emcalda (trái hầm nhừ trong xiro), doce (giống doce emcalda nhưng ở dạng cô đặc), caju cristalizado (thịt trái đông lạnh tạo hình viên bi và được bao đường bên ngoài), caju ameixa (trái được nấu và cô đặc đến khô trong xiro) và thạch. Ngoài ra dịch quả được bổ sung mật ong để tạo thành loại nước ép từ quả điều. Theo nghiên cứu về tính ổn định của sản phẩm, cho thấy sản phẩm đáp ứng tốt các giá trị cảm quan trong suốt thời hạn sử dụng và đáp ứng thị hiếu người tiêu

dùng. Tuy nhiên hàm lượng vitamin C có phần giảm mạnh ở cuối quá trình bảo quản [10].

+ Tại Nigeria, 60% dịch điều được phối trộn với 40% nước ép cam cho sản

phẩm có chất lượng về hương và vị rất tốt [11].

Ngoài việc được sử dụng làm thực phẩm, người dân đã sử dụng quả điều chín để diệt lăng quăng (bọ gậy). Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, chất axit có trong quả đã ngăn cản quá trình sinh lý của ấu trùng muỗi làm cho chúng bị chết. Ngoài ra dư lượng bã từ các ngành công nghiệp sản xuất nước ép quả điều được sử dụng như một dạng bột trái cây thay thế cho bột mì trong các công thức chế biến bánh quy. Giá trị pH, hàm lượng chất xơ và protein có sự thay đổi đáng kể khi thay thế bằng bã quả điều và nhận được sự chấp nhận tốt từ phía người tiêu dùng. Do đó, bã quả điều là một nguồn nguyên liệu giúp đa dạng hóa các loại bánh và bổ sung một nguồn chất dinh dưỡng phù hợp [12].

1.3. TANIN

1.3.1. Định nghĩa

Tanin hay tannoit là một hợp chất polyphenol có trong thực vật, có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác như: các amino axit, alkaloit... Phân tử lượng tanin phần lớn nằm trong khoảng 500-5000 Da có trong vỏ, gỗ, lá và quả của những cây như: sồi, sú, vẹt, thông, đước, chè…[13,14].

1.3.2. Phân loại và cấu trúc [15]

Cấu trúc hóa học của tanin rất phức tạp và không đồng nhất, tanin có thể chia làm 2 loại chính: tanin thủy phân (tanin pyrogallic) và tanin ngưng tụ (tanin pyrocatechic).

Tanin thủy phân là những este của gluxit, thường là D-glucose làm lõi trung tâm với một hay nhiều axit trihiđroxibenzen cacboxylic. Khi thủy phân bằng axit hoặc bằng enzym tanase thì giải phóng ra glucose, hamamelose… phần không phải đường là các axit thường gặp như: axit gallic được nối với nhau theo dây nối dipeptid để tạo thành axit digallic, axit trigallic, axit ellagic, axit luteolic… Tanin thủy phân bao gồm: Ellagitanin (hình 1.7) và Gallotanin

(hình 1.8). Gallotanin là các tanin thủy phân đơn giản nhất có năm liên kết ester giống nhau được, liên kết với lõi đường glucose.

Gallotanin

Axit gallic

Ellagitanin

Axit ellagic

Axit hexahydroxydiphenic

Tanin ngưng tụ được tạo thành từ sự ngưng tụ các đơn vị flavan-3-ol hoặc flavan 3,4-diol (hình 1.9), được xem là các oligomer hoặc polymer chứa các đơn vị flavonoic (có thể chứa từ 2 đến 50 đơn vị flavonoic hoặc lớn hơn) gắn với nhau bằng liên kết cacbon-cacbon nên không dễ bị thủy phân. Khi đó dưới tác dụng của axit hoặc enzym thì không bị thủy phân mà tạo thành chất đỏ tanin hay phlobaphen. Phlobaphen ít tan trong nước là sản phẩm của sự trùng hợp kèm theo oxy hóa, do đó tanin pyrocatechic còn được gọi là phlobatanin.

Hình 1.7: Phản ứng thủy phân ellagitanin.

Hình 1.8: Phản ứng thủy phân gallotanin.

Flavan-3-ol

Catechin

Flavol-3,4-ol

Hình 1.9: Cấu trúc của các flavonoic.

1.4. ENZYM TANASE

1.4.1. Định nghĩa và tính đặc hiệu [16]

Enzym tanase hay còn gọi là acyl tanin hydrolase (EC 3.1.1.20) là một enzym thủy phân hoạt động trên nguồn cơ chất là tanin, có khối lượng phân tử khoảng 150 kDa đến 300 kDa tùy thuộc vào nguồn enzym.

Đặc hiệu phản ứng: enzym tanase chỉ có khả năng xúc tác cho phản ứng

phân cắt tanin thủy phân tạo thành chất chính là axit gallic.

Đặc hiệu cơ chất: enzym tanase chỉ lựa chọn tanin làm cơ chất trong phản

ứng xúc tác.

1.4.2. Thành phần cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzym tanase [17]

Enzym này bao gồm hai chất nền là digallate và H2O, nhưng sản phẩm chủ yếu là gallate. Cũng như protein, enzym có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp. Trên cơ sở đó phân enzym thành hai nhóm: enzym một thành phần (enzym một cấu tử) và enzym hai thành phần (enzym hai cấu tử).

Phần protein của enzym hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenenzym, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzym. Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt vào protein hoặc chỉ có thể lỏng lẻo và có thể tách khỏi phần protein khi cho thẩm thấu qua màng.

Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzym và coenzym được gọi là haloenzym. Trong đó coenzym trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzym xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây biến tính. Còn apoenzym có tác dụng nâng hoạt tính xúc tác của coenzym quá quyết định đặc hiệu của enzym.

Cơ chế xúc tác của enzym tanase dựa theo thuyết của Michaelis-Menten

phát triển vào năm 1913, được biểu diễn bằng sơ đồ sau:

E + S  ES  ES*  EP  E + P

Trong đó: E: enzym; S: Cơ chất (Substrate);

S*: Cơ chất hoạt hóa; P: Sản phẩm phản ứng (Product).

Trước hết, tạo phức trung gian ES, trong phức hợp này do ảnh hưởng của enzym nên cơ chất được hoạt hóa, cấu tạo của cơ chất bị biến đổi, phân tử của cơ chất bị phân cực, các electron được phân phối lại, do đó điện tích của cơ chất bị biến đổi. Khi đó các liên kết bên trong trở nên lỏng lẻo hơn, năng lượng hoạt hóa giảm, tốc độ phản ứng tăng lên [16].

Enzym tanase xúc tác phản ứng phân cắt gallotanin tạo phản ứng xúc tác với b-1,2,3,4,6-pentagalloyl-O-D-glucopyranose tạo ra 5 phân tử axit gallic và một phân tử glucose (hình 1.10). Từ lâu, người ta đã ứng dụng tanase để thủy phân tanin giúp làm trong rượu vang, vì khi tanin bị oxy hóa bởi không khí sẽ làm tăng độ đục của rượu vang. Ngoài ra sử dụng trong trà xanh tạo các axit gallic giúp tăng hoạt tính kháng oxy hóa [18].

Hình 1.10: Phản ứng xúc tác thủy phân ở enzym tanase.

1.4.3. Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [17]

Enzym tanase được tìm thấy ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm và nước giải khát. Hiện tại, hầu hết các ứng dụng thương mại của enzym tanase là sản xuất chè hòa tan, nơi nó được sử dụng để loại bỏ các chất hòa tan trong nước, rượu vang, bia và cà phê có hương vị nước ngọt.

Ngoài ra tanase có vai trò quan trọng khác trong ngành thực phẩm là

được sử dụng như chất nền để tổng hợp hóa học pyrogallol hoặc estate gallat, dùng làm chất bảo quản. Axit gallic cũng được sử dụng trong tổng hợp enzym của gallit propyl, chủ yếu được sử dụng như chất chống oxy hóa trong chất béo và dầu cũng như trong đồ uống.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym: Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính enzym. Do bản chất hóa học của enzym là protein nên không bền ở nhiệt độ cao bị mất hoạt tính ở nhiệt độ lớn hơn 70oC. Ở nhiệt độ thấp, enzym không bị mất hoạt tính mà chỉ giảm hoạt tính, khi nâng nhiệt độ trở lại nhiệt độ tối ưu thì enzym lại hoạt động bình thường. Khi tăng nhiệt độ phản ứng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần cho đến 50oC enzym bị giảm hoạt tính. Ảnh hưởng của pH: Hoạt tính của enzym phụ thuộc chặt chẽ vào pH của môi trường. Phần lớn các enzym hoạt động khoảng pH= 4-9, trong đó trị số pH mà tại đó enzym hoạt động mạnh nhất được gọi là pH tối ưu. Các enzym khác nhau thường có pH tối thích không giống nhau, nó thay đổi tùy theo bản chất hóa học, nồng độ cơ chất, nhiệt độ phản ứng và tính chất dung dịch đệm.

Ngoài ra hoạt tính xúc tác của enzym còn phụ thuộc vào sự có mặt của

các chất trong môi trường: chất hoạt hóa, chất kìm hãm và thời gian…

1.5. GELATIN

1.5.1. Định nghĩa

Gelatin là một protein được tạo bởi sự liên của hai hay nhiều axit amin sắp xếp trên một chuỗi đường thẳng đây là hỗn hợp dị thể của các sợi polypeptit sợi đơn và sợi đa. Mỗi sợi có cấu hình proline xoắn ốc bên trái, chứa từ 300- 400 amino axit, hầu hết gelatin thương mại có khối lượng phân tử từ 15.000- 250.000 đvc [19].

1.5.2. Tính chất

Hoạt tính của gelatin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, nồng độ, thời gian và phương pháp chế biến. Gelatin thương mại ở dạng tinh khiết, không mùi, không vị, cứng, giòn, màu vàng rất nhạt đến hổ phách, có độ ẩm từ 9-12% và tỉ trọng 1,3-1,4.

Tính chất gel-độ bền gel: đây là yếu tố quan trọng đánh giá chất lượng gelatin khi đông, khả năng tạo gel được đặc trưng bằng độ Bloom. Độ Bloom là khối lượng tính bằng gram cần thiết tác dụng lên bề mặt gel tạo bởi ống có đường kính 14,7 mm để khối gel lún xuống 4 mm. Khối lượng gel có hàm lượng gelatin 6,67%, được giữ ở 10oC trong 16-18 giờ.

Độ nhớt tỉ lệ nghịch với nhiệt độ và tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch. Dưới 25oC, dung dịch sẽ tồn tại ở dạng gel (ngoại trừ nồng độ quá thấp). Trong khoảng 25-29oC, dung dịch vừa tồn tại ở dạng gel vừa tồn tại ở dạng dịch nhớt hoặc ở dạng chất lỏng. Tại 40oC, ở trạng thái này mạng lưới gelatin liên kết tối đa với các polyphenol và tạo hợp chất ngưng tụ. Trên 40oC, các phân tử gelatin trở nên rời rạc, do mạng lưới rời rạc này nên khả năng ngưng tụ của gelatin với các hợp chất polyphenol bị giảm, nếu có tăng nồng độ gelatin trong dung dịch thì chúng vẫn không liên kết với nhau [19].

Tính lưỡng tính: Gelatin tồn tại trong dung dịch dưới dạng lưỡng cực có

khả năng hoạt động như một axit hay một bazơ.

Điểm đẳng điện: phân tử gelatin tích điện trong dung dịch kiềm hay axit, chúng sẽ di chuyển trong điện trường. Ở pH mà không có sự di chuyển xảy ra gọi là điểm đẳng điện, tại pH này dung dịch gelatin kém bền nhất và dễ kết tủa. Theo nghiên cứu trên 2 loại gelatin (A và B), điểm đẳng điện của gelatin loại A nằm trong khoảng pH 8-9 và phụ thuộc vào thời gian xử lý. Gelatin loại B có điểm đẳng điện là 5,2 sau 4 tuần ngâm với nước vôi và giá trị này sẽ được giảm dần xuống 4,8 nếu thời gian ngâm kéo dài hơn 4 tuần. Ngoài ra, điểm đẳng điện còn phụ thuộc vào nồng độ muối trong dung dịch. Điểm đẳng điện có thể xác định ở giá trị pH mà tại đó gelatin có độ kết tủa cực đại [19].

1.5.3. Liên kết hóa học giữa gelatin và tanin

Các tương tác giữa tanin và gelatin là đặc tính phụ thuộc vào cấu tạo của cả hai chất đó. Tương tác này thường dựa trên liên kết hydro, các nhóm phenolic của tanin đóng vai trò là chất cho hydro, tạo liên kết hydro mạnh mẽ với các nhóm carboxyl của gelatin.

Để tạo liên kết mạnh với gelatin, tanin phải đủ nhỏ để xâm nhập vào phân tử gelatin và độ dài mạch phải đủ lớn để liên kết với chuỗi peptit tại nhiều điểm.

Sự liên kết và tạo phản ứng kết tủa của phức chất tanin-gelatin này đạt cực đại tại giá trị pH gần nhất với điểm đẳng điện của gelatin. Khi dung dịch có độ pH cao sự liên kết không hình thành do ở các nhóm phenolic hydroxyl bị ion hóa và các protein có điện tích âm thể hiện tính đẩy [19].

1.6. RƯỢU VANG

1.6.1. Giới thiệu chung về rượu vang

Rượu vang là loại thức uống có cồn được lên men từ dịch ép nho hay dịch ép của các loại hoa quả khác nhờ hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật, có độ cồn thường dao động từ 8,5-17% (v/v) [20].

Rượu vang có lịch sử lâu đời ở các nước phương Tây, theo các minh chứng khảo cổ cho thấy trong các nghi lễ cổ xưa của các nước Ai Cập, Hy Lạp, La Mã thì sự có mặt của rượu vang đóng vai trò rất quan trọng. Sản xuất rượu vang dần dần được phát triển và đã được sử dụng phổ biến từ thế kỷ XV. Uống rượu vang mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe vì trong thành phần chứa giàu dinh dưỡng, mùi vị thơm ngon, làm kích thích vị giác…[21].

Các công trình nghiên cứu về lợi ích của rượu vang gần đây nhất cho thấy uống rượu vang giúp giảm bớt nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, huyết áp, đồng thời làm giảm mỡ máu, giảm nguy cơ mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 hơn là dùng bia và rượu. Khi uống một (hoặc vài) ly rượu vang trong một ngày sẽ giảm tới 50% nguy cơ mắc bệnh tai biến mạch máu não hay đột quỵ. Phụ nữ ở độ tuổi 20 trở lên nếu uống một (hoặc vài) ly rượu vang mỗi ngày thì bộ óc ít bị nguy cơ suy thoái hơn so với những người không uống…[21].

1.6.2. Phân loại rượu vang [22]

Rượu vang là loại thức uống cực kì phong phú về nguồn gốc, tên gọi và cách thưởng thức, do đó cách phân loại rượu vang cũng trở nên đa dạng. Một vài cách phân loại rượu vang cơ bản như:

Phân loại theo lượng CO2: Theo Bùi Ái (2003), về mặt công nghệ, sản phẩm rượu vang được chia thành hai nhóm lớn: nhóm rượu vang có gas và nhóm rượu vang không có gas.

+ Nhóm rượu vang có gas: Rượu vang có gas tự nhiên do quá trình lên men

tạo ra. Để giữ được gas (CO2) thường thực hiện quá trình lên men phụ trong các chai, thùng hoặc hệ thống thùng kín và tùy thuộc vào điều kiện lên men (nhiệt độ, thời gian) sẽ cho ra các loại rượu với mức độ chất lượng khác nhau. Rượu vang có gas nhân tạo do nạp khí CO2 vào sản phẩm, có thể tạo ra nhiều loại rượu vang khác nhau theo thị hiếu hoặc theo yêu cầu của thị trường tiêu dùng.

+ Nhóm rượu vang không có gas: Rượu vang phổ thông được lên men tự nhiên, không bổ sung cồn etylic trong quá trình công nghệ. Nhóm rượu vang cao độ là những loại rượu vang có hàm lượng etanol cao hơn so với nhóm vang phổ thông. Có thể dùng cồn tinh luyện để nâng cao hàm lượng etanol trong quá trình công nghệ.

Phân loại theo màu:

+ Vang trắng: là các loại vang có màu trắng, gần như trong suốt.

+ Vang hồng: màu hồng nhẹ, làm từ nho giống vang đỏ nhưng tùy loại mà

có màu sắc khác nhau.

+ Vang đỏ: rượu có màu đỏ, thường gặp các giống nho có màu vỏ sậm.

Phân loại theo nồng độ cồn trong rượu vang:

+ Nồng độ cồn thấp: dưới 10% v/v. + Nồng độ cồn trung bình thấp: từ 10,5-11,5% v/v. + Nồng độ cồn trung bình cao: từ 11,5-14% v/v. + Nồng độ cồn cao: trên 14% v/v.

Phân loại theo độ ngọt:

+ Khai vị bán ngọt: Với etanol từ 14 -16% v/v và đường từ 5-12%. + Khai vị ngọt: Với etanol từ 15-17% v/v, đường từ 14-20%. + Khai vị rất ngọt: Với etanol từ 12-17% v/v, đường từ 21-35%.

Trong phạm của vi đề tài, mục tiêu là nghiên cứu chế biến rượu vang điều không có gas thuộc nhóm vang phổ thông, có độ cồn trung bình cao khoảng 11-14% v/v, mong muốn giữ được màu vàng nhạt của nguyên liệu.

1.6.3. Tình hình sản xuất rượu vang

1.6.3.1. Trên thế giới [23]

Theo báo cáo của Ủy ban châu Âu (EC) cuối năm 2017, sản lượng nho trên toàn lục địa này vào mùa vụ 2016-2017 giảm xuống mức thấp kỷ lục trong 36 năm qua, tác động nặng nề tới ngành sản xuất rượu vang của lục địa già. Nguyên nhân là do hiện tượng thời tiết khắc nghiệt như mưa đá, sương giá xuất hiện muộn vào mùa xuân cùng với thời tiết khô nóng của mùa hè khiến các vườn nho tại nhiều khu vực bị hư hại. Thế nhưng ở năm 2018 có nhiều khởi sắc, theo tổ chức rượu vang và rượu quốc tế (OIV) ước tính sản lượng rượu vang trên toàn cầu đạt 279 triệu hectoliter (1 hectoliter tương đương 100 lít), mức cao nhất kể từ năm 2000.

Trong đó, ở Italy thu hoạch nho trong niên vụ 2018 tăng 15% so với niên vụ năm trước, giúp Italy trở thành nước sản xuất rượu vang lớn nhất thế giới. Hiện nay ngành công nghiệp sản xuất rượu vang của nước Italy có 310.000 công ty và hơn 46,000 nhà sản xuất rượu vang.

Tiếp theo là Pháp với tổng sản xuất năm 2018 đạt 46,4 triệu hectoliter (4,64 tỷ lít), trong đó rượu vang được làm từ nho hữu cơ đang ngày càng hấp dẫn người tiêu dùng. Theo nhóm phân tích thị trường đồ uống của Anh (IWSR) thì doanh thu rượu vang Pháp được làm từ nho hữu cơ sẽ tăng lên 17,3 triệu thùng vào năm 2022, so với mức chỉ 4,6 triệu thùng năm 2012. Các vườn nho trồng bằng phương pháp hữu cơ có giá thành sản phẩm là 6,14 euro/chai (7 USD/chai), cao hơn 33% so với các loại rượu truyền thống với giá 4,62 euro/chai (5,24 USD/chai). IWSR dự báo thu nhập từ rượu vang hữu cơ tại Pháp sẽ sớm vượt mức 1 tỷ euro/năm (1,14 tỷ USD), viễn cảnh này cho thấy mức độ ưa chuộng ngày càng tăng đối với các sản phẩm hữu cơ trên toàn cầu. Bên cạnh hai nhà sản xuất rượu vang hàng đầu, các nhà sản xuất ở các nước khác cũng góp phần xây dựng nền công nghiệp rượu vang như: Chi-lê, Mê-xi- cô, Mỹ và Úc…

1.6.3.2. Ở Việt Nam

Ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu vào những năm 80 của thế kỷ XX và được đánh dấu bằng nhãn hiệu vang “Thăng Long”

trên thị trường nội địa với sản phẩm chủ yếu là vang ngọt từ nguyên liệu nho, vải, dứa, mơ… Khoảng cuối năm 1999, một loại vang đỏ được lên men theo công nghệ Pháp đã xuất hiện ở thị trường nội điạ, tạo tiếng vang mạnh với giá thành phù hợp và đạt tiêu chuẩn Châu Âu với thương hiệu “Vang Đà Lạt”. Tên thương hiệu được ghép từ chữ “Vang” trong từ rượu vang và tên một thành phố du lịch nổi tiếng của Việt Nam. Sau đó số lượng các nhà máy sản xuất rượu vang tăng lên, các chủng loại rượu vang đa dạng hơn nhưng chất lượng vẫn còn thấp chưa cạnh tranh được với rượu vang nhập ngoại.

Theo thống kê năm 2015, ở nước ta có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và “đóng chai” rượu vang với sản lượng 12-13 triệu lít/năm. Sản lượng đang dần tăng trong 5 năm tới, trong đó công ty cổ phần vang Thăng Long sản xuất 10 triệu lít. Ngoài ra còn có các công ty cổ phần thực phẩm Lâm Đồng (Vang Đà Lạt), công ty Anh Đào (Vang Anh Đào)… sản xuất các loại vang đỏ, vang trắng và vang chát [21].

1.6.4. Cơ chế lên men rượu vang

Trong quá trình lên men rượu dưới tác dụng của các chất xúc tác sinh học cung cấp năng lượng giúp cho tế bào vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất tạo các sản phẩm. Thông thường có nhiều sản phẩm được tạo ra nhưng chủ yếu có 4 loại chính đó là etanol, aldehyde, axit và ester được tạo thành với 2 hình thức lên men chính là lên men hiếu khí và kỵ khí [24]. Quá trình lên men kỵ khí, cơ chất (chủ yếu là đường) trải qua chuỗi các phản ứng rất phức tạp để chuyển hóa thành etanol dưới tác dụng của nấm men [22].

Các giai đoạn chuyển hóa đường thành rượu [25]:

+ Mục đích: để chuyển hóa đường thành rượu theo phương trình tổng quát

sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 27 Kcal.

+ Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Qua một loạt chuỗi phản ứng phức tạp với sự tham gia của hệ thống nhiều enzym, một phân tử glucose ban đầu sẽ chuyển hóa thành hai phân tử axit pyruvic theo chu trình đường phân Embden- Meyerhof-Parnas.

+ Giai đoạn 2 (Axit pyruvic bị decacboxyl hóa): Axit pyruvic dưới tác dụng của enzym pyruvat decacboxylaza sẽ bị khử thành acetaldehyd và CO2.

+ Giai đoạn 3: Acetaldehyd tiếp tục nhận H2 từ NAD-H2 tạo thành etanol

dưới tác dụng của enzym alcoldehydrogenaza của nấm men.

1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

1.6.5.1. Nấm men

Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang phải có khả năng lên men nhanh, không sinh ra các chất độc, chịu được độ cồn cao và có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất hương đặc trưng. Loài Saccharomyces được sử dụng phổ biến nhất [26] với các chủng thường gặp như:

Saccharomyces cerevisiae: Là loại nấm men được sử dụng phổ biến trong lên men bia rượu (hình 1.11). Tế bào có dạng hình ovan hay elip, kích thước (5-6)*(10-14) micromet, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và sinh bào tử. Điểm nổi bật ở chủng nấm men này là chúng sử dụng được đường saccarose nhờ enzym invertase tạo thành đường nghịch đảo. Tế bào nấm men chứa nhiều vitamin (đặc biệt là B1 và B6), có khả năng chịu nhiệt cao, lên men mạnh, kết lắng nhanh làm trong rượu, tạo ra các sản phẩm thứ cấp và tạo mùi vị đặc trưng cho rượu vang [27].

Saccharomyces oviformis: Hình dạng và các yếu tố sinh trưởng giống ở nấm men Saccharomyces cerevisiae (hình 1.12). Tuy nhiên, điểm khác là Saccharomyces oviformis có khả năng lên men được dịch quả có hàm lượng đường cao và lên men cạn kiệt đường, hình thức lên men nổi tạo thành màng trên bề mặt dịch lên men [22].

Saccharomyces uvarum: Là một loại nấm men có ở các loại trái cây tự nhiên, khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch malt. Về hình thái chúng không khác với các loài khác (hình 1.13), lên men chìm và có thể tạo ra độ cồn 12-13% (v/v) [28].

Yêu cầu đối với giống nấm men dùng để sản xuất rượu vang: + Có khả năng lên men cao, tạo rượu vang có hương vị thơm ngon. + Sử dụng đường gần như hoàn toàn. + Kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh. + Chịu được độ cồn, axit của môi trường cũng như các chất sát trùng.

1.6.5.2. Ảnh hưởng của pH [29]

Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Khi đó pH của môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất, mức độ thẩm thấu cũng như điện tích của vỏ tế bào vi sinh vật. Ở mỗi loài vi sinh vật thường có khả năng sinh trưởng ngoài khoảng pH tối ưu. Nhưng khi tế bào vi sinh vật đột ngột thay đổi pH trong tế bào chất để phù hợp với pH môi trường bên ngoài, dẫn đến màng sinh chất bị vỡ làm ức chế hoạt tính của enzym hay protein màng.

Đồng thời pH cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và hoạt động của vi khuẩn. Trong lên men, điều kiện pH tối ưu để nấm men sinh etanol là 4,5-5. Nếu pH nằm trong khoảng 3-4 thì vi khuẩn bị ức chế, ngược lại nếu pH cao hơn (5-6) sản phẩm tạo ra bị hư hỏng hay kém chất lượng do dễ bị nhiễm khuẩn, các sản phẩm phụ sẽ được tạo ra nhiều.

1.6.5.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khí oxy

Hầu hết các chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces trong quá trình lên men rượu vang, thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí. Khi trong môi trường có đầy đủ oxy thì nấm men sẽ phân hủy đường, dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối. Nếu thiếu oxy thì nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng, phát triển và chủ yếu là lên men.

Trong giai đoạn đầu lên men, yêu cầu hàm lượng oxy cao nhất để nấm men sinh trưởng phát triển tăng sinh khối. Ngoài ra, nếu lên men trong môi trường lớn thì người ta thường sục khí hoặc lắc để tăng lượng oxy cho nấm men sinh sản. Ở giai đoạn sau, phải tạo môi trường yếm khí nhằm tránh hiện tượng lên men giấm, đồng thời ức chế hoạt động của vi khuẩn làm hư hỏng rượu [28].

1.6.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong quá trình lên men, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt động sống của nấm men Saccharomyces cerevisiae và chất lượng sản phẩm. Nhiều công trình nghiên cứu cho rằng nhiệt độ trong khoảng:

+ Từ 15-30oC: thích hợp cho rượu vang trắng, nếu thấp hơn thì càng tốt. + Tại 25oC: thích hợp cho rượu vang đỏ, nếu nhỏ hơn 15oC quá trình diễn ra

rất chậm.

+ Từ 28-30oC: là khoảng nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển tốt nhất. + Trên 30-35oC: thì nấm men dại phát triển nhanh chóng. + Trên 40oC: nấm men không tập hợp được năng lượng dự trữ, có thể chết

và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn axit axetic hoạt động [30].

1.6.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường

Đường là cơ chất cần thiết cho quá trình lên men nên chịu ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men. Nếu nồng độ đường trong môi trường cao hơn 30% thì sẽ kéo dài thời gian lên men dẫn đến quá trình lên men không triệt để. Nguyên nhân do lượng rượu được tạo thành gây ức chế hoạt động của nấm men. Bên cạnh đó, trong môi trường có nồng độ lên men quá thấp (<10%) thì lượng rượu tạo thành ít, sản phẩm rượu vang có vị nhạt và dễ bị hư hỏng do nhiễm vi sinh vật. Còn đối với nước quả thì đa số các loại nấm men đều hoạt động bình thường ở môi trường có nồng độ đường từ 18-25%. Ngoài ra, có một số chủng hoạt động ở môi trường có độ đường cao hơn, nhưng khi nhân giống thường sử dụng môi trường có nồng độ đường thấp dưới 15% [31].

1.6.6.6. Ảnh hưởng của nồng độ etanol

Rượu là sản phẩm chính của quá trình lên men kỵ khí, thường thì nồng độ cồn của rượu vang từ 10-14% v/v. Nếu nồng độ rượu tạo thành tăng quá cao gây ức chế hoạt động của nấm men.

Khả năng sống sót và lên men trong môi trường có nồng độ cồn cao là yêu cầu thiết yếu của chủng nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang. Những chủng nấm men dại thì chúng chỉ sống được trong môi trường có nồng độ cồn thấp, thường sinh trưởng chậm dần và giảm sự nảy chồi ở nồng độ cồn 2% v/v và có thể ngừng sinh trưởng ở nồng độ cồn 5% v/v [22].

1.6.6.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian lên men ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sản phẩm tạo thành ở rượu vang. Trong hai giai đoạn lên men, nếu thời gian quá ngắn thì có thể tạo

độ cồn thấp và không đủ thời gian để hình thành hương, mùi vị đặc trưng của rượu vang. Đối với đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 5-20 ngày, thời gian lên men phụ và tàng trữ các loại rượu phải từ vài tháng trở lên. Thời gian lên men chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,…Nếu nồng độ đường càng cao thì thời gian lên men càng dài. Ngoài ra, lượng men ban đầu bổ sung cũng là một yếu tố quyết định thời gian lên men. Với đa số các loại vang, lượng giống bổ sung vào khoảng 3-10% v/v dịch lên men [28]. Do vậy mà việc xác định thời gian lên men là điều hết sức quan trọng để đảm bảo quá trình lên men tối ưu cho ra sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất.

1.6.6.8. Ảnh hưởng của CO2

Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường được tách làm 3 phần: một phần tồn tại trong môi trường, phần thứ hai sẽ nổi lên trên bề mặt và phần còn lại được tích tụ thành một lớp màng có thể ngăn cách giữa không khí và môi trường. Lớp màng ngăn này làm giảm khả năng sinh sản của nấm men nhưng vẫn lên men bình thường. Nếu hàm lượng khí CO2 cao sẽ gây ức chế cho quá trình lên men nhưng lại có tác dụng tốt khi CO2 được thoát ra ngoài sẽ khuấy động môi trường và kéo dài được trạng thái lơ lửng của nấm men, giúp quá trình lên men diễn ra nhanh chóng. Theo nghiên cứu của Miuler- Thurrau: Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng thì sẽ gây ức chế sự sinh sản của nấm men, đạt đến 1,5% trọng lượng thì nấm men không sinh sản được [31].

Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1. Thời gian

Thời gian thực hiện: 02/05/2018 đến 08/09/2019.

2.1.2. Địa điểm

Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hóa lý - Phân tích, Viện Công nghệ Hóa học và phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới.

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1. Dịch ép quả điều

Bã

Dịch

Quả điều chín vàng sau khi tuyển chọn và thu hái tại tỉnh Bình Phước (tháng 5/2018) được vận chuyển về phòng thí nghiệm, tiến hành rửa sạch để ráo, dùng máy ép trục vít để ép thu lấy dịch quả (hình 2.1). Dịch ép quả điều được cho vào chai nhựa 5 lít đóng kín và bảo quản ở nhiệt độ -10oC trong tủ đông, khi cần sử dụng dịch ép được rã đông đưa về nhiệt độ phòng (25-30oC).

Hình 2.1: Quá trình ép quả điều bằng máy ép trục vít.

2.2.2. Enzym tanase

Enzym tanase (EC 3.1.1.20) ở dạng bột trắng chuyên dùng trong chế biến

thực phẩm, từ nhà sản xuất công ty Biochemifa Kikoman, Nhật Bản.

2.2.3. Gelatin

Gelatin thực phẩm được sử dụng trong đề tài có màu vàng, hạt tròn được

cung cấp từ công ty phụ gia thực phẩm Sài Gòn.

2.2.4. Vi sinh vật

Saccharomyces uvarum 664 được cung cấp từ phòng thí nghiệm hóa thực

phẩm trường Đại học California David, Mỹ.

Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 được cung cấp từ nhà sản xuất

công ty Lalvin, Canada.

2.3. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.3.1. Môi trường

- Môi trường nhân giống: Dịch điều đã xử lý đưa về 14 oBrix, pH=4,5, thanh trùng ở 75oC trong 15 phút, dùng làm môi trường nhân giống nấm men. - Môi trường Sabouraud (SBD): Dextrose 40 g, peptone 10 g, agar 5 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong15 phút dùng để nhân giống nấm men.

- Môi trường PDA: Potatoes 200 g, dextrose 20 g, agar 15 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong15 phút dùng định lượng nấm men, nấm mốc.

- Môi trường PCA: Casein peptone 5g, yeast extract 2,5 g, dextrose 1 g, agar 15 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút dùng để định lượng vi khuẩn hiếu khí.

- Môi Trường TSC: Tryptone 15 g, soya peptone 5 g, meat extract B 5 g, yeast extract 5 g, sodium metabisulphite 1g, ferric ammonium citrate 1g, agar 15g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút dùng để định lượng vi khuẩn Clostridium.

- Đĩa petrifim 3M (Mỹ) có chứa sẵn các thành phần dinh dưỡng khô và

chất tạo đông, dùng định lượng vi khuẩn Escherichia coli và Coliform.

2.3.2. Hóa chất

- Hóa chất thực phẩm:

+ Đường tinh luyện thương phẩm từ nhà máy đường Biên Hòa.

- Hóa chất tinh khiết:

+ Folin-ciocalteu; Potassium iodide (KI); 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH); Axit gallic; Potassium ferric cyanide (K3[Fe(CN)6]); Axit tricloacetic (TCA); Iốt (I2); Monosodium phosphate (NaH2PO4); Disodium phosphate (Na2HPO4); Sulfo-indigocamine; Ferric chloride (FeCl3); Natri cacbonat (Na2CO3); Axit citric; Phenolphtalein của hãng Merck - Đức.

+ Potassium pemanganate (KMnO4) 0,1N; Sodium hydoxide (NaOH) 0,1N;

hồ tinh bột của công ty hóa chất vật liệu điện Cemaco Việt Nam.

2.3.4. Dụng cụ và thiết bị

− Thiết bị tâm

ly 4500 vòng/phút

− Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao 1260 (HPLC)

− Máy lắc − Máy khuấy từ − Nồi hấp tiệt trùng − Bình định mức 25 mL − Bình tỷ trọng − Cân phân tích Satorius − Khúc xạ kế Atago − Tủ đông Sanaky 400L − Thiết bị đo cường - độ màu Abs DR/2000. − Bình Schott − Máy đo pH Hanna − Túi lọc vải − Kính hiển vi − Bộ chưng cất cồn − Máy đo OD- HACH − Buồng đếm hồng cầu − Máy ép trục vít

2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.4.1. Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu

- Mục đích: Xác định một số thành phần dinh dưỡng ban đầu ở dịch ép

quả điều.

- Cách thực hiện: Dịch ép quả điều sau khi được rã đông đưa về nhiệt độ phòng (28-30oC) tiến hành phân tích xác định một số thành phần dinh dưỡng theo bảng 2.1.

2.4.2. Xác định sự ảnh hưởng của giá trị pH, nhiệt độ ở dịch ép quả

điều và hàm lượng enzym tanase đến hiệu suất thủy phân tanin

- Mục đích: Xác định nhiệt độ, pH ở dịch ép quả điều và hàm lượng enzym tanase bổ sung phù hợp, để phản ứng thủy phân tanin bằng enzym tanase đạt hiệu quả cao nhất.

- Bố trí thí nghiệm:

+ Thí nghiệm hai yếu tố, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với các nghiệm thức theo bảng 2.2, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều.

Chỉ tiêu

Phương pháp

STT

Tanin

Chuẩn độ

1

Đường tổng

Khúc xạ kế

2

Axit tổng số

Chuẩn độ

3

Máy đo pH

4

Tổng polyphenol

Folin – Ciocalteu

5

DPPH

So màu

6

TSS

TCVN 9462-2012

7

Vitamin C

Chuẩn độ

8

Canxi (Ca)

AAS - hấp thu nguyên tử

9

AAS - hấp thu nguyên tử

Magie (Mg)

10

AAS - hấp thu nguyên tử

Sắt (Fe)

11

AAS - hấp thu nguyên tử

Kẽm (Zn)

12

AAS - hấp thu nguyên tử

Photpho (P)

13

AAS - hấp thu nguyên tử

Kali (K)

14

Giá trị pH

Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến hoạt tính của enzym tanase.

4 4,5

5 5,5

NT1

30

NT2

NT3

NT4

NT5

40

NT6

NT7

NT8

Nhiệt độ (oC)

NT9

50

NT10

NT11

NT12

+ Sau khi xác định giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân bằng

enzym, tiến hành thí nghiệm một yếu tố để xác định ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase.

Nghiệm thức

Hàm lượng enzym tanase (ppm)

NT1

NT2

100

NT3

200

NT4

300

NT5

400

NT6

500

- Tiến hành thí nghiệm:

+ Sử dụng máy đo pH để điều chỉnh dịch mẫu về pH tương ứng với từng nghiệm thức (bảng 2.2) bằng dung dịch Na2CO3 10% và axit citric 10%. Điều chỉnh nhiệt độ bằng cách cho dịch ép quả điều vào bể ổn nhiệt.

+ Sau khi xác định pH và nhiệt độ thích hợp, tiến hành bổ sung enzym tanase ở các hàm lượng như bảng 2.3 để xác định hàm lượng enzym tanase thủy phân tanin đạt hiệu quả cao nhất. - Đánh giá hoạt tính của enzym tanase thông qua các chỉ tiêu theo dõi như sau: Hàm lượng tanin, hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa theo hai chỉ số: DPPH (IC50) và năng lực khử (giá trị ABS700), xác định pic của axit gallic được tạo thành.

2.4.3. Xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng gelatin và nhiệt độ ở

dịch ép quả điều đến hiệu suất tách loại tanin.

- Mục đích: Dịch ép quả điều sau khi thủy phân bằng enzym tanase, xác định hàm lượng gelatin cần bổ sung và nhiệt độ ở dịch ép quả điều phù hợp để hiệu suất tách loại tanin đạt hiệu quả cao nhất.

- Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm một yếu tố, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần (bảng 2.4).

- Tiến hành thí nghiệm

+ Dịch ép quả điều sau khi bổ sung hàm lượng gelatin theo bảng 2.4, thời gian 30 phút, tiến hành lọc để thu lấy dịch. Dịch thu được đem xác định hàm lượng tanin còn lại, nhằm chọn ra hàm lượng gelatin phù hợp. + Từ hàm lượng gelatin được chọn cho vào dịch ép quả điều tại các khoảng nhiệt độ từ 30-60oC, nhằm chọn ra khoảng nhiệt độ thích hợp ở dịch ép quả điều để đạt hiệu suất tách loại tanin cao nhất.

Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng gelatin đến quá trình tách loại tanin trong dịch ép quả điều.

Nghiệm thức

Hàm lượng gelatin (g/L)

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

2.4.4. Xác định một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều

sau khi tách loại tanin

- Mục đích: So sánh thành phần dinh dưỡng trước và sau khi tách loại tanin nhằm đánh giá được vai trò hoạt động của enzym tanase trong quá trình thủy phân tanin.

- Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm xác định thành phần dinh dưỡng được

thực hiện giống ở nội dung 2.4.1.

2.4.5. Khảo sát môi trường nuôi cấy và xác định chủng nấm men

thích hợp cho quá trình lên men dịch ép quả điều

- Mục đích: Đánh giá chất lượng và khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men khảo sát. Đồng thời xác định môi trường nuôi cấy và chủng nấm men phù hợp để lên men rượu vang điều.

- Bố trí thí nghiệm: Nấm men được nuôi cấy lắc trong môi trường

Sabouraud và môi trường dịch điều ở nhiệt độ phòng (28oC), theo bảng 2.5.

- Tiến hành thí nghiệm:

+ Môi trường dịch ép quả điều sau khi tách loại tanin được điều chỉnh bằng đường để đưa về hàm lượng chất khô hòa tan là 14oBrix. Chuẩn bị 200 mL từng loại dịch môi trường để nhân giống nấm men, trong đó môi trường dịch điều được thanh trùng 75oC trong 15 phút và môi trường Sabouraud được tiệt trùng 15 phút ở nhiệt độ 121oC, làm nguội. Lượng nấm men ban đầu bổ sung ở mỗi bình là 4,2x106 cfu/mL. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng tế bào nấm men trong 1 mL canh trường được xác định bằng phương pháp đếm trên buồng đếm hồng cầu với thời gian 4 giờ/1 lần trong 40 giờ. + Sau khi chọn môi trường và thời điểm dừng để nhân giống nấm men, chuẩn bị 2 bình Schott chứa 200 mL dịch điều đưa về 22oBrix, tại pH dịch điều (pH=4,5). Sau đó cấy men giống ở 2 chủng nấm men vào trong dịch lên men với mật độ 1,04x107 cfu/mL [31], tiến hành lên men chính trong 10 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. - Chỉ tiêu theo dõi:

+ Thời gian số lượng tế bào nấm men trong hai môi trường nuôi cấy sinh trưởng và phát triển đạt mật độ cao nhất, chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. + oBrix, hàm lượng axit tổng số, pH và độ cồn tạo thành nhằm chọn ra chủng nấm men phù hợp để lên men rượu vang điều.

Bảng 2.5: Lựa chọn môi trường nhân giống nấm men.

STT

Chủng nấm men

Môi trường Sabouraud

Môi trường dịch điều

1

Saccharomyces cerevisiae K1 V1116

NT1

NT2

2

Saccharomyces uvarum 664

NT3

NT4

2.4.6. Xác định điều kiện tối ưu hóa trong quá trình lên men rượu vang điều

- Mục đích: Khảo sát sự ảnh hưởng của ba yếu tố (bảng 2.6) trong quá trình lên men chính. Qua đó, ở bảng 2.7 chọn được các giá trị tối ưu: oBrix (hàm lượng chất khô), pH và tỉ lệ men ở dịch ép quả điều để hiệu suất tạo cồn của quá trình lên men là cao nhất. Ở đây, (+): giá trị cận trên, (-): giá trị cận dưới, (A): giá trị trục thấp, (a): giá trị trục cao, (0): giá trị tại tâm. Để xác định giá trị tối ưu cho quá trình lên men, kết quả phân tích khớp với phương trình đa thức

2 +

bậc 2 bao gồm phần tuyến tính bậc 1, bậc 2 và tương tác ba yếu tố bậc 1 bằng phương pháp hồi quy đa biến. Mô hình toán học sử dụng để xác định giá trị tối ưu cho các yếu tố có dạng như sau:

Y = b1X1 + b2X2 +b3X3+ b4X1X2 + b5X1X3 + b6X2X3 + b7X1X2X3 + b8X1

2 + b10X3

b9X2

Trong đó: b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7, b8, b9, b10 là hệ số hồi quy. X1; X2; X3 là yếu tố thí nghiệm cần tối ưu. Y: chỉ số theo dõi sau quá trình lên men.

Bảng 2.6: Giá trị thay đổi của các thông số trong quá trình lên men chính.

Biến (yếu tố)

Giá trị biến đổi

4,5

X1 (pH)

X2 (oBrix)

X3 (tỉ lệ men)

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tối ưu hóa được thực hiện theo phần mềm JMP bằng phương pháp đáp ứng bề mặt theo mô hình CCD-Uniform Precision (Central Composite Design-CCD) được trình bày theo bảng 2.7 với 16 nghiệm thức bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. - Tiến hành thí nghiệm:

+ Chuẩn bị dịch lên men: Cho 200 mL dịch điều đã tách loại tanin vào 16 bình Schott đã được tiệt trùng 121oC. Điều chỉnh hàm lượng chất khô (oBrix) bằng đường tinh luyện và pH bằng dung dịch axit citric 10% và dung dịch Na2CO3 10% ở mỗi bình đạt các giá trị theo bảng 2.7. Sau đó, tất cả các bình được thanh trùng ở nhiệt độ 75oC trong vòng 15 phút.

+ Nhân giống và cấy men: Tiến hành nhân giống nấm men đã chọn, cấy men vào bình Schott ngay tại điểm dừng đã xác định. Trong đó, tỉ lệ men (v/v) bổ sung dựa vào tỷ lệ của các nghiệm thức với mật độ ở bình nhân giống là 4,16x1010 cfu/mL.

+ Lên men: Tiến hành lên men chính ở nhiệt độ phòng (28-32oC) trong điều

kiện kỵ khí và kết thúc quá trình sau 7 ngày.

- Chỉ tiêu theo dõi: Độ biến thiên các chỉ tiêu: oBrix, pH, axit và độ cồn

tạo thành ở mỗi ngày trong 7 ngày lên men chính.

Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm CCD để tối ưu hóa quá trình lên men chính ở dịch ép quả điều.

STT

Pattern

0Brix (X1)

pH (X2)

Tỉ lệ men (%- X3)

−−−

−−+

4,5

7,5

a00

−+−

−++

7,5

0a0

4,5

00a

4,5

7,5

000

4,5

7,5

000

4,5

00A

7,5

0A0

+−−

+−+

4,5

7,5

A00

++−

+++

2.4.7. Xây dựng quy trình lên men rượu vang điều

Sau khi thực hiện quá trình lên men dịch ép quả điều đã tách loại tanin theo điều kiện tối ưu hóa. Tiến hành xây dựng quy trình sản xuất rượu vang điều. Sản phẩm rượu vang điều tạo thành phù hợp theo tiêu chuẩn rượu vang của Việt Nam (TCVN 7045:2013).

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5.1. Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp Lowenthal

Dùng pipet hút 10 mL dịch mẫu + 1 mL chất chỉ thị indigo-carmine cho vào bình tam giác 250 mL + 100mL nước cất 2 lần. Sau đó, chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1 N cho đến khi dịch trong bình chuyển sang màu vàng

ánh kim [32]. Hàm lượng tanin: Tanin (mg/100mL) =

Trong đó: V1: là lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ

V: là lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng m: là lượng mẫu được chuẩn độ (mL) 0,025 là lượng 1mL KMnO4 phản ứng với 1mL tanin [33].

2.5.2. Xác định hàm lượng polyphenol

Bảng 2.8: Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic.

Hàm lượng

y = 52,569x + 0,5815 R² = 0,9996

g m

ABS

(mg/100mL)

( c i l l a g

t i x a

0,171

) L m 0 0 1 / E A G

g n ợ ư l

0,362

m à H

0,561

ABS

0,748

0.2

0.4

0.6

0.8

0,945

Hàm lượng polyphenol ở dịch ép quả điều được xác định theo phương pháp Folin-Ciocalteu [34], dựa trên nguyên tắc: Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa các chất oxy hóa là axit phospho-vonframic có khả năng khử các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxy hóa trong dịch quả sinh ra màu xanh của vonfarm và molypden có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 765 nm.

Tiến hành pha loãng mẫu với nồng độ phù hợp, hút 1mL mẫu cho vào ống nghiệm + 3mL Folin-Ciocalteu 10%, để trong 4 phút rồi bổ sung thêm 4mL Na2CO3 10%, lắc đều. Để dung dịch khoảng 60 phút trong bóng tối, sau đó đem đo độ hấp phụ quang học ABS ở bước sóng 765 nm.

Đường chuẩn axit gallic được xây dựng từ dung dịch chuẩn (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg GAE/100mL). Hàm lượng polyphenol được xác định dựa trên đường chuẩn axit gallic tương đương mg GAE/100mL dịch ép (bảng 2.8). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.5.3. Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH (2,2-Diphenyl-1-

picrylhydrazyl)

Phương pháp DPPH được xây dựng dựa vào khả năng hoạt động của các chất chống oxy hóa, các electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm, bắt màu tím. Khi các electron này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang màu vàng. Khả năng bắt gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm có giá trị càng thấp và ngược lại [35].

Tiến hành pha loãng dịch mẫu theo các nồng độ thích hợp, lấy 0,2 mL dịch mẫu + 3 mL cồn + 2 mL DPPH 0,3 mM, lắc đều. Sau đó ủ trong bóng tối 60 phút, tiến hành đo độ hấp phụ quang học ABS ở bước sóng 517 nm. Khi đó khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức:

(%) = 100 x (AMT - Asp)/AMT

Trong đó: AMT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch ép Asp: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch ép.

Giá trị IC50 là nồng độ của dịch ép quả điều khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Nồng độ 9,6 µg/mL là giá trị IC50 của vitamin C được khảo sát tại điều kiện phòng thí nghiệm. Giá trị IC50 là nồng độ mà tại đó vitamin C khử 50% gốc tự do DPPH. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao.

2.4.4. Xác định năng lực khử [36]

Quy trình khảo sát năng lực khử được dựa trên nguyên tắc: Dịch mẫu thử sẽ khử ion Fe3+ trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+ trong phân tử (K4[Fe(CN)6]). Khi bổ sung FeCl3, Fe3+ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành phức hợp ferris ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]3) có màu xanh dương. Sau đó đo độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm, nồng độ dịch mẫu cho giá trị tại độ hấp phụ quang là 0,5 được gọi là EC50, nếu giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng khử của mẫu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu càng cao.

Quy trình khảo sát năng lực khử được tiến hành như sau: 1 mL mẫu thử ở các nồng độ khảo sát + 2,5 mL dung dịch đệm phosphate 0,2M (pH = 6,6), ủ

ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 20 phút. Sau đó, mỗi ống nghiệm được bổ sung thêm 2,5 mL dung dịch axit tricloacetic 10%, lắc đều. Lấy 2,5 mL dung dịch trên, thêm 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 0,1% lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang phổ.

2.5.5. Xác định hiệu suất tách loại tanin

Thực hiện chuẩn độ theo phương pháp Lowenthal để xác định hàm lượng tanin ban đầu và còn lại khi dùng enzym tanase kết hợp với gelatin ở dịch ép

quả điều. Hiệu suất tách loại tanin: H(%) = (1 - ) x 100

Trong đó: T1: làm hàm lượng tanin còn lại (mg/100ml).

T2: làm hàm lượng tanin ban đầu (250 mg/100ml).

2.5.6. Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (oBrix) [37]

Dụng cụ: Khúc xạ kế Atago thang đo 0-32oBrix.

Cách sử dụng: Dùng nước cất rửa sạch và làm khô bề mặt kính bằng giấy mềm, sau đó điều chỉnh nồng độ khô về 0, để đo hàm lượng chất khô của dung dịch thì thay nước cất bằng dung dịch cần đo. Quan sát và đọc nồng độ chất khô qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Sau khi đọc xong, rửa kính bằng nước cất và lau khô bằng giấy mềm.

2.5.7. Xác định pH

Dụng cụ: Để xác định pH sử dụng máy đo pH Mettler Toledo. Cách sử dụng: Rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô bằng giấy thấm. Nhúng điện cực vào nước cất để ổn định pH=7, để đo pH mẫu thì thay nước cất bằng dung dịch cần đo và đọc giá trị trên màn hình. Sau khi đọc xong rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô bảo quản điện cực bằng dung dịch KCl 3M.

2.5.8. Xác định hàm lượng axit tổng số [37]

Nguyên tắc: Độ chua toàn phần được xác định dựa vào phản ứng với kiềm nên dễ dàng chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N hay KOH 0,1 N chuẩn với chất chỉ thị màu là phenolphthalein.

Cách thực hiện: Hút 10 mL mẫu cho vào bình tam giác 250 mL, thêm 20 mL nước cất và 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% lắc đều rồi chuẩn độ bằng

NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền trong 30 giây.

Công thức tính hàm lượng axit tổng: X = (V * K * 1000) /V1

Trong đó: V - thể tích NaOH 0,1N (mL)

V1 - thể tích mẫu hút để chuẩn độ (mL) K - hệ số axit sulfuric bằng 0,0049

2.5.9. Xác định tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu [38]

Cách tiến hành: Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm, chuẩn bị ống nghiệm đựng dung dịch huyền phù nấm men đã được pha loãng với tỷ lệ thích hợp. Lấy một ít dịch cho vào khe ở mép giữa buồng đếm, tránh tạo bọt khí, chỉnh kính hiển vi với vật kính 40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4×4 = 16 ô). Sau đó tiến hành đếm số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện (5 vuông theo đường chéo hoặc 4 ô vuông ở bốn góc và 1 ô trung tâm). Và tính toán theo công thức:

N = [(a/b) * 400/0,1] * 103 *10n

Trong đó: N: Số lượng tế bào trong 1 mL dung dịch huyền phù nấm men

a: Số tế bào trong 5 ô vuông lớn

b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16×5 = 80 ô vuông nhỏ) 400: Tổng diện tích số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1: Thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm 103: Số chuyển mm3 thành mL (1000mm3 = 1mL) 10n: độ pha loãng mẫu

2.5.10. Xác định độ cồn trong rượu [37]

Nguyên tắc: Xác định tỷ số giữa khối lượng chất lỏng và nước cất ở cùng

thể tích.

Cách thực hiện: Cho vào bình cầu 100 mL hỗn hợp dung dịch gồm: 50 mL nước cất và 50 mL dịch điều lên men. Tiến hành chưng cất thu cồn đến khi đủ 30 mL dung dịch thì ngừng chưng cất. Rửa sạch bình tỉ trọng (dung tích 25 mL) bằng nước cất, tráng kỹ bằng cồn 96o, sau đó sấy khô, hút ẩm. Làm lạnh đến 20oC, lau khô và cân khối lượng bình (m1). Cho nước cất vào bình tỉ trọng, làm lạnh đến 20oC, cân khối lượng (m2). Tiếp theo tráng bình bằng cồn 96o và

sấy nhẹ cho khô, hoặc tráng lại bằng cồn cất được. Cho cồn cất được vào bình, thao tác như khi cân nước cất để xác định khối lượng bình và cồn (m3). Tỷ trọng của rượu so với nước cất ở nhiệt độ 20oC được xác định:

𝑑20 = 𝑚3 − 𝑚1 𝑚2 − 𝑚1

Trong đó: m1: Khối lượng bình tỷ trọng (g)

m2: Khối lượng bình và nước ở 20oC (g) m3: Khối lượng bình và cồn ở 20oC (g)

Kết quả thu được tra bảng xác định độ cồn theo tỷ trọng của etanol ở 20oC.

2.5.11. Đánh giá cảm quan [39]

+ Cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm: được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một số sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: độ trong, màu sắc, mùi vị (bảng 2.9). Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm, giá trị điểm tăng theo mức chất lượng.

Chỉ tiêu

Hệ số trọng lượng

Độ trong và màu sắc

0,8

Mùi

1,2

Vị

Bảng 2.9: Điểm trung bình và hệ số trọng lượng.

Do mỗi chỉ tiêu có vai trò khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng chung của sản phẩm nên các giá trị của mỗi chỉ tiêu được nhận thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trò lớn hơn thì hệ số trọng lượng cao hơn, thường được xác định theo kinh nghiệm, phương pháp điều tra kết hợp với phương pháp chuyên gia trên cơ sở thống kê.

Khi đánh giá chất lượng cảm thì điểm cảm quan được dùng hệ điểm 5 (từ 0-5), xây dựng trên một thang thống nhất 6 bậc. Trong đó điểm 0 tương ứng với chất lượng sản phẩm bị hỏng, còn điểm từ 1-5 ứng với mức khuyết điểm giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có sai lỗi trong tính chất đang xét.

Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm bằng 4. Chất lượng sản phẩm là điểm trung bình của từng chỉ tiêu nhân với hệ số trọng lượng của nó. Hội đồng đánh giá gồm có 10 người, mỗi người được phát một phiếu đánh giá theo 6 mức đánh giá chất lượng sản phẩm (bảng 2.10).

Bậc

Điểm

Tính chất

Bảng 2.10: Bảng điểm chất lượng của sản phẩm.

1

0 – 3,9

Hỏng

2

4,0 – 7,1

Rất kém

3

7,2 – 11,1

Kém

4

11,2 – 15,1

Trung bình

5

15,1 – 18,5

Khá

6

18,5 – 20

Tốt

+ Phép thử cho điểm thị hiếu: Phép thử gồm hai mẫu được chuẩn bị để so sánh mức độ ưa thích của người thử đối với hai sản phẩm (không so sánh về cường độ của một tính chất cảm quan nào đó). Thang điểm thị hiếu từ 1 đến 9 tương ứng: cực kỳ không thích đến cực kỳ thích. Giá trị điểm trung bình của từng sản phẩm có thể so sánh nhờ chuẩn t.

Chuẩn bị mẫu và mời người thử, mỗi người nhận được hai mẫu rượu vang

điều có ký hiệu trên ly kèm theo “Phiếu trả lời”.

2.5.12. Xử lý số liệu

Các số liệu trong đề tài được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm JMP 10. Số liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (mean ± SD). Kết luận về sự ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm dựa trên phân tích ANOVA, sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức thí nghiệm được xác định so với giá trị sai khác nhỏ nhất (5% LSD).

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU BAN ĐẦU

Kết quả phân tích ở bảng 3.1 chỉ ra dịch ép quả điều chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như: hàm lượng vitamin C đạt 211 mg/100mL cao gần gấp 2 lần quả chanh (Citrus aurantifolia), gấp 5 lần quả cam (Citrus aurantium). Vitamin C đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hóa tế bào, làm giảm sự tạo thành các gốc tự do, giúp làm chậm quá trình lão hóa, tổn thương mạch máu và ngăn ngừa bệnh ung thư. Đặc biệt nó hoạt động như một đồng yếu tố cho các enzym-N-trimethyl-L-lysine hydroxylase và butyrobetaine tham gia vào quá trình oxy hóa chất béo trong xương [40]. Ngoài ra ở dịch ép quả chứa nhiều các khoáng chất với hàm lượng kali cao gấp 6 lần và photpho cao gấp 3 lần so với quả mãng cầu xiêm (Annona muricata), sắt cao gấp 5 lần so với quả dưa hấu (Citrullus lanatus) [41].

Dịch ép quả điều chứa hàm lượng polyphenol (389 mg GAE/100mL) cao gấp 1,5 lần so với quả ổi chín (Psidium guajava) [42]. Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH của dịch ép quả điều có giá trị IC50 (239 µg /mL) cao hơn dịch chiết của lá (538 µg/mL), thân (616 µg/mL) và rễ (884 µg/mL) của loài Nam sâm bò (Boerhavia diffusa L.). Dịch chiết của Nam sâm bò chuyên được dùng để trị các bệnh như: tiểu đường, kháng viêm, ung thư…[36]. Điều này cho thấy khả năng kháng oxy hóa của dịch ép quả điều rất tốt. Khả năng kháng oxy hóa của dịch ép điều còn được đánh giá dựa theo chỉ tiêu năng lực khử. Năng lực khử của dịch ép quả điều (giá trị EC50 đạt 1 mg/mL) cao gấp 20 lần so với năng lực khử của dịch chiết yến sào Khánh Hòa (EC50 = 20,4 mg/mL) [43]; và cao gấp 3- 6 lần so với năng lực khử của 6 loại nấm ăn ở Bồ Đào Nha (giá trị EC50 từ 3,12- 6,69 mg/mL) bao gồm: Lactarius deliciosus, Tricholoma portentosum, Lactarius deliciousus (stipe), Tricholoma portentosum (stipe), Tricholoma portentosum, Tricholoma portentosum, Lactarius deliciosus (cap) [44]. Như vậy dịch ép quả điều có khả năng kháng oxy hóa cao, rất tốt cho sức khỏe.

Hàm lượng chất khô hòa tan của dịch ép quả điều cao (10%) nên dịch

ép có vị ngọt, phù hợp cho lên men rượu. Theo nghiên cứu gần đây, nếu uống dịch ép quả điều trong 4 tuần liên tiếp sẽ làm tăng bạch cầu đa nhân trung tính. Vì khả năng kháng oxy hóa từ malondialhydehyde và 8-isoprostane có trong dịch quả, giúp làm giảm sự lắng đọng chất béo và có tác dụng khử trùng đối với quá trình oxy hóa ty thể [45]. Thí nghiệm ở chuột khi cho uống dịch ép quả điều đã giúp cải thiện các cơ chế miễn dịch và cân bằng tối ưu giữa ROS và chất chống oxy hóa dẫn đến lành vết thương tốt hơn [46]. Như vậy dịch ép quả điều là một loại nước uống rất giàu dinh dưỡng, khả năng kháng oxy hóa cao, có tiềm năng rất lớn khi tạo ra loại thức uống tốt cho sức khỏe.

Bảng 3.1: Một số các chỉ tiêu dinh dưỡng trong dịch ép quả điều ban đầu.

Chỉ tiêu

Đơn vị

Kết quả

STT

Tanin

mg/100 mL

250 ± 0,02

1

2

Đường tổng

10 ± 1,05

3

Axit tổng số

g/L

1,95 ± 0,05

4

4,5 ± 0,02

5

Tổng polyphenol

mg GAE/100mL

389 ± 3,02

6

DPPH

µg/mL

239 ± 3

7

TSS

10,4 ± 1,25

8

Vitamin C

mg/100 mL

211 ± 1,02

9

Canxi (Ca)

mg/L

22 ± 1,04

10

Magie (Mg)

mg/L

137 ± 5,00

11

Sắt (Fe)

mg/L

5,9 ± 4,05

12

Kẽm (Zn)

mg/L

0,48 ± 0,52

13

Photpho (P)

mg/L

68 ± 3,02

14

Kali (K)

mg/L

639 ± 4,02

3.2. KHẢO SÁT THỦY PHÂN TANIN BẰNG ENZYM TANASE

Dịch ép quả điều có chứa nhiều giá trị dinh dưỡng nhưng nhược điểm lớn là chứa hàm lượng tanin cao gây cản trở trong quá trình chế biến và thương mại hóa sản phẩm. Tanin trong dịch quả tồn tại dưới 2 dạng: tanin thủy phân và tanin ngưng tụ. Theo kết quả nghiên cứu của Agnieszka, 2011 hàm lượng tanin (25 mg/100mL) trong dịch quả góp phần lớn trong quá trình hình thành hàm lượng polyphenol (389 mg/100 mL) giúp khả năng kháng oxy hóa tốt [47]. Trong đó tanin thủy phân là este của axit thuộc nhóm các hợp chất phenolic như: axit gallic, ellagic và polyol thường là glucose chiếm khoảng 18 mg/100mL và tanin ngưng tụ là oligome hoặc polyme của flavan-3-ols được liên kết cacbon-cacbon chiếm khoảng 7 mg/100mL [48].

Phương pháp truyền thống dùng các protein như: gelatin, casein, lòng trắng trứng... để tạo phức với cả 2 dạng của tanin được tiến hành ở nhiệt độ 60- 80oC nhằm tách loại tanin ra khỏi dịch ép. Nhược điểm của phương pháp này là: thứ nhất, phản ứng thực hiện ở điều kiện nhiệt độ cao nên đã làm giảm vitamin C có trong dịch quả. Thứ hai, protein sẽ tạo kết tủa tách cả 2 dạng tanin này ra khỏi dịch quả, điều này đồng nghĩa loại bỏ một lượng polyphenol có ích rất tốt cho sức khỏe ra khỏi dịch ép, làm giảm khả năng chống oxy hóa.

Do vậy để tách loại tanin hiệu quả cao mà vẫn giữ được hàm lượng polyphenol, khả năng chống oxy hóa cao là mục tiêu của đề tài. Nghiên cứu này sử dụng kết hợp enzym tanase và gelatin để xử lý tanin. Đầu tiên, enzym tanase được sử dụng để thủy phân tanin thủy phân tạo ra 5 phân tử axit gallic và glucose. Axit gallic cũng là một polyphenolic cấu trúc đơn vòng có khả năng kháng oxy hóa cao, có tác dụng làm giảm các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, thoái hóa thần kinh. Glucose là chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng cho cơ thể, đồng thời cũng là nguyên liệu tốt để chế biến nước hoa quả, lên men rượu...[49]. Tiếp theo, thêm gelatin vào dịch ép để tạo phức kết tủa với hàm lượng tanin ngưng tụ không bị thủy phân bởi enzym còn lại trong dịch tách ra khỏi dịch ép quả điều.

Kết quả thủy phân tanin bằng enzym tanase ở bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tanin (25mg/100mL) và hàm lượng viatmin C (211 mg/100mL) ở các nghiệm thức không thay đổi, hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy

hóa theo DPPH và năng lực khử có sự chệnh lệch giữa các nghiệm thức.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến quá trình thủy phân tanin bằng enzym tanase trong thời gian 30 phút.

NT

pH

Tanin (mg/100mL)

Polyphenol (mg/100mL)

IC50 theo DPPH (ug/mL)

Năng lực khử theo EC50 (1 mg/mL)

Nhiệt độ (oC)

0,652 ± 6,1

250 ± 0,02

453 ± 4,6

245 ± 7,1

1

0,662 ± 4,2

4,5

250 ± 0,02

457 ± 5,4

239 ± 6,8

2

0,650 ± 5,5

250 ± 0,02

454 ± 6,2

252 ± 6,2

3

0,650 ± 5,5

5,5

250 ± 0,02

448 ± 6,2

255 ± 6,2

4

0,655 ± 5,4

250 ± 0,02

460 ± 5,2

222 ± 6,7

5 0,687 ± 7,1

40 4,5

250 ± 0,02

468 ± 5,7

214 ± 6,5

6

0,657 ± 6,3

250 ± 0,02

463 ± 6,1

224 ± 6,3

7

0,653 ± 5,8

5,5

250 ± 0,02

450 ± 6,1

230 ± 5,7

8

0,645 ± 6,3

250 ± 0,02

451 ± 6,2

243 ± 5,2

9

0,647 ± 7,1

10

4,5

250 ± 0,02

452 ± 5,7

248 ± 5,8

0,642 ± 6,5

11

250 ± 0,02

454 ± 5,9

251 ± 6,9

0,648 ± 6,9

12

5,5

250 ± 0,02

442 ± 5,6

251 ± 7,2

0,575 ± 6,7

13

250 ± 0,02

445 ± 5,2

312 ± 6,7

0,587 ± 5,9

14

4,5

250 ± 0,02

448 ± 5,7

308 ± 6,5

0,591 ± 5,7

15

250 ± 0,02

433 ± 6,1

315 ± 6,3

0,582 ± 6,1

16

5,5

250 ± 0,02

430 ± 6,1

318 ± 6,3

Ghi chú: kết quả ± thể hiện độ lệch chuẩn của từng giá trị.

Thông thường, mỗi enzym hoạt động tốt nhất ở một giá trị nhiệt độ tối ưu nhất định, sự tăng nhiệt độ làm cho động năng của enzym và cơ chất tăng, giúp chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn. Nhưng nếu nhiệt độ

lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu, hoạt động của enzym giảm và tốc độ phản ứng giảm do các trung tâm hoạt động của enzym bị bất hoạt hoặc phá vỡ [50]. Nghiệm thức dịch ép quả điều được thủy phân tại nhiệt độ 40oC, enzym tanase thể hiện hoạt tính tốt nhất với hàm lượng polyphenol cao hơn 3-5% và khả năng kháng oxy hóa theo DPPH, năng lực khử cao hơn 8-11% so với các nghiệm thức ở các nhiệt độ còn lại. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường pH khác nhau, tại nhiệt độ 40oC cho kết quả khảo sát có sự chênh lệch nhau (p<0,05). Cụ thể, hàm lượng polyphenol và giá trị IC50 (DPPH) của dịch quả sau thủy phân bằng enzym ở môi trường pH=4,5 cao hơn kết quả khảo sát ở pH=4; 5 và 5,5 khoảng 4 - 6%. Đồng thời dịch ép sau thủy phân có năng lực khử theo EC50 ở pH=4,5 đạt giá trị là 0,687 cao hơn dịch ép thủy phân ở các pH còn lại và cao hơn 4% so với dịch điều ban đầu. Kết quả này cho thấy điều kiện tốt nhất của quá trình thủy phân tanin trong dịch ép quả điều bằng enzym tanase tại giá trị pH=4,5 (pH dịch quả) và nhiệt độ 40oC.

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase đến tách loại tanin.

Nghiệm thức

Tanase (ppm)

Tanin (mg/100mL)

Polyphenol (mgGAE/100mL)

Giá trị IC50 (mg/mL)

Năng lực khử (Abs700)

NT1

0,25 ± 0,02

413 ± 4,9

234 ± 5,5

0,587 ± 7,4

NT2

100

0,25 ± 0,02

468 ± 5,7

214 ± 6,5

0,687 ± 7,1

NT3

200

0,25 ± 0,02

468 ± 4,9

215 ± 5,8

0,685 ± 6,9

NT4

300

0,25 ± 0,02

469 ± 5,1

215 ± 5,3

0,684 ± 6,8

NT5

400

0,25 ± 0,02

469 ± 5,4

217 ± 4,7

0,687 ± 6,8

NT6

500

0,25 ± 0,02

468 ± 5,3

216 ± 5,2

0,685 ± 5,9

Ghi chú: kết quả ± thể hiện độ lệch chuẩn của từng giá trị.

Ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase bổ sung vào dịch ép quả điều đến quá trình thủy phân đã được khảo sát. Bảng 3.3 cho thấy ở các hàm lượng enzym khác nhau, cho kết quả khác nhau giữa nghiệm thức 1 so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05). Cụ thể khi tăng hàm lượng enzym tanase từ 50 lên 100ppm hiệu quả thủy phân tanin tăng lên. Tại đây hàm lượng enzym tanase từ 100-500 ppm cho hàm lượng polyphenol đạt 468 mg/100mL, tăng 17% so với

dịch ép ban đầu chưa xử lý, khả năng kháng oxy hóa theo DPPH có giá trị đo IC50 đạt 214-217 ug/mL thấp hơn giá trị đo IC50 của dịch ép quả chưa xử lý (240 ug/mL). Dịch ép có giá trị IC50 theo DPPH thấp hơn sẽ có khả năng kháng oxy cao hơn. Điều đó cho thấy dịch ép quả điều sau xử lý enzym có khả năng kháng oxy hóa tốt hơn.

Sơ đồ 3.1: Giản đồ phân tích HPLC xác định axit gallic trong dịch ép quả điều trước và sau khi thủy phân bằng enzym tanase.

Kết quả xác định hàm lượng tanin còn lại trong dịch ép quả điều sau xử lý bằng enzym không thay đổi. Nguyên nhân là phương pháp phân tích xác định tanin theo Lowenthal là phương pháp oxy hóa khử, dùng chất oxy hóa mạnh KMnO4 để khử các hợp chất hữu cơ polyphenol có trong dung dịch, sự thay đổi hàm lượng KMnO4 được tính toán ra hàm lượng tanin. Tanin thủy phân đã bị thủy phân tạo ra axit gallic cũng là 1 chất polyphenol, khi chuẩn độ bằng KMnO4 giá trị vẫn không thay đổi. Phản ứng thủy phân tanin tạo ra axit gallic được khẳng định rõ ràng nhất trong sơ đồ 3.1. Giản đồ HPLC cho thấy dịch điều trước thủy phân không có pic đặc trưng của axit gallic (Hình 3c). Nhưng dịch ép sau xử lý bằng enzym (Hình 3b) có pic đặc trưng của axit gallic rất rõ với cường độ cao ở thời gian lưu 12,6 phút và một số pic đặc trưng của tanin ở

mẫu chưa xử lý đã giảm đi đáng kể, vài pic biến mất thay vào đó là các pic mới. Như vậy từ kết quả phân tích trên, tại pH=4,5, nhiệt độ 40oC và hàm

lượng enzym 100 ppm cho kết quả thủy phân tanin đạt hiệu quả tốt nhất.

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁCH LOẠI TANIN BẰNG GELATIN

)

(

n i n a t i ạ o l

h c á t t ấ u s

u ệ i H

Trong dịch điều tanin được phân làm 2 loại: tanin thủy phân sẽ bị thủy phân bởi enzym tanase và tanin ngưng tụ không bị thủy phân bởi enzym. Do đó, dịch ép quả điều sau khi thủy phân tanin bởi enzym tanase, tiếp tục bổ sung gelatin với hàm lượng từ 1-5 g/L, khuấy trộn đều trong thời gian 30 phút. Khi đó gelatin tạo phức với tanin ngưng tụ chưa bị thủy phân bởi enzym hình thành kết tủa trắng lắng xuống và tách ra khỏi dịch quả.

g/L

Hình 3.1: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nồng độ khác nhau.

Kết quả ở hình 3.1 cho thấy ở các hàm lượng gelatin khác nhau hiệu suất tách loại tanin cũng khác nhau. Hiệu suất tách loại tanin đạt 42% w/v khi bổ sung hàm lượng gelatin 1 g/L vào dịch quả. Hiệu suất tách loại tanin tăng lên khi tăng hàm lượng gelatin lên 2 g/L, đạt hiệu suất tách loại cao nhất 59% w/v. Sau đó, khi tiếp tục tăng hàm lượng gelatin từ 3 lên tới 5 g/L thì hiệu suất giảm dần. Hiệu suất tách loại tanin đạt giá trị thấp nhất chỉ với 46,1% w/v (p<0,05) ở hàm lượng gelatin 5 g/L. Nguyên nhân do phản ứng tạo phức hợp tanin- protein hình thành kết tủa để tách tanin ra khỏi dịch ép quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ lớn, số lượng nhóm polyphenol và sự sắp xếp các nhóm phenoxy ở tanin hay độ lớn, cấu trúc, thành phần amino axit, điểm đẳng nhiệt, cường độ ion và vị trí các nhóm carboxy của gelatin, cũng như khả năng va đập giữa hai

chất trong dịch quả để tạo liên kết... Khi nồng độ gelatin cao sẽ gây ra độ nhớt cao cản trở phản ứng tạo kết tủa [51].

Vì vậy quá trình tách tanin trong dịch ép quả điều phụ thuộc vào hàm lượng gelatin và hiệu quả cao nhất khi gelatin được thêm vào ở hàm lượng 2 g/L. Sau đó tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (30-60oC) đến hiệu suất tách loại tanin. Kết quả khảo sát được trỉnh bày ở hình 3.2, cho thấy hiệu suất tách loại tanin tăng từ 59% w/v lên 67% w/v ở khoảng nhiệt độ từ 30-40oC. Khi tiếp tục gia tăng nhiệt độ từ 40oC lên 50oC thì hiệu suất tách loại tanin giảm xuống còn 62,8% w/v và hầu như không đổi khi tăng nhiệt độ lên 60oC (p<0,05). Có sự chệnh lệch vì tại khoảng nhiệt độ thích hợp 40oC, các chuỗi polypeptit của gelatin tiếp xúc với nhau tạo mạng lưới không gian 3 chiều, hình thành hệ keo bền, tốt nhất. Khi nhiệt độ càng cao chuỗi polypeptit bị phá vỡ tạo ra các dây ngắn hơn và rời rạc nên khả năng phản ứng tạo phức gelatin-tanin giảm [52].

)

(

n i n a t i ạ o l

h c á t t ấ u s

u ệ i H

Như vậy tại nhiệt độ 40oC, hàm lượng gelatin (2 g/L) có khả năng tạo phức tanin-protein, kết tủa đạt hiệu suất cao nhất. Với phương pháp sử dụng kết hợp enzym tanase và gelatin, hàm lượng tanin được tách loại đạt 67% w/v đồng thời giúp làm tăng hàm lượng polyphenol nên khả năng kháng oxy hóa cao hơn. Kết quả này so với sử dụng các phương pháp truyền thống [53]: tinh bột sắn (tách loại 34,2% w/v), tinh bột gạo (tách loại 42,1% w/v) thì hiệu suất tách loại tanin cao gần gấp 1,5-2 lần.

oC

Hình 3.2: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nhiệt độ khác nhau.

3.4. MỘT SỐ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU SAU XỬ LÝ

Theo bảng 3.4 và hình 3.3 cho thấy dịch ép quả điều sau xử lý bằng enzym tanase và gelatin, hàm lượng tanin còn lại trong dịch quả thấp chỉ còn 0,11 mg/100mL. Kết quả này thấp hơn 15 lần so với kết quả nghiên cứu của Shuklajasha Mohanty và cộng sự, 2006 [54], hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa cao hơn 10% so với tách loại tanin chỉ sử dụng gelatin [55]. Dịch quả khi nếm không còn vị chát, se sít lưỡi, khan vòm họng và vẫn giữ được hương thơm đặc trưng của quả điều. Kết quả này cho thấy phương pháp sử dụng kết hợp enzym tanase và gelatin không những đã xử lý tanin hiệu quả cao mà còn làm tăng hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa.

Bảng 3.4: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch quả điều sau quá trình tách loại tanin.

Chỉ tiêu

Đơn vị

Sau xử lý

STT

mg/100mL

110 ± 0,2

1

Tanin

2

Đường tổng

8,9 ± 0,1

3

Axit tổng số

g/L

1,75 ± 2

4

4,5 ± 0,2

5

µg/mL

428 ± 5

DPPH (IC50)

6

Tổng polyphenol

mg GAE/100mL

202 ± 2

7

TSS

8,4 ± 0,1

8

Vitamin C

mg/100 mL

149 ± 0,3

9

Canxi (Ca)

mg/L

16 ± 0,5

10

Magie (Mg)

mg/L

98 ± 0,3

11

Sắt (Fe)

mg/L

3,9 ± 0,1

12

Kẽm (Zn)

mg/L

0,29 ± 0,1

12

Photpho (P)

mg/L

45 ± 2

mg/L

13

Kali (K)

88 ± 4

Trước xử lý

Sau xử lý

Hơn nữa, ở dịch ép quả điều sau xử lý tanin chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như: hàm lượng vitamin C (149 mg/100mL) cao gấp 1,5 lần quả Kiwi (Actinidia chinensis), gần gấp 5 lần quả Xoài (Mangifera) và 2,7 lần quả Quýt (Citrus reticulata) [41]. Khả năng kháng oxy hóa (theo DPPH có IC50= 425 µg/mL) cao hơn một số loại rau quả và thảo dược như: cây Cà dây leo (Solanum hainanense Hance) có IC50= 1734 µg/mL [56], quả xanh của cây Nhàu (Morinda citrifolia) IC50 = 1025,2 µg/mL [57]. Dịch quả chứa khá đầy đủ các loại khoáng vi lượng như: Ca, Mg, Fe, K, P, S... cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men. Hợp chất photpho giúp thực hiện quá trình trao đổi cacbon và vận chuyển năng lượng, lưu huỳnh có trong thành phần của protein và nhóm phụ (-SH) của một số enzym và coenzym A, canxi và kali tham gia vào trung tâm hoạt động của các enzym…[28].

Hình 3.3: Dịch ép quả điều trước và sau xử lý bằng enzyme tanase và gelatin.

Như vậy, nhược điểm lớn nhất là vị chát, se khít lưỡi khi sử dụng của dịch ép điều đã được giải quyết triệt đề, vẫn giữ được hương điều đặc trưng. Dịch quả sau xử lý vẫn chứa nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men, tốt cho sức khỏe. Tuy nhiên tổng hàm lượng đường (8,9%) chưa đáp ứng đủ nhu cầu sử dụng của nấm men để tạo ra sản phẩm có độ cồn cao. Do vậy trong quá trình lên men cần bổ sung đường saccharose vào môi trường nuôi cấy và lên men nhằm tạo ra sản phẩm rượu vang điều chất lượng.

3.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ NẤM MEN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN

3.5.1. Kết quả xác định môi trường và thời điểm dừng ở quá trình

nhân giống nấm men

Trong quá trình lên men rượu vang việc lựa chọn môi trường nhân giống và xác định thời điểm để nấm men sinh trưởng và phát triển đạt đến mật độ tế bào cao nhất là rất cần thiết. Môi trường nhân giống phải đảm bảo các điều kiện thích hợp nhất cho nấm men có thể phát triển đạt đến mật độ tế bào cao nhất. Theo lý thuyết môi trường nuôi cấy Sabouraud thường được xem là môi trường chuẩn để nhân giống nấm men, bởi vì đây là môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho nấm men sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên khi sử dụng môi trường này lại có nhược điểm là mùi của một số chất dinh dưỡng trong thành phần môi trường sẽ ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm. Nhận thấy dịch ép quả điều sau xử lý chứa nhiều thành phần dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của nấm men nên được lựa chọn để nhân giống nấm men so sánh với môi trường chuẩn Sabouraud. Dịch điều sau xử lý bởi enzym và gelatin được điều chỉnh về pH = 4,5 và bổ sung đường đạt 14oBrix để nhân giống [58].

S1

S2

) L m / u ệ i r t (

n e m m ấ n

o à b

ế t

g n ợ ư l

ố S

giờ

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 SBD

SBD

dịch điều

Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2).

Hình 3.4: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1). Kết quả nhân giống ở hai môi trường (hình 3.4 và hình 3.5) trong thời gian từ 0-40 giờ cho thấy nấm men tăng giảm theo quy luật đường cong sinh trưởng của vi sinh vật, phù hợp với các giai đoạn sinh trưởng. Trong môi trường dịch điều nấm men phát triển tốt hơn trong môi trường chuẩn Sabouraud, trong đó nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) sinh trưởng và phát

triển mạnh hơn so với nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) (p<0,05).

Cụ thể, trong 4 giờ đầu nấm men chủ yếu thích nghi với môi trường, chúng chưa sinh sản mà chủ yếu phát triển kích thước và trọng lượng của tế bào. Tiếp theo từ 8-28 giờ, nấm men sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa nên số lượng tế bào nấm men tăng sinh nhanh và đạt đỉnh điểm (pha log). Trong đó ở nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) đạt pha log tại thời điểm 24 giờ với số lượng tế bào là 15,42x106 tế bào/mL cao hơn 5% so với môi trường SBD và duy trì đến 32 giờ. Ở nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) số lượng tế bào nấm men ở cả hai môi trường nuôi cấy không có sự chênh lệch lớn (p<0,05). Trong đó ở môi trường dịch điều đạt pha log chậm hơn 4 giờ so với môi trường SBD (24 giờ) với mật độ tế bào là 15,25x106 tế bào/mL và duy trì đến gần 34 giờ. Khi đến cuối pha cân bằng (32-36 giờ) ở nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) và (34-38 giờ) ở nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) số lượng tế bào nấm men giảm 5-7% so với thời điểm đạt pha log, đến 40 giờ tế bào bắt đầu chết nhanh. Nguyên nhân là do các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy giảm dần, đồng thời trong môi trường xuất hiện và tích tụ các sản phẩm trao đổi chất không cần thiết, gây độc tế bào.

So sánh kết quả ở hai môi trường, nhận thấy tại môi trường dịch ép quả điều cả 2 nấm men sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với môi trường Sabouraud. Khi nhân giống trong môi trường dịch điều sẽ hạn chế được mùi và đồng thời nấm men không bị sốc khi bổ sung vào dịch lên men. Do vậy chúng tôi chọn môi trường dịch điều sau xử lý làm môi trường tăng sinh cho nấm men (24-28 giờ) trước khi bổ sung vào dịch lên men.

3.5.2. Kết quả lựa chọn nấm men để lên men rượu vang điều

Giống nấm men là nhân tố quan trọng trong quá trình lên men rượu vang quyết định đến chất lượng thành phẩm tạo thành. Giống nấm men tốt là nấm men có khả năng sử dụng gần như hoàn toàn lượng đường có trong dịch lên men, cần có khả năng lắng tốt và chịu được độ cồn cao, làm trong dịch và giữ được hương điều. Các thông số cần theo dõi để đánh giá và lựa chọn nấm men bao gồm: tổng hàm lượng chất khô còn lại, đường khử, hàm lượng cồn, pH,

oBrix

% v/v 12

axit… Trong đó, khả năng sử dụng hàm lượng chất khô (đường) và tạo cồn là hai thông số đáng chú ý, thể hiện rõ nhất khả năng lên men của từng chủng nấm men. Quá trình khảo sát khả năng lên men ở dịch ép quả điều của hai nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) và Saccharomyces uvarum 664 (S2) tới quá trình lên men chính được trình bày ở hình 3.6 và hình 3.7. Kết quả cho thấy, nấm men sử dụng hàm lượng chất khô càng nhiều thì độ cồn tạo ra càng cao và có sự khác biệt giữa hai dòng nấm men (p<0,05).

ngày

Hình 3.7: Sự biến thiên độ cồn ở nấm men S1 và S2. Hình 3.6: Sự biến thiên oBrix ở nấm men S1 và S2.

Trong 24 giờ đầu hàm lượng chất khô ở nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) giảm 24% tương ứng với 1,5% v/v độ cồn được tạo thành. Tiếp đến từ ngày thứ 3-5 thì hàm lượng chất khô giảm từ 55-69%, độ cồn tạo thành đạt 3,1-7,4% v/v. Khi đến các ngày cuối của quá trình lên men (từ ngày thứ 7), hàm lượng chất khô giảm 72%, độ cồn tạo thành là 11,7% v/v và giữ ổn định cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Ở nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) trong ngày đầu hàm lượng chất khô giảm 20%, độ cồn tạo thành tương ứng 1,4% v/v so với toàn quá trình lên men. Tiếp đến ngày thứ 3-5 giảm từ 64% đến 68%, độ cồn tạo thành tăng tương ứng là 3,7-7,1% v/v. Sau đó quá trình hình thành cồn diễn ra chậm dần và giữ ổn định từ ngày thứ 7 đến hết quá trình lên men là 9,4% v/v, đồng thời hàm lượng chất khô còn lại là 31% so với ban đầu. Như vậy ở nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) có khả năng chuyển hóa đường tốt hơn và tạo ra độ

cồn cao hơn nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2).

2.4

4.65

2.3

4.5

) L / g (

2.2

ô s

4.35

H p

2.1

4.2

g n ổ t t i x a

ị r t á i G

4.05

1.9

g n ợ ư l

3.9

1.8

m à H

Theo Larpent 1991, trong quá trình lên men có khoảng 10% lượng đường được sử dụng cho quá trình tăng sinh khối, phần còn lại để chuyển hóa thành rượu và các sản phẩm phụ khác như: glycerol, pyruvate, este…[59]. Do vậy ngoài việc sử dụng đường để tạo cồn và CO2 thì hàm lượng axit (axit malic, axit citric, axit lactic, axit acetic...) cũng tạo thành trong quá trình lên men ở hai nấm men.

ngày

1.7

3.75

8 S2

Hình 3.8: Sự biến đổi hàm lượng axit tổng số trong quá trình lên men chính. Hình 3.9: Sự biến đổi giá trị pH trong quá trình lên men chính.

Trong 5 ngày đầu lên men, nấm men chuyển hóa đường rất mạnh. Do trong khoảng thời gian này, nấm men đang có hoạt lực mạnh nhất được bổ sung vào môi trường khá giàu chất dinh dưỡng, để thực hiện quá trình thủy phân đường tạo thành cồn trong điều kiện kỵ khí. Khi đó phân tử đường bị phân giải tạo các axit hữu cơ và CO2, do đó pH trong dịch lên men thường có xu hướng giảm, điều đó đồng nghĩa với việc hàm lượng axit tổng tăng nhanh. Tiếp đến ở những ngày cuối các phản ứng sinh hóa diễn ra, lúc này các axit hữu cơ chuyển hóa thành aldehyde, rượu bậc cao, thêm vào đó cũng có thể kết hợp với rượu bậc cao tạo thành các ester sinh hương cho sản phẩm làm giá trị pH tăng lên (hàm lượng axit tổng số giảm) [60]. Thật vậy, hình 3.8 và hình 3.9 cho thấy ở nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) dịch lên men có hàm lượng axit tổng số tăng từ 1,75 g/L đến 2,15 g/L ở ngày thứ 5, tương ứng với giá trị pH giảm từ 4,5-3,97. Tiếp theo đó hàm lượng axit tăng chậm và đạt cao nhất ở

ngày thứ 7 là 2,23 g/L, sau đó giảm nhẹ, giữ ổn định đến ngày thứ 10 là 2,19 g/L và giá trị pH=3,95. Ở quá trình lên nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) dịch lên men có tổng hàm lượng axit cao hơn 4% so với nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1). Tại ngày thứ 5 tổng hàm lượng axit tổng tạo thành đạt 2,2 g/L, (giá trị pH=3,92), sau đó tăng chậm và đạt giá trị cao nhất là 2,31 g/L vào ngày thứ 7. Sang ba ngày cuối của quá trình lên men hàm lượng axit tổng giảm 0,3 g/L tương ứng giá trị pH = 3,93.

Sau 10 ngày lên men chính bằng nấm men: Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) rượu tạo thành có độ cồn tạo thành đạt 11,7% v/v, hàm lượng chất khô còn lại 6 oBrix, tổng hàm lượng axit đạt 2,19 g/L và pH=3,95. Độ cồn tạo thành ở ngày thứ 7 và 10 của qúa trình lên men gần như nhau, không tăng lên. Với nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) rượu tạo thành có độ cồn đạt 9,8% v/v, hàm lượng chất khô còn lại là 7 oBrix, tổng hàm lượng axit tạo thành 2,28 g/L và pH = 3,93. Độ cồn tạo thành sau 7 ngày vẫn tiếp tục tăng cho đến ngày thứ 10 của qúa trình lên men. Điều này cho thấy nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) có tốc độ lên men nhanh hơn nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2).

Các thông số phân tích sau quá trình lên men chính của 2 giống nấm men đều phù hợp để chọn lên men rượu vang. Tiếp theo, thực hiện quá trình đánh giá cảm quan được tiến hành để so sánh chất lượng rượu thành phẩm giữa 2 nấm men.

Ở phương pháp cảm quan cho điểm tổng số thì mẫu rượu được lên men bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) và nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) có số điểm lần lượt là 17,6 và 15,4.

Ở phương pháp cảm quan với cho điểm thị hiếu, kết quả cho thấy giá trị t = 2,91 lớn hơn ttc = 2,57 (giá trị ttc được tra từ hàng của số bậc tự do tương ứng với số cặp đôi trừ 1 và từ cột mức ý nghĩa 5%), chỉ ra hai mẫu rượu vang được ưa thích khác nhau. Đồng thời sản phẩm lên men từ Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) được yêu thích hơn với số điểm cảm quan là 6,67 so với sản phẩm lên men từ nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) với số điểm 4,7

Do vậy, chủng nấm men chọn Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1)

được chọn để thực hiện lên men rượu vang điều. Sau 7 ngày lên men chính thành phẩm có độ cồn phù hợp, các chỉ tiêu khác (hàm lượng axit tổng, pH) đáp ứng được các yêu cầu và điểm đánh giá cảm quan tốt. Nên thời gian lên men chính trong 7 ngày được lựa chọn để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo nhằm tìm ra điều kiện tối ưu.

3.6. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

Trong quá trình lên men chính có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men như: nồng độ đường, tỉ lệ và mật độ nấm men, pH môi trường, hàm lượng SO2, nhiệt độ lên men, thời gian lên men, oxy không khí, nồng độ rượu tạo thành, nguồn dinh dưỡng photphat, nitơ… Trong phạm vi của đề tài, đã khảo sát 3 yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên men là: độ Brix, pH và tỉ lệ nấm men bổ sung. Từ kết quả ở trên chọn nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) để lên men rượu vang điều, tiến hành thực hiện tối ưu hóa quá trình lên men chính được bố trí thí nghiệm theo phần mềm JMP.

Bảng 3.5: Kết quả phân tích ANOVA đến quá trình hình thành cồn trong lên men chính.

Nguồn

Df

F Ratio Prob > F

R2

Tổng bình phương

Trung bình bình phương

Mô hình

55,8539

5,5854

65,5510

<0,0001

Lỗi

0,4260

0,0852

Lack of Fit

0,4260

0,1065

4,4789

0,3388

0,9996

Kết quả 16 nghiệm thức được khảo sát lắp vào phần mềm, cho thấy các yếu tố khảo sát có quan hệ tuyến tính với chỉ số theo dõi, phụ thuộc vào R2 là hệ số xác định bội có giá trị từ 0 đến 1. Thông thường nếu R2 > 0,8 thì mô hình dự đoán tuyến tính được xem là tốt, ngược lại R2 < 0,5 thì ta nên sử dụng mô hình khác, vì mô hình tuyến tính không phù hợp để dự đoán [61]. Kết quả tối ưu hóa quá trình lên men chính theo ba yếu tố được trình bày trong bảng 3.5. Kết quả cho thấy 3 yếu tố: oBrix ban đầu (X1), pH (X2) và tỉ lệ men (X3) bổ

sung trước quá trình lên men đều có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình hình thành độ cồn sau 7 ngày lên men (p < 0,05, R2= 0,996 cho test lack of fit).

Bảng 3.6: Tác động các yếu tố đến quá trình hình thành độ cồn theo phần mềm JMP.

p-value

Giá trị ước lượng

Sai số chuẩn

Hệ số

< 0,00018*

12,1551

0,1811

Intercept

< 0,0001*

2,06

0,1201

0,0227*

0,3

0,1201

0,0290*

0,28

0,1201

0, 0371*

-0,1

0,1569

0,0371*

0,1

0,1569

0,8182

0,025

0,1569

0,0003*

1,5827

0,1169

0,0435*

-0,4827

0,1169

0,2809

0,05

0,1169

0,6443

0,2172

0,1569

b10

Kết quả bảng 3.6, mô hình JMP chỉ ra kết quả ước lượng hệ số hồi quy trong đó: oBrix (b1=2,06) là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến quá trình tạo cồn, còn pH (b2=0,3) và tỷ lệ men (b3=0,28) có tác động gần như nhau và thấp hơn oBrix. Sở dĩ có sự chênh lệch bởi trong quá trình lên men, đường là nguồn nguyên liệu chính cung cấp dinh dưỡng cho nấm men và đây là cơ chất quyết định đến quá trình chuyển hóa tạo thành cồn, đồng thời pH của môi trường thuận lợi giúp vi sinh vật phát triển tối ưu nhất [62]. Khi đó phương trình mô tả mối tương quan giữa độ Brix ban đầu (X1), pH (X2) và tỉ lệ men ban đầu (X3) đến độ cồn (Y) hình thành như sau:

Y= 12,155 + 2,06X1 + 0,3X2 + 0,28 X3 - 0,1X1X2 + 0,1 X1X3 +

2 - 0,4827 X2

1,5827 X1

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của 3 yếu tố khảo sát đến độ cồn tạo thành trong không gian 3 chiều.

Hình 3.11: Kết quả tối ưu hóa ba yếu tố ảnh hưởng theo phần mềm JMP.

oBrix ban đầu được đề xuất là 22, theo nghiên cứu trước đây của Attri

Dấu đứng trước các hệ số của phương trình hồi quy cho biết chiều ảnh hưởng của các yếu tố là dương hay âm hoặc độ biến thiên của các yếu tố thuận hay nghịch đối với các chỉ tiêu theo dõi. Khi đó mô hình hồi quy phù hợp với bề mặt đáp ứng của độ cồn được tạo thành theo hình 3.10, giá trị R2= 0,995 và R2 adj= 0,978. Mỗi điểm trên bề mặt là một giá trị độ cồn tương ứng đồng thời thể hiện mức độ và chiều hướng ảnh hưởng của ba yếu tố khảo sát đến quá trình tạo độ cồn cao nhất hoặc thấp nhất. Điều kiện tối ưu của yếu tố khảo sát ban đầu được thể hiện qua hình 3.11.

(2009) trên quả điều, khi dịch lên men không đủ lượng đường cho nấm men tăng sinh khối thì nấm men có thể chết đi do cạnh tranh dinh dưỡng lẫn nhau và cuối cùng là lượng rượu sinh ra thấp. Nhưng nếu bổ sung cao thì hiện tượng áp suất thẩm thấu xảy ra làm thay đổi quá trình sinh lý và trao đổi chất của tế bào, khi đó quá trình chuyển hóa tạo sản phẩm bị giảm. Vì vậy oBrix ban đầu phải phù hợp để đủ cơ chất cho sự hoạt động của nấm men là rất cần thiết. Giá trị này cũng giống với kết quả của nhiều nghiên cứu khác như: lên men rượu vang ổi [63], rượu vang thốt nốt [64], lên men rượu vang từ dịch ca cao [65].

Ở giá trị pH (X2) điều kiện tối ưu là 4,5 kết quả tương tự như lên men ở rượu vang khóm [66], vang thanh long [67]. Trong dịch lên men rượu vang điều, nếu giá trị pH cao thì độ cồn giảm, do các vi khuẩn hại phát triển gây sự cạnh tranh đồng thời ức chế sự sinh trưởng và phát triển nấm men. Còn nếu giá trị pH thấp thì làm tế bào nấm men bị teo nguyên sinh gây rối loạn quá trình trao đổi chất (có thể bị chết), khi đó độ cồn tạo thành thấp, rượu bị đục và nhiểu sản phẩm phụ hình thành. Như vậy pH thích hợp, có thể cải thiện được độ ổn định của rượu, ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và cũng tạo điều kiện tốt cho quá trình lên men đường [68].

Tỷ lệ men (X3) càng tăng thì độ cồn tăng cao do quá trình chuyển đường thành rượu được thực hiện nhanh chóng. Nhưng nếu số lượng nấm men quá cao thì tốc độ lên men ở thời gian đầu rút ngắn không có thời gian để tạo các hương rượu. Nếu mật độ nấm men quá thấp thì quá trình lên men chậm, rượu sẽ dễ bị hỏng. Do vậy tỉ lệ men bổ sung khi lên men dịch quả thường nằm trong khoảng 5-10% v/v [3], [67], nấm men cần bổ sung ban đầu phải thích hợp để thời gian lên men nhanh nhưng cũng đủ để tạo ra các hương, vị hài hòa cho rượu. Ở đây khi nghiên cứu bề mặt đáp ứng cho thấy tại 7,5% men là thích hợp. Từ các giá trị tối ưu thu được do phần mềm JMP đưa ra, tiến hành lên men thực nghiệm (hình 3.12): Ở 5 ngày lên men đầu giá trị pH giảm (pH=3,91) tương ứng khi đó hàm lượng axit tổng đạt 2,15 g/L tăng 25% so với ngày đầu. Điều này cho thấy song song với sự chuyển hóa đường thành cồn (oBrix giảm 13,8o) là sự hình thành các axit hữu cơ trong dung dịch, làm cho giá trị pH giảm, hàm lượng axit tổng tăng lên. Sau 5 ngày lên men độ cồn đạt 8,9% v/v. Đến ngày thứ 7, khi quá trình lên men kết thúc thì độ cồn đạt 12,1% v/v, hàm

lượng axit tăng lên 2,13 g/L tương ứng giá trị pH=3,97. Kết quả dự đoán và kết quả thực nghiệm (bảng 3.7) gần như không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Do vậy các thông số thực nghiệm với 22oBrix, pH=4,5 và tỷ lệ men là 7,5% được xác định là điều kiện tối ưu để lên men rượu vang điều có độ cồn 12,1% v/v sau 7 ngày lên men.

ngày

axit tổng (g/l)

độ Brixcòn lại

Độ cồn (% v/v)

Hình 3.12: Kết quả các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình lên men. Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra thực nghiệm từ thông số của phần mềm JMP.

Chỉ tiêu

Giá trị JMP đề xuất Giá trị thực nghiệm

0Brix ban đầu

22a

4,5b

Tỷ lệ men (%)

7,5

Độ cồn (% v/v)

12,15c

12,2c

Các chữ giống nhau trong cùng một dòng thể hiện sự khác nhau không có ý nghĩa ở mức p<0,05%.

Kết quả lên men chính thu được ở đề tài cho thấy rượu vang điều thành phẩm có hiệu suất chuyển hóa đường thành cồn tốt hơn so với các nghiên cứu lên men từ dịch ép quả điều trước đây. Attri 2009, đã chế biến sản phẩm rượu vang điều có độ cồn là 8,25% v/v tại điều kiện tối ưu với 22oBrix, pH=4,0 và tỉ lệ men Saccharomyces cerevisia var. ellipsoideus 5% [3]. Umashankar và cộng sự, 2014 đã chế biến rượu vang điều có độ cồn thấp chỉ đạt 6,6% v/v tại điều kiện thực nghiệm với oBrix giảm từ 20,2 xuống còn 15,5, tỷ lệ men 5% v/v, pH giảm từ 3,8 còn lại là 2,6 sau 15 ngày lên men [69].

3.7. XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG ĐIỀU

Từ kết quả thu được ở trên, quy trình sản xuất rượu vang điều được đề xuất như sơ đồ 3.2. Quy trình đề xuất sản xuất rượu vang điều như sau: Lựa chọn quả điều chín làm nguyên liệu, sau đó rửa sạch quả điều, để ráo, tiến hành ép bằng máy ép trục vít để lấy dịch. Dịch ép qủa sẽ được xử lý tanin bằng enzym tanase (hàm lượng enzym 100ppm, nhiệt độ 40oC trong thời gian 30 phút), tiếp theo bổ sung gelatin đã hòa tan vào với hàm lượng 2 g/L khuấy nhẹ trong 30 phút. Sau đó lắng, lọc để loại bỏ kết tủa. Dịch ép quả điều sau khi xử lý tanin được bổ sung đường saccharose và điều chỉnh về điều kiện tối ưu oBrix 22, pH=4,5. Dịch quả sau khi thanh trùng ở 75oC trong 15 phút, tiến hành thực hiện quá trình lên men chính trong 7 ngày. Giai đoạn này nấm men giúp chuyển hóa đường tạo ra 85-90% lượng cồn có trong thành phẩm. Sau đó quá trình lên men phụ được tiến hành ở nhiệt độ 20-22oC trong 60 ngày.

Rượu vang điều tạo thành có độ cồn đạt 13,8% v/v, giá trị pH = 3,97, hàm lượng axit tổng là 2,11 g/L, oBrix còn lại 6,1 (bảng 3.8). Kết quả này gần tương tự như ở một số khảo sát ở các rượu vang như: vang Đà Lạt, vang Bordeaux của Pháp. Sản phẩm hoàn thiện được phân tích kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh vật tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, kiểm tra các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh vật, kết quả (bảng 3.9) phù hợp theo QCVN 6- 3:2010/BYT [71] và TCVN 7045:2013 quy định cho rượu vang. Rượu vang điều hoàn thiện có màu vàng nhạt, trong suốt, mùi vị hài hòa, có độ nồng của cồn, hậu vị ngọt và mang hương điều đặc trưng (hình 3.13).

Hình 3.13: Rượu vang điều. Bảng 3.8: Kết quả một số chỉ tiêu ở sản phẩm rượu vang điều.

Kết quả

STT Các chỉ tiêu Đơn vị

1

Độ cồn

% v/v

13,8 ± 0.4e

2

3,97 ± 0.03b

3

Brix

Độ (o)

6,1 ± 0.3c

4

Axit tổng

g/L

2,11 ± 0.5d

5

Andehyd

mg/L

KPH*

6

Metanol

mg/L

KPH*

(KPH*: Không phát hiện; a, b, c, d, e sự sai khác về thống kê theo hàng dọc)

Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ở rượu vang điều.

Chỉ tiêu vi sinh

Số lượng

Giới hạn cho phép

STT

1

Escherichia coli (CFU/mL)

2

Coliform (CFU/mL)

3

1000

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/mL)

4

Nấm men-Nấm mốc (CFU/mL)

100

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH

KẾT LUẬN

Dịch ép quả điều chứa nhiều thành phần dinh dưỡng cao: vitamin C (211 mg/100mL), đường (10%), khoáng chất, polyphenol và có khả năng kháng oxy hóa…, nhưng hàm lượng tanin cao (250 mg/100mL) gây vị chát, sít lưỡi.

Phương pháp sử dụng kết hợp enzym tanase và gelatin để tách loại hàm lượng tanin đạt hiệu quả đạt cao 67% w/v, tương ứng hàm lượng tanin còn lại là 110 mg/100mL, dịch ép sau xử lý không còn vị chát. Điều kiện tối ưu để xử lý enzym như sau:

+ Tanin thủy phân trong dịch ép quả điều đã được thủy phân bằng enzym tanase tạo thành axit gallic và glucose. Tại điều kiện thực nghiệm với hàm lượng enzym 100 ppm, nhiệt độ 40oC và trong thời gian 30 phút, dịch ép quả điều sau thủy phân có tổng hàm lượng polyphenol tăng lên 17% và khả năng kháng oxy hóa cao hơn so với dịch ép quả điều chưa xử lý.

+ Gelatin được thêm vào dịch ép sau thủy phân bằng enzym tanase sẽ tạo kết tủa với phần tanin ngưng tụ còn lại trong dịch quả. Hiệu quả tách loại tanin ra khỏi dịch ép quả điều đạt cao nhất tại điều kiện gelatin với hàm lượng 2 g/L và nhiệt độ 40oC. Dịch điều sau xử lý tanin được chọn làm môi trường nuôi cấy giống nấm men. Cả hai giống nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) và Saccharomyces uvarum 664 (S2) đều sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường dịch điều. Rượu vang điều được lên men từ giống nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) cho kết quả đánh giá cảm quan tốt hơn rượu vang điều lên men từ nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2). Dịch ép quả điều sau xử lý tanin vẫn còn chứa nhiều chất dinh dưỡng, bổ sung đường saccarose, thực hiện lên men rượu vang điều bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) ở điều kiện tối ưu là: 22oBrix, pH = 4,5 và 7,5% tỉ lệ men, trong thời gian 7 ngày lên men chính ở nhiệt độ phòng và lên men phụ 60 ngày ở nhiệt độ 20oC. Quy trình chế biến rượu vang điều đã được xây dựng với rượu thành phẩm có độ cồn đạt 13,8% v/v, mang đậm hương điều đặc trưng, phù hợp theo

tiêu chuẩn rượu vang TCVN 7045:2013 và QCVN 6-3:2010/BYT.

KIẾN NGHỊ

Do thời gian còn hạn chế nên kết quả thu được thực sự chưa trọn vẹn. Đề

xuất một số ý kiến cần nghiên cứu như sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng theo enzym tanase và gelatin

tới quá trình tách loại tanin ở dịch ép quả điều.

- Thực hiện quá trình lên men malolactic trong quá trình lên men phụ. - Theo dõi thời gian, quá trình biến đổi màu, mùi của sản phẩm trong quá

trình lên men phụ và thời gian bảo quản.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ Nông nghiệp và PTNN (2015). Quyết định phê duyệt quy hoạch phát triển ngành điều đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030. Hà Nội. 2. Sơn Trang, 2018, Điều-Ngoạn mục đạt mức 3.5 tỷ đô. Báo Nông nghiệp Việt Nam, http://nongnghiep.vn/dieu-ngoan-muc-vuot-moc-35-ty-dopost 209336.htmL.

3. Attri B.L., 2009, Effect of initial sugar concentration on the physico- chemical characteristics and sensory qualities of cashew apple wine, Natural Product Radiance, 8(4), pp 374-379.

4. Uma Talasila, Rama Rao Vechalapu, Khasim Beebi Shaik, 2013, Clarification, Preservation, and shelf life evaluacation of cashew apple juice, Food Science Biotechnology, 21(3), pp 709 - 714.

5. Tran Nhat Nam, Nguyen Phuoc Minh, Dong Thi Anh, 2014, Investigation of processing conditions for dietary fiber production from cashew apple (Anacadium occidentale L.) residue, International Journal of Scientific & Technology Research, 3(1), pp 2277-861.

6. Phạm Văn Biên, Nguyễn Thanh Bình, Hồ Huy Cường, Trần Doãn Sơn, Hoàng Văn Tám, Lã Phạm Lân, (2005), Nghiên cứu các giải pháp khoa học công nghệ và thị trường để phát triển vùng điều Nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất khẩu, Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật, TP. Hồ Chí Minh.

7. Cashewinfo.com.,2016, Geographical distribution,

http://www.cashewinfo.com/geographical_distribution.htmL 8. Minh Huệ, 2017, Phát triển bền vững ngành điều, Báo Nhân Dân. 9. Phạm Đình Thanh, 2003, Hạt Điều- Sản xuất và chế biến, Nhà xuất bản

nông nghiệp TP. HCM, tr 12-79.

10. Akinwale T.O., Olubamiwa O., Ajav E. A., 2011, Cottage processing of cashew apple wine juice in Nigeria: physico-chemical and sensory evalution of product, Journal of Food technology in Africa, 6(2), pp 56-58. 11. Inyang, Abah, 1997, Chemical composition and organoleptic evaluation of juice freom steamed cashew appl blended with orange juice, Nigeria.

12. Theo Sức khỏe & đời sống, 2005, Công dụng làm thuốc của quả điều,

https://dantri.com.vn/suc-khoe/cong-dung-lam-thuoc-cua-qua-dieu 1134666593.htm .

13. Bate-Smith, E.C. & Swain, 1962, T. Flavonoid Compounds, pp. 705-809 in Comparative Biochemistry vol 3A (Mason and Florkin, eds), Academic Press.

14. Haslam E., 1989, Plant Polyphenols. Vegetable Tannins Revisited,

Cambridge University Press.

15. Hagerman A.E., 1986, Tannin-protein interaction. In: Plant flavonoids in biology and medicine: biochemical, pharmacological and structure- activity relationships, Ed: Cody V., Middleton E. Jr., Harborne J. -Alan R. liss, New York.

16. Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thy Thư, 2004, Hóa sinh học, Nhà xuất bản đại

học Sư Phạm.

17. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Khuyên, 1998, Giáo trình sinh hóa

hiện đại, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.

18. Lekha and Lonsane, 1997, Production and application of tanin acyl

hydrolase, Central Food Technological Research Institute, India.

19. GMIA, 2012, Gelatin Handbook, Gelatin Menufacturers Institute of

America.

20. Bộ Khoa học và Công nghệ, 2013, Rượu vang, Tiêu chuẩn quốc gia

TCVN 7045:2013.

21. Tô Việt, 2014, Khám phá rượu vang, Nhà xuất bản Bách khoa Hà Nội. 22. Bùi Ái, 2003, Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ Thực Phẩm,

Nhà xuất bản đại học quốc gia TP.HCM, 115 tr.

23. Trà My, 2019, Bức tranh đa diện trên thị trường rượu vang thế giới.

https://bnews.vn/buc-tranh-da-dien-tren-thi-truong-ruou-vang-the- gioi/112295.htmL.

24. Trần Thị Luyến, 1998, Công nghệ chế biến sản phẩm lên men, Nhà xuất

bản Nông nghiệp TP. HCM.

25. Lê Xuân Phương, 2001, Vi sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Xây dựng. 26. Feldmann, Horst, 2010, Yeast, Molecular and Cell Biology, Wiley-

Blackwell, pp 400-402.

27. Anandapandian K.T.K., Kumar R.S., Shankar T.,

(2011), Characterization of alcohol resistant yeast Saccharomyces cerevisiae isolated from Toddy, International Research Journal of Microbiology, 2(10), pp 399-405.

28. Lương Đức Phẩm, 2011, Giáo trình công nghệ lên men, Nhà xuất bản

Giáo dục Việt Nam, 57 tr.

29. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Pham Văn Tý, 2010, Vi sinh vật

học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.

30. Nguyễn Thành Đạt, 2014, Sinh học 10, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 31. Lương Đức Phẩm, 2005, Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật.

32. Lowenthal J.,1877, Uber die bestimmung desgerbstoffs, Z. Anal.

Chemical, 16, pp 33-48.

33. Jyotismita Khasnabis, Chandan Rai and Arindam Roy, 2015, Determination of tannin content by titrimetric method from different types of tea, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 7(6), 238-241.

34. Fu L., Xu X.-R., Gan R.-Y., Zhang Y., Xia E.-Q., Li H.-B., 2011, Antioxidant capacities and total phenolic contents of 62 fruits, Food Chemistry, 129(2), pp 345-350.

35. Thaipong K., Boonprakob U., K. Crosby, L. Cisneros-Zevallo, D.H. Byrne, 2006, Comparision of ABTS, DPPH, FRAP and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts, Journal of Food Composition and Analysis, 19, pp 669-675.

36. Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Thanh Tâm, Mai Hữu Phương, 2016, Khả năng bắt gốc tự do DPPH và năng lực khử của Nam sâm bò ở Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh, Tạp chí khoa học Đại học Sư phạm TP. HCM, 12(90), pp 112-122.

37. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, 2009, Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr 149-219.

38. Vương Thị Việt Hoa, 2002-2003, Thực tập: Vi Sinh Đại Cương, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, 25 tr. 39. Hà Duyên Tư, 2006, Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm, Nhà xuất

bản văn hóa dân tộc, 146 tr.

40. Padayatty S.J., Katz A., Wang Y., Eck P., Kwon O., 2003, Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease prevention, Jour Am CollNul, 22(1), pp 18-35.

41. Viện dinh dưỡng, 2007, Bảng Thành phần thực phẩm Việt Nam, Nhà xuất

bản y học.

42. Nguyễn Thị Huyền Trang, Lê Thị Thu Thủy, Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Hương Thủy, 2012, Nghiên cứu sự biến đổi hàm lượng vitamin C, polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa của quả ổi trong quá trình chín, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(5), pp 805-811.

43. Lê Hữu Hoàng, Lương Công Bình, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Thế Hân, 2017, Khả năng chống oxy hóa và ức chế enzym tyrosinase của yến sào, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, 10, pp 28-30.

44. Isable C.F.R. Ferreira, Paula Baptista, Miguel Vilas-Boas, Lillian Barros, 2007, Free-radical scavenging capacity and reducing power of wild edible mushrooms from northeast Portugal: Individual cap and stipe activity, Food Chemistry, 100, pp 1511-1516.

45. Toyomizu M., Okamoto K., Ishibashi T., Chen Z., Nakatsu T., 2000, Uncoupling effect of anacardic acids from cashew nut shell oil on oxidative phosphorylation of rat liver mitochondria, Life Science, 66(3), pp 229-234.

46. Melocavalcante AA, Rubensam G, Picada JN, Gomes da Silva E, Fonseca Moreira JC, Henriques JA, 2003, Mutagenicity, antioxidant potential, and antimutagenic activity against hydrogen peroxide of cashew (Anacardium occidentale) apple juice and cajuin, Environ Mol Mutagen 41(5), pp 360-369.

47. Agnieszka Kosin´ska, Magdalena Karamac, Kamila Penkacik, Anna Urbalewicz, Ryszard Amarowicz, 2011, Interactions between tannins and proteins isolated from broad bean seeds (Vicia faba Major) yield soluble

and non-soluble complexes, Eur Food Res Technology, 233, pp 213-222. 48. Aliyu OM, Hammed LA, 2008, Nigerian Cashew Economy: A Review of Nut Production Sector. Paper Presented at the International Academy of African Business and Development (IAABD) Conference, University of Florida Gainesville, pp 20-24.

49. Singh Manish Pal, Gupta Avneet, Sisodia S Siddhraj, 2018, Gallic acid: Pharmacogical promising lead molecule: a review. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 10(4), pp 132-138. 50. Hà Thị Thụy Vy, Trần Thanh Trúc, Nguyễn Văn Mười, 2018, Khảo sát đặc điểm enzym protease thịt đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sau quá trình tinh sạch sơ bộ, Tạp chí trường Đại học Cần Thơ, 51(1), pp 28-36.

51. Bartosz Adamczyk, Judy Simon, Veikko Kitunen, Sylwia Adamczyk, and Aino Smolander, 2017, Tannins and their complex interaction with different organic nitrogen compound and enzyms: old paradigms versus recent advances, Erschienen in: Chemistry Open, 6(5), pp 610-614. 52. Nishimoto M, Sakamoto R, Mizuta S, Yoshinaka R, 2005, Identification and characterization of molecular species of collagen in ordinary muscle and skin of the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus), Jour Food Chem, 90, pp 151-156.

53. Emmanuelle SCA, Dedehou, Joseph Dossou, Bonaventure Ahohuendo, Aliou Saidou, Adam Ahanchede, Mohamed M Soumanou, 2015, Optimization of cashew (Anacardium occidentale L.) apple juice’s clarification process by using cassava and rice starch, Journal of Applied Biosciences, 95, pp 8989-9002.

54. Shuklajasha Mohanty, Pratima Ray, M.R. Swain, R.C. Ray, 2006, Fermentation of cashew (Anacadium Occcccidentable L.) “Apple” in to wine, Journal of Food Processing and Preservation, 30(3), pp 314 - 322. 55. Nguyen Van Khoa, Vo Thi Thu Giang, Tran Thi Tuong An, Nguyen Minh Hien, Nguyen Huu Tri, Duong Phuoc Dat (2017). Removal of tannin to reduce the astringent in cashew apple juice by enzyme method.

Proceeding of the 15th Asean Conference on Food Science and Technology, 3:405-411.

56. Nguyễn Xuân Duy, Hồ Bá Vương, 2013, Hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzym polyphenoloxydase của một số loại thực vật ăn được ở Việt Nam, Tạp chí khoa học và phát triển, 11(3), pp 364-372.

57. Đái Thị Xuân Trang, Nguyễn Thị Mai Phương, Võ Thị Ngọc Diễm, Quách Tú Huê, 2012, Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và chống oxi hóa của cao chiết cây Nhàu (Morindan citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu đường, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 23b, pp 115-124.

58. Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Phú Cường, Nguyễn Thị Mỹ Tuyền và Nguyễn Hữu Phước, 2011, Biện pháp làm trong và ổn định sản phẩm rượu vang khóm, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 18b, pp 73-82.

59. Larpent, 1991, Biotechnologie des levures, Masson éditeur, pp 132-273. 60. Nguyễn Thanh Hằng, Nguyễn Đình Thưởng, 2007, Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn Ethylic, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 61. Nguyễn Văn Tuấn, 2006, Phân tích số liệu và tạo biểu đồ bằng R, Nhà

xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật.

62. Tống Thị Ánh Ngọc, Bùi Thị Ánh Ngọc, Nguyễn Thị Mỹ Ngọc, Ngô Minh Quang, 2018, Ảnh hưởng của pH và chất khô hòa tan đến quá trình lên men rượu từ xơ mít (Artocarpus heterophyllus) giống Thái Lan, Tạp chí trường Đại học Cần Thơ, 5, pp 211-218.

63. Sevda, Rodrigues L., 2011, Fermentative Behavior of Saccharomyces Strains During Guava (Psidium Guajava L) Must Fermentation and Optimization of Guava Wine Product, Journal of Food Processing and Tecnology, p.16-22.

64. Bùi Thị Thúy Ngân, 2010, Phân lập và tuyển chọn nấm men từ nước thốt nốt ở huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang. Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ thực phẩm và đồ uống, trường Đại học Cần Thơ.

65. Trần Thị Thanh vân, 2016, Nghiên cứu quy trình lên men rượu vang ca cao, Luận văn thạc sĩ chuyên ngành công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

66. Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế và Nguyễn Thị Mỹ Tuyền, 2013, Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rượu vang khóm, Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ, 25, pp 27-35.

67. Hồ Thanh Trúc, 2011, Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng trong sản xuất rượu vang thanh long, Luận văn tốt nghiệp cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.

68. Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Donèche B., Lonvaud A., 2006, Handbook of Enology, Volume 1: The Microbiology of Wine and Vinifications (Volume 1, 2). Great Britain by Antony Rowe Ltd, Chippennham, Wiltshire.

69. Umashankar, N., Mohan Chavan, Benherlal P.S., Maruthesh.A.M., 2014, Standardization of fermentation process for the production of cashew wine, International Journal of Science and Nature, 5(2), pp 226-230. 70. Bộ Y tế, 2010, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống

có cồn, QCVN 6-3:2010.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ XỬ LÝ PHẦN MỀM

➢ Kế quả xử lý thống kê hàm lượng polyphenol (mgGAE/100mL)

Analysis of Variance

Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio

Model Error C. Total 15 16 31 594,95306 7,42815 602,38121 39,6635 0,4643 85,4340 Prob > F <0,0001*

Effect Tests

Source Nparm DF Sum of Squares F Ratio Prob > F

69,99922 50,2587 <0,0001* pH 3 3

508,51833 365,1107 <0,0001* Nhiệt độ 3 3

pH*Nhiệt độ 16,43550 3,9335 0,0083* 9 9

LSMeans Differences Student's t a = 0,050 t = 2,11991

Level Least Sq Mean

5,50 A 463,63500

4,5, 60 B 457, 06750

5,50 B C 454,89500

5,5, 60 B C 448,69750

4,60 C D 445,90750

5,5, 50 C D E 442,52500

4,5, 50 D E J 453,53750

5, 40 E F 352,74750

➢ Kết quả xử lý thống kê khả năng bắt gốc tự do DPPH

Analysis of Variance

Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio

Model 15 2707,5538 180,504 9,5511

Error 16 302,3799 18,899 Prob > F

C. Total 31 3009,9337 <0,0001*

Effect Tests

Source Nparm DF Sum of Squares F Ratio Prob > F

Nhiệt độ 3 3 1292,9611 22,8051 <0,0001*

pH 3 3 998,8634 17,6178 <0,0001*

9 9 Nhiệt độ*pH 415,7293 2.4442 0,0570

LSMeans Differences Student's t

a = 0,050 t = 2,11991

Level Least Sq Mean

30,5.5 A 315,38000

50,4 A B 308,19000

30,4 B C 255,00000

60,4 C D 252,82000

30,5 C D E 248,00500

50,5.5 C D E 243,75500

50,5 C D E 224,88000

50,4.5 C D E

40,5.5 D E F 222,75000

30,4.5 E F 218,44500

60,5.5 E F J 218,44000

40,4 E F J 214,94000

Kết quả xử lý thống kê năng lực khử (ABS700)

Analysis of Variance

Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio

Model 15 0,03138447 0,002092 78,3082

Error 16 0,00042750 0,000027 Prob > F

C. Total 31 0,03181197 <0,0001*

Effect Tests

Source Nparm DF Sum of Squares F Ratio Prob > F

Nhiệt độ 0,01330234 165,9552 <0,0001* 3 3

pH 0,01146409 143,0218 <0,0001* 3 3

9 Nhiệt độ*pH 0,00661803 27,5214 <0,0001* 9

➢ Kết quả xử lý thống kê hàm lượng tanin với nhiệt độ thay đổi

Analysis of Variance

Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio

Model 0,00060000 0,000200 5,37e+15 3

Error 1,4908e-19 3,73e-20 Prob > F 4

C. Total 0,00060000 <0,0001* 7

Effect Tests

Source Nparm DF Sum of Squares F Ratio Prob > F

Nhiệt độ 4 4 0,00060000 5,37e+15 <0,0001*

Levels not connected by same letter are significantly different.

➢ Kết quả của nồng độ cồn:

➢ Kết quả chạy anova trên phần mềm JMP:

➢ Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp:

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN

Hình PL 2.1: Phiếu điểm của phép thử cho điểm chất lượng.

Bảng PL 2.1: Bảng điểm đánh giá chất lượng của sản phẩm rượu vang.

Điểm chưa

Chỉ

có trọng

Cơ sở đánh giá

tiêu

lượng

Sản phẩm trong, không vẩn đục, màu vàng trong suốt đẹp, hấp dẫn

Sản phẩm trong, không vẩn đục, màu hơi vàng

Sản phẩm có căn lơ lửng, màu ít đặc trưng

Sản phẩm hơi đục, màu không đặc trưng

Độ trong và màu sắc

Sản phẩm đục, nhiều cặn lơ lửng, màu không đặc trưng

Sản phẩm vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng

Thơm dịu, hài hòa, có mùi đặc trưng của điều, thoảng mùi rượu, tạo cảm giác thích mạnh

Mùi thơm nhẹ, đặc trưng cho sản phẩm, thơm mùi rượu và tương

đối hài hòa, tạo cảm giác thích

Mùi

Có mùi thơm của điều, mùi rượu cao, mùi không được hài hòa.

Khó nhận ra mùi của điều, mùi rượu cao rõ rệt, mùi không hài hòa, thoảng mùi lạ

Sản phẩm có mùi lạ rõ rệt, mùi nồng, hăng

Sản phẩm có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng

Vị ngọt của đường, của rượu, hài hòa với vị chua nhẹ của acid. Tạo

thành vị êm dịu, đậm đà, hậu vị kéo dài

Sản phẩm có vị hài hòa, dễ chịu, đặc trưng, hậu vị vừa phải.

Vị

Sản phẩm thiếu vị đậm đà, hơi chua, cho cảm giác không thích.

Vị chua nổi trội, ít ngọt, đắng, hơi chát.

Vị chua gắt, đắng mạnh, không ngọt, vị chát, có vị lạ

Vị chua rất gắt, đắng gắt, chát gắt, vị lạ của sản phẩm hỏng

Hình PL 2.2: Kết quả đánh giá cảm quan rượu vang điều ở nấm men S1.

Hình PL 2.3: Kết quả đánh giá cảm quan rượu vang điều theo nấm men S2.

➢ Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo phương pháp so sánh thị hiếu:

Phòng thí nghiệm

PHIẾU TRẢ LỜI

Phép thử cho điểm

H ọ và tên: Ngày thử:

Bạn nhận được 2 mẫu rượu ký hiệu S1 và S2. Bạn hãy nếm và đo mức độ

yêu thích của mỗi mẫu theo thang điểm:

1. Cực kỳ không thích 6. Tương đối thích

1. Rất không thích 7. Thích

2. Không thích 8. Rất thích

3. Tương đối không thích 9. Cực kỳ thích

4. Không thích cũng không ghét

Trả lời:

Mẫu S1 S2

Điểm

Nhận xét:…………………………………………………………...

Hình PL 2.4: Phiếu cho điểm cảm quan.

Bảng 2.2: Kết quả đánh giá cảm ở nấm men S1 và S2.

Mẫu Thành viên Khác nhau d = A - B S1 S2

1 5 1 6

2 4 3 7

3 5 3 8

4 4 2 6

5 7 2 5

6 3 6 8

Tổng 40 28 14

Điểm trung bình 6,67 4,60 2,16

Tổng số cặp đôi được so sánh: n = 6.

Khi đó theo phương pháp cảm quan với cho điểm thị hiếu được tiến hành

tìm t theo công thức sau:

Trong đó: d- : trung bình kết quả độ lệch khác nhau ở 2 mẫu thử

n: tổng số cặp đôi được so sánh; n = 6 S: độ lệch chuẩn

bình phương kết quả độ lệch khác nhau ở 2 mẫu thử = (1)2 + (3)2 + (3)2 + (2)2 + (2)2 + (5)2 = 52

: bình phương tổng kết quả độ lệch khác nhau ở 2 mẫu thử = (14)2=196

𝒅̅ 𝑺 √𝒏

𝟐,𝟑𝟑 𝟏,𝟗𝟔 √𝟔

Vậy 𝒕 = = =2,91

PHỤ LỤC 3: MỘT SỐ HÌNH ẢNH