Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcu s mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:79

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích đưa ra được qui trình tách chiết α- mangostin hiêụ quả, đơn giản đồng thời khẳng định được tác dụng kháng khuẩn sâu răng của chất này trên đối tượng vi khuẩn S. mutans trên biofilm và bước đầu tạo được chế phẩm nước súc miệng mới có tác dụng phòng chống bệnh sâu răng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcu s mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------*****------ NGUYỄN VŨ ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA α- MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT Garcinia mangostana L. LÊN VI KHUẨN Streptococcus mutansTRÊN BIOFILM VÀ ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
HÀ NỘI - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN --------------- Trong quá trình thực hiê ̣n luận văn khoa học , tôi đã nhận được r ất nhiều sự giúp đỡ, khích lệ và động viên của các Thầy, Cô giáo, các bạn đồng nghiệp, bạn bè và những người thân trong gia đình. Qua đây, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắ c của mình đế n những cá nhân và tập thể đã hế t lòng giúp đỡ để tôi có th ể hoàn thành bản luận văn này. Trước hế t , tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS . Nguyễn Thi ̣ Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Viê ̣t Nam đã tận tình hướng dẫn trong suố t quá trình học tập và thực hiê ̣n nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên c ứu của phòng Sinh hóa thực vật, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa h ọc và Công nghệ Viê ̣t Nam , ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh họcđã nhiê ̣t tình giúp đỡ và tạo điề u kiê ̣n thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này. Cuố i cùng , tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu , bạn bè , người thân và đ ồng nghiệp - những người đã luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên , khích lệ và là chỗ dựa vững chắ c cho tôi trong suố t quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, 18tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Vũ Anh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT EPS exopolysaccharide GTF glucosyltransferase HPLC high performance liquid chromatography NMR nuclear magnetic resonance NSM nước súc miệng PTS sugar-phosphotransferase system TLC thin layer chromatography TSA tryptic soy agar Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4 1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans ................................. 4 1.1.1. Bệnh học sâu răng............................................................................. 4 1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng.............................................................. 4 1.1.1.2. Mảng bám răng (dental plaque) ..................................................... 5 1.1.1.3. Cơ chế gây sâu răng ...................................................................... 6 1.1.1.4. Vi khuẩn Streptococcus mutans ...................................................... 7 1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam ........................... 9 1.1.3. Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng .................................................. 10 1.1.3.1. Sử dụng chất kháng khuẩn ........................................................... 10 1.1.3.2. Sử dụng chất thay thế đường ........................................................ 12 1.1.3.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy) ................................... 12 1.1.3.4. Vacxin .......................................................................................... 13 1.1.3.5. Kiể m soát sự hình thành biofilm.................................................. 13 1.2. Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng.................. 15 1.2.1. Bơm proton F-ATPase .................................................................... 16 1.2.2. Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid .............. 17 1.2.3. Sự sinh các chất kiềm ..................................................................... 18 1.2.3.1. Urease ......................................................................................... 18 1.2.3.2. Hệ thống arginin deiminase (ADS) .............................................. 19 1.3. Giới thiệu về cây măng cụt .................................................................. 20 1.3.1. Đặc điểm sinh học .......................................................................... 20 1.3.2. Các chất xathone trong măng cụt .................................................... 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
1.3.3. Sinh tổng hợp các chất xanthone ..................................................... 21 1.3.4. Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt ......... 23 1.3.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................. 23 1.3.4.2. Hoạt tính kháng nấm.................................................................... 23 1.3.4.3. Tác dụng chống oxi hóa ............................................................... 23 1.3.4.4. Tác dụng chống viêm (anti-inflamation) ...................................... 24 1.3.4.5. Hoạt tính chống ung thư .............................................................. 24 Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................... 25 2.1. Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy ....................................... 26 2.2. Nguyên liệu thực vật ............................................................................ 26 2.3. Hóa chất và thiết bị .............................................................................. 26 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 27 2.4.1. Các phương pháp nghiên cứu tế bào ............................................... 27 2.4.1.1. Chuẩn bị dịch tế bào .................................................................... 27 2.4.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop) .................................. 27 2.4.2. Các phương pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme .................................... 28 2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào thấm ................................................................... 28 2.4.2.2. Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS) ............... 28 2.4.2.3. Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase .......................................... 29 2.4.2.4. Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF) .................. 29 2.4.3. Các phương pháp nghiên cứu về biofilm......................................... 30 2.4.3.1. Tạo biofilm .................................................................................. 30 2.4.3.2. Xác đi ̣nh thành phầ n biofilm ........................................................ 31 2.4.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase .. ............................................................................................................... 31 2.5. Đánh giá sƣ̣ tích lũy của α-mangostin trên biofilm ............................ 32 2.6. Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S. mutans từ vỏ quả măng cụt... 32 2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ....................................................................................................... 32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
2.6.2. Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ... 33 2.7. Xử lý số liệu .......................................................................................... 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 34 3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt .. 34 3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt ..... 34 3.1.2. Tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt .................................... 36 3.1.2.1. Lựa chọn hê ̣ dung môi thích hợp để chạy cột sắ c ký silica gel ..... 36 3.1.2.2. Tinh sạch -mangostin trên cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexane: acetone (3:1) ..................................................................... 37 3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của α-mangostin lên S. mutans trên biofilm ......................................................................................................... 44 3.2.1. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans trên biofilm… .................................................................................................. 44 3.2.1.1. Ức chế sự giảm pH của môi trường ............................................. 44 3.2.1.2. -mangostin ức chế hoạt tính enzyme liên quan đến quá trình sinh và chống chịu acid F-ATPase và PTS ....................................................... 45 3.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế sự hiǹ h thành biofilm của vi khuẩ n S . mutans ...................................................................................................... 48 3.2.2.1. -mangostin ức chế sự sinhtổng hợp EPS ngoại bào ................... 48 3.2.2.2. -mangostin làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans............ 49 3.2.2.3. -mangostin ức chế hoạt tính các enzyme GTF liên quan đ ến sự hình thành biofilm của vi khuẩn S. mutans ............................................... 51 3.3. Khả năng giết vi khuẩn trên biofilm của α-mangostin ...................... 52 3.4. Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm ............................... 53 3.4.1. Bước đầ u đánh giá tác du ̣ng chống sâu răng của dung dịch nước súc miệng có chứa α-mangostin ...................................................................... 54 3.4.1.1. Khả năng ức chế sự sinh acid ...................................................... 54 3.4.1.2. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm (mảng bám răng)............ 55 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
PHỤ LỤC........................................................................................................ 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 1. Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt 21 Bảng 2.Độ sạch của chế phẩ m α-mangostin so với chấ t chuẩ n 40 Bảng 3. Độ sống sót của S. mutans trên biofilm được xử lý với -mangostin53 Bảng 4. Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm của vi khuẩ n S. mutans53 Bảng 5. Khả năng ức chế sự sinh a cid của S. mutans trên biofilm của các dung dịch nước súc miệng 55 Bảng 6. Ảnh hưởng của NSM chứa α-mangostin lên sự tić h lũy sinh khố i biofilm của vi khuẩ n S. mutans56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Trang Hình 1.1.Cấu trúc của răng 4 Hình 1.2. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng 6 Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans 8 Hình 1.4. Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) 20 Hình 1.5. Quá trình hình thành xanthone trong thực vật 22 Hình 2.1. Mô hình ta ̣o biofilm S. mutans trên bề mă ̣t điã hydroxyapatite 31 Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng 36 Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng 37 Hình 3.3. Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1) 38 Hình 3.4.A. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ v ỏ quả măng cụt với hệ dung môi Hexane: acetone (3:1 v/v) 38 Hình 3.4.B. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1 v/v) 38 Hình 3.5. Phổ HPLC của chất tinh sạch (A) so với chấ t chuẩ n (B) sau khi qua cột sắc ký silica gel đo trên máy LC-MSD-Trap-SL 39 Hình 3.6. Phổ Proton (A) và 13C (B) của chất -mangostin đo trên máy NMR Bruker, Avance 500 42 Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của -mangostin (C24H26O6) 43 Hình 3.8. Sơ đồ qui trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Hình 3.9. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutanstrên bioflm 45 Hình 3.10. Ảnh hưởng của -mangostin lên hoạt độ F-ATPase và PTS củaS. mutans trên biofilm 46 Hình 3.11. Ảnh hưởng của -mangostin lên sinh khố i biofilm của vi khuẩ n S. mutans 49 Hình 3.12. -mangostin 150 µM làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans 50 Hình 3.13. -mangostin 150µM ảnh hưởng đế n hoa ̣t độ GTF củaS. mutans 51 Hình 3.14. Chế phẩ m nước súc miê ̣ng chứa α-mangostin từ vỏ quả măng cu ̣t 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh MỞ ĐẦU Sâu răng là một trong những bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển. Tổ chức Y tế thế giới đã c ảnh báo về mức độ phổ bi ến của bê ̣nh này ch ỉ sau các bệnh tim mạch và ung thư [5]. Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm Mặt Việt Nam, thực tế có tới hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề về răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59], [60]. Đây là tỷ lệ thuộc hàng cao nhất thế giới. Ngay cả ở những nước phát triển như Hoa Kỳ, tỷ lệ sâu răng hiện nay vẫn còn tới 84% ở lứa tuổi thanh niên. Đi kèm với sâu răng là các bệnh về răng miệng. Trong những năm qua, chi phí cho việc chăm sóc, sửa chữa răng ta ̣i Viê ̣t Nam đã lên t ới nhiều tỷ đồng. Bệnh sâu răng là do vi khuẩn trên mảng bám răng gây ra. Những vi khuẩn trên mảng bám răng sử dụng carbonhydrate để lên men t ạo acid, trong đó chủ yế u là lactic . Môi trường acid sẽ phá v ỡ sự cân b ằng của hệ vi khuẩn đường miệng, tạo điều kiện thích hợp cho những vi khuẩn có khả năng chịu được pH thấp tiếp tục sinh acid. Khi lượng acid đủ lớn sẽ hòa tan các chất khoáng có trong men răng dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [38]. Sử dụng chất kháng khuẩn trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng là một trong những biện pháp phòng chống sâu răng có hiệu quả nhất hiện nay. Trong số các chất kháng khuẩn đã được sử dụng vào mục đích này, fluor là chất có tiềm năng hơn cả. Đây là chất có cơ chế tác động hai mặt. Một mặt chất này có tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng mạnh, mặt khác nó lại có vai trò giúp tái tạo lại men răng và vì vậy có tác dụng làm bền răng. Chính vì thế, fluor vẫn được sử dụng rộng rãi và cho đến nay chưa có một chất kháng khuẩn nào có thể thay thế được [43]. 1
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh Tuy nhiên, việc xuất hiện hiện tượng bệnh nhiễm fluor (fluorosis) do sử dụng lâu dài các sản phẩm vệ sinh răng miệng có chứa fluor đã khiến cho các nhà nghiên cứu và các công ty sản xuất các sản phẩm vệ sinh răng miệng phải tìm kiếm thêm những hợp chất mới để có thể thay thế fluor hay kết hợp với fluor, nhưng ở nồng độ thấp hơn mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hàng loạt các chất kháng khuẩn mới bao gồm những chất tổng hợp và tự nhiên như các acid yếu, dẫn xuất của các acid béo, triclosan, muối kim loại và cả những chất có nguồn gốc từ thực vật đã được nghiên cứu và thử nghiệm. Việc tìm kiếm và sử dụng những chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất có nguồn gốc thực vật (phytochemicals) đang rất được quan tâm. Hướng nghiên cứu này còn được gọi là cuộc cách mạng xanh trong y học (green medicine) [9], [19], [43]. Trong lĩnh vực bảo vệ răng miệng, đây cũng là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng do tin ́ h hiê ̣u quả và an toàn cao của các chấ t này . Những kết quả điều tra trước đây của chúng tôi cho thấy vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostanaL.) có chứa một số polyphenol thuộc nhóm chất xanthone, trong đó có α-mangostin, có khả năng ức chế sự sinh trưởng, sự sinh acid, sự hô hấp và diệt vi khuẩn gây sâu răng S. mutans mạnh. Ngoài ra, vỏ quả măng cu ̣t cũng là nguồ n nguyên liê ̣u khá phong phú và rẻ tiề n để tách chiế t các chấ t xanthone vì th ế, Garcinia mangostanaL. sẽ là đối tượng tiềm năng để tinh sạch, nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng vi khuẩn sâu răng mới (anticaries agents).Với mong muố n có mô ̣t nghiên cứu đầ y đủ về cơ chế tác du ̣ng kháng vi khuẩ n sâu răng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt và ứng dụng chúng trong viê ̣c sản xuấ t mô ̣t loa ̣i sản phẩ m vê ̣ sinh răng miê ̣ng mới , chúng tôi tiến hành thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩ n Streptococcu s mutans trên biofilm và đinh ̣ hướng ứng dụng ” nhằ m mu ̣c đić h đưa ra được qui trình tách chiết α- mangostin hiê ̣u quả , đơn giản đồ ng thời kh ẳng định được tác dụng kháng khuẩn 2
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh sâu răng của chấ t này trênđối tượng vi khuẩnS. mutans trên biofilmvà bước đầu tạo đươ ̣c chế phẩm nước súc miệng mới có tác du ̣ng phòng ch ống bệnh sâu răng. Đề tài khoá luận tập trung nghiên cứu các nội dung chính sau: i. Xây dựng qui trình tách chiế t α-mangostinđơn giản , đạt hiệu suất cao. ii. Nghiên cứu tác dụng của α-mangostinlên vi khuẩn S. mutans trên biofilm thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chấ t này lênquá trì nh sinh acid và tạo biofilm c ủa vi khuẩ n cũng như các enzyme liên quan đế n các quá trình này. iii. Nghiên cứu khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm iv. Tạo dung dịch nước súc miệng có chứa xanthone cùng một số chất hoạt động khác và đánh giá khả năng chống sâu răng của chế phẩm thu được trên mô hình biofilm nhân tạo cóso sánh tác dụng với chế phẩm nước súc miệng thương mại thông qua các chỉ tiêu: i) Ảnh hưởng của chúng lên quá trình sinh acid của vi khuẩn; ii) Khả năng hạn chế sự tạo mảng bám răng (dental plaque). 3
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans 1.1.1. Bệnh học sâu răng Bệnhsâu răng thực chất là sự tiêu hủy cấu trúc vôi hóa hữu cơ (tinh thể canxi) của men răng và ngà răng, tạo nên lỗ hổng trên bề mặt răng, do vi khuẩn gây ra. Ban đầu chỉ là sự tạo thành các lỗ trên bề mặt răng, giai đoạn này không gây ra triệu chứng, có thể kéo dài vài tháng thậm chí vài năm. Nếu không phát hiện và điều trị kịp thời thì “sâu răng” sẽ ăn sâu vào tủy, phá hủy tủy, gây chết tủy. Từ bệnh sâu răng và viên tủy có thể phát sinh ra các biến chứng như viên quanh cuống răng, rụng răng, viêm xương, viêm hạch v.v... nhiều trường hợp gây ra tử vong. Hình 1.1. Cấu trúc của răng 1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng Thương tổn sâu răng là kết quả của sự phân huỷ khoáng (mineral dissolution) ở tổ chức cứng của răng [4],[6]. Sâu răng xảy ra do nhiều nguyên nhân nhưng có 3 yếu tố chủ yếu cùng tác động để gây sâu răng: 4
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh  Vi khuẩn trong hốc miệng.  Chất bột, đường, dính vào răng bị lên men do vi khuẩn tạo thành acid.  Acid phá huỷ men răng, tạo điều kiện để hình thành lỗ sâu răng [2]. 1.1.1.2. Mảng bám răng (dental plaque) Mảng bám răng, được xem là mô ̣t biofilm sinh ho ̣c điể n hiǹ h , chính là một quần thể các vi sinh vật đa dạng về chủng loại tồn tại trên bề mặt răng [27],[43]. Đó là một lưới polymer sinh học chứa các vi sinh vật và nước bọt. Thuật ngữ biofilm mô tả quần thể các vi sinh vật bám vào bề mặt giá thể. Sử dụng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử trong đó có kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đã phát hiện tới hơn 500 loài vi khuẩn khác nhau có mặt trong mảng bám răng [22]. Nhìn chung biofilm có các tính chất sau: i. Bảo vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phòng thủ của chính vật chủ hay của vi sinh vật kẻ thù. ii. Chống lại sự mất nước. iii. Chống lại các chất kháng khuẩn thông qua việc tạo kiểu hình mới có tốc độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có khả năng bất hoạt hay trung hoà các chất kháng khuẩn. iv. Nồng độ các chất dinh dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi trường xung quanh. Chính vì những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm thường có khả năng chống chịu cao với các chất kháng khuẩn so với các tế bào sống tự do trong môi trường nuôi cấy (độ chống chịu có thể cao hơn tới khoảng 1000 lần) [57]. Sự hình thành biofilm bao gồm ba giai đoạn chính. Giai đoạn mở đầu: vi khuẩn bắt đầu bám vào bề mặt răng. Các mối tương tác đặc hiệu và không đặc hiệu giữa bề mặt răng và tế bào xuất hiện dẫn đến sự tạo liên kết và sự xâm chiếm dần dần. Giai đoạn bùng nổtăng trưởng: hình thành biofilm đồng thời với sự sinh tổng hợp polymer ngoại bào. Giai đoạn mất đi các tế bào trên mảng bám 5
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh răngvào nước bọt: thúc đẩy sự xâm nhập của các cơ thể vi sinh vật mới vào các vị trí vừa được giải phóng trên mảng bám răng [43]. A. Vi khuẩn được vận B.Các liên kết không thuận C.Sự đồng gắn kết của các cơ chuyển đến bề mặt của răng nghịch hình thành do mối thể vi khuẩn vào các tế bào đã và bám vào răng nhờ các lực tương tác phân tử hoá lập thể định cư trước. Sự bùng nổ tĩnh điện yếu. giữa tế bào vi khuẩn và các tăng trưởng để hình thành receptor trên bề mặt răng. biofilm đồng thời với sự sinh tổng hợp polymer ngoại bào. Hình 1.2. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng [43] 1.1.1.3. Cơ chế gây sâu răng Bệnh sâu răng được khởi đầu bằng sự hình thành mảng bám răng (dental plaque). Hydrat cacbon trong thức ăn được chuyển hoá thành glucose. Glucose sau đó được polymer hoá thành dextran bởi enzyme dextranase và glucosyltransferase. Dextran có tính dính bám nên tạo điều kiện để các vi khuẩn khác và các mảnh thức ăn bám thêm vào. Sự dính bám còn được gia tăng bởi những protein trên bề mặt vi khuẩn đang sinh sống tại đó và các polysaccharide do chúng chuyển hoá tạo ra như là các glucan [38],[43]. Việc hình thành nhiều lớp vi khuẩn cộng với thức ăn còn tạo ra môi trường cho cả các vi khuẩn kỵ khí sinh sống. Quá trình tiêu thụ đường thông qua con đường glycolysis với sự sinh acid bởi vi khuẩn làm cho pH trong mảng bám rănggiảm xuống thấp, thậm chí 6
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh dưới 4,0. Ở điều kiện pH thấp này, lớp men răng bị bào mòn và dẫn đến sâu răng. Các vi khuẩn tham gia chủ yếu vào quá trình này là các Streptococcus mutans. Ngoài ra còn có S. sobrinus và một số chủng lactobacillus[38]. Acid do chúng sinh ra còn tấn công cả phần lợi gây ra một số bệnh như viêm nướu răng (gingivitis), viêm quanh răng (periodontal diseases)... Vì vậy có thể nói, bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn gây ra và kiểm soát vi khuẩn trên mảng bám là biện pháp hữu hiệu để phòng chống sâu răng. 1.1.1.4.Vi khuẩn Streptococcus mutans Streptococcus là các vi khuẩn Gram (+), gồm một lượng lớn các loài, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Một số là các nhân tố gây ra những bệnh nguy hiểm như viêm phổi (pneumonia), sốt phát ban (scarlet fever), viêm màng não (meningitis)… Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN mã hoá cho ARN ribosome 16S, sơ đồ phả hệ của streptococci đã được xây dựng [43]. Trong sơ đồ đó, ngoài thành viên của hai nhóm Pyrogenic và Bovis cùng với Streptococcus pneumoniae (nhóm mitis),Streptococcus thermophilus (nhóm salivarius),Streptococcus suis,Streptococcus acidominimus, là các streptococci không sinh sống trong miệng động vật, còn lại đều là streptococci xoang miệng (oral streptococci). Ở xoang miệng của người chỉ thấy hai thành viên của nhóm mutans là Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus [43]. Streptococcus mutans lần đầu tiên được Clark mô tả năm 1924 sau khi phân lập được nó từ vùng răng bị tổn thương. Tuy vậy phải đến thập niên 60, khi các nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm, vi khuẩn này mới được chú ý đến nhiều. Cũng từ đó, rất nhiều dòng mang những đặc tính hoá sinh tương tự nhau nhưng hoàn toàn phân biệt bởi chỉ thị kháng nguyên đã được phân lập. Tổng cộng có 7 kiểu chỉ thị kháng nguyên đã được mô tả là a, b, c, d, e, và f[43]. Những nghiên cứu về sau trên protein, cấu trúc màng, ADN 7
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh tổng số cũng khẳng định có rất nhiều các biến thể ở những vi khuẩn vốn vẫn được coi là S. mutans. Dựa trên tất cả các nghiên cứu, S. mutans được chia nhỏ thành rất nhiều dưới loài riêng biệt. Từ đó, đã ra đời cụm từ "mutans streptococci" và tên gọi S. mutans không còn thực sự chính xác về mặt phân loại, tuy nhiên, nó vẫn còn được dùng như một thói quen để gọi tên dòng Streptococcus xoang miệng phổ biến nhất ở người [43]. Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans S. mutans được phát hiện ở tất cả các mảng bám răng và có tỉ lệ rất cao ở những vùng răng sâu. Các nghiên cứu khác nhau [38], [43] cũng đã chỉ ra đây chính là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến bệnh sâu răng. Sở dĩ như vậy là vì S. mutans có những đặc điểm đặc biệt, đó là: i) có khả năng chuyển hoá được nhiều loại hydrat cacbon khác nhau, ii) chuyển hoá đường bằng con đường lên men sinh ra rất nhiều acid lactic, iii) chống chịu được pH rất thấp của môi trường, iv) có khả năng sinh polysaccharide ngoại bào (EPS) mạnh.Do vậy, vi khuẩn này thường được sử dụng như là đối tượng điển hình cho các nghiên cứu về sâu răng. 8
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nguyễn Vũ Anh 1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam Từ những năm 1940 cho đến những năm 1960, tình hình sâu răng ở các nước công nghiệp hoá rất nghiêm trọng. Trung bình mỗi trẻ em 12 tuổi có tới 8- 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu. Chỉ số DMFT ( Decayed Mising, Filling Teeths, phản ánh số răng sâu, số răng mất do sâu hoặc số răng đã trám) ở tuổi 12 của Na Uy năm 1940 cao tới mức 12,0 [2]. Tới những năm 1980, chỉ số DMFT ở tuổi 12 của các nước công nghiệp đã giảm xuống đáng kể (nằm trong khoảng từ 2-4) và chỉ còn từ 1 - 2 vào năm 1993. Tuy vậy, tại thời điểm 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi trung niên (35 – 44 tuổi) tại các nước công nghiệp phát triển vẫn còn ở mức rất cao. Ví dụ như Canada, Nhật Bản, Úc và Bắc Âu là 13,9, Hoa Kỳ là 9,0 - 13,9. Theo những thông báo gần đây, tình trạng sâu răng tuổi thanh niên của Hoa Kỳ vẫn còn ở mức cao. Cụ thể là 84% thanh niên lứa tuổi 17 có răng sâu và trung bình mỗi người có 11 mặt răng bị phá huỷ do sâu. Người từ 40 tuổi trở lên có trung bình 30 mặt răng bị sâu và 41% người từ 65 tuổi trở lên không còn răng. Ở các nước đang phát triển như Thailand, Uganda, Zaire... chỉ số DMFT tuổi 12 cuối những năm 1960 chỉ từ 1,0 đến 3,0, nhưng lại tăng lên mức 3,0 - 5,0 và thậm chí cao hơn vào những năm 1970-1980. Nhìn chung, tình trạng sâu răng có xu hướng tăng lên ở các nước này. Tới 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi 12 lớn hơn 4,4 còn gặp ở nhiều nước như Ba Lan (châu Âu), Philipin (châu Á), và Trung Mỹ. Còn ở lứa tuổi trung niên, mức độ sâu răng cũng rất cao, trung bình mỗi người có trên 13,9 răng sâu [5]. Ở Việt Nam, các kết quả điều tra răng miệng năm 1991 của Võ Thế Quang cho thấy sâu răng ở Việt Nam tăng dần theo tuổi, cả về tỉ lệ sâu răng và chỉ số DMFT. Trần Văn Trường và cs [5] công bố tỉ lệ sâu răng ở Việt Nam sau điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 là 84,9% ở lứa tuổi 6 - 7; 56,6% ở lứa tuổi 12 và 67,6% ở lứa tuổi 15. Ở người lớn, tỉ lệ này là 9