Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THANH HUỆ

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ

QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA

XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans

GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - NĂM 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜ NG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THANH HUỆ

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ

QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA

XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans

GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Bích Thủy

THÁI NGUYÊN, NĂM 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành và sâu sắc nhất của mình tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ

gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong quá trình nghiên cứu và

hoàn thành luận văn.

Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trong Ban giám hiệu Trường Đại

học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường

Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ trong

suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học.

Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nghiêm Ngọc Minh, KS. Phạm

Thùy Linh và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên

cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng

dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng yêu thương và biết ơn sâu sắc đến gia đình,

đồng nghiệp - những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả trong

quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

Tác giả

Trần Thị Thanh Huệ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện

với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu

hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa

học của TS. Võ Thị Bích Thủy. Các tư liệu trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng,

các kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố ở bất kỳ

công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Huệ

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iii

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4

1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira ........................................................ 4

1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 6

1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis .................................................................. 6

1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 10

1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................. 12

1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis ................................................................ 12

1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 14

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 15

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15

2.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 16

2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 16

2.2.2. Thiết bị ................................................................................................... 17

2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 17

2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 18

2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 18

ii

2.4.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số ........................ 19

2.4.3. Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB .......................................................................................... 20

2.4.4. Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 20

2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA ....................................... 21

2.4.6. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 22

2.4.7. Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira .. 23

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24

3.1. Phân loại học phân tử 6 chủng Leptospira ............................................... 24

3.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số......................................................... 24

3.1.2. Trình tự các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB .......................................................................................... 26

3.1.3. Nhân gen với các cặp mồi của gen 16S rDNA ...................................... 27

3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16S rDNA .............................................. 28

3.1.5. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 29

3.1.6. Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn ............................................................................................................... 30

3.2. Xác định sự có mặt của các gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 ............................................................................................................. 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 41

1. Kết luận ....................................................................................................... 41

2. Đề nghị ........................................................................................................ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1

PHỤ LỤC

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Base pair bp

Nước khử ion dH2O

Deoxyribonucleic acid DNA

deoxyribonucleotide triphosphates dNTPs

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EDTA

Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris EMJH

Ethidium Bromide EtBr

Forward Primer : Mồi xuôi F-

Reverse Primer: Mồi ngược R-

Kilobase Kb

Leptospira L.

MLST Multilocus Sequence Typing

Protein ngoài màng (outer membrane protein) OMP

Polymerase Chain Reaction PCR

Ribonucleic acid RNA

Sodium Dodecyl Sulfate SDS

Tris-acetate-EDTA TAE

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

2.1 Danh mục các thiết bị đã sử dụng 17

2.2 Thành phần phản ứng nhân gen 21

Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm 3.1 25 và 280nm của 6 chủng Leptospira

3.2 Trình tự cặp mồi dùng để nhân các đoạn gen 27

Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ cơ sở dữ 3.3 30 liệu GenBank

v

DANH MỤC HÌNH

Tên hình Trang Hình

1 Leptospira interrogans 4

2 Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen 21

3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 6 chủng Leptospira 24

3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 28

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S 3.3 29 tinh sạch

3.4 Hình ảnh cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn 32

3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA 35

3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32 35

3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB 36

3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1 36

3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21 37

3.5.f Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41 37

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền

nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được

Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal Health-

OIE) xếp vị trí thứ 2 trong nhóm bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm

bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Nguyên nhân gây ra bởi một loại xoắn khuẩn

Leptospira interrogans.

Leptospira interrogans là loài gây bệnh thường kí sinh ở người và động

vật, bao gồm hơn 200 typ, được chia thành 23 nhóm (trong đó Leptospira

interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất). Xoắn khuẩn này có

khả năng gây bệnh trên động vật và có thể lây sang người. Bệnh do xoắn khuẩn

gây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể

gây sẩy thai ở thú nuôi. Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc,

da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc

mẫu mô động vật mắc bệnh. Bệnh phát triển ở khắp mọi nơi trên thế giới, gây

thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của

con người. Do tính đa dạng về triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn

đoán và tỷ lệ tử vong cao. Việc điều trị bệnh này rất khó khăn nên đòi hỏi những

biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng

bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết.

Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học đang tập trung

vào các loại vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ

vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe

cộng đồng và động vật. Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc được

thiết kế dựa trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc lực của các tác nhân gây

bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn của các loại vắc xin. Đây là một bước đột

2

phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói chung và

vắc xin Leptospirosis nói riêng.

Thực tế, nhiều protein ngoài màng của xoắn khuẩn Leptospira đã được

tìm thấy và sử dụng trong công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp. Quá trình tách

chiết, tái tổ hợp và tinh sạch các protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổ

hợp có giá trị tương tự như kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát

hiện xoắn khuẩn Leptospira. Kết quả thực nghiệm cho thấy vắc xin tái tổ hợp

phòng bệnh xoắn khuẩn có miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin thông

thường. Do đó, những nghiên cứu về các gen quyết định kháng nguyên tiềm

năng, công thức tối ưu, tá dược, liều lượng và liệu trình để phát triển các loại

vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn đạt hiệu quả cao, an toàn cho người và động

vật sử dụng là rất cần thiết. Việc cải thiện chất lượng vắc xin tái tổ hợp DNA

và vắc xin protein thực sự quan trọng đối với các ứng dụng thực tế. Hơn nữa,

việc nghiên cứu các protein màng sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền học,

có ý nghĩa thiết thực đối với các nhà khoa học và sản xuất liên quan đến vắc

xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira.

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định

một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn

Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam” nhằm tạo cơ

sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn

Leptospira interrogans tại Việt Nam.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Định danh được 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh

Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam.

- Xác định được một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá

trị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn

Leptospira interrogans tại Việt Nam.

3

3. Nội dung nghiên cứu

- Giải trình tự gen 16S rDNA và xây dựng sơ đồ phân loại hình cây của 6

chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc

xin vô hoạt ở Việt Nam.

- Xác định sự có mặt của một số gen mã hóa kháng nguyên trên 6 chủng

xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô

hoạt ở Việt Nam.

4

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira

Đặc điểm sinh vật học: Xoắn khuẩn Leptospira có hình thể rất mảnh,

đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm. Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấy

vi khuẩn di động mạnh. Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc

Fontana -Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy

mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu và 2 tiêm mao quanh bào chất để

Leptospira có thể chui sâu vào mô vật chủ. Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại

khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ (15 - 30 vòng), sát nhau như

một sợi chỉ lóng lánh bạc, di động nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như lò

xo. Xoắn khuẩn có khả năng xuyên qua da và niêm mạc, nhất là da bị xây xước.

Bắt màu Gram âm, ưa khí, mọc chậm ở các môi trường nuôi cấy, pH thích hợp

7,2-7,5; không thể phát triển trong điều kiện axít; nhiệt độ 28-300C (nhưng cũng

có thể nuôi cấy ở nhiệt độ tối đa là 390C và nhiệt độ tối thiểu là 13 - 150C)

(http://toquoc.vn/thu-y/benh-xoan-khuan-o-gia-suc-206301.html)

Hình 1. Xoắn khuẩn Leptospira interrogans

(http://benh.vn/truyen-Nhiem/Benh-do-xoan-khuan-

Leptospira/35/4081/12-11-2013.htm)

5

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu hoặc các môi trường thông

thường, nếu không bổ sung 5 - 10% huyết thanh thỏ, xoắn khuẩn không mọc

được. Ngoài ra, giống như các loài vi khuẩn khác, xoắn khuẩn cũng cần sắt để

phát triển. Hiện nay có nhiều loại môi trường bổ sung albumin huyết thanh bò

(bovine serum albumin - BSA) dùng để nuôi cấy, phân lập xoắn khuẩn, ví dụ

môi trường thạch bán cố thể (0,1 - 0,2 thạch) có BSA + Tween 80 (môi trường

EMJH - Ellinghausen McCullough - Johnson - Harris) hoặc môi trường có BSA

+ hỗn hợp Tween 80 và Tween 40. Để hạn chế tạp nhiễm cho thêm vào môi

trường các chất như 5 - fluorouracil, fosfomycin hoặc hỗn hợp gồm rifamycin,

polymycin, neomycin, 5 - fluorouracil, bacitracin và actidione; tuy nhiên các

loại môi trường này có thể gây khó khăn trong việc phân lập xoắn khuẩn nếu

số lượng xoắn khuẩn ít hoặc một số chủng xoắn khuẩn không mọc được trong

môi trường có nhiều kháng sinh. Có thể quan sát rõ các chủng xoắn khuẩn gây

bệnh mọc sau khi nuôi cấy 5 - 7 ngày; trong khi đó các loài sống hoại sinh có

thể mọc trong vòng 2 - 3 ngày. Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào thời gian mọc

khác nhau của các serovar Leptospira, ví dụ L. interrogans serovar Pomona và

L. interrogans serovar Grippotyphosa cho kết quả sau 7 - 10 ngày nuôi cấy

nhưng các chủng khác như L. interrogans serovar Hardjo và L. interrogans

serovar Bratislava có thể lâu hơn, lâu nhất sau 26 tuần.

Xoắn khuẩn Leptospira có sức đề kháng yếu nhưng còn cao hơn so với

các loại xoắn khuẩn khác, bị diệt ở nhiệt độ 500C/10 phút. Ánh sáng và các

thuốc khử trùng thông thường như phenol, nước javen dễ diệt được Leptospira.

Tuy vậy, xoắn khuẩn Leptospira chịu được lạnh và sống được lâu ở nước tới 3

tuần; sống dai dẳng trong bùn lầy, nước đọng với pH bazơ (pH=7,7), tốt nhất

là nước cống, rãnh, ruộng đồng, khe suối.

( http://vinafeed.com.vn/vn/benh-xoan-khuan-o-gia-suc.html)

6

Về phân loại thì xoắn khuẩn Leptospira thuộc giới Monera, ngành

Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira. Người ta phân ra thành các

loài gây bệnh, loài không gây bệnh và loài trung gian. Dựa vào cấu trúc kháng

nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 23 nhóm, bao gồm 230

typ huyết thanh; mỗi typ huyết thanh có các kháng nguyên đặc hiệu. Một typ

huyết thanh có thể gây nhiều bệnh cảnh khác nhau. Ngược lại, một bệnh cảnh

lâm sàng có thể do bất kỳ typ nào trong nhóm gây bệnh tạo nên. Các typ huyết

thanh có nhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo, gây khó khăn cho chẩn đoán.

Có ít nhất 5 typ huyết thanh có tầm quan trọng tại Mỹ và Canada, tất cả đều

gây bệnh ở chó (với các thuật ngữ Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona,

Grippotyphosa và Bratislava). Ở Việt Nam thường gặp 12 typ huyết thanh sau:

L. interrogans serovar Australis, L. interrogans serovar Canicola, L.

interrogans serovar Autumnalis, L. interrogans serovar Grippotyphosa, L.

interrogans serovar Bataviae, L. interrogans serovar Hebdomalis, L.

interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar Ponoma, L.

interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Saxkoebing 6, L. interrogans

serovar Poi, L. interrogans serovar Sejroe.Trong đó, 6 typ gây bệnh đang sử

dụng làm vắc xin vô hoạt ở Việt Nam là: L. interrogans serovar Pomona, L.

interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans

serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar Bataviae và L. interrogans

serovar Grippotyphosa.

(http://www.impe-qn.org.vn/impe-

qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1066&ID=2240)

1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis

Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, được phát hiện đầu

tiên vào năm 1850 trên chó tại Stuttgart (Đức). Khi đó, bệnh được gọi là bệnh

7

vàng da truyền nhiễm. Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tả dấu

hiệu lâm sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất hiện

đột ngột kèm theo lách to, vàng da và viêm thận. Đến đầu thế kỷ 20, những

thuật ngữ được sử dụng để mô tả bệnh Leptospirosis bao gồm sốt xuất huyết

Java, sốt bảy ngày, sốt mùa thu, bệnh Akiyama và sốt đầm lầy [9].

Năm 1915, Inada và cộng sự đã xác định Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae là tác nhân gây bệnh Weil ở Nhật Bản [32] và cũng được

Hiibener và Reiter xác nhận tại Đức [31]. Inada và cộng sự (1918) đã phát hiện

serovar L. interrogans serovar Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản [33].

Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm thấy hàng loạt các serovars khác nhau của

Leptospira như L. interrogans serovar Pyrogenes (1923), L. interrogans

serovar Bataviae (1926), L. interrogans serovar Grippotyphosa (1928) [12].

Đến nay, người ta đã phát hiện ra hơn 230 serovars khác nhau của Leptospira

interrogans ở khắp nơi trên thế giới [60].

Bệnh Leptospirosis lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các

màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật

mắc bệnh. Các triệu chứng thường gặp của bệnh Leptospirosis là cơ bắp chân

đau, sốt cao đột ngột, rét run, sốt liên tục hoặc kèm theo mạch nhanh, huyết áp

dao động, mệt nhiều, đau đầu, nhức mắt, buồn nôn và nôn, trường hợp nặng có

biểu hiện li bì, vật vã, mê sảng. Sau khi qua da và niêm mạc, xoắn khuẩn

Leptospira vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết, giai đoạn khởi phát này kéo dài

khoảng 5-7 ngày. Sau đó, xoắn khuẩn khu trú và gây bệnh ở gan, thận, màng

não, tim, phổi, thượng thận. Bệnh nhân có triệu chứng vàng da do độc tố xoắn

khuẩn hủy diệt hồng cầu và gây viêm tổ chức trung diệp ở gan. Gan to ra, xung

huyết, xuất huyết vi thể, các bè gan đảo lộn, có thể có ổ hoại tử và xuất huyết

rải rác (có thể nhầm lẫn áp xe gan). Xoắn khuẩn cũng gây tổn thương ống thận,

dẫn đến thiểu niệu và vô niệu, tăng urê và creatinin máu - nguyên nhân chính

làm bệnh nhân tử vong. Thận bệnh nhân to ra, đôi khi có xuất huyết, các tế bào

8

phình lên và hoại tử, gây bít tắc, khe thận bị phù và xâm nhiễm tế bào đơn nhân

(dễ bị chẩn đoán nhầm với viêm gan virus, sốt xuất huyết dengue hoặc nhiễm

khuẩn huyết). Leptospira trong giai đoạn hoại huyết có thể đến cơ quan sinh

dục gây rối loạn sinh sản.Về mức độ nguy hiểm của nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira, tuy ít ảnh hưởng trực tiếp đến tính mạng của người bệnh, song gây

ra các tổn thương ở nhiều cơ quan, trong đó đáng chú ý đến triệu chứng hoại tử

cơ, hoại tử ống thận cấp có thể gây suy thận cấp, tổn thương các mô, gan, viêm

và xuất huyết khu trú ở tim, phổi; gây tổn thương (không nguy hiểm lắm) ở não

và màng não. Đặc biệt trên cơ địa phụ nữ mang thai thì khi nhiễm xoắn khuẩn

Leptospira có thể gây ra sẩy thai [4].

Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có ở mọi nơi

trên thế giới, nhiều nhất ở Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kể

cho ngành chăn nuôi và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt

là các nước vùng nhiệt đới [8], [9], [62].

Một số gia súc nhiễm Leptospira nhưng không thể hiện triệu chứng lâm

sàng và đây là nguồn truyền lây mầm bệnh. Một số loài gặm nhấm như chuột

là loài vật trung gian mang trùng nguy hiểm nhất [40]. Mặc dù, các loài chuột

là vật chủ chính quan trọng nhưng cũng có nhiều loại động vật có vú khác bao

gồm chó, hươu, nai, thỏ, nhím, bò, cừu, gấu trúc, thú có túi, chồn và một số

động vật có vú ở biển có thể mang và truyền bệnh như là vật chủ phụ. Ở châu

Phi, mèo Banded Mongooses đã được xác định là ổ chứa mang mầm bệnh,

ngoài ra còn có một số vật chủ hoang dã khác ở châu Phi cũng có khả năng

mang mầm bệnh. Chó có thể liếm nước tiểu của động vật bị nhiễm bệnh thải ra

cỏ hoặc đất hoặc uống nước bị nhiễm bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng

loài “chó nhà” nhiễm Leptospirosis do thói quen liếm nước tiểu của chuột bị

nhiễm bệnh đi vào nhà. Tuy không lây lan mạnh và làm chết nhiều chó như

dịch Carre, Parvo, nhưng nếu mắc nhiễm sẽ bị viêm gan, báng bụng, vàng da,

9

rối loạn toàn thân và tử vong. Nguy cơ lây bệnh Leptospirosis cho người rất

cao qua tiếp xúc với nước tiểu từ những con vật bị bệnh [61].

Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis hàng năm là khác nhau từ 0,02/100.000 dân

ở các quốc gia vùng khí hậu ôn đới và 100/100.000 dân ở vùng khí hậu nhiệt

đới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm trên thế giới có từ

7 đến 10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da. Do tính đa dạng của các triệu

chứng, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một

số vùng có thể lên đến 20%-25% [44]. Ở các nước đang phát triển, những người

mắc bệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo ở các thành phố. Ở các nước

phát triển, những người thường phải làm việc ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm

thấp thường có nguy cơ nhiễm bệnh [7]. Người mắc bệnh ngẫu nhiên chứ không

phải là nguồn bệnh. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng, có sự lây truyền từ

người sang người do thải xoắn khuẩn qua đường nước tiểu của người bệnh hoặc

lây qua đường tiêu hóa: qua thức ăn, nước uống không đun sôi, nấu chín, bị ô

nhiễm. Cá biệt, bệnh có thể lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nước

nhiễm khuẩn ở dạng khí dung.

Xoắn khuẩn Leptospira rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm,

như động vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia

đình, đồng thời xoắn khuẩn Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường

tự nhiên. Hơn nữa, bệnh này càng khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp

phát triển (do có đàn gia súc đông) và tình trạng vệ sinh môi trường kém (tạo

điều kiện mầm bệnh phát triển) [65]. Bệnh xoắn khuẩn có thể lây sang người

qua tiếp xúc với thú bệnh khi da, niêm mạc bị trầy xướt hay da nguyên lành

nhưng bị ngâm nước lâu làm giãn nở các lỗ chân lông, xoắn khuẩn có thể chui

qua da và gây bệnh. Sự truyền lây còn xảy ra do sự vấy nhiễm của động vật

nhiễm bệnh với các nguồn nước, thực phẩm hay ngay cả chỗ nằm ô nhiễm, chó

tiếp xúc với môi trường bị vấy nhiễm này cũng lây bệnh. Nước tù đọng hay

chảy chậm là môi trường sống thích hợp cho xoắn khuẩn Leptospira tồn tại lâu.

10

Có thể chẩn đoán bệnh bằng cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn hoặc

tìm DNA của vi khuẩn trong máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mang

mầm bệnh [35]. Chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp phổ biến được sử

dụng để chẩn đoán bệnh do xoắn khuẩn gây ra. Các phương pháp chẩn đoán

khác như sử dụng kính hiển vi tụ quang nền đen, phản ứng miễn dịch huỳnh

quang, PCR, phương pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi thể cũng được sử

dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR dùng để phát hiện chuỗi DNA của Leptospira

chỉ thực hiện ở các trung tâm lớn. Có nhiều cặp mồi (primer) khác nhau đã

được thiết lập, trong đó một số đặc hiệu ở mức giống Leptospira nhưng một số

loại đặc hiệu ở mức serovar.

1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis

Các nỗ lực phòng bệnh bao gồm trang bị bảo vệ để không tiếp xúc với

động vật có nguy cơ nhiễm bệnh, vệ sinh sạch sẽ sau khi tiếp xúc và tiêu diệt

các loài gặm nhấm ở những khu dân cư [52]. Việc sử dụng kháng sinh để ngừa

bệnh không đem lại hiệu quả rõ ràng [7]. Một số vắc xin dùng cho động vật để

phòng vài loại xoắn khuẩn vàng da có thể làm giảm nguy cơ lây lan sang người.

Từ lâu, các nhà khoa học đã mong muốn tìm được một loại vắc xin hiệu quả để

ngăn ngừa bệnh do xoắn khuẩn Leptospira thông qua tiêm chủng cho người và

động vật có nguy cơ lây nhiễm cao. Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu với chi phí

hàng triệu đô la, các nhà khoa học đã tìm được một số loại vắc xin phòng bệnh

Leptospirosis. Tuy nhiên cho đến nay, các loại vắc xin để phòng bệnh này vẫn

còn hạn chế và chưa đạt hiệu quả cao trong ứng dụng lâm sàng [64].

Một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis như: vắc xin sống [41], [15],

vắc xin lipopolysaccharide (LPS) [22], [54], vắc xin lipoprotein [16] [37], [58],

vắc xin protein màng ngoài (OMPs), [25], [46] và vắc xin các yếu tố độc lực

tiềm năng [55], [68]. Hiện nay, ở một số nước như Nhật Bản, Cuba và Trung

Quốc đã có vắc xin phòng chống bệnh Leptospirosis cho người tuy nhiên chưa

11

được cấp phép sử dụng rộng rãi do cần phải tiếp tục nghiên cứu về độ an toàn

của vắc xin này. Vắc xin áp dụng ở động vật chỉ có một vài chủng.

Vắc xin protein tái tổ hợp là loại vắc xin có tiềm năng lớn trong phòng

bệnh do xoắn khuẩn Leptospira. Vắc xin protein tái tổ hợp được xây dựng với

phương pháp công nghệ sinh học hiện đại [49], [58], [59] nhưng trong đó vắc

xin OMPs tái tổ hợp, vắc xin lipoprotein và vắc xin các yếu tố độc lực tái tổ

hợp được quan tâm hơn cả. Những đặc trưng bảo vệ của vắc xin tái tổ hợp đã

được kiểm nghiệm, bao gồm: OmpL1, LipL41 [18], [29], hemolysis-associated

protein 1 (Hap1) [14], và protein miễn dịch (Lig) [48]. Năm 1993, lần đầu tiên

OmpL1 được báo cáo [27]. Sáu năm sau đó, nghiên cứu trên chuột mô hình đã

chứng minh tác dụng gây miễn dịch của 2 loại vắc xin OmpL1 và LipL41 [29].

Vào năm 2002, LigA được mô tả như một globulin miễn dịch giống protein

[48], sau đó các phản ứng miễn dịch của protein LigA, LigB cũng được xác

nhận [37], [49], [59]. Hơn nữa, gen Lig đã được chứng minh là hữu ích trong

việc phát hiện bệnh xoắn khuẩn [47]. Một số protein ngoài màng khác như

LAg42, Loa22 [36], Lk73.5 [10] cũng được công nhận là nguyên liệu trong

việc tạo vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira, tuy nhiên chúng vẫn

chưa được tiến hành thử nghiệm trong các mô hình động vật để phát triển thành

vắc xin.

Lipoprotein là protein quan trọng trong Leptospira, những protein có

nhiều ở màng ngoài và chúng được gắn thông qua các axit béo. Mặc dù khó

khăn trong việc sản xuất lipoprotein do hệ thống biểu hiện dị hợp, nhưng một

số loại lipoprotein như LipL41 [26], LipL32 [28], LipL45 [43] và LipL21 [17]

đã được khẳng định là nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc tạo ra vắc xin

lipoprotein tái tổ hợp. Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) cũng được dự đoán là

một trong những gen tiềm năng, do khả năng sản xuất ra các yếu tố hoại tử khối

u, interleukin-10 và CD69 [21]. Loại GPLs này xuất hiện trong cả chủng gây

bệnh L. interrogans hoặc chủng không gây bệnh L. biflexa. Trong một vài công

12

trình nghiên cứu trước đây đã có báo cáo về yếu tố độc lực của Leptospira, bao

gồm FlaA, FlaB [52], Hsp58 [51], SphH [38], [39] và ChpK [53] đều có thể

được coi là nguồn nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh Leptospirosis.

Gen mã hóa yếu tố độc lực FlaB (gen flab) có thể được khuếch đại từ hệ gen

DNA của nhiều chủng. Tuy nhiên, một số kết quả nghiên cứu đã chỉ ra hàng

loạt các protein ngoài màng (LAg42, Loa22, Lk73.5), lipoprotein (LipL32,

LipL45, LipL21 và GLP) và các yếu tố độc lực mới được phát hiện (Hsp58,

flaA, Flab, SphH và ChpK) có thể giúp chúng ta tìm thấy vắc xin phù hợp hơn

[44], [50], [67]. Bởi vì hệ gen của L. interrogans chủng Icterohaemorrhagiae

Lai [55] và L. interrogans chủng Copenhageni [45] có biểu hiện dị hợp của

OMPs, điều này mở ra một tiềm năng mới cho việc phát triển vắc xin [70].

Do vậy, vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn nói riêng cũng như các loại vắc xin

khác nói chung đã, đang và sẽ được nghiên cứu xa hơn để tạo một bức tường

bảo vệ con người và động vật khỏi những tác nhân gây bệnh.

1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước

1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis

Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu tiên trên

người năm 1931. Tiếp đó, dịch bệnh bùng phát ở Lai Châu (1964) gây thiệt hại

nhiều gia súc và nhiễm cho cả người [3]. Bệnh Leptospirosis trên gia súc được

nghiên cứu từ rất sớm (1968-1978), đã có nhiều tác giả nghiên cứu về bệnh,

như Đào Trọng Đạt (1966), Lê Đại (1972), Phạm Quân (1976), Vũ Đình Hưng

(1979), Nguyễn Thị Nhân (1999) và gần đây là Vũ Đạt, Lê Huỳnh Thanh

Phương (2001). Các tác giả đã tập trung nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira

ở một số loài gia súc, trong đó có bệnh xảy ra ở lợn. Theo một số tác giả, các

loại gia súc và người chăn nuôi nhiễm xoắn khuẩn Leptospira với tỷ lệ 21 -

56%. Các serovar Leptospira interrogans thường gặp ở gia súc là

Grippotyphosa, Australis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Hebdomadis [5].

13

Nguồn lây là các súc vật mang xoắn khuẩn Leptospira và nước tiểu của

chúng. Xoắn khuẩn Leptospira bài tiết từ cơ thể gia súc ra bên ngoài cùng với

nước tiểu làm ô nhiễm môi trường xung quanh, trong đó có nguồn nước. Trong

nước, xoắn khuẩn Leptospira không chỉ tồn tại mà còn sinh sản và giữ nguyên

đặc tính gây bệnh. Ổ chứa mầm bệnh thường là các loài gặm nhấm (chuột),

chúng luôn đào thải xoắn khuẩn Leptospira hoặc gia súc (trâu, bò, ngựa…). Ở

nước ta, bệnh hay gặp ở những người làm việc trong rừng và gần rừng như bộ

đội (biên giới), công nhân địa chất, lâm nghiệp, hầm mỏ, công nhân chăn nuôi

và nông dân qua da bị xây xát, qua vết thương hoặc qua niêm mạc do tiếp xúc

trực tiếp hay gián tiếp với nguồn lây.

Bệnh xoắn khuẩn vàng da cũng lưu hành rộng rãi ở nông thôn, thành thị,

miền núi, đồng bằng, ven biển... Các vùng sinh thái khác nhau có tỷ lệ nhiễm

Leptospira khác nhau và dao động từ 19,45% đến 31,31%. Khoảng 20 năm

trước đây, nhiều nơi có dịch xoắn khuẩn vàng da ở súc vật nuôi, nhất là lợn

trong các trại chăn nuôi và lây sang người. Trong những năm gần đây, nguy cơ

bùng phát dịch bệnh nhiễm xoắn khuẩn Leptospira có chiều hướng ngày càng

gia tăng do tình hình vệ sinh môi trường thấp kém, úng ngập thường xuyên,

kéo dài và hệ thống kiểm soát bệnh gia súc còn yếu kém. Bệnh gây thiệt hại

nặng về kinh tế, đặc biệt ở những đàn gia súc sinh sản. Trên các đàn sinh sản,

bệnh là nguyên nhân gây giảm khả năng sinh sản, sẩy thai; lợn con sau khi sinh

ra chậm lớn, còi cọc.

Ở người, theo bác sĩ Lê Công Tảo, Phó trưởng khoa Sốt rét, Ký sinh trùng

động vật (Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội) cho biết, Leptospirosis vốn được

coi là bệnh ở các vùng núi, đầm lầy, nông thôn, nhưng hiện nay đã tràn xuống

vùng địa hình dân cư đông đúc, nghèo nàn tại các thành phố lớn [4]. Mỗi năm

ở Hà Nội có 10 - 15 người mắc. Từ tháng 4/1999 đến 12/2002, tại thành phố có

28 ổ dịch trên người. Tại các khu dân cư, bến xe, bến tàu (nơi cư ngụ lý tưởng

của chuột) nguy cơ bùng phát dịch nhiễm xoắn khuẩn Leptospira là rất lớn. Do

14

vậy, dịch bệnh xoắn khuẩn Leptospira vẫn là một vấn đề sức khỏe cấp thiết cần

quan tâm tại Việt Nam [2].

Hiện nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ học cao của bệnh xoắn

khuẩn [6]. Nghiên cứu dịch tễ học mô tả sử dụng số liệu hồi cứu cho thấy, tổng

số ca mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369

ca và không có trường hợp tử vong. Người mắc bệnh mang tính chất nghề nghiệp

rõ: công nhân làm vệ sinh cống rãnh, công nhân chăn nuôi, cán bộ địa chất, lâm

nghiệp hay mắc bệnh. Mặc dù bệnh này luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm cao cho

người và động vật, nhưng lâu nay ít được chú ý cả về mặt pháp luật cũng như về

nhận thức của nhân dân. Việc mua bán gia súc bừa bãi không được kiểm tra chặt

chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngày một tăng, đồng

thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo [1].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis

Như đã nói ở trên, việc điều trị bệnh này là rất khó khăn chính vì vậy cần

có những biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao. Do đó, sản xuất vắc xin

phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết. Tại Việt Nam

hiện có một số cơ sở đã sản xuất các loại vắc xin Leptospirosis, như vắc xin

Leptospira vô hoạt của Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương (Vetvaco).

Kháng nguyên là vi khuẩn Leptospira được vô hoạt bằng methiolat bao gồm 6

chủng: L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar Canicola, L.

interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L.

interrogans serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa. Chúng

tương đồng về mặt kháng nguyên với đa số các chủng gây bệnh Leptospirosis

đang lưu hành tại Việt Nam. Với 2 lần tiêm cho gia súc, nhưng thời gian tạo

miễn dịch bảo hộ chỉ trong vòng 6 tháng. Hoặc vắc xin vô hoạt

PALATO.VACL của Công ty cổ phần Nanovet, có thể phòng 3 bệnh: khô thai,

sẩy thai truyền nhiễm và Leptospirosis. Tương lai của việc phát triển vắc xin

15

phòng bệnh Leptospirosis là tìm ra một loại có khả năng phòng bệnh cho một

số lượng lớn người khỏe mạnh và động vật để làm tăng khả năng kháng bệnh,

như vậy, vắc xin phải có độ an toàn cao [19], [24]. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt

Nam chỉ đang lưu hành 2 loại vắc xin Leptospirosis vô hoạt và nhược độc phòng

bệnh cho gia súc. Trong đó, các vắc xin nhược độc được thực hiện bằng cách

tiêm truyền các xoắn khuẩn đã được giảm độc lực vào vật chủ với hi vọng giúp

vật chủ tạo kháng thể chống lại bệnh xoắn khuẩn nhưng không kích thích sự

phát triển của các loại xoắn khuẩn này đủ để gây bệnh cho cơ thể đó. Vắc xin

vô hoạt Leptospirosis đã được nghiên cứu rộng rãi trong thập kỷ 70-80 của thế

kỷ 20. Những năm gần đây, việc sử dụng kết hợp cả vắc xin nhược độc và vô

hoạt trong phòng bệnh cho hiệu quả phòng bệnh cao hơn nhưng để đảm bảo an

toàn cho vật nuôi cũng như cho con người, chúng ta cần đầu tư nhiều hơn nữa

cho lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất vắc xin Leptospirosis.

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

6 chủng xoắn khuẩn đang được sử dụng chế vắc xin vô hoạt phòng bệnh

xoắn khuẩn Leptospirosis tại Việt Nam được nuôi cấy trong môi trường EMJH

16

tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, bao gồm: L.

interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans

serovar Mitis, L. interrogans serovar Icteroheamorrhagiae, L. interrogans

serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa.

2.2. Hóa chất, thiết bị

2.2.1. Hóa chất

- Hóa chất tách DNA tổng số: gồm có đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8,NaCl

5M, EDTA 0,5M, CTAB 4% H2O), đệm rửa (Tris HCl 1M , EDTA 0,5M,

pH=8, H2O), dung dịch phenol-chloroform-isoamyl 25:24:1, dung dịch

Isopropanol,...

- Hóa chất điện di: Đệm TAE 50X: 57,1 ml CH3COOH, 100ml 0,5M

EDTA, 242g TRIS - BASE, đệm TAE 1X, agarose, loading dye, ethidium

bromide (EtBr).

- Các hóa chất phục vụ nhân gen: Taq polymerase (Fermentas). Cặp mồi

đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được công bố trên ngân hàng

gen quốc tế.

- Bộ kit dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM PCR Purification

Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA),…và một số hóa chất khác.

17

2.2.2. Thiết bị

Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị đã sử dụng

STT Thiết bị Nguồn gốc, xuất xứ

Máy PCR Applied Biosystem - Mỹ 1

Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh 2

Bể ổn nhiệt Memmert - Đức 3

Máy ly tâm Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ 4

Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ 5

Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức 6

Máy đo quang phổ định 8 NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ lượng

Tủ lạnh -20oC Sanyo - Nhật Bản 10

Tủ lạnh -4oC Sanyo - Nhật Bản 11

13 Máy lắc ấm Hàn Quốc

14 Máy giải trình tự AB 3500 Applied Biosystems, Mỹ

15 Lò vi sóng Sanyo - Nhật Bản

Ngoài ra còn sử dụng các trang thiết bị sinh học phân tử cần thiết khác

của Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.3. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu

hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

18

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Lấy mẫu: 6 chủng xoắn khuẩn (L. interrogans serovar Pomona, L.

interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans

serovar Icteroheamorrhagiae, L. interrogans serovar Bataviae và L. interrogans

serovar Grippotyphosa) sẽ được nuôi cấy trong các môi trường đặc hiệu (môi

trường Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris (EMJH) của hãng Difco

(Detroit, USA) có bổ sung 8% huyết thanh thỏ và 0.1% agarose trong một ống

5ml) ở 28oC trong điều kiện hiếu khí, sau bảy ngày nuôi cấy sẽ được chuyển về

Viện Nghiên cứu hệ gen để tiến hành tách chiết DNA cho các nghiên cứu tiếp

theo.

Tách chiết DNA tổng số từ 6 chủng xoắn khuẩn sử dụng phương pháp

phenol- chloroform theo như hướng dẫn [57]. Cụ thể:

- Xoắn khuẩn sau khi được nuôi cấy, đạt yêu cầu về số lượng, cho dung

dịch nuôi vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.

Loại bỏ dung dịch nổi ở trên, thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Chuẩn bị dung dịch đệm gồm: 10% SDS, Tris (100 mM), EDTA (50

mM), 3 µl của proteinase - K 20 µg/ml, 5 µl của RNase A 20 µg/ml, cho vào

ống eppendorf 1,5ml có chứa cặn xoắn khuẩn, ủ ở 37oC trong 1 giờ.

- Thêm vào một lượng tương đương dung dịch phenol-chloroform-

isoamyl , trộn đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.

- Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới. Kết tủa

DNA với một lượng tương đương isopropanol, ủ ở - 20oC/30 phút. Sau đó ly

tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm.

- Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ

19

qua lại, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10phút ở 4oC. Thu kết tủa và làm khô ở

nhiệt độ phòng.

- Hòa tan hoàn toàn DNA kết tủa trong dung dịch TE (10mM Tris HCl,

pH = 8,0 và 1 mM EDTA).

- Bảo quản sản phẩm trong tủ ở nhiệt độ -20oC để phục vụ cho các nghiên

cứu tiếp theo.

2.4.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

2.4.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ

DNA được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm.

Nồng độ DNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng

Độ sạch DNA = A260/A280

Trong đó: A260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm

A280 là chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm.

Nếu tỷ lệ A260/A280 = 1,8 - 2,0 thì sản phẩm DNA tổng số được tách chiết là

tinh sạch.

2.4.2.2. Phương pháp điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose:

1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di,

ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn đều1l dung dịch 6X loading buffer

với 5 l mẫu, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện

thế 110V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung

dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel và chụp

ảnh.

Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA

20

trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

2.4.3. Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,

LipL21, LigA, LigB

Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,

LipL21, LigA, LigB dựa trên các thông tin về trình tự của các gen được công bố

trên ngân hàng gen quốc tế (Genbank)/NCBI và chương trình

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/.

2.4.4. Kỹ thuật PCR

Sau khi tách chiết được DNA tổng số, thực hiện khuếch đại trình tự gen

16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA, LigB bằng phản

ứng PCR.

Thành phần phản ứng PCR nhân gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,

LipL21, LigA, LigB của 6 chủng xoắn khuẩn được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nhân gen

STT Thành phần Thể tích (μl)

1 10X Buffer 2 µl

2 dNTPsmix (2,5mM) 2 µl

3 Mồi -F 1 µl

4 Mồi -R 1 µl

5 Taq (5u/ µl) 0,2 µl

6 12,8 µl H2O

19 µl Tổng

Thực hiện phản ứng PCR nhân gen với chu trình nhiệt như sau:

21

Hình 2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân gen

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose

1% với sự có mặt của marker chuẩn, nhuộm bản gel trong EtBr và chụp ảnh

dưới ánh sáng cực tím.

2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA

Trong sản phẩm PCR, ngoài đoạn gen đặc hiệu đã được nhân lên còn lẫn

tạp với 1 lượng primer, dNTP dư và enzyme DNA polymerase. Những chất lẫn

tạp này có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng giải trình tự Sanger (sử dụng

ddNTP). Vì vậy, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S

rDNA theo hướng dẫn của bộ kít GeneJETTM PCR Purification Kit (Thermo

Fisher Scientific Inc., USA).

Quy trình làm sạch sản phẩm PCR như sau:

- Bổ sung đệm hòa tan (Binding Buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VBB = 1 : 1 (quy

ước 100μl Binding Buffer tương đương 100μl mẫu), trộn đều và quan sát màu

của dung dịch. Màu vàng cho thấy độ pH tối ưu để hòa tan DNA. Nếu dung

dịch có màu cam hoặc tím, bổ sung thêm 10μl Natri axetat 3M, pH 5,2 và trộn

đều sẽ chuyển sang màu vàng.

- Thêm vào thể tích isopropanol 100% với tỷ lệ 1: 2 (Ví dụ, 100 μl

isopropanol nên được thêm vào 100 μl hỗn hợp PCR kết hợp với 100 μl Binding

Buffer). Trộn kỹ.

22

- Chuyển 800 μL dung dịch từ bước 1 (hoặc bước 2) tới cột tinh sạch

GeneJET, ly tâm 30-60 giây. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Bổ sung 700μl đệm rửa WB (Washing Buffer) lên cột. Ly tâm 30-60

giây. Loại bỏ dịch chảy qua cột và đặt cột vào ống thu.

- Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.

- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 50μl nước cất đã khử

trùng lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút.

- Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới.

Bảo quản ở -20oC.

- Điện di kiểm tra sản phẩm sau tinh sạch.

2.4.6. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn

Giải trình tự với máy giải trình tự AB 3500 (Applied Biosystems, USA)

tại Viện Nghiên cứu hệ gen. Quy trình được tóm tắt như sau:

Các sản phẩm PCR được giải trình tự theo phương pháp chuỗi

dideoxynucleotide. Các đoạn DNA được khuếch đại trong 10 μl thể tích phản

ứng (bao gồm: 2 μl BigDye Terminator v3.1, 1μl dung dịch BigDye

Sequencing, 1 μl primer (10 μM), 2 μl DNA và 4 μl nước). Chu trình khuếch

đại như sau: biến tính ở 96oC trong 1 phút, sau đó là 96oC trong 10 giây ở 25

chu kỳ, ủ ở 50oC trong 5 giây, kéo dài ở 60oC trong 4 phút. Tiếp theo, các mẫu

được tinh chế và ủ với 20 μl Hi-Di, và bị làm biến tính ở 98°C trong 2 phút.

Cuối cùng, các mẫu này được chuyển lên màng và giải trình tự bằng cách sử

dụng POP6 và một mao mạch 36 cm. Các điều kiện chạy giải trình tự như sau:

22 giây cho thời gian bơm mẫu, 1 kV cho điện áp bơm, 15 kV cho điện áp chạy,

10 μAmps cho dòng chảy và 55oC cho nhiệt độ chạy.

23

2.4.7. Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira

- Các trình tự tham chiếu của gen 16S rDNA dùng trong nghiên cứu này

được lấy từ cơ sở dữ liệu NCBI với các công cụ tin sinh BLAST và PSI-

BLAST.

- Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại thông qua trình tự của

các gen 16S rDNA với các thuật toán ClustalW thực hiện trong MEGA 4.0. Xác

suất biến đổi và vùng bảo tồn giữa các trình tự liên quan được thực hiện bởi

MEGA 4.0 và BioEdit 7.0.4.1.

24

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân loại học phân tử 6 chủng Leptospira

3.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số

DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân tử. Chất

lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các

thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi tiến hành tách chiết

DNA của 6 chủng xoắn khuẩn sử dụng phương pháp phenol- chloroform theo

như hướng dẫn [57].

Trong quy trình tách chiết, chúng tôi đã sử dụng tác nhân lý, hóa học vì

thế ít hay nhiều ảnh hưởng tới độ nguyên vẹn của axit nucleic. Bởi vậy chúng

tôi phải kiểm tra mức độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di trong gel agarose

1%, sau đó nhuộm EtBr và soi qua tia cực tím. Kết quả thể hiện trong hình 3.1:

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 6 chủng Leptospira.

Kí hiệu được sử dụng như sau: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae;

Ca: Leptospira interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans

serovar Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar

25

Grippotyphosa; Po: Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira

interrogans serovar Mitis; M: Marker DNA 1 Kb (10.000 bp; Thermo).

Kết quả cho thấy mẫu DNA thu được có băng sáng rõ, gọn và không bị

đứt gãy, kích thước lớn hơn 10.000 bp, đạt tiêu chuẩn cho các thí nghiệm sinh

học phân tử.

Tiếp theo chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng của

DNA tổng số bằng phương pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu được thể

hiện ở bảng 3.1:

Bảng 3.1. Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm và 280nm

của 6 chủng Leptospira

Tỷ số Hàm lượng DNA

Tên chủng

A260/A280 (ng/µl)

L. interrogans serovar 1,95 559,3 Canicola

L. interrogans serovar 1,89 473,4 Bataviae

L. interrogans serovar 1,81 272 Icterohaemorrhagiae

L. interrogans serovar 1,81 230,5 Mitis

L. interrogans serovar 1.86 561,1 Grippotyphosa

L. interrogans serovar 1,93 152,5 Pomona

26

Bảng 3.1 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0

chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein, có

thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.

3.1.2. Trình tự các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,

LipL21, LigA, LigB

Mu ̣c đích của việc thiết kế mồi là có được mô ̣t sự cân bằng giữa hai kết quả: sự đặc hiệu và hiê ̣u suất khuếch đa ̣i. Sự đă ̣c hiệu dựa trên cơ sở xuất hiê ̣n bao nhiêu lần hiê ̣n tượng gắn mồi nhầm (mis-priming) trên tổ ng số lần gắn

primer (priming) tức là quá trình lai giữa mồi và khuôn mẫu tại vi ̣ trí đích củ a nó . Hiê ̣u suất là sự tiếp câ ̣n với lý thuyết về kết quả sản phẩm, trong mỗi chu kỳ PCR, mô ̣t că ̣p mồi có thể khuếch đa ̣i ra mô ̣t sản phẩm. Vớ i mô ̣t trình tự DNA cho trước, mồi có thể được tính toán và phân tích trên máy tính để có mô ̣t

kết quả cân bằng giữa hai mu ̣c tiêu nó i trên.

Viê ̣c cho ̣n lựa mồi có một ý nghĩa quan trọng để phản ứng PCR có hiê ̣u quả và độ chính xác cao. Vì thế, cần phải tính toán các thông số chính xác hợp lý trong thiết kế mồi. Trình tự củ a mồi quyết định vị trí và kích thước sản phẩm PCR, cũng như nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vùng đươ ̣c khuếch đa ̣i. Mồi thiết kế đúng có thể tránh được việc tạo ra những sản phẩm PCR không đă ̣c hiệu. Trình tự cặp mồi dùng để nhân các đoạn gen được thể hiện trong bảng 3.2:

27

Bảng 3.2. Trình tự cặp mồi dùng để nhân các đoạn gen

Kích

Nhiệt độ

thước

bắt cặp

TT

Tên mồi

Trình tự (5’ – 3’)

(bp)

1

16S

GCCTACGGGAGGCAGCAG

550

56oC/ 50s

F

rDNA

CCGTCAATTCMTTTGAGTTT

R

2

OmpL1

TTGATTGAATTCTTAGAGTTCGTGTTTATA

960

56oC/ 50s

F

AAGGAGAAGCTTATGATCCGTAACATAAGT

R

3

LipL32

TTACCGCTCGAGGTGCTTTCGGTGGTCTGC

782

50oC/ 30s

F

TGTTAACCCGGGTTACTTAGTCGCGTCAGA

R

4

LipL41

AGAGAAGATAATTTTCTCCCCATGGGTAACA

1065

50oC/ 30s

F

GAAAGCAACGCAAAGTAACTCGAGTCCTTT

R

5

LipL21

ATGATCAATAGACTTATAGCTC

560

50oC/ 60s

F

TTATTGTTTGGAAACCTCTTGA

R

6

LigA

CGGTCGACTATCGTTACTCCAGCA

991

50oC/ 50s

F

CGGCGGCCGCAATATCCGTATTAGA

R

7

LigB

CCGCTCGAGGTGTTTATGAAGAAA

620

50oC/ 30s

F

ACTCTCGAGCGTATTAGAGGAAT

R

3.1.3. Nhân gen với các cặp mồi của gen 16S rDNA

Sử dụng DNA tổng số làm khuôn để khuếch đại trình tự gen 16S rDNA,

bằng phản ứng PCR với cặp mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế dựa trên trình

tự gen 16S rDNA đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế. 16S rDNA là

vùng mã hóa các RNA ribosome được xác định là đoạn gen được bảo tồn nhất

ở tất cả các tế bào. Trình tự các đoạn gen này ở các sinh vật có khoảng cách di

truyền rất xa nhau vẫn tìm thấy có sự giống nhau. Tuy nhiên, đây cũng là vùng

rất linh hoạt, sự thay đổi trình tự các nucleotide ở vùng này được ứng dụng

nhiều trong khảo sát di truyền các dòng vi khuẩn. Chúng tôi tiến hành phản ứng

PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR nhân gen

28

xảy ra tối ưu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 56oC. Sau 25 chu kỳ phản ứng,

kết quả nhân gen được kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với DNA Marker

100bp (Thermo) và được thể hiện ở hình 3.2:

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen 16S rDNA

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 100 (1000 bp; Thermo).

Hình 3.2 cho thấy băng DNA nhân bản sáng rõ, gọn và đẹp, có kích thước

khoảng 550 bp phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Hàm lượng của

sản phẩm đủ lớn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16S rDNA

Thông thường sau khi chạy PCR, ngoài đoạn gen quan tâm còn có các sản

phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dư thừa sau phản ứng, mồi,

enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hưởng đến các kết quả của quá

trình giải trình tự. Vì vậy, để quá trình giải trình tự đạt hiệu quả cao nhất, chúng

tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm theo quy trình của bộ kít: GeneJETTM PCR

29

Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Các đoạn gen sau khi

tinh sạch xong sẽ được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra

chất lượng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR được thể hiện ở hình 3.3:

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen 16S rDNA tinh sạch

Ghi chú: Ba: Leptospira interogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 1Kb (10.000 bp; Thermo).

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau tinh sạch cho thấy một băng DNA

duy nhất với kích thước khoảng 550bp, chứng tỏ đã thu nhận được đoạn gen

mong muốn và đoạn DNA không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch, có thể

tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.5. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn

Gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn được giải trình tự với máy giải

trình tự AB 3500 (Applied Biosystems, USA). Kết quả giải trình tự được trình

bày ở phần phụ lục.

30

3.1.6. Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn

khuẩn

Trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng Leptospira đã được chuẩn hóa và

được sử dụng như một công cụ để phân tích phát sinh loài. Phân tích trình tự

của các gen 16S rDNA được phân lập từ các chủng xoắn khuẩn sử dụng chế vắc

xin ở Việt Nam bằng các thuật toán ClustalW thực hiện trong MEGA 4.0. Xác

suất biến đổi và vùng bảo tồn giữa các trình tự liên quan được thực hiện bởi

MEGA 4.0 và BioEdit 7.0.4.1. Các dữ liệu của phần mềm Maximum

Likelihood đã cho thấy mối quan hệ phát sinh loài giữa những chủng Leptospira

gây bệnh khác nhau trong nghiên cứu này với các loài gây bệnh quốc tế khác.

Bảng 3.3. Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ cơ sở dữ liệu GenBank

Leptospira interrogans

Hardjo-prajitno

JQ765630.1

1

2

Leptospira interrogans

Hardjo-prajitno

CP013147.1

3

Leptospira interrogans

Hardjo

CP012603.1

4

Leptospira interrogans

Kennewicki

FJ154571.1

5

Leptospira interrogans

Pyrogenes DB60

JQ988842.1

6

Leptospira interrogans

Pomona DB37

JQ988858.1

7

Leptospira interrogans

Pomona

KR091971.1

8

Leptospira interrogans

Copenhageni

NR 74524.1

9

Leptospira interrogans

Copenhageni

KR091970.1

10

Leptospira interrogans

Linhai

CP006723.1

11

Leptospira interrogans

Grippotyphosa

JQ906628.1

Mã số trên STT Chủng Loài genbank

31

12

Leptospira interrogans

Grippotyphosa

JQ906625.1

13

Leptospira interrogans

Saxkoebing

KR107202.1

14

Leptospira interrogans

Manilae

CP011931.1

15

Leptospira interrogans

Canicola

KU053945.1

16

Leptospira interrogans

Canicola

KR080516.1

17

Leptospira interrogans

Bratislava

CP011410.1

18

Leptospira interrogans

Bratislava-DB38

JQ988859.1

19

Leptospira interrogans

Lai

NR 74481.1

20

Leptospira interrogans

Australis-DB42

JQ988863.1

21

Leptospira interrogans

JQ988845.1

22

Leptospira interrogans

Icterohaemorrhagiae -DB69 Icterohaemorrhagiae

FJ154563.1

23

Leptospira interrogans

Bataviae-DB59

JQ988841.1

24

Leptospira interrogans

Muenchen

FJ154565.1

Mã số trên STT Chủng Loài genbank

Kết quả xây dựng sơ đồ hình cây phân loại các chủng xoắn khuẩn như

hình 3.4:

32

Hình 3.4. Sơ đồ hình cây phân loại các chủng xoắn khuẩn

Hình ảnh cho thấy hầu hết các chủng xoắn khuẩn sử dụng chế vắc xin ở

Việt Nam tương đồng với các chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans phân

lập được trên thế giới. Điều này khẳng định lại một cách có cơ sở những mẫu

chủng được sử dụng trong nghiên cứu là các chủng Leptospira mà không bị

nhầm lẫn trong quá trình thực nghiệm.

Các kết quả cũng đã chỉ ra rằng hai loài gây bệnh L. interrogans serovar

Pomona_VN và L. interrogans serovar Hardjo dường như là có quan hệ di

truyền chặt chẽ (mức độ gần gũi về mặt di truyền: 99%, khoảng cách di truyền

0,00). Ngược lại, giữa các chủng L. interrogans serovar Canicola_VN hoặc L.

33

interrogans serovar Icterohaemorrhagiae_VN và chủng cổ điển L. interrogans

serovar Canicola, L. interrogans serovar Grippotyphosa lại có mối quan hệ di

truyền yếu hơn (mức độ gần gũi về mặt di truyền: 62%). Cũng từ kết quả sơ đồ

hình cây phân loại cho thấy 2 chủng L. interrogans serovar Mitis_VN và L.

interrogans serovar Grippotyphosa_VN thuộc cùng một phân nhóm, nhưng

chúng xuất hiện một mối quan hệ di truyền yếu với nhóm chị em là chủng L.

interrogans serovar Bataviae_VN (bootstrap: 62%). Như vậy kết quả phân tích

sơ đồ hình cây phân loại cho thấy một sự đa dạng di truyền giữa các chủng L.

interrogans gây bệnh phân lập được từ Việt Nam và các chủng phân lập được

từ các nước khác. Tỷ lệ mức độ gần gũi về mặt di truyền trong thí nghiệm của

chúng tôi dao động trong khoảng 62% đến 99%, cho thấy xoắn khuẩn

Leptospira có thể phát triển khác nhau theo các địa điểm khác nhau và dịch tễ

học của bệnh do Leptospira ở Việt Nam là tương đối độc lập so với các nước

khác.

Các mối quan hệ di truyền của loài Leptospira cũng được xác nhận bởi

một số nghiên cứu trước đó. Anna Rettinger (2012) đã so sánh cây phân loại

của 28 chủng Leptospira, kể cả các chủng gây bệnh, không gây bệnh và trung

tính thông qua việc phân tích trình tự gen 16S rDNA của chúng. Phân tích thống

kê của ba chủng gây bệnh cho thấy có các đỉnh khác biệt về di truyền giữa các

chủng trong nghiên cứu [56]. Một nghiên cứu phát sinh loài của Xiao và cộng

sự (2015) đã sử dụng trình tự gen 16S rDNA và các phương pháp phân tích kiểu

gen MLST (Multilocus Sequence Typing) để điều tra sự đa dạng di truyền của

Leptospira và hiểu các xu hướng thay đổi dịch tễ học và tiến hóa của chủng tại

Trung Quốc. Dữ liệu của họ cho thấy rằng các chủng Leptospira từ các nước

khác nhau có sự khác biệt và một sự đa dạng di truyền lớn về dịch tễ học địa lý

[66]. Bourhy (2014) phân tích trình tự gen 16S rDNA và cây phân loại của chi

Leptospira ở Mayotte (Ấn Độ Dương). Kết quả cũng phản ánh quan hệ di

truyền khác nhau giữa các chủng Leptospira [13]. Trong nghiên cứu này của

34

chúng tôi cũng chỉ ra rằng trình tự gen 16S rDNA là một kỹ thuật hữu ích để

phát hiện sự đa dạng di truyền và dịch tễ học phân tử của bệnh do Leptospira

trên toàn cầu. Hơn nữa, những kết quả này cung cấp một kế hoạch chi tiết cho

các nghiên cứu phát sinh loài rõ hơn đối với một số chủng Leptospira bệnh lý

khác.

3.2. Xác định sự có mặt của các gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21,

LipL41

Tiếp tục sử dụng DNA tổng số làm khuôn để khuếch đại trình tự các gen

LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41 bằng phản ứng PCR với cặp mồi

xuôi và mồi ngược được thiết kế dựa trên trình tự các gen đã được công bố trên

ngân hàng gen quốc tế. Chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR với các điều

kiện khác nhau và nhận thấy rằng các phản ứng PCR nhân gen xảy ra tối ưu

trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi tương tự bảng 3.2. Sau 25 chu kỳ phản ứng,

kết quả nhân gen được kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với DNA Marker

1000bp và 100bp (Thermo), được thể hiện ở các hình 3.5.a đến 3.5.f:

35

Hình 3.5.a. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 1Kb (10.000 bp; Thermo).

Hình 3.5.b. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 1Kb (10.000 bp; Thermo).

36

Hình 3.5.c. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 1Kb (10.000 bp; Thermo).

Hình 3.5.d. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 1Kb (10.000 bp; Thermo).

37

Hình 3.5.e. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 100 (1.000 bp; Thermo).

Hình 3.5.f. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41

Ghi chú: Ba: Leptospira interrogans serovar Bataviae; Ca: Leptospira

interrogans serovar Canicola; Ic: Leptospira interrogans serovar

Icterohaemorrhagiae; Gr: Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa; Po:

Leptospira interrogans serovar Pomona; Mi: Leptospira interrogans serovar

Mitis; M: Marker DNA 1Kb (10.000 bp; Thermo).

38

Chúng tôi đã chọn sáu gen, bao gồm: gen LigA và LigB (immunoglobulin

likeproteins A and B), gen OmpL1 và gen LipL32, LipL41, LipL21

(lipopolysaccharide) và kiểm tra sự xuất hiện của các gen này bằng phương

pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Kết quả cho thấy, chỉ có ba gen (gen

LipL32, LipL21 và gen LigA) xuất hiện trong tất cả các chủng kiểm tra, riêng

gen OmpL1 chỉ xuất hiện trong 4 chủng (gồm L. interrogans serovar Bataviae,

L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis và L. interrogans

serovar Pomona). Trong khi đó, gen LipL41 thì không xuất hiện trong bất cứ

chủng Leptospira nào. Chúng tôi đã không nhân được đoạn gen mong muốn

(kích thước 620 bp) của gen LigB bằng kỹ thuật PCR, mặc dù đã thử nhiều điều

kiện bắt cặp mồi khác nhau. Kết quả điện di sản phẩm PCR 6 chủng với gen

LigB cho thấy có xuất hiện 1 băng vạch 2000 bp (không đúng với kích thước

của gen khi thiết kế).

Việc nghiên cứu xác định một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng

nguyên của xoắn khuẩn Leptospira đã và đang được các nhà nghiên cứu tại

Việt Nam và trên thế giới quan tâm và phát triển. Năm 2000, Zuerner và cộng

sự đã phát hiện ra hệ gen của L. interrogans có biểu hiện dị hợp của OMPs giúp

mở ra một hướng mới trong nghiên cứu vắc xin chống bệnh Leptospirosis [70].

Điều này được Nascimento phát hiện ở L. interrogans chủng Copenhageni [45]

và cũng được khẳng định trong nghiên cứu trước đó của Ren và cộng sự trên

chủng L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae Lai năm 2003 [55]. Một số

kết quả nghiên cứu đã chỉ ra hàng loạt các protein ngoài màng (LAg42, Loa22,

Lk73.5), lipoprotein (LipL32, LipL45, LipL21 và GLP) và các yếu tố độc lực

mới được phát hiện (Hsp58, flaA, Flab, SphH và ChpK) có thể giúp chúng ta

tìm thấy vắc xin phù hợp hơn. Mặc dù không nhằm mục đích thương mại hóa,

nhưng các loại vắc xin tái tổ hợp đầu tiên đã đặt nền móng hiệu quả cho việc

phát triển các vắc xin thế hệ mới phù hợp với nhu cầu hiện tại [63]. Hu (2014)

công bố nhiều kháng nguyên protein màng ngoài tồn tại trong tất cả các chủng

39

L.interrogans phổ biến ở Trung Quốc và cho rằng loại kháng nguyên này có

thể được sử dụng để phát triển vắc xin phòng bệnh do Leptospira [30]. Các kết

quả nghiên cứu của Dezhbord (2014) trong nhân bản và tái tổ hợp gen biểu hiện

OmpL1 như một kháng nguyên hiệu quả và đã đề xuất rằng gen OmpL1 có thể

là gen tiềm năng để nghiên cứu sản xuất vắc xin phù hợp phòng bệnh do

Leptospira trong khu vực Iran [20]. Một số nghiên cứu cho rằng các protein

LigA tái tổ hợp tinh khiết là protein vắc xin tiềm năng nhất đối với bệnh do

Leptospira [11]; [34]. Trong năm 2014, Maneewatch và Adisakwattana nghiên

cứu hai kháng thể đơn dòng chuột LipL32 cụ thể (mAbLPF1 và mAbLPF2) và

kết luận LipL32 protein tái tổ hợp là công cụ cho chẩn đoán và vắc xin cho

Leptospirosis [42]. Ngoài ra, Ye (2014) đã thử nghiệm và phát triển bốn protein

tái tổ hợp của L. interrogans, cụ thể là, rLipL21, rLoa22, rLipL32 và

rLigACon4-8 như kháng nguyên để chẩn đoán bệnh do Leptospira ở ngựa [69].

Tiếp tục phát triển từ nghiên cứu khảo sát các loại OMP của các chủng

Leptospira trong năm 2013, Raja và Natarajaseenivasan (2015) đã kết hợp tất

cả các tính năng mới của OMP và đưa ra một số quan điểm cho các nghiên cứu

trong tương lai của vắc xin tái tổ hợp [23]. Forster (2015) đã đánh giá vùng N-

terminal của protein B immunoglobulin (LigBrep) như một kháng nguyên hiệu

quả cho loại vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh xoắn khuẩn và nhấn mạnh việc

sử dụng protein DNA sẽ là một chiến lược quan trọng để phát triển các loại vắc

xin thế hệ mới. Tuy nhiên, hiện nay chỉ có protein Lig, LipL41 và Hap1 được

công nhận như vắc xin phòng chống Leptospira ở động vật. Ở Việt Nam, hiện

nay lưu hành phổ biến vắc xin vô hoạt dạng nước trong việc ngăn ngừa và kiểm

soát bệnh do Leptospira. Tuy nhiên, loại vắc xin này chứa toàn bộ tế bào của

xoắn khuẩn đã được làm bất hoạt (bacterins) nên hạn chế khả năng đáp ứng

miễn dịch của cá thể được tiêm phòng. Trong một nỗ lực hướng tới cải thiện và

phát triển các loại vắc xin phòng bệnh, vắc xin tái tổ hợp là một trong những

loại cần được tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm.

40

Tóm lại, trên cơ sở của các nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam, vắc

xin tái tổ hợp phòng bệnh do Leptopira nói riêng cũng như các loại vắc xin

khác nói chung đã, đang và sẽ được nghiên cứu xa hơn để tạo một bức tường

bảo vệ con người cũng như động vật khỏi những tác nhân gây bệnh.

41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

- Trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn và kết quả xây dựng sơ

đồ cây phân loại cho thấy những mẫu chủng được sử dụng trong nghiên cứu là

các chủng Leptospira interrogans mà không bị nhầm lẫn trong quá trình thực

nghiệm. Các chủng Leptospira interrogans của Việt Nam đã có sự khác biệt so

với một số chủng Leptospira gây bệnh khác trên thế giới (mức độ gần gũi về

mặt di truyền từ 62 - 99 %, khoảng cách di truyền 0,00 - 0,82), có thể do dịch

tễ học địa lý khác nhau đã dẫn đến sự đa dạng về di truyền.

- Ở 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng

chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam có mặt của một số gen mã hóa kháng nguyên,

bao gồm: gen LipL32, LipL21 và gen LigA xuất hiện trong tất cả các chủng

kiểm tra, riêng gen OmpL1 chỉ xuất hiện trong 4 chủng (gồm L. interrogans

serovar Bataviae, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis

và L. interrogans serovar Pomona), gen LipL41 thì không xuất hiện trong bất

cứ chủng Leptospira nào. Chúng tôi bước đầu dự đoán 3/ 6 gen này có thể sử

dụng như những gen tiềm năng cho các nghiên cứu về vắc xin tái tổ hợp phòng

chống bệnh xoắn khuẩn tại Việt Nam. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu

sinh học phân tử sâu hơn để chứng minh giả thuyết này.

2. Đề nghị

Cần tiếp tục nghiên cứu:

- Giải trình tự các gen quyết định kháng nguyên tiềm năng (gen LigA, LigB,

gen OmpL1, gen LipL32, gen LipL41 và gen LipL21)

- Phân tích protein tái tổ hợp tiềm năng để tạo cơ sở cho việc sản xuất vắc xin

tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis ở Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tài liệu Tiếng Việt

1. Trần Quang Bính (2010), "Nhân một số trường hợp nhiễm Leptospira

khó chẩn đoán", Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh, Phụ bản Số 2,14: p.

603-607.

2. Báo Lao động (2003), "Hà Nội có nguy cơ bùng phát dịch Leptospirosis",

Báo Lao động.

3. Trần Thanh Phong ( 1996), Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo, Tủ

sách ĐHNL TP.HCM.

4. Huỳnh Hồng Quang (2009), Bệnh Leptospirose và những dấu hiệu lâm

sàng cần phân biệt với sốt rét ác tính thể gan mật,Viện Sốt Rét Ký Sinh

Trùng Côn Trùng Quy Nhơn.

5. Nguyễn Thị Nội, Vũ Đình Hưng (1980), Bệnh Leptospirosis ở gia súc

và người, Kết quả nghiên cứu KH&KT thú y 1968 – 1978: p. 226-232.

6. Lê Thị Thanh Xuân (2015), "Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh xoắn

trùng Leptospira tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011", Tạp chí y học dự

phòng, 6(15): p. 358.

B. Tài liệu Tiếng Anh

7. A Slack (2010), Leptospirosis, Aust Fam Physician, 7(39): p. 495 - 498.

8. Alston JM (1963), The Leptospiroses,The Practitioner, 191: p. 594-598.

9. Alston JM and Brown HC (1937), The epidemiology of Weil's

disease,Journal of the Royal Society of Medicine, 30(6): p. 741-756.

10. Artiushin S, Timoney JF, Nally J, Verma A (2004), Host-inducible

immunogenic sphingomyelinase-like protein, Lk73. 5, of Leptospira

interrogans,Infection and immunity, 72(2): p. 742-749.

11. Bacelo Katia L, Hartwig Daiane D, Seixas Fabiana K, Schuch Rodrigo,

Moreira Angelita da S, Amaral Marta, Collares Tiago, Vendrusculo

Claire T, McBride Alan JA, Dellagostin Odir A (2014), Xanthan gum as

an adjuvant in a subunit vaccine preparation against leptospirosis,

BioMed research international.

12. Baranton Guy and Postic Danièle (2006), "Trends in leptospirosis

epidemiology in France. Sixty-six years of passive serological

surveillance from 1920 to 2003", International journal of infectious

diseases, 10(2): p. 162-170.

13. Bourhy Pascale, Collet Louis, Brisse Sylvain, Picardeau Mathieu (2014),

"Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus

Leptospira isolated from humans", International journal of systematic

and evolutionary microbiology, 64(12): p. 4061-4067.

14. Branger C, Sonrier C, Chatrenet B, Klonjkowski B, Ruvoen-Clouet N,

Aubert A, Andre-Fontaine G, Eloit M (2001), Identification of the

hemolysis-associated protein 1 as a cross-protective immunogen of

Leptospira interrogans by adenovirus-mediated vaccination, Infection

and immunity, 69(11): p. 6831-6838.

15. Charon Nyles W and Goldstein Stuart F (2002), Genetics of motility and

chemotaxis of a fascinating group of bacteria: the spirochetes, Annual

review of genetics, 36(1): p. 47-73.

16. Coutinho ML, Vasconcellos FA, Fernandes CPH, Seyffert N, Seixa K,

Ko AI, Dellagostin OA, Aleixo JAG (2007), "Evaluation of the Anti‐

LipL32 Monoclonal Antibodies Potential for Use in Leptospirosis

Immunodiagnostic Tests", Journal of immunoassay &

immunochemistry, 28(3): p. 279-288.

17. Cullen Paul A, Cordwell Stuart J, Bulach Dieter M, Haake David A

Adler Ben (2003), LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of

pathogenic Leptospira species, Infection and immunity, 71(5): p. 2414-

2421.

18. Dai B, Chen Z, Haake DA, You Z, Fang Z (1999), Alignment of DNA

sequences of ompL1 genes of insert fragment of recombinant plasmid,

pDC38 of L. interrogans serovar lai and L. kirschneri, Hua xi yi ke da

xue xue bao= Journal of West China University of Medical Sciences=

Huaxi yike daxue xuebao/[bian ji zhe, Hua xi yi ke da xue xue bao bian

wei hui], 30(3): p. 236-240.

19. Day MJ (2006), Vaccine side effects: fact and fiction, Veterinary

microbiology, 117(1): p. 51-58.

20. Dezhbord Mehrangiz, Esmaelizad Majid, Khaki Pejvak, Fotohi Fariba,

Moghaddam Athena Zarehparvar (2014), "Molecular identification of

the ompL1 gene within Leptospira interrogans standard serovars", The

Journal of Infection in Developing Countries, 8(06): p. 688-693.

21. Diament Decio, Brunialti Milena Karina Colo, Romero Eliete Calo,

Kallas Esper Georges, Salomao Reinaldo (2002), Peripheral blood

mononuclear cell activation induced by Leptospira interrogans

glycolipoprotein, Infection and immunity, 70(4): p. 1677-1683.

22. Erridge Clett, Pridmore Alison, Eley Adrian, Stewart John, Poxton Ian

R (2004),"Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia

trachomatis and Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2",

Journal of Medical Microbiology, 53(8): p. 735-740.

23. Forster Karine M, Hartwig Daiane D, Oliveira Thaís L, Bacelo Kátia L,

Schuch Rodrigo, Amaral Marta G, Dellagostin Odir A (2015), DNA

prime-protein boost based vaccination with a conserved region of

leptospiral immunoglobulin-like A and B proteins enhances protection

against leptospirosis, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, (AHEAD).

24. François Guido, Duclos Philippe, Margolis Harold, Lavanchy Daniel,

Siegrist Claire-Anne, Meheus André, Lambert Paul-Henri, Emiroglu

Nedret, Badur Selim, Van Damme Pierre (2005), Vaccine safety

controversies and the future of vaccination programs, The Pediatric

infectious disease journal, 24(11): p. 953-961.

25. Gebriel AM, G Subramaniam, and SD Sekaran (2006), The detection and

characterization of pathogenic Leptospira and the use of OMPs as

potential antigens and immunogens, Trop Biomed, 23(2): p. 194-207.

26. Guerreiro Hygia, Croda Júlio, Flannery Brendan, Matsunaga James

Reis, Mitermayer Galvaxo (2001), Leptospiral proteins recognized during the

humoral immune response to leptospirosis in humans, Infect, Immun.

27. Haake DA, Champion CI, Martinich C, Shang ES, Blance DR, Miller

JN, Lovett MA (1993), "Molecular cloning and sequence analysis of the

gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of

pathogenic Leptospira spp". Journal of bacteriology, 175(13): p. 4225-

4234.

28. Haake David A, Chao Garlo, Zuerner Richard L, Barnett Jeanne K,

Barnett Dean, Mazel Mary, Matsunaga James, Levett Paul N, Bolin

Carole A (2000), The leptospiral major outer membrane protein LipL32

is a lipoprotein expressed during mammalian infection, Infection and

immunity, 68(4): p. 2276-2285.

29. Haake David A, Mazel Mary K, McCoy Adam M, Milward Frank, Chao

Garlo, Matsunaga James, Wagar Elizabeth A (1999), Leptospiral outer

membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic

immunoprotection, Infection and immunity, 67(12): p. 6572-6582.

30. Hu Weilin and Yan Jie (2014), Leptospira and leptospirosis in China,

Current opinion in infectious diseases, 27(5): p. 432-436.

31. Hübener EA and Reiter Hans (1915), Beiträge zur Aetiologie der

Weilschen Krankheit, Dtsch,Med, Wochenschr., 41: p. 1275-1277.

32. Inada R and Ido Y (1915), A report of the discovery of the causal

organism (a new species of spirocheta) of Weil’s disease, Tokyo

Ijishinshi, 1908: p. 351-360.

33. Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune

(1918), "INTRAVENOUS SEROTHERAPY OF WEIL'S DISEASE

(SPIROCHÆETOSIS ICTEROHÆMORRHAGICA)", The Journal of

experimental medicine, 27(2): p. 283.

34. Inada Ryokichi, Ido Yutaka, Hoki Rokuro, Ito Hiroshi, Wani Hidetsune

(2014), B-cell-specific peptides of Leptospira interrogans LigA for

diagnosis of patients with acute leptospirosis, Clinical and Vaccine

Immunology, 21(3): p. 354-359.

35. Koizumi N and Watanabe H (2005), "Leptospirosis vaccines: past,

present, and future", Journal of postgraduate medicine, 51(3): p. 210.

36. Nobuo Koizumi and Haruo Watanabe (2003), Molecular cloning and

characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain,

FEMS microbiology letters, 226(2): p. 215-219.

37. Koizumi Nobuo and Watanabe Haruo (2004), Leptospiral

immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity, Vaccine,

22(11): p. 1545-1552.

38. Lee Seoung Hoon, Kim Kyung A, Park Yong Gun, Seong In Wha, Kim Min

Ja, Lee Yong Ju (2000), Identification and partial characterization of a

novel hemolysin from Leptospira interrogans serovar Lai, Gene, 254(1):

p. 19-28.

39. Lee Seoung Hoon, Kim Sangduk, Park Seung Chul, Kim Min Ja (2002),

Cytotoxic activities of Leptospira interrogans hemolysin SphH as a pore-

forming protein on mammalian cells, Infection and immunity, 70(1): p.

315-322.

40. Levett Paul N, Branch Songee L, Whittington Carol U, Edwards Charles

N, Paxton Helene (2001), Two methods for rapid serological diagnosis

of acute leptospirosis, Clinical and diagnostic laboratory immunology,

8(2): p. 349-351.

41. Li Chunhao, Motaleb A, Sal Melanie, Goldstein Stuart F, Charon Nyles

W (2000), "Spirochete periplasmic flagella and motility", Journal of

molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p. 345-354.

42. Maneewatch Santi, Adisakwattana Poom, Chaisri Urai, Saengjaruk ,

Patcharin, Srimanote Potjanee, Thanongsaksrikul Jeeraphong,

Sakolvaree Yuwaporn, Poungpan Phakkanan, Chaicumpa Wanpen

(2014), Therapeutic epitopes of Leptospira LipL32 protein and their

characteristics, Protein Engineering Design and Selection: p. gzu006.

43. Matsunaga James, Young Tracy A, Barnett Jeanne K, Barnett Dean,

Bolin Carole A, Haake David A (2002), Novel 45-kilodalton leptospiral

protein that is processed to a 31-kilodalton growth-phase-regulated

peripheral membrane protein, Infection and immunity, 70(1): p. 323-

334.

44. McBride AJ Athanazio DA, Reis MG, Ko AI (2005), Leptospirosis, Curr

Opin Infect Dis 5(18): p. 3.

45. Nascimento Ana Lucia Tabet Oller do, Verjovski-Almeida S, Van Sluys

MA, Monteiro-Vitorello CB, Camargo LEA, Digiampietri LA,

Harstkeerl RA, Ho PL, Marques MV, Oliveira MC (2004), "Genome

features of Leptospira interrogans serovar Copenhageni", Brazilian

Journal of Medical and Biological Research, 37(4): p. 459-477.

46. Oliveira Thaís Larré, Grassmann André Alex, Schuch Rodrigo Andrade,

Neto Amilton Clair Pinto Seixas, Mendonça Marcelo, Hartwig Daiane

Drawanz, McBride Alan John Alexander, Dellagostin Odir Antonio

(2015), Evaluation of the Leptospira interrogans Outer Membrane

Protein OmpL37 as a Vaccine Candidate, PloS one, 10(11): p.

e0142821.

47. Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Chang Chao-Fu, Pan MJ

Yang CW, Harpending Peter, McDonough Sean P, Dubovi Edward,

Divers Thomas, Qu Jiaxin (2005), Evaluation of lig-based conventional

and real time PCR for the detection of pathogenic leptospires, Molecular

and cellular probes, 19(2): p. 111-117.

48. Palaniappan Raghavan UM, Chang Yung-Fu, Jusuf SSD, Artiushin S,

Timoney John F, McDonough Sean P, Barr Steve C, Divers Thomas J,

Simpson Kenneth W, McDonough Patrick L (2002), Cloning and

molecular characterization of an immunogenic LigA protein of

Leptospira interrogans, Infection and immunity, 70(11): p. 5924-5930.

49. Palaniappan Raghavan UM, McDonough Sean P, Divers Thomas J,

Chen Chia-Sui, Pan Ming-Jeng, Matsumoto Mitsuharu, Chang Yung-Fu

(2006), Immunoprotection of recombinant leptospiral immunoglobulin-

like protein A against Leptospira interrogans serovar Pomona infection,

Infection and immunity, 74(3): p. 1745-1750.

50. Palaniappan Raghavan UM, Ramanujam Subbupoongothai, and Chang

Yung-Fu (2007), Leptospirosis: pathogenesis, immunity, and diagnosis.

Current opinion in infectious diseases, 20(3): p. 284-292.

51. Park Se-Hoon, Ahn Byung-Yoon, and Kim Min-Ja (1999), Expression

and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58

of Leptospira species: a major target antigen of the humoral immune

response, DNA and cell biology, 18(12): p. 903-910.

52. Picardeau M (2013), Diagnosis and epidemiology of leptospirosis,

Médecine et maladies infectieuses, 43(1): p. 1-9.

53. Picardeau Mathieu, Bauby Hélène, and Saint Girons Isabelle (2003),

Genetic evidence for the existence of two pathways for the biosynthesis

of methionine in the Leptospira spp, FEMS microbiology letters, 225(2):

p. 257-262.

54. Priya C Gowri, Bhavani K, Rathinam SR, Muthukkaruppan VR (2003),

"Identification and evaluation of LPS antigen for serodiagnosis of uveitis

associated with leptospirosis", Journal of medical microbiology, 52(8):

p. 667-673.

55. Ren Shuang-Xi, Fu Gang, Jiang Xiu-Gao, Zeng Rong, Miao You-Gang,

Xu Hai, Zhang Yi-Xuan, Xiong Hui, Lu Gang, Lu Ling-Feng (2003),

Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans

revealed by whole-genome sequencing, Nature, 422(6934): p. 888-893.

56. Rettinger Anna, Krupka Inke, Grünwald Karola, Dyachenko Viktor,

Fingerle Volker, Konrad Regina, Raschel Heribert, Busch Ulrich, Sing

Andreas, Straubinger Reinhard K (2012), Leptospira spp. strain

identification by MALDI TOF MS is an equivalent tool to 16S rRNA gene

sequencing and multi locus sequence typing (MLST), BMC

microbiology, 12(1): p. 185.

57. Sambrook (2011), Molecular cloning: a laboratory manual.

58. Seixas Fabiana Kömmling, Fernandes Claudia Hartleben, Hartwig

Daiane Drawanz, Conceicao Fabricio Rochedo, Aleixo Jose Antonio

Guimaraes, Dellagostin Odir Antonio (2007), "Evaluation of different

ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of

developing a recombinant vaccine against leptospirosis", Canadian

journal of microbiology, 53(4): p. 472-479.

59. Silva Éverton F, Medeiros Marco A, McBride Alan JA, Matsunaga

Jim, Esteves Gabriela S, Ramos João GR, Santos Cleiton S, Croda Júlio,

Homma Akira, Dellagostin Odir A (2007), The terminal portion of

leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective

immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis,

Vaccine, 25(33): p. 6277-6286.

60. Smythe Lee D, Smith Ina L, Smith Greg A, Dohnt Michael F, Symonds

Meegan L, Barnett Leonie J, McKay David B (2002), A quantitative PCR

(TaqMan) assay for pathogenic Leptospira spp, BMC infectious

diseases, 2(1): p. 13.

61. Talwani Rohit, Gilliam Bruce L, and Howell Charles (2011), Infectious

diseases and the liver, Clinics in liver disease, 15(1): p. 111-130.

62. Vanasco Norma Bibiana, Schmeling MF, Lottersberger Javier, Costa

Federico, Ko Albert Icksang, Tarabla Héctor Dante (2008), Clinical

characteristics and risk factors of human leptospirosis in Argentina

(1999–2005), Acta Tropica, 107(3): p. 255-258.

63. Vedhagiri K, Natarajaseenivasan K, Chellapandi P, Prabhakaran SG, Selvin

Joseph, Sharma S, Vijayachari P (2009), Evolutionary implication of outer

membrane lipoprotein-encoding genes ompL1, lipL32 and lipL41 of

pathogenic Leptospira species, Genomics, proteomics & bioinformatics,

7(3): p. 96-106.

64. Wang Zhijun, Jin Li, and Węgrzyn Alicja (2007), Leptospirosis

vaccines, Microbial Cell Factories, 6(1): p. 39.

65. Wasinski Bernard and Dutkiewicz Jacek (2013), Leptospirosis-current

risk factors connected with human activity and the environment, Annals

of Agricultural and Environmental Medicine, 20(2).

66. Xiao Di, Zhang Cuicai, Zhang Huifang, Li Xiuwen, Jiang Xiugao,

Zhang Jianzhong (2015), "A novel approach for differentiating

pathogenic and non-pathogenic Leptospira based on molecular

fingerprinting", Journal of proteomics, 119: p. 1-9.

67. Yanagihara Yasutake, Villanueva Sharon YAM, Yoshida Shin-ichi,

Okamoto Yoshihiro, Masuzawa Toshiyuki (2007), Current status of

leptospirosis in Japan and Philippines, Comparative immunology,

microbiology and infectious diseases, 30(5): p. 399-413.

68. Yang Hong-Liang, Zhu Yong-Zhang, Qin Jin-Hong, He Ping, Jiang Xu-

Cheng, Zhao Guo-Ping, Guo Xiao-Kui (2006), In silico and microarray-

based genomic approaches to identifying potential vaccine candidates

against Leptospira interrogans, BMC genomics, 7(1): p. 293.

69. Ye Cuilian, Yan Weiwei, McDonough Patrick L, McDonough Sean P,

Mohamed Hussni, Divers Thomas J, Chang Yung-Fu, Yang Zhibang

(2014), Serodiagnosis of equine leptospirosis by enzyme-linked

immunosorbent assay using four recombinant protein markers, Clinical

and Vaccine Immunology, 21(4): p. 478-483.

70. Zuerner Richard, Haake David, Adler Ben, Segers Ruud (2000),

"Technological advances in the molecular biology of Leptospira",

Journal of molecular microbiology and biotechnology, 2(4): p. 455-462.

PHỤ LỤC

1. Trình tự gen 16S rDNA của chủng L. interrogans serovar Bataviae

GACCGGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGAA

GGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCAGC

AATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC

AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCAT

TGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAA

ACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGA

GTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCG

TAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCT

AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA

GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAAGGTTGTCTACCAGTTGTTGG

GGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGC

CTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAATGAAATTTGACGG

2. Trình tự gen 16S rDNA của chủng L. interrogans serovar Mitis

GGCCCAAGGGGGGGGACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATGA

AGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCMSGGAAAAATAAGCAG

CAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTGCC

AGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCATT

GGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGAAAA

CTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGGAG

TTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGT

AGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGCCTA

AAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTAA

ATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTTGGG

GGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACCGCCT

GGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGGA

3. Trình tự gen 16S rDNA của chủng L. interrogans serovar Pomona

GGATGGCCGTCCCAGGGCGGTCTACTTAATCCGTTAGGTTCGTTAC

TGAGGGTTAAAACCCCCAACAACTGGTAGACCACGTTTAGGGCGT

GGATTACCGGGGTATCTAATCCCGTTCACTACCCACGCTTTCGTGC

CTCAGCGTCAGTTTTAGGCCAGCAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTT

CCTCCAGATATCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCCACTT

GCCTCTCCCAAACTCCAGACACATAGTTTCAAGTGCAGGCTGCGA

GTTGAGCCCGCAGTTTTCACACCTGACTTACATGTCCGCCTACGCA

CCCTTTACGCCCAATGATTCCGAACAACGCTTGCACCATACGTATT

ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTTAGGCAGGTAC

CATCATCACATTGCTGCTTATTTTTCCCTGCTTACTGAACTTTACAA

TCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTCGCTGCTTCAGGGTTCC

CCCCAATATAGAATAATCCTAATCGGCCGTGCCCCATCAGCCAAG

GCATTAATAACCCTGGCCAAGGGGGGGGAAACCCAAAAACCCCCC

CCCCCGAGAAAGAAAAAATTTCCCCAATAGTAAAATTTTTCAAAA

AGGGGGAAAAAAAAAACCCCCCGGGGAAAAAGGGTCCCCCCCCA

AAGCCCCGAAAAAAGGGGGCCCCCCCGGGGAAAAAAATAAGGGG

GGAAATGTTTTTAACAAAAAATTGCGGGCAAACAGGGGGGGGAG

GGGGGGAAATAGATATTAGGTGGGATAAAAAACGAGACGCGCGG

GGTGTTGCAAAAAAAACCTTTGCGCGTAGTGGTGAGAGAGAGAAG

AGACCCCCTCTCCCGCGTGGGGCGCGGGGAAATATTATAATATTTT

GGAAAGACACATCACGAGCAGACCAGCATTAAGGTATAACACTAG

CTAAACTAGACTGAGCATACGA

4. Trình tự gen 16S rDNA của chủng L. interrogans serovar Canicola

GGGCGTGGGGGGCAAATCTGACCACCCATGCCGCGTGAAGGATGA

AGGTCCTCTGGATTGTAAACTTCTTTTATAGGGGGCGAAAAAAGG

GAAATCTTTCTCACTTGACCGTACCCTATGAATAACACACCGGCTA

ACTCCGTGCCAGCAAACCGCGGTACATACGGAGGGTGCAAGCGTT

ATCCGGATTCACTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGGCGTATAAG

TCAAATGGTGAAATCCTGGAGCTTATCTCCAGAACTGCCATTGATA

CTATATGTCTTGAATATGGTGGAGGTAACCGGAATATGTCATGTAG

CGGTGAAATGCATAAATATGAACATAGAACACCTATTGCGAAGGC

GGCTTACTACGCCTATTTTGACCCTAAGGCACGAAAGCGTGGGGA

TCAAACAGGATTAGATACCCTGGTACTCCACGCCCTAAACCATGAT

TACTCGACGTGTGCGATAAACGGTACGCGTCTGAGCGAAAGCATT

AAGTAATCCACCTGGGAAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAT

GAAATTGACGG

5. Trình tự gen 16S rDNA của chủng L. interrogans serovar Grippotyphosa

TTAACCTTGGGGGCACCTGTATCAGCGCAGGCCGCGTGAACGACG

AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCATTAGGCAGGGAAAAATAAGCA

ACCTTGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGATAACTACCTGC

CAGCAACCGCGGTAATACCTATGGGGCAAGCGTTGTTCGGAATCA

TTGGGCGTAAAGGGTGCGTAAGCGGACATGTAATTCAAGTGTGAA

AACTGCGGGCTCACCTCATAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTGG

AGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCAGGTGTACCGGTGAAATGC

GTAAATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCACTTGCTGGCCT

AAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGATTA

GATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCACTTGTTGG

GGGTTTTAACCCTCATTAACGAACCTAACGGATTAACTAGACCGCC

TGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAATTGACGG

6. Trình tự gen 16S rDNA của chủng L. interrogans serovar Icteroheamorrhagiae

GCACGGAGGGGGGGCACCTGAGCAGCGACGCCGCGTGAACGATG

AAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCAGTAAGCAGGGAAAAATAAGCA

GCAATGTGATGATGGTACCTGCCTAAAGCACCGGCTAACTACGTG

CCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGKGCAAGCGTTGTTCGGAATC

ATTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGACATGTAAGTCAGGTGTGA

AAACTGCGGGCTCAACTCGCAGCCTGCACTTGAAACTATGTGTCTG

GAGTTTGGGAGAGGCAAGTGGAATTCCRGGTGTAGCGGTGAAATG

CGTAGATATCTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGC

CTAAAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGTGAACGGGAT

TAGATACCCCGGTAATCCACGCCCTAAACGTTGTCTACCAGTTGTT

GGGGGTTTTAACCCTCAGTAACGAACCTAACGGATTAAGTAGACC

GCCTGGGGACTATGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAATGAAATTGAC

GGATAGCAAACCAAGAGTCTTGCTCACTGGGGGGAACCCTGAAGC

ATTCACAACGCATGAGCCATCAACGTCGTCCAATTGTAAAAGTTCC

CTAAGCAGGGAAGTATAARCAGCATGCTGAATGATTGTACCTGCC

TAAAGGCACGGCTAATTACGTGCCGCRTCGGCCTAATACATTATGG

GTGCAACGGGTTGTTTAGGAATCATTAGTAACGTAGAGAGGGCGA

TATAGGGCGGAACATCGACAAGTCAGGATGTGAAAACTGGCGTGC

TCACTACACTGCAATAGAAAAATAAACGTTATTCGAGGAGTTTCG

GGAACAAGCAAATGATAATTCCCAGGATGTCACAAGGTGACAACC

GTGGCTACAAAATRTCTCTCAGACAGGGA