NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG HẢI TOÀN

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN 2006

TÓM TẮT Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và t ồn lưu trong cá tra ( Pangasius hypophthalmus ) giai đoạn giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nh ằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của Malachite Green và m ột số biến đổi sinh hóa trên cá tra. Thí nghi ệm gồm hai n ồng độ MG gây nhi ễm: 0,1mg/l trong 12 gi ờ và 1mg/l trong 60 phút. K ết quả cho th ấy ho ạt tính c ủa các men trong não, gan c ủa cá Tra đều bị biến đổi và kh ả năng phục hồi lại trạng thái bình th ường tuỳ thuộc vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. Sau 60 ngày thí nghi ệm MG vẫn còn tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ABSTRACT

Keywords: Malachite Green, biomarker, residue.

“Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in the fingerling stages of catfish ( Pangasius hypophthalmus) “ was implemented from March to July 2006. The aim of the study was to determine the changes of some biomarkers and the residues of MG on catfish. The experiment included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours, each applied in 3 replicates. The results showed that the biomarkers activity in brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the treatment. After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish (2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

iii

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

CÁC TỪ VIẾT TẮT CHƯƠNG 1..................................................................................................1

ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................1

CHƯƠNG 2..........................................................................................................3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU......................................................................................3

2.1 Sơ lược về Malachite Green.............................................................................3

2.1.1 Sơ lược về Malachite Green.......................................................................3

2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của

Malachite Green.................................................................................................3

2.1.3 Độc tính của Malachite Green....................................................................4

2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green.................................................................5

2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green trên thế giới........................................5

2.2.2 Tính hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam........................................6

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.3 Ảnh hưởng của Malachite Green......................................................................6

2.4 Một số nghiên cứu về chỉ tiêu sinh hóa

LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD ......................................................................7

CHƯƠNG 3:.........................................................................................................9

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................9

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................................................9

3.1.1 Địa điểm....................................................................................................9

3.1.2 Thời gian thực hiện....................................................................................9

3.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................9

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm.....................................................................................9

3.2.2 Cá thí nghiệm.............................................................................................9

3.2.3 Bố trí thí nghiện ......................................................................................10

3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu............................................................10

3.2.5 Chuẩn bị mẫu...........................................................................................11

3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu.....................................................................11

3.3. Xử lí số liệu..................................................................................................16

CHƯƠNG 4........................................................................................................17

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................17

4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong th ời gian gây nhiễm

Malachite Green ...........................................................................................17

4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống.....................................................19

4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green..............................20

4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green......................................................................21

4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green...........................................................22

4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong

quá trình thí nghiệm.................................................................................23

4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong

quá trình thí nghiệm ...............................................................................23

4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong

quá trình thí nghiệm ................................................................................25

4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra

trong quá trình thí nghiệm ......................................................................26

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghi ệm .....................................27

4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong

quá trình thí nghiệm ................................................................................28

CHƯƠNG 5........................................................................................................30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................................................30

5.1 Kết luận.........................................................................................................30

5.2 Đề xuất .........................................................................................................30

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................31

PHỤ LỤC............................................................................................................34

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn....................................................................................4

Bảng 2: Quá trình phân tích AchE.................................................................12

Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA...........................................................13

Bảng 4: Quá trình phân tích GST...................................................................14

Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH..............................................................14

Bảng 6: Quá trình phân tích CAT..................................................................15

Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin...............................................................16

Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG ..........................................17

Bảng 9: pH trong quá trình gây nhi ễm MG ...................................................18

Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhi ễm MG ...................................18

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm...........................19

Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm........................................21

Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm.....................................22

Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AchE trong não, gan theo th ời gian

qua các đợt thu mẫu .......................................................................23

Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO trong não, gan theo thời gian

qua các đợt thu mẫu........................................................................25

Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian

qua các đợt thu mẫu.......................................................................26

Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo th ời gian

qua các đợt thu mẫu.......................................................................27

Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian

qua các đợt thu mẫu.......................................................................28

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm..................................20

Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm..................................22

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long

LMG Leucomalachite green

MG Malachite Green

AchE Acethylcholine

LPO lipid peroxidase

GST Glutathione S-transferase

G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase

CAT Catalase

UBND Ủy ban nhân dân

EU Th ị trường chung Châu Âu

BTS Bộ Thủy Sản

HAE 4- hydroxyalkenals

MDA malondialdehyde

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

DCP 2,4-dichlorphenol

MC-RR micocystin-RR

TCA Trichloroacetic acid

DMSO Dimethyl sulfoxide

TBA Thiobarbituric acid minimum

DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid

CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene

GSH Glutathione 50mM

G-6-P D-glucose 6 phosphat

NADP nicotin ami đe adenine đinucleotide phosphate

viii

LOOP lipid hydrerxdes

CHƯƠNG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đồng Bằng Sông C ửu Long ( ĐBSCL) có kho ảng 600.000 ha di ện tích m ặt nước ngọt, là n ơi có ti ềm năng rất lớn cho vi ệc nuôi các loài cá n ước ng ọt như: Cá tra, basa, vồ đém, hú, tra bần…trong đó cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng được nuôi chính và truy ền thống. Đối tượng này được người nuôi ưa chuộng vì có những ưu điểm như: dễ nuôi, tăng trọng nhanh, kích c ở lớn dễ thích nghi v ới môi trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao.

Trong nh ững năm gần đây, do vi ệc qu ảng bá, thúc đẩy xu ất khẩu mặt hàng cá tra của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam được nâng cao rất nhiều. Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, C ần Thơ năm 2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát tri ển đáng kể, sản lượng loài cá này trong khu v ực An Giang và C ần Th ơ năm 2004 là trên 160.000 t ấn (C ục thống kê An Giang và C ục thống kê Cần Thơ, 2005). Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ thả nuôi t ăng (120-130 con/m 3 trong nuôi bè và 25-35con /m 2 trong nuôi ao đất (Nguyễn Chính, 2005).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tuy nhiên vì mu ốn gia tăng năng suất, sản lượng mà ng ười nuôi đã thả mật độ dày đặc, cho thức ăn thừa dẫn đến môi tr ường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra dẫn đến việc sử dụng các lo ại thuốc, hoá chất trong phòng tr ị bệnh cho thu ỷ sản nuôi là vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị Phương Nga, 2004). Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng như là Malachite Green.

Chất Malachite Green được dùng r ất ph ổ bi ến trên th ế gi ới tr ị các b ệnh nấm bên ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể). Đó là một loại thuốc trị nấm rất công hi ệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các b ể ương cá giống. Ch ất Leucomalachite green (LMG) là ch ất được tạo thành trong quá trình chuyển hóa của Malachite Green và th ường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay Malachite Green không còn t ồn lưu nữa (CFIA, 2005). Chính vì s ự tồn lưu này ảnh hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada, Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng ch ục container cá da tr ơn, cá rô phi và cá trê xuất kh ẩu của các doanh nghi ệp An Giang, Đồng Tháp,…b ị tr ả về do phát hi ện nhiễm chất Malachite Green ( www.vietnam.net, 28/2/2005). Ngoài ra vi ệc sử dụng hoá chất còn ảnh hưởng đến một số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống của cá.

Do đó đề tài : “Nghiên c ứu ảnh hưởng của Malachite Green lên s ự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa và t ồn lưu trong cá tra ( Pangasius hypophthalmus ) giai đoạn giống” được thực hiên là rất cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu và

đào thải của Malachite Green trên cá tra và m ột số biến đổi sinh hóa. Từ đó đề xuất giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn.

Nội dung nghiên cứu:

• Ảnh hưởng của sử dụng Malachite Green lên sự biến đổi Acetylcholine,

lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Catalase trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn giống.

• Phân tích s ự

tồn

lưu Malachite Green trong cá tra (

Pangasius

hypophthalmus) ở giai đoạn giống.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN

2.1.1 Sơ lược về Malachite green

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Malachite Green ( MG) có tên hóa h ọc là Triphenylmethane. MG là một loại bột rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da. MG cũng được dùng trong phòng thí nghi ệm để nhu ộm vi khu ẩn và bào t ử của nó. T ừ lâu MG được xem là ch ất diệt nấm ( lo ại saprolegnia ssp ) và di ệt ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa). MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS04) mà còn gọi là phèn xanh dùng để di ệt ốc, di ệt n ấm và rong rêu trong nông nghi ệp. MG đã được gi ới nuôi tr ồng th ủy sản trên th ế gi ới sử dụng một cách r ộng rãi t ừ lâu để phòng và tr ị bệnh cho cá tôm và h ến. Tại Canada tr ước 1992 các tr ại sản xuất cá giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ng ừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay Canada cũng như hầu hết các qu ốc gia khác trên th ế giới trong đó có Trung Qu ốc và Vi ệt Nam đều nghiêm c ấm vi ệc sử dụng ch ất MG trong vi ệc nuôi tr ồng th ủy sản. Chloramphenicol, Nitrofurans , xanh Malachite được liệt kê trong danh m ục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại VN, MG vẫn còn được các hộ nuôi tr ồng thủy sản sử dụng để vệ sinh ao h ồ, tắm cá tr ước khi th ả chúng vào lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng. Khi vào c ơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leucomalachite Green (LMG). Th ời gian đào thải của MG nhanh, ng ược lại chất LMG có th ể tồn tại trong 1 th ời gian r ất lâu dài trong th ịt và nh ất là trong m ỡ của cá đã bị nhiễm MG.( www.khoahoc.net,22/12/2005)

2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite green.

Công thức cấu tạo [ __ ] [ / \__N(CH2)2 ] [ __ / \__/ ] _ [ / \__C __ + ] Cl [ \__/ \ / \__N (CH2)2 ] [ \__/ ] [ ]

Công thức phân tử : C23H25N2.CL

Một số tên thường gọi:

• Malachite green chloride

• C.i. Basic green 4

• Benzaldehyde green

•

n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene- 1- ylidene) -n-methyl-chloride

• Acryl brilliant green

• Aniline green

• Aizen malachite green

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.1.3 Độc tính Malachite green.

Độc tính của MG có liên h ệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có th ể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và th ời gian ti ếp xúc tăng sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào lúc sáng sớm khi nhi ệt độ nước chưa tăng cao là t ốt nhất. Đặc biệt trong các tháng mùa hè nóng b ức, th ời gian ti ếp xúc khi x ử lý MG nên gi ảm xuống. (Lê Th ị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).

Kết quả thí nghi ệm xác định LC 50 của Malachite Green trên cá da tr ơn (Ictarulus punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn

ệt độ (oC) Th

ời gian (giờ)

LC50 (mg/l) pH Nhi 0,4 7,5 22 6 1,72 8 12 6 1,3 8 12 6 0,286 8 12 24 0,238 7,5 22 6 0,519 9,5 12 6

Kết qủa này cho th ấy nhiệt độ càng tăng thì độc tính của MG càng t ăng. pH càng cao thì độc tính của MG càng cao.

Một nghiên cứu về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm của Trung tâm Nghiên c ứu Độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy MG và LMG làm h ại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình tr ạng mất máu, làm đột biến thay đổi gene (mutagenic) và gây ung th ư (carcinogenic) trên loài chu ột thí nghi ệm. Qua việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có ti ềm năng gây ung th ư cho ng ười. (Sở Nông Nghi ệp An Giang, 2/2/2005).

Năm 2002 Canada c ũng nh ư nhi ều qu ốc gia khác đã nh ận th ấy ch ất Malachite Green có th ể là m ột mối đe dọa cho s ức kh ỏe nên b ắt đầu đề ra nh ững ch ương trình kiểm nghiệm MG ở một số loại cá tôm bán ở thị trường. Các qu ốc gia trong khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa k ỳ và Canada thì cho áp d ụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không ch ấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG. (www.khoahoc.net,22/12/2005).

Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG trong nuôi tr ồng th ủy sản và đề ngh ị tất cả các h ộ nuôi th ủy sản không được sử dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản.

2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới

Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi tr ồng thủy sản thế giới đã có những bước tiến bộ vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để gia tăng năng su ất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhi ễm môi tr ường làm cho thủy sản nuôi ch ết hàng lo ạt, đòi hỏi ng ười nuôi ph ải tìm bi ện pháp kh ắc ph ục, trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu hiệu.

Tháng 6/2005, các c ơ quan ch ức năng Trung Qu ốc đã phát hi ện thấy một vài tỉnh vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi nh ư một chất diệt nấm. Nguyên nhân là do lo ại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua. ( www.vietnam.net).

Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các trại nuôi cá hồi và cá chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày t ừ 15/9/2005 đến 3/10/2005, Cục thanh tra ch ất lượng thủy sản quốc gia Hàn Qu ốc (NEPQIS) đã tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Qu ốc phát hiện thấy MG trong các tr ại nuôi cá ở nước này. Lượng hóa chất tìm thấy dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com, 6/10/2005).

2.2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam.

Sau khi hàng lo ạt lô hàng th ủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hi ện nhiễm kháng sinh c ấm đã gây thi ệt hại lớn về tài chính c ũng như uy tín hàng th ủy sản Việt Nam. Nhà nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa ra và th ường xuyên có rà soát, b ổ sung các quy định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, ổn định và phát tri ển xuất khẩu, đảm bảo nuôi tr ồng thủy sản phát triển bền vững. Tuy nhiên vi ệc chấp hành các quy định của nhà nước là ch ưa triệt để vì th ỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng th ủy sản Việt Nam nh ập khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh c ấm hoặc hoặc vượt quá gi ới hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có gi ới hạn, trong ch ương trình ki ểm soát dư lượng các ch ất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved th ực hiện năm 2003 và 2004 th ỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản, mẫu nước môi trường nuôi nhiễm thuốc, hóa chất bị cấm sử dụng nh ư Choramphenicol, các d ẫn xu ất Nitrofuran, g ần đây và theo di ện rộng là tồn lưu Green Malachite (NAFIQAVED, 2004).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Về tình hình s ử dụng thuốc, hóa ch ất trong nuôi cá tra công nghi ệp ở Đồng Tháp (Phạm Thanh Tu ấn, 2004) ghi nh ận được có 90 lo ại thuốc, hóa ch ất được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: diệt tạp, xử lý nước, trộn vào thức ăn để phòng và trị bệnh. Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên li ệu và ngu ồn gốc không rõ ràng, riêng ch ất MG là ch ất nằm trong danh m ục cấm nhưng vẫn được người nuôi sử dụng ở đây.

Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu v ực Th ốt Nốt, Cần Th ơ, An Giang thì cho bi ết không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện hiện đến 10/64 mẫu trong cá th ương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb. Đối với cá đang nuôi thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - 4,18 ppb. (Nguy ễn Chính, 2005).

2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN

Theo quy định của Bộ Th ủy Sản (2001) thì th ời gian ng ưng sử dụng kháng sinh trước khi thu ho ạch 28 ngày tr ở lên. Vi ện nghiên c ứu và phát tri ển th ủy sản Hàn Quốc –NFRDI (2002) th ử nghi ệm tồn lưu của 2 ch ất Oxytetracyline HCl và Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho k ết quả thời gian đào thải là sau 30 ngày, đối với lươn sự đào thải của Ciprofloxacin và Ofloxacin là sau 35 ngày. Nhiều tài liệu cho th ấy chất MG t ồn lưu trong cá chình nuôi sau khi tr ị bệnh không dưới 100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002).

Theo quá trình theo dõi và phân tích s ự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh trùng cho thấy (vietlinh.com.vn):

Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35ppb

Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10ppb

Sau 3 tháng : MG = 0. Nh ưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn còn.

Vậy thời gian có th ể làm MG không t ồn lưu trong th ịt cá là rõ ràng. Vi ệc tích lủy MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhi ễm MG sẽ tích lủy dần trong thịt và tế bào mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lủy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong thịt. Như vậy nếu tích lủy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng sau khi ăn cá bị nhiễm.

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN C ỨU VỀ CH Ỉ TIÊU SINH HÓA Lipid peroxidase (LPO), Acetylcholinestrease (AChE), Catalase (CAT), Glutathione S- transferease (GST), Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).

Acelthylcholine là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò nh ư một tác nhân d ẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961)

ạo ra malondialdehyde (MDA) và 4-

Lipid peroxidation chất có liên quan đến các tác nhân oxy hóa trong c ơ thể thường góp phân vào các ti ến trình phát sinh b ệnh. Khi oxy hóa lipid nó liên quan đến sự hấp thụ allylic hydrogen bằng việc tạo ra gốc hydroperoxyl để hình thành nên lipid hydroperoxides (LOOPs). LOOPs hydroxyalkenals (HAE) khi phân hủy (Amad và ctv, 2000)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Từ nghiên c ứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ th ấp 10.6 - 32.0 ng/l Endosulfan có th ể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong c ơ th ể của Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm sụt giảm hoạt tính của enzyme Acetylcholinesterase (AChE), hàm lượng protein trong máu.

Theo Pandey và ctv (2000) nghiên c ứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia tăng LPO. Tác gi ả tiến hành thí nghi ệm trên cá Channa punctatus (23 – 50g/con), khi cho tiếp xúc với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa so với đối chứng ở các cơ quan gan, th ận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các nhân tố chống oxy hoá c ũng tăng theo. Theo tác gi ả, sự thay đổi hoạt tính của các nhân tố chống oxy hóa và chỉ số của LPO có thể là chỉ thị sinh học. Như vậy, có thể dựa và s ự thay đổi của LPO để đánh giá s ự tác động của endosulfan lên các đối tượng khác.

Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4D và azinphosmethyl ở gan cá rô phi ( Oreochromis lên các men ch ống oxy hoá và lipid peroxidase niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03ppm azinphosmethyl trong các kho ảng thời gian 24, 48, 72 và 96 gi ờ. Kết quả cho th ấy cá rô phi có kh ả năng chống lại stress oxy hoá b ằng các cơ chế kháng oxy hoá và chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydase. Ho ạt tính G6PD t ăng so với đối ch ứng khi s ử dụng riêng l ẻ 2,4-D sau 24 gi ờ, ở 96 gi ờ không ảnh hưởng đến hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể.

Theo Horsberg và ctv .(1989) thu ốc tr ừ sâu nhóm lân h ữu cơ (Dichlorvos) gây ức chế men AchE trong não cá h ồi (Salmon) mạnh nhất ở nồng độ tồn lưu trong cơ thể cao nhất. Ông cũng cho bi ết việc xác định hoạt tính của men AchE có th ể tin cậy hơn việc phân tích l ượng thuốc tồn lưu khi ch ẩn đoán việc cá hồi có bị nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hay không.

Theo Zinkl và ctv. (1980) và Fleing à Grue (1981) thì n ếu nh ư hoạt tính của men AchE trong não giảm 20% so với đối chứng thì cơ thể xem như là cá có tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ. Chính do sự rất nhạy cảm về hoạt tính của men AchE đối với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ mà có th ể dùng đo hoạt tính của men nh ư là một công cụ trong việc đánh giá môi tr ường có bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ (FanCey và ctv . 1987, Morgan và ctv . 1990) Alexander và ctv . 19..) dã nghiên cứu và đề ngh ị một ph ương phát đơn giản và cho k ết quả nhanh qua vi ệc do tỉ lệ hoạt tính c ủa men AchE để bi ết cá nhi ễm độc thu ốc tr ừ sâu g ốc lân h ữu cơ nh ư parathion, malathin,..

Weiss ( 1958) nghiên c ứu sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá và th ấy rằng mức độ hoạt hóa của AchE trong não b ị ức chế tùy thuộc vào nồng độ thuốc. Ở nồng độ 500mg/kg của Folidol 600 (Methyl parathino làm AchE trong huy ết tương của cá bị ức chế 90% sau 4h thí nghiệm duy trì mức ức chế này trong 4 ngày vài hồi phục 80- 90% múc bình th ường sau 8-10 ngày và đạt được mức bình th ường sau 35 ngày (Silva và ctv 1993).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003). Thí nghi ệm ảnh hưởng của endosufan lên ho ạt động AchE trên não c ủa cá bluegill sunfish ( Lepomis macrochius ). Thí nghiệm được tiến hành gây nhi ễm trong các kho ảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96 giờ và 1 tu ần ở nồng độ 1.0 µg/l (d ựa vào LC 50 của endosulfan đối với cá bluegill sunfish là 1,2 µg/l ). K ết quả cho th ấy hoạt động của AchE trong não gi ảm tương ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%.

J. Zhang và ctv (2004) nghiên c ứu sự ảnh hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol (DCP) trên gan c ủa cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40 ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng.

Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghi ệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến ho ạt động của các men trên gan, mang, não c ủa cá Corydoras paleatus . Tiến hành gây nhi ễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL -1 sau 24 gi ờ. Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL-1 thì LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang v ẫn bình th ường. Đối với hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µgL-1 và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu :

3.1.1 Địa điểm:

Khoa Thủy Sản -Trường Đại Học Cần Thơ

3.1.2 Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2006 đến 06/2006

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm

Bể thí nghiệm có thể tích 0,5 m3

Xô nhựa, cân tiểu ly

Bộ đồ giải phẩu (kéo, nhíp, dao)

Pipet, ống đong

Máy ly tâm, máy so màu quang ph ổ (Thermo, Anh sản xuất)

Dụng cụ, thi ết bị, ph ương ti ện dùng trong thí nghi ệm được sử dụng từ phòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hóa chất thí nghiệm:

Malachite Green 80% hoạt chất (Merck)

Từ kết quả kh ảo sát th ực tế tại Th ốt Nốt, Cần thơ, ng ười nuôi cá th ường sử dụng MG nồng độ 0,05-0,1ppm tắm cá trong thời gian 12 giờ hoặc tắm ở nồng độ cao 1- 2ppm trong th ời gian 30-60 phút m ục đích trị bệnh nấm thủy mi cho cá Tra. Ngoài ra, một số hộ dân tắm cá bằng MG nồng độ 0,1-0,2ppm trong th ời gian 30-60 phút hoặc kết hợp với CuSO 4 0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong th ời gian 15-30 phút. Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1 ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm.

Phương pháp pha Malachite Green thí nghi ệm ở các nồng độ khác nhau

ước cất, khu ấy đều bằng Dung dịch chu ẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít n khuấy từ. Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể. Mỗi bể chứa 410 lít nước.

- Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): l ấy 41 ml dung d ịch chuẩn cho vào b ể chứa 410 lít nước

- Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): l ấy 410 ml dung d ịch chuẩn cho vào b ể chứa 410 lít nước.

3.2.2 Cá thí nghiệm

Cá được mua tại trại cá giống tại Cần Thơ kích cỡ từ 20 - 30g. Cá có màu s ắc sáng,

khỏe mạnh, không bị dị tật, không có dấu hiệu bệnh tật .

3.2.3 Bố trí thí nghiện

Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghi ệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức. Hai nghiệm thức có nồng độ gây nhi ễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghi ệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) ch ứa 410 lít nước, mỗi bể bố trí 50 con.

Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12 giờ.

Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1 giờ.

Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green.

3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu

Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục.

Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là

28%, mỗi ngày cá được cho ăn 2 lần (8h, 16h) .

Các yếu tố nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được theo dõi 2 gi ờ 1 lần trong 2 ngày đầu

thí nghiệm để xem ảnh hưởng của các yếu tố này đến độc tính của MG.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Nhiễm

Không nhiễm

(cid:252) Thu mẫu phân tích sự tồn lưu của MG trong cá tra theo thời gian

Ngày 0 Ngày7 Ngày 30 Ngày 60

Tiến trình thí nghiệm và thu mẫu

Ngày 0: mẫu cá thu ngay sau khi kết thúc gây nghiễm

Ngày 7: mẫu cá thu 7 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước

Ngày 30: mẫu cá thu 30 ngày sau khi k ết thúc gây nghiễm và mẫu nước

Ngày 60: mẫu cá thu 60 ngày sau khi k ết thúc gây nghiễm và mẫu nước

(cid:252) Thu mẫu phân tích s ự biến đổi thành ph ần sinh hoá trên não, gan cá tra d ưới

Không nhiễm

Nhiễm

tác động của MG theo thời gian.

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4

Lần 1: mẫu cá trước khi gây nhiễm MG

Lần 2: mẫu cá sau khi kết thúc gây nhiễm MG

Lần 3: mẫu cá 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm MG

Lần 4: mẫu cá 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm MG

Mẫu nước sau khi thu được tr ữ đông -20 độ cho đến khi phân tích. M ẫu cá được giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi phân tích, ph ần còn lại được xây nhuy ễn và gi ữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng và Thú Y Thu ỷ Sản – Vùng 6. Ph ương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg. 88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) d ựa trên h ệ thống sắc kí HPLC v ới đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb.

3.2.5 Chuẩn bị mẫu

Cân trọng lượng mẫu (A)

Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá

Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH 2PO4/K2HPO4 50mM (pH=7.5) (1:5 w/v)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Cân mẫu (bao gồm mẫu và dung dịch đệm) (B)

Mẫu phân tích (AchE, CAT, GST, G6PD ) (D) M ẫu phân tích LPO(C)

Lấy phần nổi (trữ -80oC đến khi phân tích )

Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4 oC) Trữ -80oC đến khi phân tích

3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu:

Phân tích Acetylcholinestrease (AchE)

Nguyên tắc:

Hoạt tính c ủa AchE được xác định theo ph ương pháp c ủa Ellman và ctv (1961). Phương pháp này s ử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) nh ư là c ơ ch ất của AchE. ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate b ởi AchE và thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) t ạo ra sản phẩm có màu vàng. C ường độ màu d ần đậm theo th ời gian và ho ạt tính của AchE được đo bằng máy so màu quang phổ.

Phương trình phản ứng minh họa

Acetylthiocholine iodide AchE thiocholine + acetae

Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate s ản phẩm có màu vàng

Quá trình phân tích:

Chuẩn bị hóa chất:

- DTNB 167µM: 66.1mg/ml sodium phosphate 50mM, pH = 7.5

- Acetylthiocholine iodine (c ơ ch ất) 30mM: 8,67mg Acetylthiocholine iodine/1ml sodium phosphate, pH = 7.5

Bảng 2: Quá trình phân tích AchE

Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl)

150 100

Hóa chất DTNB ( 150 µM nồng độ cuối) 800 800 Sodium phosphate Mẫu / 50 Cơ chất (1.5mM nồng độ cuối) 50 50

Hoạt tính AchE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5 phút

Công thức tính

Abs * pha loãng

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

R = ----------------------------------------------------

(thể tích mẫu (ml) * 0.0136)/protein (mg/ml)

R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein

0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuy ển thành thiocholine và acetate.

Lipid peroxidation

Nguyên tắc

LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ sung. Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5% và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma). Sau khi ủ hỗn hợp trong 15 phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi. Sau đó cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút. Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang phổ.

Chuẩn bị đường chu ẩn: sử dụng malondialdehyde (MDA) làm đường chuẩn và

chuẩn bị như sau:

Bảng 3: Cách chuẩn bị đường chuẩn MDA

Nồng độ MDA Th ể tích pha loãng Dung dịch chuẩn 500µM

ịch chuẩn + 4ml nước ịch 1 + 2ml nước ịch 2 + 4ml nước ịch 3 + 2ml nước ịch 4 + 2ml nước ịch 5 + 2ml nước ịch 6 + 2ml nước 1 100µM 1ml dung d 2 50µM 2ml dung d 3 10µM 1ml dung d 4 5µM 2ml dung d 5 2.5µM 2ml dung d 6 1.25µM 2ml dung d 7 0.625µM 2ml dung d 8 0µM n ước

Sau đó lấy 1ml th ể tích pha loãng ở các nồng độ của MDA làm đường chu ẩn. Sử dụng đường chuẩn với malondialdehyde (MDA) cho phép xác định được LPO th ể hiện qua nmole MDA tương đương/g mẫu.

Glutathione S-transferase

Nguyên tắc

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

GST được phân tích theo ph ương pháp c ủa (Habig và ctv, 1974). Để đo ho ạt tính của GST c ơ ch ất được sử dụng là 1-chloro-2,4-, dinitrobenzen (CDNB), m ột hợp chất có tính kỵ nước. Nhìn chung CDNB có ái l ực với enzyme phân tích hơn các cơ chất khác và nó c ũng là đồng cơ chất trong quá trình chuy ển hóa của nhiều enzyme đồng đẳng với GTS. Ngoài ra glutathion (GSH) c ũng là đồng cơ ch ất trong ph ản ứng.

CDNB + GSH CDNB – GS + HCl

Hoạt tính của đựoc đo bằng máy so màu quang ph ổ thông qua độ hấp phụ của cơ chất (CDNB-GSH) ở bước sóng 340nm trong 3 phút

Quá trình phân tích:

Chuẩn bị hóa chất:

- HEPES: cách pha HEPES

- 50mM CDNB : 50.5mg CDNB/5ml ethanol).

- 50mM GSH: 76,83mg/5ml dung d ịch HEPES, pH = 7.5

Bảng 4: Quá trình phân tích GST

Hóa chất (µl) Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl)

HEPES 700 700 CDNB ( nồng độ cuối 1.5mM ) 30 30 H2O 240 220 GSH 30 30 Mẫu / 20

Công thức tính:

Hoạt tính của GST = (A340/min – Ablank) x độ pha loãng x coff.ExMol CDNBcoeff = 9.6mM -1cm-1 9.6mM-1cm-1 hệ số CDNB chuyển thành CDNB – GS + HCl dưới tác dụng của GST

Đơn vị tính của GST là nmol/mg protein/phút

Glucose-6-phosphate dehydrogenase ( G6DPH)

Nguyên tắc:

D- glucose-6-phosphat + NAD(P) (cid:243) D-gluconod-lactone-6-phosphat + NAD(P)H 2 Quá trình phân tích

Chuẩn bị hóa chất:

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu - Tris- HCl buffer 1M, pH = 7.8: 121g Tris- HCl /1000ml H 2O

- MgCl2 0.2M : 10,15g/250ml H2O

- Nicotin ami đe adenine đinucleotide phosphate (NADP) 50mM: 76,5mg

NADP/2ml H2O

- Hỗn hợp G6PDH bao gồm: 2,36 ml Tris- HCl 1M, pH = 7.8 + 1,2ml MgCl 2

0.2M + 0,48ml NADP 50mM + 15,96ml H 2O.

- 17,89mM G6P (D-glucose 6 phosphate) : 12,16mg G6P/2ml H 2O

Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH

Hóa chất Mẫu Mẫu trắng hiệu chỉnh máy Mẫu trắng hiệu chỉnh mẫu

G6PDH mix (µl) 600 600 600 H2O (µl) 400 390 360 Mẫu (µl) / 10 10 G6P (µl) / 30

Hoạt tính G6PDH được đo bằng máy so màu quang ph ổ ở bước sóng 340 nm trong 3 phút.

Cách tính:

AOD ( AOD Test-AOD blank) x tổng thể tích(ml)x hệ số pha loãng

Hoạt tính của G6PD =

6.22 x 1.0 x th ể tích mẫu (ml)

Đơn vị tính của G6PD là nmol NADPH/phút/mg protein

Chú ý: m ẫu não pha loãng 2 l ần, mẫu gan pha loãng 2 l ần, pha loãng m ẫu bằng dung dịch đệm potasium phosphate 50mM

Catalase (CAT)

Nguyên tắc :

2H2O2 2H2O + O2

Catalse là enzyme hi ện diện trong peroxisom c ủa hầu hết các tế bào hi ếu khí và có chức năng bảo vệ tế bào ch ống lại độc chất hydrogen peroxide b ằng việc phân hu ỷ H2O2:

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CAT được xác định theo ph ương pháp c ủa Baudhuin và ctv , 1964 có b ổ sung. Trước tiên, dung d ịch đầu BC được chu ẩn bị gồm 1 g (BSA); 100 ml Imidazol buffer 0.2M, pH 7.0 . Sau đó, một lượng H2O2 30% thích hợp được sử dụng là 40 µl H2O2 30% cho vào 250 ml of BC t ạo thành dung d ịch SC. Chu ẩn bị 0.75 ml TiOSO4 vào 1.25 ml SC và đọc ở bước sóng 420 nm. Độ hấp th ụ ph ải nằm trong khoảng 0.75 và 0.95. Hỗn hợp phản ứng gồm 1250µl SC, 25µl Triton X-100 0.02%, 12.5µl mẫu, được ủ khoảng 6 phút ở 0o C. Sau đó, 750µl of TiOSO 4 được thêm vào để dừng phản ứng. Độ hấp thụ được đo ở 420 nm bằng máy so màu quang ph ổ. Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme tạo ra sự phân hu ỷ 90% cơ chất trong một phút.

Quá trình phân tích:

Hoá chất

Mẫu (µl)

Bảng 6: Quá trình phân tích CAT

SC 1250 / / BC / 1250 1250

Triton X- 100 25 25 25

Phosphate buffer 12.5 25 12.5

ở Oo C

Mẫu 12.5 / / Ủ mẫu trong 6 phút TiSO4 750 750 750

Đọc ở bước sóng 420nm sau 5 đến 10 phút

Mẫu trắng 1 (µl) Mẫu trắng 2 (µl)

Đơn vị tính hoạt tính CAT là U/mgprotein.

Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần

Cách tính CAT(U/mg protein)= logSC-log(h ấpthụ)*V(ml) phản ứng/V(ml) SC/V (ml) mẫu/T(phút) phản ứng * độ pha loãng/mg protein

Prôtêin

Nguyên tắc:

Protein được phân tích theo ph ương pháp Lowry, 1951 s ử dụng Albumine bovine làm đường chu ẩn. Trong môi tr ường kiềm đồng sẽ tạo ph ức với protein. Khi ch ất folin phenol được đưa vào, folin phenol s ẽ kết dính v ới protein. Ph ản ứng này là phản ứng khử và chuyển màu từ màu vàng sang màu xanh.

Quá trình phân tích:

Chuẩn bị hóa chất:

- BSA: 10mg/mlH2O

- Hỗn hợp A :150ml Na 2CO3 2% + 1,5ml CuSO 4 1% + 1,5ml NaK Tartrate

2%.

- Folin : 10ml Folin + 10ml H2O

Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin

Đường chuẩn Mẫu

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hóa chất 0 mg 0.05 mg protein 0.1mg protein 0.2 mg protein 0.5 mg protein

protein BSA 0µl 5 µl 10 µl 20 µl 50 µl / Mẫu / / / / / 10 H2O 500 µl 495 µl 490 µl 480 µl 450 µl 490 µl NaOH 1N 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Ủ trong 30 – 120 phút Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ trong 15 phút Folin 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

Ủ trong 30 phút Đọc ở bước sóng 660nm

Hoạt tính protein được đọc ở bước sóng 660nm b ằng máy so mày quang ph ổ. Đơn vị tính của protein là mg protein/ml

3.3. Xử lí số liệu

Tất cả số liệu về sinh hóa nh ư AchE, LPO, GST, CAT, G6DP được kiểm tra dạng phân ph ối tr ước khi x ử lý th ống kê. S ố li ệu phân ph ối chu ẩn được xử lý b ằng phương pháp phân tích ph ương sai one-way ANOVA và dùng Post hoc, Duncan test so sánh với đối chứng. Phần mềm Satistica 5.0 được dùng để xử lý thống kê.

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

ời gian gây nhi ễm

4.1 Bi ến động nhi ệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong th Malachite Green

Các chỉ tiêu nhi ệt độ, oxy hoà tan, pH được ghi nh ận trong quá trình ti ến hành thí nghiệm trong th ời gian hai ngày tính t ừ khi gây nhi ễm với MG, ghi nh ận các ch ỉ tiêu 2 gi ờ 1 l ần sau đó lấy trung bình gi ữa bu ổi sáng và bu ổi chi ều để xem ảnh hưởng của chúng đến quá trình biến đổi MG trong cơ thể cá.

Nhiệt độ

Ngày 1 Ngày 2

Nghiệm thức

Trung bình 2 ngày

Sáng Chi

ều Sáng Chi

ều

Đối chứng 29,1±0,,19

29,5±0,22

29,8±0,45

29,2±0,10

30,4±0,06

0,1 ppm 28,7±0,20

29,4±0,25

29,8±0,28

29,2±0,06

30,3±0,00

1 ppm 29,1±0,07

29,6±0,35

30,2±0,06

29,8±0,06

30,4±0,41 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG

Qua bảng 8 cho th ấy nhi ệt độ trung bình dao động trong kho ảng 29,4 ±0,25 đến 29,6±0,35oC. Nhiệt độ buổi chiều (30,4±0,41oC) luôn cao hơn buổi sáng (28,7±0,20oC) do ảnh hưởng của ánh sáng m ặt trời. Toàn bộ hệ thống thí nghi ệm bố trí trong mái che nên nhiệt độ khá ổn định và khoảng chênh lệch trung bình giữa 2 buổi là 1,2 oC. Nhiệt độ trung bình ngày vào kho ảng 29,5 oC thích hợp cho s ự sinh tr ưởng và phát triển của cá tra. Theo Đỗ Thị Bích Ly (2004) cá tra có th ể sinh tr ưởng và phát tri ển tốt ở 26-30 oC. Gi ữa các nghi ệm thức sự khác bi ệt về nhi ệt độ nằm trong gi ới hạn không lớn hơn 1oC. Điều này cho th ấy nhiệt độ hầu như đồng nhất trong quá trình thí nghiệm.

Ngoài ra độc tính của MG có liên h ệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ r ệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào lúc sáng s ớm khi nhi ệt độ nước ch ưa tăng cao là t ốt nh ất. Đặc biệt trong các tháng mùa hè nóng b ức, thời gian ti ếp xúc khi x ử lý MG nên gi ảm xuống. (Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).

Theo Bill và ctv (1977) độc tính của MG tác động lên cá s ẽ tăng theo s ự tăng của nhiệt độ. Cá nheo gi ống (Italurus punctatus ) ở pH là 7,5 th ời gian thí nghi ệm là 6 giờ, LC50 ghi nhận được ở nhiệt độ 12oC là 0,96mg/l trong khi đó ở nhiệt độ 22oC là 0,23mg/l.

Ngày 1 Ngày 2

Nghiệm thức

Trung bình 2 ngày

Sáng Chi

ều Sáng Chi

ều

Đối chứng 6,89±0,4

6,47 ± 0,38

6,32±0,96

6,42±0,02

6,26±0,14

0,1 ppm 6,87±0,43

6,47 ± 0,33

6,35±0,86

6,48±0,02

6,19±0,01

1 ppm 7,26±0,23

6,66 ± 0,32

6,48±0,89

6,46±0,01

6,42±0,15

Bảng 9: pH trong quá trình gây nhi ễm MG

ất là 7,26±0,23) và bu

Giá tr ị pH trong cùng nghi ệm thức hay gi ữa các nghi ệm thức dao động không l ớn hơn 1 đơn vị từ 6,47 ± 0,33 đến 6,66 ± 0,32. Giá tr ị pH trung bình trong bu ổi sáng (thấp nh ất là 6,42±0,02 và cao nh ổi chi ều (th ấp nh ất là 6,19±0,01 và cao nh ất là 6,48±0,89) tuy có s ự chênh l ệch nh ưng vẫn nằm trong khoảng thích hợp. Theo Dương Nhật Long (2002) thì kho ảng pH thích cho mô hình nuôi cá thâm canh trong ao đất là 6,0 - 8.

Giá trị pH ảnh hưởng trực tiếp đến độc tính của MG, pH càng cao thì độc tính của MG càng t ăng (Bill và ctv , 1977). Cá nheo gi ống (Italurus punctatus ) ở nhi ệt độ 12oC thời gian thí nghi ệm là 6 gi ờ, LC50 ghi nhận được ở pH 8,0 là 1,72 mg/l trong khi đó ở pH 9,5 là 0,52 mg/l.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Oxy hoà tan

Ngày 1 Ngày 2

Nghiệm thức

Trung bình 2 ngày

Sáng Chi

ều Sáng Chi

ều

Đối chứng 4,71±0,25

3,77 ± 0,20

2,96±0,17

2,72±0,04

4,41±0,35

0,1 ppm 4,85±0,19

3,95 ± 0,16

3,02±0,08

3,65±1,24

4,43±0,06

1 ppm 4,31±0,53

3,76 ± 0,41

2,85±0,22

2,67±0,18

4,17±0,12

Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhi ễm MG

Oxy hoà tan (DO) gi ữa các nghi ệm th ức thí nghi ệm không có s ự khác bi ệt lớn nhưng có sự chênh lệch giữa buổi sáng và bu ổi chiều. Buổi sáng DO cao h ơn buổi chiều khoảng 1 mg/l, trung bình DO trong ngày dao động trong khoảng 3,76 ± 0,41 mg/l – 3,95 ± 0,16 mg/l. Theo Tr ần Bình Tuyên (2000) hàm luợng DO phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cá khoảng 2,2-4,56 mg/l, DO thích h ợp cho ao nuôi thâm canh là 3,5-6,5 ppm (được trích dẫn Đỗ Thị Bích Ly, 2004).

Nguyễn Văn Công và ctv (2006) ti ến hành thí nghi ệm ảnh hưởng của nhiệt độ (24- 30-34oC) và oxy hoà tan ( DO < 2 và DO > 5 mg/l) lên kh ả năng ức chế hoạt tính cholinesterase (ChE) c ủa Basudin 50EC (diazinon) ở cá lóc gi ống (Channa striata)

có tr ọng lượng trung bình 18,47 ±2,49g. Kết qu ả cho th ấy trong điều ki ện bình thường nhiệt độ, DO không làm ảnh hưởng đến hoạt tính ChE. Trong môi tr ường có Basudin thì DO không làm ảnh hưởng đến mức độ ức chế ChE mà ch ỉ có nhi ệt độ ảnh hưởng mạnh đến ức ch ế này, nhi ệt độ càng cao thì m ức độ ức ch ế càng t ăng (ngoại tr ừ gan). K ết qu ả cho th ấy cá lóc có nhi ều nguy c ơ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi việc sử dụng Basudin dưới điều kiện môi trường trên đồng ruộng

Nhìn chung các y ếu tố nhi ệt độ, DO, pH đều nằm trong kho ảng thích h ợp cho s ự sinh trưởng và phát tri ển của cá tra, gi ữa các nghi ệm thức không có s ự chênh lệch nhiều. Do đó nhi ệt độ, DO, pH không ph ải là điều ki ện ảnh hu ởng đến các ho ạt động sinh lý, sinh hoá của cá tra.

4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra gi ống

4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green

Tổng lượng tồn lưu của MG và LMG được trình bày ở bảng 11 và hình 1

Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm

Nghiệm thức Ngày 0 Ngày 7 Ngày 30 Ngày 60

(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

0,1 ppm 1003±54,7 2,01±1,88 6,28±3,04 107±43,0

1 ppm 2569±402 110±22,98 10,6±4,70 1,50±2,59

Kết quả phân tích cho th ấy tổng lượng tồn lưu MG và LMG trong cá vào ngay th ời điểm kết thúc gây nhi ễm MG (Ngày 0) t ương ứng là 1003±54,7 µg/kg (n ồng độ 0,1ppm) và 2569±402 µg/kg (n ồng độ 1ppm). K ết quả cho th ấy sự tồn lưu MG và LMG ngay sau khi s ử dụng là rất cao. S ự tồn lưu của MG và LMG gi ảm dần theo thời gian và đến ngày thứ 60 sau khi kết thúc gây nhiễm thì tổng hàm lượng MG và LMG còn l ại trên cá là 2,01±1,88 µg/kg (n ồng độ 0,1ppm) 1,50±2,59 µg/kg (n ồng độ 1ppm) trong đó hàm lượng LMG không được phát hiện trong mẫu cá.

Malachite green + Leuco Malachite gre e n

35 0 0

30 0 0

0,1 pp m

25 0 0

1 pp m

20 0 0

15 0 0

b p p

10 0 0

50 0

Ngày 0Ngày 7Ngày 30Ngày 6 0

Ngà y

Mala chite gre en + Leuco Malachite gree n

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

0,1 pp m

1 0.6 1

1 p p m

b p p

6.2 8 3

2.0 1 1. 5

1 6 1 4 1 2 1 0 8 6 4 2 0

Ngày 30Ng ày 6 0

Ngà y

Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm

Qua các dữ liệu trên cho thấy có sự đào thải của MG và LMG ra kh ỏi cơ thể cá theo thời gian. Tuy nhiên k ết quả phân tích m ẫu nước sau 7 ngày thí nghi ệm thì không phát hiện được MG và LMG trong m ẫu nước phân tích v ới giới hạn phân tích c ủa phương pháp là 1 ng/ml (1ppb)

Các quốc gia trong kh ối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa c ủa MG và LMG trong s ản ph ẩm th ủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa k ỳ và Canada thì cho áp d ụng nguyên t ắc zero tolerance, ngh ĩa là không ch ấp nh ận sự

ật th ấp của MG và LMG.

hiện di ện của bất kỳ 1 d ư lượng nào dù là th (www.khoahoc.net,22/12/2005). Kết quả thí nghi ệm sau 60 ngày cho th ấy vẫn còn sự hiện diện của MG ( 2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb). Ba m ẫu trong sáu mẫu phân tích xác định có hàm l ượng MG cao h ơn mức giới hạn 2 ng/g. Điều này cho th ấy sau thời gian 60 ngày gây nhi ễm thì hàm l ượng MG vẫn còn tồn lưu trong cá. K ết quả ở nghi ệm th ức gây nhi ễm với nồng độ 0,1ppm trong th ời gian 12h là 2,01±1,88ppb cao h ơn so v ới mức gi ới hạn quy định của Liên minh Châu Âu và Châu Úc trong khi đó ở nghiệm thức gây nhi ễm với nồng độ 1ppm trong th ời gian 1h thì sau 60 ngày hàm l ượng MG tồn lưu trung bình là 1,50±2,59ppb, th ấp hơn so với mức giới hạn của Liên minh Châu Âu và Châu Úc. C ả hai mức tồn lưu này đều không được chấp nhận theo quy định của FDA Hoa Kì.

Theo Nguyễn Chính (2005) một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang cho bi ết không s ử dụng MG trong quá trình nuôi nh ưng qua phân tích thì hiện diện đến 10/64 mẫu trong cá th ương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb. Đối với cá đang nuôi thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - ị 4,18 ppb. Nhi ều tài li ệu cho th ấy chất MG t ồn lưu trong cá chình nuôi sau khi tr bệnh không dưới 100 ngày, v ới cá hồi chấm là không d ưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002).

4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm

Nghiệm thức Ngày 0 Ngày 7 Ngày 30 Ngày 60

(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg)

0,1 ppm 821±54 22,22±2,72 3,64±0,43 2,01±1,88

1 ppm 2106±157 29,01±1,18 7,41±4,04 1,50±2,59

Kết quả phân tích (B ảng 12) cho th ấy sau khi gây nhi ễm MG với nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12 giờ và nồng độ 1 ppm trong thời gian 60 phút cho th ấy sự tồn lưu MG tương ứng là 821±54 µg/kg (n ồng độ 0,1ppm) và 2106±157 µg/kg (n ồng độ 1ppm). Kết quả cho thấy sự tồn lưu MG ngay sau khi s ử dụng là rất cao. Tuy nhiên sau 7 ngày gây nhi ễm sự tồn lưu của MG giảm xuống còn 22,22±2,72 µg/kg(n ồng độ 0,1ppm) và 29,01±1,18 µg/kg (n ồng độ 1ppm). S ự tồn lưu của MG gi ảm dần theo thời gian và đến ngày thứ 60 sau khi gây nhi ễm thì hàm lượng MG còn lại trên cá là 2,01±1,88 µg/kg (n ồng độ 0,1ppm) 1,50±2,59 µg/kg (n ồng độ 1ppm). Sự giảm dần tồn lưu MG trong cá tra theo thời gian được thấy rõ hơn trong hình 2.

p p b

Malachite gre en&LeucoMala chite gr ee n

2 5 0 0

2 0 0 0

1 5 0 0

1 0 0 0

MG 0, 1 pp m MG 1 pp m LM G 0,1 p p m LM G 1p p m

5 0 0

Ngà y

Ng ày 0Ng ày 7Ng ày 30Ng ày 6 0

Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm

4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green

Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm

Nghiệm thức Ngày 0 Ngày 7 Ngày 30 Ngày 60

0,1 ppm 182±3,45 84,7±41,1 2,88±2,23 0,00±0,00

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1 ppm 156±31,9 80,7±21,8 2,92±1,07 0,00±0,00

ồng độ 0,1ppm) và

Qua bảng 13 cho th ấy sau khi gây nhi ễm MG với nồng độ 0,1 ppm trong th ời gian 12 gi ờ và n ồng độ 1 ppm trong th ời gian 60 phút cho th ấy có s ự chuy ển hoá của MG thành LMG t ồn lưu trong cơ thể cá. Hàm lượng LMG được chuyển hoá từ MG ngay sau khi gây nhi ễm tương ứng là 182±3,45 µg/kg (n 156±31,9 µg/kg (n ồng độ 1ppm). Kết quả cho th ấy sự chuyển hoá nhanh chóng t ừ MG sang LMG ngay sau khi s ử dụng là rất cao. Tuy nhiên sau 30 ngày gây nhi ễm sự tồn lưu của LMG gi ảm xuống nhanh chóng 2,88±2,23 µg/kg (n ồng độ 0,1ppm) và 2,92±1,07 µg/kg (n ồng độ 1ppm). Sự tồn lưu của LMG gi ảm dần theo th ời gian và đến ngày th ứ 60 sau khi gây nhi ễm thì hàm l ượng LMG không còn phát hi ện trong mẫu cá với giới hạn phân tích của hệ thống phân tích là 1 µg/kg (1ppb). Hình 2 cho thấy rõ hơn sự giảm dần tồn lưu LMG trong cá tra theo thời gian.

Kết quả vẫn chưa được khẳng định hoàn toàn rằng LMG sau 60 ngày gây nhi ễm thì được đào th ải hoàn toàn nguyên nhân chính là do ph ương pháp phân tích ch ỉ dựa trên hệ thống sắc kí HPLC v ới đầu dò hu ỳnh quang nên gi ới hạn phát hi ện (LOD) chỉ đến 1ppb trong khi đó nếu phân tích bằng hệ thống sắc kí lỏng khối phổ thì giới hạn phát hiện LOD rất thấp (0,01 ppb).

4.3 Sự biến đổi của các ch ỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm.

4.3.1 Ho ạt tính c ủa Acetylcholinestrease (AChE) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm

Cơ quan Nghi

ệm thức

Lần 3

Lần 4

Lần 2

Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AChE (nmole/phút/mg protein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu

Lần 1

Não

Đối chứng 2103 ± 774 2317 ± 35 2392 ± 111 2349 ± 86

0,1ppm 2353 ± 137 ns 2050 ± 251ns 1847 ± 246ns 1897 ±137ns 1ppm 2031 ± 495ns 2054 ± 72*

1404 ± 208* (41%)

1340 ±103* (43%)

(11%)

Đối chứng 1722 ± 304 1909 ± 367 1680 ± 134 1212 ± 44

Gan 0,1ppm 1548 ± 292ns 1054 ± 37*

1609 ± 148ns 1097 ± 128ns

(45%)

1ppm 1909 ± 367ns 1488 ± 31ns 1487 ± 464ns 1177 ± 37ns

Kết quả trình bày trung bình ± SD. D ấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng. Số liệu trong ngoặc là tỷ lệ ức chế (%)

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Acetylcholinestrease (AChE) là m ột ch ất hoá h ọc thần kinh đóng vai trò nh ư một tác nhân dẫn truyền thông tin qua các th ể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961). Kết quả của bảng 14 cho th ấy hoạt tính của AChE ở cá tra trong não 2103 ± 774 (nmole/phút/mg protein) cao h ơn ở gan 1722 ± 304 (nmole/phút/mg protein) ở trạng thái không ch ịu tác động của MG (L ần 1). Sau khi có s ự tác động của MG thì ho ạt động của AChE bị ức chế một cách đáng kể và mức độ ức chế này còn phụ thuộc vào nồng độ của MG trong thí nghi ệm, thời gian gây nhi ễm với MG. Hoạt động AChE b ị ức chế thể hiện rõ nét ở não, đặc biệt ở nồng độ gây nhi ễm 1 ppm trong thời gian 60 phút 2054 ± 72 (nmole/phút/mg protein) gi ảm 11% và khác biệt có ý ngh ĩa th ống kê (p<0,05) so v ới đối ch ứng, trong khi đó ở nồng độ gây nhiễm 0,1 ppm trong th ời gian 12 giờ thì không khác bi ệt so với đối chứng. Sau khi chuyển cá ra môi tr ường nước không chứa MG, nghiệm thức 1ppm MG, ho ạt động AChE vẫn bị ức ch ế và không có d ấu hi ệu hồi ph ục, 1404 ± 208 (nmole/phút/mg protein) ( ức chế 41 % so với đối chứng) ở 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm (lần 3) và 1340 ± 103 (nmole/phút/mg protein) ( ức chế 43 % so v ới đối chứng) ở 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.

Trong khi đó hoạt động của AChE trong gan thì không ch ịu ảnh hưởng bởi sự tác động của MG ở nồng độ 1ppm trong th ời gian 60 phút. Ho ạt động của AChE trong gan ch ỉ bị tác động của MG ở nồng độ 0,1ppm trong th ời gian 12gi ờ gây nhi ễm, 1054 ± 37(nmole/phút/mg protein), ức chế 45% so v ới đối chứng và khác bi ệt có ý nghĩa th ống kê so v ới đối ch ứng (P<0,05). Tuy nhiên s ự ức ch ế của AChE trong gan không di ễn ra lâu mà đã có s ự ph ục hồi ho ạt động của AChE t ừ 1054 ± 37

(nmole/phút/mg protein) ( ức ch ế 45 % so v ới đối ch ứng) tăng lên 1609 ± 148 (nmole/phút/mg protein) không khác bi ệt có ý ngh ĩa th ống kê so v ới đối ch ứng (P<0,05) sau 12giờ và 4 ngày kể từ khi kết thúc gây nhiễm.

Gan là cơ quan có ch ức năng quan tr ọng trong su ốt quá trình gi ải độc sau khi xâm nhập vào cơ thể, nhiều loại men có ch ức năng oxy hóa hay gi ải độc của đa số sinh vật đều do gan s ản sinh ra. Th ời gian gây nhi ễm ngắn (1giờ) dù ở nồng độ cao (1 ppm) sự ức ch ế ho ạt tính AChE ở gan đã không x ảy ra trong khi đó mặc dù v ới nồng độ th ấp 0,1 ppm nh ưng cá ti ếp xúc v ới MG trong th ời gian dài (12 gi ờ) thì hoạt tính AChE bị ức chế.

Các nghiên cứu cũng đã chứng minh sự biến đổi của AChE khi bị tác động bởi một tác nhân hoá h ọc. Trichlorfon là m ột loại thu ốc trừ sâu g ốc lân hữu cơ được dùng trong nuôi tr ồng thu ỷ sản để di ệt ngo ại kí sinh. Thí nghi ệm ảnh hưởng của Trichlorfon ở 2 nồng độ 0,25mg/L trong th ời gian 1 gi ờ và 0,5mg/L trong th ời gian 24 giờ lên ho ạt tính AChE ở não cá chép g ần trưởng thành. K ết quả cho th ấy hoạt động AChE ở thời gian gây nhi ễm 24 gi ờ giảm 55-57% so v ới đối chứng và ph ục hồi lại tr ạng thái bình th ường sau 7 ngày (Aruni Udara Chadrasekara và Asoka Pathiratne, 2005).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Nguyễn Văn Công và ctv (2006) nghiên c ứu ảnh hưởng của Diazon lên ho ạt tính của men cholinesterase (ChE) ở ba mức nồng độ 0,016mg/l, 0,079mg/l và 0,35mg/l trong 4 ngày trong h ệ th ống bể composite có s ục khí liên t ục. Kết qu ả cho th ấy Diazon làm gi ảm hoạt tính ChE ở nồng độ 0,016mg/l. S ự ức chế này gia t ăng theo sự gia tăng của nồng độ. Hoạt tính ChE chỉ phục hồi hoàn toàn ở nồng độ 0,016mg/l khi kết thúc thí nghiệm

T. Balint và ctv (1995) nghiên c ứu ảnh hưởng thuốc trừ sâu Methidathion (MD) và Deltamethein (DM) làm bi ến đổi ho ạt tính AChE ở não loài cá chép tr ưởng thành (Cyprinus Carpio L), ở nồng độ trị bệnh 2 mg/l MD sau 5 ngày gây nhi ễm làm giảm 70-90% hoạt tính AChE ở cơ quan não, trong khi đó ở nồng độ 2 mg/l DM sau 3 ngày không thâý được sự biến đổi của hoạt tính AChE.

Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003) thí nghi ệm ảnh hưởng của endosufan lên hoạt động AChE trên não c ủa cá Lepomis macrochius . Thí nghi ệm được tiến hành gây nhiễm trong các kho ảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96 gi ờ và 1 tu ần ở nồng độ 1,0 µg/l (dựa vào LC50 của endosulfan đối với cá Lepomis macrochius là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AChE trong não giảm theo sự gia tăng của thời gian gây nhiễm tương ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%.

Theo Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ th ấp 10,6 – 32,0 ng/l Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong c ơ th ể của Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn gi ống, làm gi ảm ho ạt tính c ủa men Acetylcholinesterase (AChE).

Silva và ctv (1993) cho r ằng ho ạt tính AChE trong huy ết tương cá Callichthys b ị hoá chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ methy parathium (ở nồng độ dưới mức gây chết ) ức chế 90% sau 4 gi ờ gây nhiễm và duy trì mức ức chế này trong 4 ngày, sau đó khôi phục ở 8-10 ngày kế tiếp và đạt 80-90% mức bình thường sau 35 ngày.

Như vậy hoạt động AchE trong não cá tra nh ạy hơn ở gan hay s ố lượng men AchE có sẵn trong não nhi ều hơn ở gan. Ở nồng độ gây nhiễm 1ppm trong th ời gian 1giờ hoạt động AchE trong não cá tra không th ể phục hồi trở lại có th ể do th ời gian để giải phóng men này kh ỏi sự ức chế là lớn hơn thời gian cơ thể cá tái t ạo một men mới.

4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm

ệm thức

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Cơ quan Nghi Não

Đối chứng 4,3 ± 1,04 2,64 ± 0,67 3,95 ± 0,84 4,12 ± 1,27

0,1ppm 3,44 ± 0,89 ns 8,81 ± 0,43 *

13,9 ± 3,99*

10,89 ± 2,06 * 13,9 ± 1,33 *

10,0 ± 2,62*

Đối chứng 27,03 ± 1,7 27,00 ± 5,88 29,6 ± 1,97 26,61 ± 1,97

Bảng 15: Bi ến đổi hàm lượng của LPO (nmol TBARS /g m ẫu) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

1ppm 2,64 ± 0,67ns 10,4 ± 3,53 * Gan 0,1ppm 19,76 ± 2,76 ns 32,43 ± 8,33ns 33,38 ± 4,84ns 33,38 ± 4,84ns 1ppm 27,00 ± 5,88 ns 26,76 ± 7,51ns 27,95 ± 3,97ns 27,95 ± 3,97ns

Kết quả trình bày trung bình ± SD. D ấu sao (*) chỉ sai khác có ý ngh ĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng.

ơ th ể

Lipid peroxidation là ch ất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong c thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh (Jollon và ctv, 1974).

Vào thời điểm kết thúc quá trình gây nhi ễm và 12h và 4 ngày k ể từ khi kết thúc quá trình gây nhi ễm hàm l ượng LPO trong não cá t ăng lên đáng kể và khác bi ệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so v ới đối chứng lần lượt là 8,81 ± 0,43; 10,89 ± 2,06 và 13,9 ± 3,99 (nmol TBARS /g) mẫu ở nồng độ gây nhi ễm là 0,1ppm và 10,4 ± 3,53; 13,9 ± 1,33; 10,0 ± 2,62 (nmol TBARS /g) mẫu ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm.

Đối với gan, tác động gây nhi ễm MG không ảnh hưởng đến hàm lượng LPO trong gan, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng qua từng giai đoạn.

Khi gây nhi ễm MG với cá trong th ời gian 12h ở nồng độ 0,1 ppm; 1ppm trong 1h thì hoạt tính LPO trong não t ăng lên. Do não là c ơ quan trung ương cho tất cả hoạt động sống trong cơ thể cá khi tiếp xúc trực tiếp với MG thì não bị ảnh hưởng nhanh nhất làm cho cá bị streess.

Pandey và ctv (2000) nghiên c ứu về cơ ch ế gây độc của endosulfan làm gia t ăng LPO. Tác gi ả tiến hành thí nghi ệm trên cá Channa punctatus (23-50g/con), khi gây nhiễm với endosulfan n ồng độ thấp 5ug/l, k ết quả LPO gia t ăng có ý ngh ĩa so với

đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo. Trong thí nghi ệm này hoạt tính LPO trong gan cá tra không khác bi ệt có ý ngh ĩa so với đối chứng. Kết quả này tương tự Elif Ozan Oruc (2000) ti ến hành thí nghi ệm ảnh hưởng của 2,4-D và azinphosmethyl lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi ( Oreochromis niloticus ). Kết quả cho thấy cá rô phi có kh ả năng chống lại stress oxy hoá b ằng các cơ chế kháng oxy hoá và chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydation

4.3.3 Hoạt tính của men Glutathione-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Đối chứng 723 ± 112 691 ± 140 723 ± 162 563 ± 37

616 ± 93ns

Cơ quan Nghiệm thức Não 0,1ppm 730 ± 102ns 1068 ± 94* 1ppm 691 ± 140ns 1005 ± 104*

790 ± 49ns 773 ± 164ns 779± 112ns

Đối chứng 499 ± 34 558. ± 31 548 ± 36 517 ± 144

512 ± 97ns

Gan 0,1ppm 569 ± 48ns 559 ± 14ns 791 ± 40* 1ppm 558 ± 31ns 583 ± 20ns 693 ± 105ns 506 ± 40ns

Kết quả trình bày trung bình ± SD. D ấu sao (*) chỉ sai khác có ý ngh ĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng.

Bảng 16: Bi ến đổi ho ạt tính c ủa GST (nmol/mg protein/phút) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ọng trong quá trình làm gi

ảm Glutathione GST là men xúc tác phase II quan tr (GSH) tiếp hợp lên tế bào làm phá hu ỷ tế bào do s ự tấn công của ROS dẫn đến sự làm giảm độc tính của chúng (Storey, 1996). Ho ạt động của men GST trong não cá vào th ời điểm kết thúc gây nhi ễm ở hai n ồng độ gây nhi ễm 0,1ppm và 1ppm l ần lượt là 1068± 94, 1005 ± 104 (nmol/mg protein/phút) cao h ơn và khác bi ệt có ý nghĩa so với đối chứng (P<0,05). Tuy nhiên 12 gi ờ và 4 ngày sau khi k ết thúc gây nhiễm thì ho ạt tính GST trong não cá không có s ự khác bi ệt giữa các nghi ệm thức so với đối chứng (P>0,05).

GST hoạt động trong gan tương đối chậm. Ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm trong thời gian 60 phút thì không bi ểu hiện thay đổi của men GST trong khi đó ở nồng độ gây nhiễm 0,1ppm trong th ời gian 12 gi ờ thì men GST ch ỉ hoạt động sau khi k ết thúc gây nhi ễm 12 gi ờ là 791± 40 (nmol/mg protein/phút) cao h ơn và khác bi ệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng. Do tác d ụng của MG lúc này ch ưa ảnh hưởng làm bi ến đổi hoạt tính GST, 12 gi ờ kết thúc gây nhi ễm GST có bi ển đổi và khác biệt có ý ngh ĩa so với đối chứng ở nồng độ 0,1 ppm có th ể là ở não các men giải độc sinh ra không đủ khả năng để trung hoà độc tính của MG, sau m ột khoảng thời gian (12 gi ờ kết thúc gây nhi ễm) tác d ụng của MG đến gan, sau đó các men giải độc ở gan được sinh ra. Đó có thể là nguyên nhân làm cho GST tăng lên.

Hoạt tính này t ăng có th ể do khi gây nhi ễm với MG cá t ăng cường trao đổi ch ất chúng gia tăng trao đổi chất qua mang để lấy đủ oxy cho nhu cầu của cơ thể. Đây là điều kiện làm cho MG hoà tan vào n ước có nhi ều cơ hội tiếp xúc với mang và xâm nhập vào c ơ thể đặt bi ệt là ở não khi đó cơ th ể mới sản sinh ra men GST để giải độc. Elif Ozcan Orue và Nevin Uner (2000) nghiên c ứu tác động 2,4-D ở nồng độ 27 ppm và thu ốc tr ừ sâu azinphosmethy ở nồng độ 0,03 ppm ảnh hưởng đến ho ạt tính của men GST và lipid peroxidation trên cá rô phi, trong c ả hai tr ường hợp sử dụng riêng lẻ và kết hợp tắm cá ở các thời gian 24, 48, 72, 96 gi ờ cho thấy hoạt tính CAT, GST và mức độ MDA trong gan loài cá O. niloticus không có sự biến đổi.

Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghi ệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến ho ạt động của các men trên gan, mang, não c ủa cá Corydoras paleatus . Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µg/L sau 24 giờ. Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µg/L thì LPO trong não có s ự thay đổi trong khi đó ở gan, mang v ẫn bình th ường. Đối với ho ạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µg/L và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.

ấy có s ự bi ến đổi sinh hoá, sinh lý trong c

Tương tự nghiên c ứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ endosulfan l ần lượt là (10,6; 16,0; 3,2ng/l) sau 21 ngày gây nhi ễm qua các giai đoạn thu mẫu ở các ngày 1, 8, 15, 21 cho th ơ th ể Macrobrachium malcolmsoii giai đoạn giống làm tăng hoạt tính của enzim GST so với đối chứng.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

4.3.4 Ho ạt tính c ủa men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghi ệm

ệm thức

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Cơ quan Nghi Não

Đối chứng 31,16 ± 2,48 32,14 ± 3,61 30,02 ± 4,19 20,71 ± 4,46

0,1ppm 29,02 ± 7,93ns 32,22 ± 6,81ns 21,73 ± 2,49* 21,81 ± 5,59ns 1ppm 32,14 ± 3,61ns 31,60 ± 7,82ns 23,83 ± 8,91ns 15,81 ± 3,32ns Gan

Đối chứng 75,61 ± 17,72 75,84 ± 9,16 79,31 ± 7,50 73,40 ± 22,3

0,1ppm 83,44 ± 0,46ns 65,57 ± 5,88ns 64,88 ± 4,13ns 62,24 ± 11,17ns

1ppm 75,84 ± 9,16ns 62,03 ± 13,66ns 72,11 ± 20,33ns 59,25 ± 8,94ns

Kết quả trình bày trung bình ± SD. D ấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng.

Bảng 17: Bi ến đổi hoạt tính của G6PD (nmol NADPH/phút/mg protein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu.

Từ kết quả bảng 17 cho th ấy hoạt động của men G6PD trong não, gan c ủa cá tra ở cả 2 nghiệm thức 0,1 ppm và 1 ppm vào th ời điểm kết thúc gây nhi ễm không có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (P > 0,05). Ở thời điểm 12 gi ờ sau khi k ết thúc gây nhi ễm, hoạt động của G6PD trong não có s ự biến đổi 21,73 ± 2,49 (nmol NADPH/phút/mg protein) và khác bi ệt có ý ngh ĩa thống kê so v ới đối chứng, trong

khi ở nồng độ gây nhi ễm 1ppm trong 1gi ờ thì không có s ự khác bi ệt của G6PD so với đối chứng.

ến hành thí nghi

ệm ảnh hưởng của 2,4-D và ở gan cá rô phi

Elif Ozan Oruc (2000) ti azinphosmethyl lên các men ch ống oxy hoá và lipid peroxidase (Oreochromis niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03 ppm azinphosmethyl trong các kho ảng thời gian 24, 48, 72 và 96 gi ờ. Kết quả cho thấy hoạt tính G6PD t ăng so với đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể.

4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm.

Nghiệm thức

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Cơ quan

0,0038 ± 0,0004ns 0,0021 ± 0,0001ns

Não Đối chứng 0,0038 ± 0,0003 0,0028 ± 0,0004 0,003 ± 0,001 0,0038 ± 0,0003 0,1ppm 0,0035 ± 0,0006ns 0,0039 ± 0,0002 * 0,0047 ± 0,0011ns 0,0035 ± 0,0006ns 1ppm 0,0031 ± 0,0001ns 0,0021 ± 0,0001 * Gan Đối chứng 0,0266 ± 0,0023 0,0237 ± 0,0062 0,0226 ± 0,0029 0,0266 ± 0,0023 0,1ppm 0,0285 ± 0,005ns 0,0136 ± 0,0101ns 0,0198 ± 0,0011ns 0,0285 ± 0,005ns 1ppm 0,0237 ± 0,0062ns 0,0243 ± 0,0025ns 0,0186 ± 0,0003 ns

Bảng 18: Bi ến đổi hoạt tính của CAT (U/mgprotein) trong não, gan theo th ời gian qua các đợt thu mẫu.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 0,0237 ± 0,0062ns

Kết quả trình bày trung bình ± SD. D ấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng.

đổi ch ất thành n ước và khí oxy.

Catalase là một men trong c ơ thể có tác d ụng biến đổi hydroperoxyl m ột trong các sản ph ẩm được th ảy ra trong quá trình trao Hydrogen peroxide được sinh ra trong quá trình chuy ển hoá các chất trong cơ thể và là tiền thân của các phân t ử gốc tự do làm t ổn hại đến tế bào bằng cách tạo ra các phản ứng oxy hoá (Winston và Di Giulio, 1991).

Vào thời điểm kết thúc gây nhi ễm hoạt tính c ủa CAT trong não cá có s ự biến đổi khác bi ệt có ý ngh ĩa thống kê ( P<0,05) so v ới đối ch ứng; 0,0039 ± 0,0002 (U/mg protein) ở nồng độ gây nhiễm 0,1ppm và 0,0021 ± 0,0001 (U/mg protein) ở nồng độ gây nhi ễm 1ppm. K ết qu ả Jungueira và ctv (1988) khi gây nhi ễm với 10 -4 thiram làm tăng hoạt tính CAT trong khi ở nồng độ 10 -6 và 10 -8 thiram thì ho ạt tính này giảm. Theo Dimitrova và ctv (1994) cho r ằng ho ạt tính c ủa CAT t ăng khi b ị tác động bởi kẽm và chì sau 24h và 10 ngày ở cá chép C.carpio.

cho thấy ở nồng độ MC-RR (l ớn hơn hoặc bằng 2µg/L thì CAT t ăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.

Kết quả thí nghiệm này cho th ấy hoạt tính CAT ở gan không b ị ảnh hưởng ở cả hai nồng độ gây nhi ễm. Kết quả này gần giống với kết quả của Gallagher và Di Giulio (1991) nghiên c ứu ảnh hưởng sử dụng kết hợp 2,4-D và picloram tr ị bệnh trên cá chép C. carpio, không làm biến đổi hoạt tính men CAT.

Dưới tác d ụng của MG ho ạt tính CAT ở não cá tra t ăng lên ở cả hai n ồng độ thí nghiệm. Chứng tỏ men CAT được sinh ra ở não thông qua cơ chế giải độc hay trung hoà tác nhân oxy hoá. Nh ưng cả hai nồng độ này không làm biến đổi hoạt tính CAT của cá tra.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

ấy vẫn còn s ự hi ện di ện của MG Kết qu ả thí nghi ệm sau 60 ngày cho th (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb)

Hoạt tính của các men trong não gan c ủa cá Tra đều bị biến đổi. Khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG.

MG gây ức ch ế AchE trong não trong th ời gian dài ở nồng độ 1ppm ( 2031 ± 495 (nmole/phút/mg protein) trước khi gây nhiễm 1340 ±103 (nmole/phút/mg protein) ở 4 ngày sau khi k ết thúc gây nhi ễm. Ở nồng độ 0,1ppm AchE không b ị ức chế trong khi ở gan AchE bị ức chế ở nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12h và không b ị ức chế ở nồng độ 1ppm trong 1h.

Hàm lượng LPO ở não t ăng ở cả hai n ồng độ gây nhi ễm là 8,81 ± 0,43 (nmol TBARS /g mẫu) ở nồng độ 0,1ppm và 10,4 ± 3,53 (nmol TBARS /g m ẫu) ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm, trong khi ở gan thì không có sự biến đổi.

Hoạt tính c ủa các men GST và CAT ở não t ăng lên ở cả hai n ồng độ gây nhi ễm trong khi ở gan thì không có s ự biến đổi đối với CAT, GST ch ỉ bị biến đổi sau khi kết thúc gây nhiễm 12h là 791± 40 (nmol/mg protein/min).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Men G6PD không b ị tác động khi gây nhi ễm MG ngo ại trừ nồng độ 0,1 ppm thì có sự bi ến đổi sau 12h gây nhi ễm là 21,73 ± 2,49 (nmol NADPH/phút/mg protein) trong khi nghiệm thức đối chứng là 30,02 ± 4,19 (nmol NADPH/phút/mg protein).

5.2 Đề xuất

Tiến hành thí nghi ệm với thời gian dài h ơn nhằm mục đích xác định chính xác th ời gian đào thải hoàn toàn MG và LMG

Sử dụng phương pháp phân tích MG và LMG bằng sắc kí lỏng khối phổ.

Tiếp tục nghiên cứu các chỉ tiêu sinh hóa ở mức độ quần thể nhằm tìm ra phương pháp chuẩn đoán nhanh mức độ nhiễm MG trong quần thể.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Aruni Udara Chandrasekara and Asoka pathiratne, 2005. Effect of low concentrations of Trichlorfon on haematological parameters and brain acetylcholinesterase activity in common carp, Cyprinus carpio L. Aquaculture Research 144.

2. Bùi Quang T ề, 1998. Giáo trình b ệnh cá c ủa Động Vật Th ủy Sản. Nhà

xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội

3. Cục Quản Lý Chất Lượng, ATVS & TYTS (NAFIQAVED), 2003, 2004. Báo cáo kết quả chương trình ki ểm soát dư lượng các ch ất độc hại trong thủy sản nuôi.

4. CFIA, July, 2005. Update on the Canadian Food Inspection Agency

Monitoring Activities for Malachite Green.

5. Cục thống kê An Giang và C ục thống kê Cần Thơ, 2005. Thông báo tình

hình kinh tế xã hội và kết quả điều tra thuỷ sản.

6. Đỗ Th ị Bích Ly, 2004. Kh ảo sát s ự tương quan gi ữa các y ếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra (Pangasius hypopthamus) thâm canh. Luận Văn Tốt Nghiệp Đại Học.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

7. Dương Nhật Long, 2003. Giáo trình kĩ thuật nuôi thuỷ sản nước ngọt.

8. Elif Ozcan Orue, Nevin Uner, 2000. Combined effects of 2,4-D and

azinphosmethyl on antioxidant enzymes and lipid peroxidation in liver of Oreochromis niloticus. Comparative Biochemistry and Physiology PartC 127, Elsevier Science Ine. Ellman, G.L., K.D. Courtney, V.Andres and R.M. Featherstone(1961). A new and rapid colorimetric determination of AchE activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95

9. Fatima, M., Ahmad, I., Sayeed, I., Athar, M., and Raisuddin, S. (2000).

Pollutant-induced over-activation of phagocytes is concomitantly associated with peroxidative damage in fish tissues. Aquat. Toxicol. 49, 243–250

10. Food and Environonental Hygiene Dapartment Hongkong, Malachite

Green in food, August 2005.

11. Hiran M. Dutta, D. A. Arends, 2003. Effects of endosunlfan on brain actycholinesterase activity in juevenile bluegill sunfish. Environmetal Research 91, 157-162.

12. http://www.khoahoc.net. Nguyễn Thượng Chánh, 22/12/2005. Cá basa và

chất Malachite Green.

13. http://www.vietlinh.com.vn. Tác hại xanh Malachte ch ất có th ể thay th ế

Malachite, 2/2/2005

14. http://www.vietnam.net. MGTam Cargill. Hiểm hoạ Malachite Green.

15. Jimena cazenave, Maria de los Angeles Bistoni, Silvia Fabiana pesce and Daniel Albeto Wunderlin, 2006. Diffrential detoxification and antioxidant response in diverse argan of corydoras paleatus experimentally exposed to microcytin-RR. Aquatic Toxicological.

16. Jinfei Zhang, Hua Shen, Xiaorong Wang, Jichun Wu, Yuqun Xue, 2004. Effect of chronic exposure of 2,4-dichlorophenol on the antioxidant system in liver of freshwater fish Carassius auratus. Chemosphere 55, 167-174.

17. Lê Th ị Kim Liên, Nguy ễn Qu ốc Th ịnh, 2005. Bài gi ảng thu ốc và hóa chất trong Nuôi Trồng Thủy Sản. Khoa Thủy Sản- Đại Học Cần Thơ

18. Nguyễn Bạch Loan, 2000. Giáo trình Ng ư Loại I. Khoa Th ủy Sản - Đại

Học Cần Thơ.

19. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình s ử dụng thu ốc, hóa ch ất trong nuôi cá tra thâm canh ở An Giang và C ần Thơ. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Nuôi Trồng Thủy Sản.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

20. Nguyễn Th ị Kim Liên, 1998. Ảnh hưởng của thu ốc Basudin 40ND lên các chỉ tiêu sinh lý, huy ết học và ho ạt tính c ủa men Acetylcholineterase của cá rô phi và cá mè vinh.

21. Nguyễn Thị Phương Nga, 2004. Phân tích tình hình phân ph ối và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thủy sản tại Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Lu ận văn thạc sỹ ngành Nuôi Trồng Thủy Sản Đại Học Cần Thơ.

22. Nguyễn Văn Công, Nguy ễn Xuân L ộc, Lư Th ị Hồng Ly và Nguy ễn Thanh Phương, 2006. Ảnh hưởng của Basudin 50EC lên ho ạt tính enzym cholinterase và t ăng tr ọng của cá lóc (Channa striata). T ạp chí nghiên cứu khoa học thuỷ sản 2006, 1-12.

23. Nguyễn Văn Công, Tr ần Sỷ Nam, Phan Ng ọc Thanh Hùng, Nguy ễn Thanh Ph ương, 2006. Ảnh hưởng của nhi ệt độ và oxy hoà tan lên độc tính Basudin 50EC ở cá lóc (Channa striata). T ạp chí nghiên c ứu khoa học thuỷ sản 2006, 1-12.

24. P.S. Bhavan and P. Geraldine, 2000. Alteration in concentration of protein, carbohydrate, glycogen, free sugar, and lipid in the praw Macrobrachium malcolmsonii on exposure to sublethal concentrations of endosulfan, pestic. Biochem. Physiol. 58, 59.

25. Phan Thanh Tu ấn, 2004. Kh ảo sát bước đầu về tình hình s ử dụng thu ốc thú y thủy sản trong nghề nuôi cá tra công nghiệp ở tỉnh Đồng Tháp.

26. Raoul V. Kuiper, Peter Scherpenisse and Alder A.Bergwerff, 2000.

Persistence of residues of Malachite green in Euro eel (Auguilla Anguila) after water – borne exposure ofjuvenice eels.

27. S. Pandey, I. Ahmad, S. Parvez, B. Bin. Hafeez, R.Haque, S. Raisuddin, 2000. Department of Medical Elemcatology and Toxicology, Tamia Hamdard (Hamdard University), New Delhi 110062, India.

28. Shivaji Srivastava, Ranjana Sinha, D. Roy, 2004. Toxicological effect of

Malachite green. Aquatic toxicology 66, 319-329.

29. Sở ng ư nghi ệp An giang, Tác h ại xanh Malachte ch ất có th ể thay th ế

Malachite, 2/2/2005.

30. T. Balint, T. Szegletes, Z. Szegletes, K. Halasy, J. Nemcsok, 1995.

Biochemical and sublellular changes in carp exposed to the organophosphorus methidathion and the pyrethriod deltamethrin. Aquatic Toxicology 33, 297-295.

31. Tạp chí khoa học số đặc biệt chuyên đề thuỷ sản, 2006. 13-23