89
TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21
Tr
ầ
n V
ă
n Giang
Tr
ườ
ng
Đạ
i h
ọ
c S
ư
ph
ạ
m,
Đạ
i h
ọ
c Hu
ế
TÓM TẮT
β
-galactosidase là enzyme xúc tác ph
ả
n
ứ
ng thu
ỷ
phân liên k
ế
t
β
– 1,4-D galactoside
trong phân t
ử
đườ
ng lactose thành glucose và galactose.
Để
bi
ể
u hi
ệ
n
đượ
c enzyme này trong E.
coli BL21, chúng tôi
đ
ã ti
ế
n hành chèn gene
đ
ích
đ
ã tinh s
ạ
ch vào vector bi
ể
u hi
ệ
n pET, sau
đ
ó
chúng tôi
đ
ã tinh s
ạ
ch vector tái t
ổ
h
ợ
p, ti
ế
n hành bi
ế
n n
ạ
p vào t
ế
bào E. coli BL21 và
đ
ã bi
ể
u
hi
ệ
n
đượ
c protein này
ở
nhi
ệ
t
độ
và pH thích h
ợ
p sau khi c
ả
m
ứ
ng v
ớ
i IPTG.
1. Mở đầu
β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-D
galactoside trong phân tử đường lactose thành glucose và galactose, được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, trong y học để chế biến thuốc hỗ trợ tiêu hoá.
Trên thế giới, đã có một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase
từ Lactobacillus reuteri 103 [1] và Bacillus megaterium [2]. Ở Việt Nam, Nguyễn Văn
Cách (2008) đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính
chất lý-hóa của nó [3]. Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008)
đã tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis
G1 [4].
Nhiều người khi uống sữa có hiện tượng đau bụng và tiêu chảy do bị dị ứng với
đường lactose trong sữa, đây là một dạng đường chủ yếu trong thành phần sữa. Sau khi
uống sữa nếu bị khó tiêu, đầy hơi, sôi bụng hay tiêu chảy, đau bụng thì chắc chắn họ bị
dị ứng với lactose trong sữa. Lactose khi vào đến ruột sẽ được thủy phân thành
galactose và glucose nhờ vào enzyme lactase (β-galactosidase ở vi khuẩn) có ở thành
ruột non. Trong trường hợp thiếu lactase, lactose không được thủy phân sẽ bị tống ra
ngoài dưới dạng tiêu chảy. Những người không tiêu hóa được lactose do họ thiếu lactase
bẩm sinh hoặc lactase bị thoái hóa từ thuở thơ ấu.
Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về β-galactosidase có nguồn
gốc từ các sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase mới
dừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này [3]. Vì vậy, cần
nghiên cứu biểu hiện β-galactosidase để làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme này và góp
phần giúp các nhà sản xuất sữa Việt Nam có thêm sản phẩm sữa dễ tiêu hóa.
90
2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
Chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp β-galactosidase đã được tuyển chọn
Baccillus subtilis G1 [4]. Vector pET22b(+) (Invitrogen) dùng để biểu hiện β-
galactosidase trong E. coli BL21. Các thiết bị và hóa chất để biểu hiện được Phòng
Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công Nghệ
Việt Nam cung cấp.
2.2. Khuếch đại gen bằng PCR
Để khuếch đại gen mã hóa β-galactosidase của chủng Bacillus subtilis G1, sử
dụng mồi xuôi GalF: 5'-GCG GAT CCG GTG ATG TCA AAG CTT GAA AAA ACG
C-3' và mồi ngược GalR: 5'-GCG CGG CCG CAT GTG TGT TTA CGA CAA T-3',
được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa β-galactosidase B. subtilis trên
GenBank (mã số NC_000964), có bổ sung điểm cắt hạn chế BamHI và NotI để chèn
vào vector biểu hiện pET-22b(+). Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm 10x
PCR; 2 µl 2,5 mM dNTP; 2 µl 25 mM MgCl2; 1 µl (0,1µg/ml)DNA khuôn mẫu; 0,5 µl
(5u/µl )Taq polymerase và 1 µl (10u/µl) mồi mỗi loại bổ sung nước cất đến thể tích 25
µl. Phản ứng được thực hiện trong điều kiện: 94°C/3 phút; 35 chu kỳ: 94°C/1 phút,
54°C/1 phút, 72°C/1 phút; cuối cùng 72°C/10 phút.
2.3. Gắn sản phẩm PCR
Phản ứng gắn sản phẩm PCR từ vector tạo dòng với vector biểu hiện gồm: 2 µl
đệm gắn dính DNA T4 10x; 3µl DNA tinh sạch; 3 µl (0,5µg/ml) plasmid pET-22b(+)
cắt mở vòng; 1,5 µl (5u/µl) DNA T4 ligase; bổ sung nước cất đến thể tích 20 µl. Hỗn
hợp phản ứng được ủ ở 22°C từ 30 phút đến 3 giờ hoặc qua đêm.
2.4. Biến nạp vector biểu hiện vào E. coli BL21
Phân đoạn DNA sau khi gắn vào vector pET-22b(+) được biến nạp vào tế bào
khả biến E. coli BL21 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli
BL21 được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. 15
ml môi trường LB lỏng được tiếp giống với 150 µl dịch tế bào đã nuôi qua đêm. Sau khi
tiếp giống, dịch này được nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút trong khoảng 2-3 giờ, đến
khi OD600nm đạt 0,4 - 0,6. Sau đó dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 5
phút ở 4°C với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa đều trong 7,5 ml 0,1 M CaCl2 vô
trùng đã để lạnh, ủ đá lạnh 30 phút và ly tâm như trên. Tủa tế bào lại được hòa đều
trong 7,5 ml 0,1 M CaCl2 vô trùng đã để lạnh, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 5 phút với
4000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa vào 750 µl 0,1 M CaCl2 vô trùng, lạnh. Dịch tế
bào được chia nhỏ 50 µl/ống Eppendorf 1,5 ml khử trùng, dùng biến nạp ngay hoặc bổ
sung 50 µl 75% glycerol bảo quản ở -80°C để biến nạp sau. Năm µl dung dịch plasmid
hoặc hỗn hợp phản ứng gắn dính được hòa với 50 µl dịch tế bào khả biến vừa chuẩn bị
91
xong (hoặc tế bào khả biến ở -80°C đã giải đông), ủ 20-30 phút trong đá. Hỗn hợp được
gây sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó được đặt ngay vào đá lạnh khoảng 2 phút rồi bổ
sung 250 µl môi trường SOC lỏng đã khử trùng. Sau khi ủ lắc hỗn hợp khoảng 60 phút
ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-250 µl dịch tế bào đã biến nạp plasmid được cấy trải trên
đĩa thạch chứa ampicillin với nồng độ 0,1% (w/v), ủ qua đêm ở 37°C để cho khuẩn lạc
mọc và sàng lọc tiếp.
2.5. Nuôi cấy E. coli và biểu hiện
Khuẩn lạc E. coli BL21 tái tổ hợp được nuôi lắc qua đêm (200 vòng/ phút) trong
môi trường LB lỏng có bổ sung 0,1% (w/v) ampicillin trong bình tam giác 25 ml. Tiếp
1% giống vào bình tam giác 250 ml, lắc 200 vòng/phút. Sau 2 giờ, dịch nuôi được cảm
ứng bằng 1% (w/v) IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), tiếp tục nuôi và tiến
hành lấy mẫu sau thời gian 1,5; 3 và 4,5 giờ ở 37°C. Mỗi lần lấy 1 ml mẫu dịch nuôi
biểu hiện đã được cảm ứng. Đối chứng là khuẩn lạc E. coli BL21 không biến nạp. Sau
đó, các mẫu được ly tâm thu cặn và hòa trong nước khử ion để tiến hành điện di kiểm
tra. Protein tổng số đo được sau khi biểu hiện theo phương pháp Bradford. Phương pháp
này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình
thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu
tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Nồng độ β-galactosidase được xác định
dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò 1 mg/ml.
2.6. Điện di SDS trên polyacrylamide gel
Điện di biến tính protein trên polyacrylamide gel 12,5% theo Laemmli (1970)
[5]. Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ. Sau đó,
gel được rửa bằng dung dịch rửa (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid) cho đến
khi nền gel trở nên trong còn các băng protein xuất hiện màu xanh.
3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Chèn gene β-galactosidase tinh sạch vào vector biểu hiện
Phân đoạn gen gal (β-galactosidase) và vector plasmid pET-22b(+) mở vòng
được tinh sạch bằng kit của hãng Invitrogen để sử dụng cho phản ứng gắn (Hình 1).
Dung dịch của phản ứng gắn được biến nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp
sốc nhiệt, sau khi biến nạp, dịch tế bào được nuôi lắc phục hồi và trải lên đĩa thạch để
nuôi cấy chọn lọc. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di
agarose. Plasmid tái tổ hợp (pEGal) có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng pET-
22b(+) (Hình 2). Hình ảnh điện cho thấy plasmid đối chứng (ĐC) chạy nhanh hơn các
plasmid tái tổ hợp (1 - 4).
92
Hình 1.
Đ
i
ệ
n di phân
đ
o
ạ
n gen gal (1) tinh s
ạ
ch sau khi c
ắ
t ra kh
ỏ
i vector nhân dòng và pET-
22b(+) (2)
đ
ã
đượ
c tinh s
ạ
ch. M: DNA marker (1kb)
Hình 2. Vector bi
ể
u hi
ệ
n
Hình 3.
Đ
i
ệ
n di
đồ
plasmid
đố
i ch
ứ
ng pET-22b(+) (
Đ
C)
và các plasmid tái t
ổ
h
ợ
p pEGal (1-4).
3.2. Hệ thống biểu hiện E. coli BL21/pEGal
Để biểu hiện thành công gen ngoại lai cần phải có vector thích hợp. Vector tái tổ
hợp pEGal (vector biểu hiện pET-22b(+) mang gen gal) được biến nạp vào chủng E.
coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt và hóa học, tạo ra hệ thống biểu hiện E. coli
BL21/pEGal. Dịch tế bào E. coli BL21/pEGal được thu sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng
với IPTG để xác định mức độ biểu hiện của β-galactosidase tái tổ hợp.
Dịch nuôi cấy biểu hiện sau khi thu được đo độ hấp thụ quang (OD). Từ độ hấp
2000
5000
500
10000
M
2
1 M
1 2 ĐC 3 4
93
thụ của protein tổng số (trong đó cóβ-galactosidase) đo được trên máy quang phổ, đối
chiếu với đồ thị chuẩn đã được xây dựng dựa trên BSA (Bovine serum albumin) để tính
ra nồng độ protein tổng số .Nồng độ protein tổng số của các mẫu biểu hiện được thể
hiện qua bảng (1). Dựa vào nồng độ protein tổng số để tính toán hiệu suất thu hồi sau
khi tinh sạch β-galactosidase.
Bảng 1 cho thấy khi không cảm ứng IPTG thì hàm lượng protein tổng số ở các
chủng tái tổ hợp và đối chứng sai khác không đáng kể. Nhưng sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm
ứng IPTG, hàm lượng protein tổng số ở chủng tái tổ hợp đã tăng lên rất nhiều. Điều đó
chứng tỏ promoter của vector biểu hiện đã được cảm ứng và β-galactosidase đã được
tổng hợp. Để khẳng định chắc chắn hơn, dịch nuôi cấy biểu hiện đã được điện di trên
polyacrylamide gel.
B
ả
ng 1. N
ồ
ng
độ
protein c
ủ
a d
ị
ch nuôi bi
ể
u hi
ệ
n
Dịch nuôi biểu hiện OD (TB) Nồng độ protein tổng số (µ
µµ
µl)
E. coli
BL21/pEGal (0h) 0,425 977,7
E. coli
BL21/pEGal (1.5h) 0,785 1652,7
E. coli
BL21/pEGal (3h) 0,825 1727,7
E. coli
BL21/pEGal (4.5h) 0,885 1840,2
E. coli BL21 (0h) 0,421 970.2
E. coliBL21 (1.5h) 0,485 726,8
E. coli BL21 (3h) 0,501 746,8
E. coliBL21 (4.5h) 0,542 798,2
3.3 Mức độ biểu hiện β-galactosidase
Dịch tế bào thu ở các thời gian khác nhau sau cảm ứng được chạy điện di kiểm
tra trên gel polyacrylamide. β-galactosidase tái tổ hợp đã được biểu hiện sau 1,5 giờ
cảm ứng bởi IPTG. Sau thời gian 3 và 4,5 giờ, hàm lượng protein tăng lên không đáng
kể.
