LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA ( Pangasius hypophthalmus)"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THUỶ SẢN

NGÔ MINH DUNG

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA ( Pangasius hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG ĐẶNG THỤY MAI THY CAO TUẤN ANH 2007

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn quý thấy cô khoa Thủy sản đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường.

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Thanh Phương, chị Đặng Thụy Mai Thy, anh Cao Tuấn Anh và cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Từ Thanh Dung và cô trợ lý cố vấn Phạm Trần Nguyên Thảo cùng các bạn lóp Bệnh học thủy sản K29 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

i

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra” được thực hiện bởi hai thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) và Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) trên cá tra giống bằng phương pháp tiêm. Mỗi thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức mật độ vi khuẩn, với 3 lần lặp lại và một nghiệm thức đối chứng. Hai trăm lẻ tám cá tra giống được bố trí vào 26 bể 80L, mật độ 8 con/bể. Không cho cá ăn trong suốt thời gian bố trí thí nghiệm.

Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila sử dụng 4 mật độ vi khuẩn 2,16×103 CFU/ml, 2,16×104 CFU/ml, 2,16×105 CFU/ml và 2,16×106 CFU/ml kết quả thu được ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn A. hydrophila gây cảm nhiễm, vì ở nồng độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×106 CFU/ml cá đã có tỉ lệ chết trên 50% (54,17%).

Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri sử dụng 4 mật độ vi khuẩn 1×105 CFU/ml, 1×106 CFU/ml, 1×107 CFU/ml và 1×108 CFU/ml kết quả thu được ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 37 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu có giá trị LD50= 106,5 CFU/ml.

Trong cả hai thí nghiệm, khi quan sát biến đổi mô học ở các cơ quan gan, thận và tỳ tạng chỉ thấy có hiện tượng sung huyết và xuất huyết, không có hiện tượng hoại tử ở các cơ quan.

ii

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm tạ ........................................................................................................ i Tóm tắt............................................................................................................. ii Mục lục ............................................................................................................ iii Danh sách bảng, danh sách hình...................................................................... iv Danh mục từ viết tắt......................................................................................... v

Chương 1: Giới thiệu ....................................................................................... 1

Chương 2: Tổng quan tài liệu .......................................................................... 3 2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra ............................................................... 3 2.2 Bệnh xuất huyết do A. hydrophila trên cá tra ...................................... 3 2.3 Bệnh mủ gan do E. ictaluri trên cá tra................................................. 5

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 8 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 8 3.2 Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 8 3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 8 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm.................................................................... 8 3.3 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 9 3.3.1 Đối tượng thí nghiêm.................................................................. 9 3.3.2 Bố trí thí nghiệm......................................................................... 10 3.3.3 Phương pháp thu mẫu ................................................................. 10 3.3.4 Phương pháp lấy mẫu vi sinh .................................................... 11 3.3.5 Phương pháp xác định LD50 ....................................................... 11 3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn ............................................... 11 3.3.7 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô học ..................................... 12

Chương 4: Kết quả và thảo luận ...................................................................... 13 4.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây cảm nhiễm ....................................... 13 4.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả LD50 sau khi gây cảm nhiễm ....................... 14 4.2.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila ................................. 14 4.2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ........................ 18

4.3 Tổn thương do vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên một số cơ quan của cá tra ................................................................................................. 20 4.3.1 Những biến đổi mô học do vi khuẩn A. hydrophila ................... 20 4.3.2 Những biến đổi mô học do vi khuẩn E. ictaluri ......................... 23 4.4 Kết quả tái định danh vi khuẩn ........................................................... 26 4.4.1 Tái định danh vi khuẩn A. hydrophila ....................................... 26 4.4.2 Tái định danh vi khuẩn E. ictaluri ............................................ 27 4.5 Một số hạn chế trong quá trình thí nghiệm.......................................... 28

Chương 5: Kết luận và đề xuất ........................................................................ 29 5.1 Kết luận................................................................................................ 29 5.2 Đề xuất................................................................................................. 29

Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 30

Phụ lục ............................................................................................................. 34

iii

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Nồng độ vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm ..................................... 10

Bảng 4.1 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ................................................ 15

Bảng 4.2 Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila .................................................................................................. 15

Bảng 4.3 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ............................................... 18

Bảng 4.4 Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri......................................................................................................... 18

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

iv

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 4.1 Biểu hiện bên ngoài cá tra bị nhiễm A. hydrophila ......................... 13 Hình 4.2 Nội tạng cá tra nhiễm A. hydrophila bị xuất huyết .......................... 13 Hình 4.3 Cá tra nhiễm E. ictaluri bị đốm trắng ở nội tạng ............................. 14 Hình 4.4 Mô gan cá tra bị nhiễm A. hydrophila ............................................. 22 Hình 4.4 Mô thận và tỳ tạng cá tra bị nhiễm A. hydrophila ........................... 23 Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri .......................................................... 26 Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri .......................................................... 27 Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 ..... 28 Hình 4.8 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Tỷ-PT207 .................. 29

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

v

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU

Trong thời gian gần đây, dịch cúm gia cầm và bệnh lở mồm long móng, bệnh tai xanh ở lợn lan rộng ở nhiều nước trên thế giới. Dịch bệnh cũng đã xuất hiện ở Việt Nam đã làm giảm đáng kể nguồn thực phẩm phục vụ cho đời sống con người. Người tiêu dùng bắt đầu chọn sản phẩm thủy sản dùng làm thực phẩm dinh dưỡng hàng ngày. Theo công bố của bộ thủy sản ngày 05-12-2005 thì kim ngạch xuất khẩu của toàn ngành thủy sản đạt 2,5 tỉ USD (trích dẫn bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006). Điều này cho thấy nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thủy sản ở Việt nam hiện nay là rất lớn. Việc quy hoạch vùng nuôi và đẩy mạnh nuôi các đối tượng thủy sản có giá trị xuất khuẩu với mức đầu tư rất cao, quy mô thâm canh hóa tạo ra sản phẩm sạch mà không tác động đến môi trường đang là vấn đề rất quan trọng đặt ra cho các nhà khoa học, những người quản lý và đầu tư nuôi trồng thủy sản.

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi đang được phát triển với tốc độ nhanh ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Từ những năm 1998–2000, với sự thành công trong hoạt động nghiên cứu xây dựng “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu tra thương phẩm” của Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ, có thể nói phong trào nuôi cá tra thương phẩm đang phát triển rất mạnh ở vùng ĐBSCL, năng suất và sản lượng nuôi không ngừng tăng: năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 trên 200.000 tấn, năm 2004 trên 300.000 tấn và năm 2005 đã vượt qua 500.000 tấn (Dương Nhựt Long, 2006). Trong “Chương trình hành động về chất lượng và thương hiệu cá tra, basa giai đoạn 2005- 2010” Bộ thủy sản đặt ra chỉ tiêu sản lượng cá tra, basa nuôi phải đạt 1 triệu tấn vào năm 2010 và kim ngạch xuất khẩu đạt 800 triệu USD (Hà Yên, 2005)

Việc tăng sản lượng cá tra là vấn đề không khó, điều đáng lưu tâm hiện nay là tình trạng ô nhiễm môi trường nước thường xuyên xảy ra ở các hộ nuôi; nguyên nhân có thể là do nuôi cá với mật độ dày, lượng thức ăn dư thừa nhiều, quản lý chất lượng nước chưa tốt, sử dụng hóa chất và kháng sinh không đúng qui cách… tạo điều kiện cho dịch bệnh thường xuyên bộc phát.

Bệnh xảy ra trên cá tra có nhiều nguyên nhân. Tác nhân thường gây bệnh cho cá tra là ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng, stress…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, làm tỉ lệ hao hụt cao và khó điều trị ở cá tra. Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ

1

mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết đường ruột, trắng da, đốm trắng trên gan…Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas và bệnh trắng gan (mủ gan) do vi khuẩn E. ictaluri là bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra nuôi ao, bè, đăng quần. Chúng đã gây nhiều thiệt hại cho người nuôi trong những năm gần đây. Đầu năm 2006, ở tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006), bệnh xảy ra làm thiệt hại hàng trăm triệu đồng/hộ nuôi. Từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra” được thực hiện.

Mục tiêu đề tài

Tìm hiểu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra.

Nội dung đề tài

1. Xác định LD50 của vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra trong điều kiện gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với các mật độ vi khuẩn khác nhau.

2. Khảo sát sự biến đổi về cấu trúc mô học ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng của cá tra đã gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

2

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra

Cá tra là một trong những loài cá da trơn ở hạ lưu sông Mê kông thuộc địa phận Việt Nam.

Theo Nguyễn Bạch Loan (2004) cá tra có hệ thống phân loại như sau:

Bộ: Siluriformes Họ: Pangasidae Chi: Pangasius Loài: Pangasius hypophthalmus

Theo Dương Nhựt Long (2006), cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có ở bốn nước: Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao. Cá tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn được mùn bã hữu cơ, cây cỏ thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá. Tuy nhiên, thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá sinh trưởng và phát triển nhanh hơn. Cá tra không đẻ trong ao nuôi, cũng không có bãi đẻ tự nhiên ở Việt Nam. Cá Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu đẻ ở thượng nguồn sông Campuchia, cá bột theo dòng nước về hạ nguồn sông Mê kông Việt Nam. Trong tự nhiên mùa vụ sinh sản của cá bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 7 hàng năm.

2.2 Bệnh xuất huyết do A. hydrophila trên cá tra

Theo Từ Thanh Dung (2005), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bao gồm 3 loài Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria. Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi...là bệnh do vi khuẩn A. hydrophila (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005).

Trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis & Plumb, 1979). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ tử vong từ 80-90% (Angka, 1990). Trong báo cáo của Saitanu et al., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do nhiễm trùng máu trên cá chép.

3

Theo Angka (1990) vi khuẩn này cũng gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979). Vi khuẩn A. hydrophila còn tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp) (trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005).

Đặc điểm sinh hoá

Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que hoặc hình que cầu, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử Nitrate, có khả năng lên men, Oxidase dương tính, kháng với O/129 (Từ Thanh Dung, 2005)

Điều kiện sống và gây bệnh

Ở Châu Âu, bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân - hè, nhiệt độ nước khoảng 17 oC - 22 oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Bên cạnh đó, Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5oC và 17oC, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, còn ở 9oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy các chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson, 1988).

Báo cáo của Rahman et al., (2000) cũng cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có độc lực cao nhất ở 17oC (LD50= 106,03 CFU/ml) và 25oC (LD50= 106,53 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu CFU/ml) khi tác giả gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus). Ngoài ra, theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), vào thời gian lũ rút thì các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện cao nhất với 85,4%.

Dấu hiệu bệnh lý

Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu.

Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm

Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá vàng bằng 4 cách khác nhau: tiêm ở bụng (mật độ vi khuẩn 3x104 - 3×108 CFU/ml), tiêm ở cơ (mật độ vi khuẩn 8x104 - 8×108 CFU/ml), tiêm dưới da (mật độ vi khuẩn 8,5x104 - 8,5×108 CFU/ml) và ngâm vi khuẩn (mật độ vi khuẩn 4,6x104 - 4,6×108 CFU/ml). Sau khi so sánh đã đưa kết luận gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới da thì độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50

4

là 106,4CFU/ml. Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá rô phi, ở mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml đã gây chết trên 80%. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 103 CFU/ml đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD50 lần lượt là 3,68×106 CFU/ml, 2,64×106 CFU/ml đến 4,52×106 CFU/ml và 1,96×106 CFU/ml đến 1,45×107 CFU/ml.

2.3 Bệnh mủ gan do Edwardsiella ictaluri trên cá tra

Vi khuẩn Edwardsiella ictalluri đượ c Hawke (1979) phân lập lần đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish). Ở Việt Nam, bệnh do E. ictaluri gây ra trên cá tra được gọi là bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al., 2001).

Theo Hawke (1981), Plumb và Sanchez (1983) vi khuẩn E. ictaluri còn có khả năng gây bệnh trên một số nhóm cá da trơn khác như blue catfish (Ictalurus furcatus) và white catfish (Ictalurus catus) (trích lược bởi Từ Thanh Dung, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2005). Ngoài ra, vi khuẩn E. ictaluri được ghi nhận cũng gây bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan, trên cá trê xanh (Ictalurus furcatus) và cá trê sông (Ictalurus catus) (Bùi Quang Tề, 2006). Ở Việt Nam, bệnh mủ gan gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế đối với cá tra nuôi thâm canh, tỉ lệ hao hụt lớn ở cá tra giống từ 10% - 90% (Từ Thanh Dung và ctv., 2004). Đầu năm 2006 ở 2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006).

Đặc điểm sinh hóa

E. ictaluri là loài vi khuẩn thuộc Enterobacteriaceace, gram âm, hình que ngắn, di động yếu hoặc không di động. Catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men glucose, không sinh ra H2S và Indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA chậm 36-48 giờ ở nhiệt độ 28-30oC (Từ Thanh Dung, 2005).

Điều kiện sống và gây bệnh

Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại. Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện vào thời gian lũ về là cao nhất với tỉ lệ 87,8% số hộ nuôi cá ghi nhận ở An Giang (Trần Anh Dũng, 2005). Lê Thị Bé

5

Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy mạnh cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh vì vậy bệnh dễ dàng bộc phát. Bệnh xuất hiện ở tất cả các giai đoạn nhưng gây thiệt hại nghiêm trọng ở giai đoạn cá lứa.

Khi nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26oC - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn này gây bệnh trên cá tra (Trương Quốc Phú, 2004). Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở nhiệt độ khoảng 27,5±0,8oC đã kết luận mật độ vi khuẩn 1×106 CFU/ml và 1×105 CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết cá. Theo Plumb (1999), E. ictaluri chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18oC - 28oC, do đó bệnh do vi khuẩn này xảy ra trên cá trơn thường rơi vào mùa có nhiệt độ thấp. Bên cạnh đó, trong điều kiện thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá nheo giống, bố trí thí nghiệm ở 25oC cho tỉ lệ cá chết cao nhất, thấp nhất ở các nghiệm thức có nhiệt độ 23oC và 28oC và không có cá chết tại các nhiệt độ 17oC, 21oC và 32oC (Francis-Floy et al., 1987).

Dấu hiệu bệnh lý

Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 1-3mm các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận (Từ Thanh Dung và ctv, 2004)

7

Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm

7

Wolter và Johnson (1994) gây cảm nhiễm (bằng phương pháp ngâm) trên Cá Nheo Mỹ (15-20 cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri 1,2.10 6 CFU/ml ở 25oC, tốc độ nước chảy 1L/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ngày. Tỉ lệ chết dao động từ 38-95,3% trong thời gian thí nghiệm là 7 ngày (trích dẫn từ Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004). Klesius & Sealey (1995) sử dụng E. ictaluri với mật độ 1x10 CFU/mL ngâm trong một giờ trên Cá Nheo (14-17 cm). Tỉ lệ chết là 28% trong vòng 5-20 ngày.

Gần đây nhất, Williams và Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0x10 7 CFU/ml và 7,2x10 CFU/ml ngâm trên cá Nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là 90% và 85%. Bên cạnh đó họ cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn

6

E. ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối với E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2×103 CFU/ml, 5,2×104CFU/ml, 5,2×105CFU/ml thì tỉ lệ cá chết lần lượt là 67,2%, 100% và 100%. Trong khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2×103 CFU/ml, 5,2×104 CFU/ml, 5,2×105 CFU/ml, 5,2×106 CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%, 100% và 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau về tỉ lệ chết giữa 2 phương pháp ngâm và tiêm.

Ngoài ra, Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh rằng ngâm cá tra với mật độ vi khuẩn E. ictaluri mật độ vi khuẩn từ 1x105 CFU/ml đến 1x107 CFU/ml trong 1 giờ, thời gian theo dõi thì nghiệm là 10 ngày thì ở mật độ 1x107 CFU/ ml có tỉ lệ cá chết cao nhất (75% số cá thí nghiệm) so với 2 nồng độ còn lại là 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml. Và đưa ra kết luận rằng mật độ vi khuẩn 1x 107 CFU/ml có độc lực cao nhất. Bên cạnh đó, Lương Trần Thục Đoan cũng gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 1x104 CFU/ml đến 1x106 CFU/ml đã cho rằng mật độ vi khuẩn 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết cá trong thí nghiệm tiêm (ở 1x106 CFU/ml cá chết 100% chỉ sau 5 ngày thí nghiệm) và kết luận rằng phương pháp tiêm vi khuẩn làm cá chết nhanh hơn phương pháp ngâm vi khuẩn trong khoảng thời gian 1 giờ. Trong khi đó, Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu khi gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra, tiêm cá ở mật độ vi khuẩn 1,5×106CFU/ml và 1,5×105CFU/ml làm cá chết 100% sau 6 ngày thí nghiệm.

Trần Thị Ngọc Hân (2006) cũng thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn này trên cá tra bằng 2 phương pháp: phương pháp tiêm (mật độ vi khuẩn từ 1x104 CFU/ml đến 1x106 CFU/ml) và phương pháp ngâm (mật độ vi khuẩn từ 1x105 CFU/ml đến 1x107 CFU/ml) đã đưa ra kết luận: trong cùng mật độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml, cấu trúc mô của mẫu thu ở phương pháp ngâm biến đổi sớm hơn so với phương pháp tiêm.

7

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 06/2007. - Địa điểm nghiên cứu tại trại thực nghiệm bệnh cá và phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm

- Bể composit: 36 bể, mỗi bể 80 lít. - Máy sục khí, hệ thống sục khí, xô nhựa, vợt. - Dụng cụ tiểu phẫu, que cấy, đèn cồn, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy tissues,

bút lông, kính hiển vi, lame.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

- Cốc thủy tinh, lọ thủy tinh, đĩa Petri, ống đong. - Ống tiêm, kim tiêm. - Cân điện tử, máy Autolauve, máy ly tâm. - Máy đúc khối, máy cắt lát mỏng, máy xử lý mẫu. - Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy. - Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày.

3.2.2 Hóa chất thí nghiệm

- Chlorin, cồn, nước cất, formol (70%, 10%) - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: TSA (Trypticase soya agar), NB (Nutrient

broth).

- Các loại hóa chất nhuộm Gram. - Các hóa chất Test sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn theo phương

pháp truyền thống.

- Dung dịch cố định mẫu: NBF (Neutral Buffered Formalin) - Xylen, parafin, sáp ong. - Dung dịch Mayer’ s aldumin. - Dung dịch nhuộm Harris’ s Haematolin & Eosin (H&E). - Keo dán Enterlan.

8

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Đối tượng thí nghiệm

(cid:190) Cá thí nghiệm

- Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-20g. - Cá tra giống tương đối đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng bóng. - Cá giống sau khi mua về được dưỡng trong bể composite nước chảy tràn, có sục khí khoảng 1 tuần và cho cá ăn thức ăn công nghiệp (cho ăn theo nhu cầu).

- Kiểm tra tình trạng sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi tiến

hành bố trí thí nghiệm.

(cid:190) Nguồn vi khuẩn

- Vi khuẩn được phân lập từ các ao cá Tra bệnh ở An Giang thuộc đề tài “Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (Tra- Pangasius hypophthamus) và tôm càng xanh (Macrobrachiumrosenbergii)

- Mẫu vi khuẩn được trữ vào tháng 11/2006 ở nhiệt độ -80oC. Mã vi khuẩn A. hydrophila: Xương-CĐ3L310 Mã vi khuẩn E. ictaluri: Tỷ-PTK207 - Vi khuẩn trữ được cấy trên môi trường TSA để có khuẩn lạc rồi tiếp tục Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu đem cấy sang trên môi trường TSA để chắc chắn có khuẩn lạc thuần, kiểm tra tính thuần dựa vào các chỉ tiêu về hình thái: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram.

- Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong 100 ml NB, ủ trong tủ ấm ở

28oC từ 24-48 giờ.

- Sau đó vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong vòng 5 phút. Tiếp đó vi khuẩn sẽ được rửa sạch 3 lần trong nước muối sinh lý bằng cách ly tâm ở 5.000 vòng/phút ở 4oC trong vòng 5 phút (Theo Rahman et al., 2000)

- Xác định mật độ vi khuẩn bằng hai cách tiến hành song song 1. Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm. Với OD = 1 tương đương với mật độ vi khuẩn là 1×109CFU/ml (Theo Lương Trần Thục Đoan, 2006).

2. Pha loãng dung dịch vi khuẩn, dùng pipet hút 20µl cho lên môi trường TSA, lặp lại 7 lần (140µl/ độ pha loãng/ dòng vi khuẩn). Cho vi khuẩn phát triển 24-48 giờ ở điều kiện 28oC. Đếm số lượng khuẩn lạc, xác định mật độ vi khuẩn bằng công thức:

Tế bào vi khuẩn (CFU/ ml) = Số khuẩn lạc trên đĩa/7 x 50 x Hệ số pha loãng - Pha loãng vi khuẩn với các mật độ và tiến hành bố trí thí nghiệm.

9

3.3.2 Bố trí thí nghiệm

- Bể composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200 ppm, phơi

khô. Sau đó cấp nước vào bể, có sục khí. Nguồn nước là nước máy. • Bể 500L dùng để trữ cá được đặt ngoài trời nơi có mái che. • Bể 80L dùng để thí nghiệm cấp khoảng 50-60L nước. Bể được đặt

trong phòng kín.

- Thí nghiệm được bố trí trong hệ thống nước tĩnh. - Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 8 con/bể. - Không cho cá ăn suốt thời gian bố trí thí nghiệm. - Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. - Thí nghiệm gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm gồm 4 nghiệm thức với mật độ vi khuẩn khác nhau và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý.

Bảng 3.1: Nồng độ vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm

Nghiệm thức

Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml) E. ictaluri A. hydrophila 1 × 105 2,16 × 103 1 × 106 2,16 × 104 1 × 107 2,16 × 105 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 × 108 2,16 × 106 1 2 3 4

- Tiêm 0,1 ml vi khuẩn cho mỗi con cá, mẫu đối chứng tiêm 0,1 ml dung dịch nước muối sinh lý. Vị trí tiêm ở gốc vi ngực. - Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 10 ngày.

3.3.3 Phương pháp thu mẫu

- Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý, số cá chết cá ở các mốc thời gian 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 18h, 24h, ngày 2,…ngày 14 sau khi gây cảm nhiễm.

- Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết và ghi nhận lại dấu hiệu bên

ngoài và bên trong cơ thể mẫu cá.

- Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. - Thu mẫu mô ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định mẫu bằng dung dịch

NBF trong lọ nhựa.

10

3.3.4 Phương pháp lấy mẫu vi sinh

Mẫu vật: mẫu cá dung để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống hoặc vừa mới chết.

Trước khi giải phẫu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh.

Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng. Khi giải phẫu để tránh nhiễm các tạp khuẩn từ bên ngoài, cần áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình phân lập vi khuẩn. Dụng cụ lấy mẫu được đốt trên đèn cồn trước khi lấy mẫu ở các cơ quan. Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch các chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá.

3.3.5 Phương pháp xác định LD50 (Lethal dose: Nồng độ vi khuẩn gây chết cá 50%)

Xác định LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938). Xác định LD50 để biết được khả năng năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn.

p.d =

LD50 = 10a - p.d 50% L − Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu % L H % − (cid:190) a: số lũy thừa mà tại đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%) (cid:190) H%: tỷ lệ cá chết cao nhất (dưới 50%) (cid:190) L%: tỷ lệ cá chết thấp nhất (trên 50%)

3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn

Chỉ tiêu về hình thái

- Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc - Nhuộm Gram và hình dạng của vi khuẩn.

Chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa (Chi tiết xem phần phụ lục A)

- Tính di động, - Các phản ứng Oxydase, Catalase, O/129, Decarboxylase, Voges-Proskauer (VP), Indole, Citrate, Ure, Asculin, phản ứng tạo Nitrite từ Nitrate; Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test), khả năng sinh gas và H2S, khả năng thủy phân Starch, Gelatin

Định danh vi khuẩn dựa theo phương pháp của Bergey (1974) và dòng chuẩn vi khuẩn dựa theo dòng chuẩn của Inglis et al., (1993).

11

3.3.7 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô (chi tiết ở phần phụ lục B)

Thu mẫu ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định bằng dung dịch NBF trong lọ nhựa, sau đó thực hiện các bước sau:

- Rửa mẫu sau khi cố định - Cắt tỉa và định hướng - Quy trình xử lý mẫu (quy trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy)

(cid:57) Loại nước (cid:57) Làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian) (cid:57) Tẩm paraffin

- Đúc khuôn - Cắt mẫu - Dán mẫu lên lame - Nhuộm mẫu (quy trình nhuộm mẫu được thực hiện trên máy) - Dán lamelle vào lame - Đọc kết quả

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

12

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây cảm nhiễm

Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra giống được thực hiện trong cùng địa điểm và điều kiện thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức với 3 lần lặp lại và 1 nghiệm thức đối chứng. Kết quả sau khi gây cảm nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều xuất hiện cá chết, trừ nghiệm thức đối chứng. Tổng số cá thí nghiệm là 208 con.

Trong quá trình thí nghiệm, cá được gây cảm nhiễm A. hydrophila có những biểu hiện bơi lờ đờ, gầy, có hiện tượng xuất huyết ở các gốc vây, hậu môn, xung quanh miệng. Cá sắp chết thường ngửa bụng, thả trôi theo nước. Giải phẫu bên trong thấy bóng hơi căng phồng, gan tái nhợt hoặc sưng, thận sưng, ruột, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất huyết. Xoang bụng xuất huyết và có nhiều dịch nhờn, có mùi hôi thối đặc trưng ngay cả khi cá còn sống (Hình 4.1).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

A

Hình 4.1 Biểu hiện bên ngoài cá tra bị nhiễm A. hydrophila ((cid:188)) A. Cá bị xuất huyết miệng, mắt. B. Cá bị xuất huyết vi bụng và hậu môn

Hình 4.2 Nội tạng cá tra nhiễm A. hydrophila bị xuất huyết ((cid:188))

13

Theo Aydin et al., (2004) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss Walbaum), cá bị bệnh có biểu hiện bơi lờ đờ, bỏ ăn, da tối lại, mang bi sưng, tỳ tạng cũng sưng đỏ, gan và thận bị xuất huyết và có dịch trong ruột. Bùi Quang Tề (2006) cho rằng cá bị nhiễm vi khuẩn này còn có thể xuất hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét còn có nấm và ký sinh trùng ký sinh.

Trong khi đó, cá nhiễm E. ictaluri cũng có hiện tượng cá bơi lờ đờ, gầy và xuất huyết hậu môn. Da cá không còn màu xanh đen hay có ánh bạc mà trở nên nhợt nhạt. Cá sắp chết thường nổi đầu. Đặc biệt, khi giải phẫu bên trong nội quan ở gan, thận và tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng tròn, nhỏ, đường kính khoảng 1-2,5mm, các cơ quan còn có hiện tượng sưng to. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá tra giống, Lương Trần Thục Đoan (2006) cũng ghi nhận được nhưng dấu hiệu bệnh lý như trên, ngoài ra còn có hiện tượng nhũn ở thận.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4.3 Cá tra nhiễm E. ictaluri bị đốm trắng ở nội tạng ( (cid:188))

Qua những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong cho thấy trên cùng một đối tượng vật chủ, cùng điều kiện thí nghiệm và chăm sóc như nhau, nhưng dưới sự xâm nhập của 2 loài vi khuẩn khác nhau thì đều có những biểu hiện bệnh lý đặc trưng khác nhau, đặc biệt là những biểu hiện ở các cơ quan nội tạng.

4.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả LD50 sau khi gây cảm nhiễm

4.2.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila

Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nồng độ vi khuẩn đều xuất hiện cá chết và đều biểu hiện bệnh lý rất rõ. Ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau thì thời điểm phát sinh bệnh ở các nghiệm thức cũng khác nhau (Bảng 4.1).

14

Nghiệm thức (CFU/ml) 2,16×103 2,16×104 2,16×105 2,16×106

Thời gian xuất hiện bệnh (giờ) 26 18,5 18 17

Bảng 4.1: Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh

Bảng 4.1 cho thấy ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml có thời gian cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất 17 giờ và chậm nhất ở mật độ 2,16×103 CFU/ml là 26 giờ. Trong khi đó thời gian xuất hiện bệnh ở nghiệm thức 2,16×105 CFU/ml là 18 giờ và nghiệm thức 2,16×104 CFU/ml là 18,5 giờ. Thời điểm xuất hiện bệnh của thí nghiệm phù hợp với thời điểm xuất hiện dấu hiệu bệnh lý của chủng A5 là 18,5 giờ trong thí nghiệm xác định LD50 của A. hydrophila khi gây cảm nhiễm trên cá chép (Cyprinus carpio) của Đoàn Nhật Phương (2001). Bên cạnh đó, ở thí nghiệm xác định LD50 của vi khuẩn này trên cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon) của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998) cũng đã ghi nhận thời điểm làm cá chết 50% là 24 giờ.

Trong khi đó, Thompson và Adams (1998) khi gây cảm nhiễm các dòng A. hydrophila có độc lực khác nhau trên cá trê lai giống (Clarias gariepimes × C. macrocephalus), thu được thời điểm cá chết ở dòng vi khuẩn có độc lực Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu mạnh nhất (LD50 khoảng 105 CFU/ml) là 18 giờ sau khi gây cảm nhiễm và 96 giờ ở các dòng vi khuẩn có độc lực yếu (LD50 khoảng 108 CFU/ml). Ngoài ra, khi xác định độc lực của dòng vi khuẩn này được phân lập từ cá chình giống, Esteve et al., (1993) ghi nhận được thời điểm xuất hiện cá chết là 18 giờ.

Bảng 4.2: Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila

Nghiệm thức (CFU/ml)

Tỉ lệ cá chết (%)

1

Tỉ lệ trung bình cá chết trong thời gian theo dõi (%/tổng số cá/ngày) 5 3

9

7

8

4

6

2

10

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

50

4,17

0

0

0

0

0

0

54,17±7,22

0

33,33 41,66

0

0

0

0

0

0

0

75±12,5

0

62,5

12,5

4,17

0

0

0

0

0

0

79,17±26

0

75

8,33

0

0

0

0

0

0

0

83,33±14,43

0

Đối chứng 2,16×103 2,16×104 2,16×105 2,16×106

Với thời gian biểu hiện bệnh lý của các mật độ vi khuẩn như trên cho thấy tính nhạy cảm của ký chủ và khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm. Bên cạnh đó, cùng với thời gian biểu hiện bệnh lý của các mật độ vi khuẩn thì tỉ lệ cá chết ớ các nghiệm thức cũng cho thấy được độc lực của chủng vi khuẩn.

15

Kết quả bảng 4.2 cho thấy ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao nhất 83,33%. Tỉ lệ chết thấp nhất 54,17% ở mật độ 2,16×103 CFU/ml. Trong khi đó, ở hai nghiệm thức còn lại 2,16×104 CFU/ml và 2,16×105 CFU/ml cá chế với tỉ lệ 75% và 79,17%. Riêng ở lô đối chứng không thấy có cá chết.

Cá bắt đầu chết vào ngày đầu tiên ở các nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml, 2,16×105 CFU/ml và 2,16×104 CFU/ml. Trong đó nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml và 2,16×105 CFU/ml cá chết tập trung vào ngày thứ nhất với tỉ lệ 75% và 62,5%. Nghiệm thức 2,16×104 CFU/ml cá bắt đầu chết vào ngày đầu tiên nhưng chết nhiều vào ngày thứ 2 với tỉ lệ 41,66% và không thấy cá chết vào ngày thứ 3. Riêng mật độ 2,16×103 CFU/ml xuất hiện cá chết vào ngày thứ 2 và chỉ xuất hiện trong vòng 2 ngày.

Qua kết quả thí nghiệm nhận thấy rằng, cá chỉ chết tập trung chỉ trong vòng 2- 3 ngày, những ngày sau đó không thấy xuất hiện cá chết. Ở các nghiệm thức cá đều chết với tỉ lệ cao từ 75% đến 83,33%. Riêng ở nghiệm thức với mật độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×103 CFU/ml cũng có tỉ lệ chết khá cao là 54,17%.

Kết quả của thí nghiệm không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn A. hydrophila đem gây cảm nhiễm, vì ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn thấp nhất đã có tỉ lệ cá chết trên 50%. Trong khi đó, thí nghiệm xác định LD50 vi Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu khuẩn này trên cá chép, Đoàn Nhật Phương (2001) đã kết luận chủng A. hydrophila có độc lực mạnh nhất với giá trị LD50 từ 2,64×106 CFU/ml đến 4,52×106 CFU/ml. Chủng A. hydrophila trong thí nghiệm của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998) cũng ghi nhận giá trị LD50= 1,35×107 CFU/ml.

Ngoài ra, trong thí nghiệm so sánh độc lực của các dòng A. hydrophila có ECP (Extracellular products) khác nhau, Thompson và Adams (1998) đã kết luận những dòng có độc lực mạnh có giá trị LD50 khoảng 105 CFU/ml với protein của ECP có trọng lượng phân tử từ 88kDa đến 52kDa. Ngược lại những dòng vi khuẩn có độc lực yếu có giá trị LD50 khoảng 108 CFU/ml và protein của ECP khoảng 31kDa. Bên cạnh đó, báo cáo của Esteve et al., (1993) cho rằng các dòng vi khuẩn đã được phân lập trong thời gian xảy ra dịch bệnh, sau đó được gây cảm nhiễm trên cá chình (Anguilla anguilla) đã thu được các giá trị LD50 từ 105,4 CFU/ml đến 107,2 CFU/ml, ngược lại ở các dòng vi khuẩn được phân lập tại các thời điểm khảo sát khác thì thu được giá trị LD50 từ 106,2 CFU/ml đến 107,4 CFU/ml.

Takahashi et al., (1986) cũng thu được giá trị LD50=1,4×104 CFU/ml khi gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở cá thơm (ayu Plecogrossus). Bên cạnh đó, trên cá rô phi (Oreochromis mossambicus) với vi khuẩn A. hydrophila

16

chủng SAH 93 và thu được kết quả LD50= 106,22 CFU/ml, cá bị nhiễm bệnh có những biểu hiện bệnh lý rất rõ (Azad et al., 2001).

Hơn nữa, ở thí nghiệm xác định độc lực của các chủng A. hydrophila khác nhau, De Figuerredo và Plumb (1977) đã gây cảm nhiễm trên cá nheo Mỹ và đưa kết luận chủng A. hydrophila được phân lập từ cá bệnh có giá trị LD50= 6,4×104 CFU/ml, trong khi đó chủng phân lập từ môi trường có LD50= 1,5×108 CFU/ml.

Qua các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy vi khuẩn gây bệnh cho ký chủ ở mức nào còn tuỳ thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn ấy đối với ký chủ và các điều kiện tác động. Trong khi đó ở thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra, tuy không xác định được LD50 nhưng ở nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×103 CFU/ml đã có tỉ lệ chết 54,16% chỉ trong vòng 2 ngày. Kết quả cho thấy chủng A. hydrophila trong thí nghiệm có giá trị LD50< 2,16×103 CFU/ml chứng tỏ chủng vi khuẩn này có độc lực cao hơn những chủng A. hydrophila trong các nghiên cứu trước đây. Bên cạnh đó, cá thí nghiệm đã được thuần hóa 2 tuần trước khi gây cảm nhiễm, nên đủ để cá thích nghi với điều kiện thí nghiệm. Trong thời gian này cá vẫn không có biểu hiện gì bất thường. Hơn nữa trước khi gây cảm nhiễm thì cá đã được kiểm tra vi sinh và ở tất cả các bể hoàn toàn không có sự nhiễm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu khuẩn, nhất là A. hydrophila. Đặc biệt trong suốt thời gian thí nghiệm thì bể đối chứng không có cá chết hay cá bị nhiễm khuẩn. Qua đó đã thế hiện được tính sạch bệnh và khỏe mạnh của đàn cá thí nghiệm. Ngoài ra, theo Roselynn và Stevenson (1988) độc lực của vi khuẩn A. hydrophila có giá trị LD50 trong khoảng từ 104 CFU/ml đến 105 CFU/ml, nếu vi khuẩn không gây chết ở mật độ 107 CFU/ml thì chủng vi khuẩn không có độc lực. Do đó chủng vi khuẩn A. hydrophila trong thí nghiệm gây cảm nhiễm là có độc lực.

17

4.2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri

Cũng như ở thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, ở thí nghiệm này, sau khi gây cảm nhiễm đều xuất hiện cá chết ở tất cả các nồng độ vi khuẩn và xuất hiện bệnh lý ở những mốc thời gian khác nhau.

Ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml có thời gian cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất 37 giờ và chậm nhất ở mật độ 1×105 CFU/ml là 86 giờ. Trong khi đó thời gian xuất hiện bệnh ở nghiệm thức 1×106 CFU/ml là 72,5 giờ và nghiệm thức 1×107 CFU/ml là 61 giờ (Bảng 4.3)

Nghiệm thức (CFU/ml)

Thời gian xuất hiện bệnh (giờ)

86

72,5

61

37

1×105 1×106 1×107 1×108

Bảng 4.3: Bảng thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh

Kết quả cho thấy, thời điểm cá bắt đầu biểu hiện bệnh của thí nghiệm chậm hơn so với những nghiên cứu trước đây. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu tiêm vi khuẩn này trên cá tra giống của Lương Trần Thục Đoan (2006) đã thu được cá chết vào ngày thứ 2 ở mật độ 1×106 CFU/ml. Lawrence et al., (1997) gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá nheo và ở nghiệm thức 1,3×106 CFU/ml cá chết đã được ghi nhận ở thời điểm 24 giờ sau khi gây cảm nhiễm.

Ngoài thời điểm biểu hiện bệnh lý thì tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức cũng phản ánh khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn lên vật chủ.

Tỉ lệ trung bình cá chết trong thời gian theo dõi (%/tổng số cá/ngày)

Tổng tỉ lệ cá chết (%)

Nghiệm thức (CFU/ml)

1

2

3

5

4

6

7

8

9

10

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

25

0

0

0

0

0

25±12,5

0

0

25

4,17

4,17

0

0

0

0

0

33,33±14,43

0

0

50

12,5

4,17

0

0

0

0

0

66,67±7,22

0

50

41,66

0

0

0

0

0

0

0

91,67±7,22

Đối chứng 1×105 1×106 1×107 1×108

Bảng 4.4: Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri

Kết quả bảng 4.4 cho thấy ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao nhất 91,67%. Tỉ lệ chết thấp nhất 25% ở mật độ 1×105 CFU/ml. Trong khi đó, ở hai nghiệm thức còn lại 1×107 CFU/ml và 1×106 CFU/ml cá chết với tỉ lệ 66,67% và 33,33%. Riêng ở lô đối chứng, cá đều có trạng thái sinh lý bình

18

thường trong suốt thời gian thí nghiệm nên thể hiện được tính thích nghi của cá đối với điều kiện môi trường.

Cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml với tỉ lệ 50%. Ở nghiệm thức 1×107 CFU/ml và 1×106 CFU/ml xuất hiện cá chết vào ngày thứ 3 và không thấy cá chết vào ngày thứ 6. Trong đó nghiệm thức 1×107 CFU/ml cá chết tập trung vào ngày thứ 3 với tỉ lệ 50%. Riêng mật độ 1×105 CFU/ml chỉ xuất hiện cá chết vào ngày thứ 4.

Từ kết quả thí nghiệm, LD50 của dòng vi khuẩn E. ictaluri thu được trong thí nghiệm gây cảm nhiễm có giá trị LD50 = 106,5 CFU/ml. Trong khi đó, Lương Trần Thục Đoan (2006) sử dụng mật độ vi khuẩn 1×106 CFU/ml và 1×105 CFU/ml tiêm trên cá tra giống đã thu được tỉ lệ chết 100% và 66,7% trong khoảng thời gian theo dõi 10 ngày, trong đó mật độ 1×106 CFU/ml cá bắt đầu chết ở ngày thứ 2 và 1×105 CFU/ml là ngày thứ 3. Ở thí nghiệm xác định khả năng bộc phát bệnh của vi khuẩn này lên cá tra sau khi tiêm, sử dụng mật độ 1,5x105 CFU/0,1ml và 1,5x106 CFU/0,1ml đã thu được tỷ lệ chết ở cả 2 nồng độ là 100% trong 6 ngày thí nghiệm (Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004). Ngoài ra, Williams và Lawrence (2005) sử dụng mật độ 5,2x104 CFU/ml và 5,2x105 CFU/ml tiêm trên cá nheo giống trong khoảng nhiệt độ nước 260C đã gây chết 100% (trích dẫn bởi Lương Trần Thục Đoan 2006).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu So sánh với kết quả thí nghiệm trên, nhận thấy độc lực của vi khuẩn trong thí nghiệm gây cảm nhiễm yếu hơn so với độc lực của vi khuẩn ở thí nghiệm của Lương Trần Thục Đoan và Phan Thị Mỹ Hạnh, tỉ lệ cá chết thấp hơn so với những thí nghiệm trước có cùng mật độ vi khuẩn.

Trong báo cáo của Lawrence et al., (1997) gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm trên cá nheo với hai dòng vi khuẩn E. ictaluri: dòng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên và dòng LSU-E2 đã được làm giảm độc lực, kết quả ở dòng LSU-2 thu được giá trị LD50= 5,1×107 CFU/ml, còn ở dòng tự nhiên không xác định được LD50 do ở nồng độ vi khuẩn thấp nhất 1,3×102 CFU/ml đã có tỉ lệ cá chết trên 50%. Hơn nữa, Baxa et al., (1990) sử dụng mật độ từ 4×106 CFU/ml đến 4×108 CFU/ml ngâm trên cá hồi trắng, theo dõi trong 14 ngày, đã ghi nhận được giá trị LD50= 3,4×107 CFU/ml và ở nồng độ 4×108 CFU/ml có tỉ lệ chết cao nhất là 92%.

Qua các nghiên cứu trước đây cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể của ký chủ tạo nên sự nhiễm bệnh hay không, ở mức nào còn tuỳ thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩm đối với ký chủ và điều kiện tác động. Với kết quả thí nghiệm trên, tuy độc lực của dòng vi khuẩn đem gây cảm nhiễm không cao nhưng theo Santos (1988) vi khuẩn được xem như không có độc lực khi có giá

19

trị LD50 ≥ 108 CFU/ml (trích dẫn bởi Esteve et al.,1993). Do vậy, kết quả LD50= 106,5 CFU/ml chứng tỏ độc lực của dòng vi khuẩn vẫn nằm trong phạm vi có thể chấp nhận được.

Qua kết quả thí nghiệm, cả hai chủng vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri đều được phân lập từ những ao cá bệnh ở An Giang. Hai chủng vi khuẩn này cùng được gây cảm nhiễm trên cá tra nhưng thời điểm biểu hiện bệnh lý, tỉ lệ chết ở cả hai thí nghiệm đều rất khác nhau. Ở thí nghiệm gây cảm nhiễm, chủng A. hydrophila có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giời ở mật độ là 2,16×106. Trong khi đó với mật độ 1×106 của chủng E. ictaluri lại có thời biểu hiện bệnh lý là 72,5 giời. Đồng thời ở mật độ 106 CFU/ml tỉ lệ chết của cá bị nhiễm A. hydrophila (83,33%) cũng cao hơn nhiễm E. ictaluri (33,33%). Bên cạnh đó, giá trị LD50 của chủng E. ictaluri (106,5 CFU/ml) cao hơn chủng A. hydrophila (LD50< 2,16×103 CFU/ml).

4.3 Tổn thương do vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên một số cơ quan của cá tra

Trong quá trình thí nghiệm cũng tiến hành phân tích và quan sát mẫu mô. Các cơ quan được chọn làm tiêu bản mô gồm: Gan, tỳ tạng, thận. Mẫu mô được nhuộm bằng dung dịch Hematocyline và Eosin. Mục đích của việc quan sát Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu tiêu bản mô học nhằm khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn trên các cơ quan. Tuy nhiên, do hạn chế của phương pháp này nên cũng khó xác định được sự hiện diện của vi khuẩn ở các cơ quan mà chỉ quan sát được một số những biến đổi về mô học.

4.3.1 Những biến đổi mô học do vi khuẩn A. hydrophila

Kết quả quan sát tiêu bản mô học cho thấy sự biến đổi ở các mô không đáng kể ở cả 4 nghiệm thức, đặc biệt là ở nghiệm thức 2,16×105 CFU/ml và 2,16×106 CFU/ml. Tuy nhiên các biến đổi chủ yếu chỉ là sung huyết và xuất huyết. Trong các nghiệm thức không ghi nhận được hiện tượng hoại tử ở các cơ quan.

Sung huyết ở các tĩnh mạch gan làm cho tĩnh mạch có hiện tượng phình to và tập trung nhiều tế bào hồng cầu (Hình 4.3 B), hiện tượng này được ghi nhận ở cả 4 nghiệm thức. Hiện tượng sung huyết xảy ra là do kích thích đặc biệt làm cho mao mạch nở ra một lượng máu lớn hơn bình thường được đưa đến gần ổ viêm, hiện tượng sung huyết được xem là phản ứng đầu tiên của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004)

Hiện tượng xuất huyết cũng quan sát được ở các nghiệm thức (Hình 4.3 C & Hình 4.3 F). Theo Trần Thị Ngọc Hân (2006) khi những vùng sung huyết dưới

20

ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn, các mao mạch máu bị vỡ hoặc tính thẩm thấu của mao mạch tăng lên, làm cho các tế bào máu trong vùng sung huyết thoát ra xen lẫn với các tế bào máu cơ quan sẽ gây ra hiện tượng xuất huyết.

Hiện tượng sung huyết và xuất huyết kéo dài sẽ làm tế bào bị mất cấu trúc, hiện tượng mất cấu trúc đã được ghi nhận ở mô gan của nghiệm thức 2,16×105 CFU/ml (Hình 4.3 D). Tế bào mất cấu trúc và dẫn đến hoại tử, đầu tiên là hoại tử dạng hạt và sau đó là hoại tử gần hóa lỏng đến hoá lỏng (Trần Thị Ngọc Hân, 2006).

A B

c

b

a

C

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

A. Gan cá khỏe (H & E, 10X) a: tế bao gan b: xoang tĩnh mạch gan

c: trung tâm đại thực bào sắc tố

B. Gan bị sung huyết và xuất huyết (H & E, 40X) C. Gan bị mất cấu trúc (H & E, 10X)

Hình 4.4 Mô gan cá tra bị nhiễm A. hydrophila ((cid:188))

21

B A

a

b

C D

a

b

c

A. Thận cá khỏe (H & E, 10X) a: ống dẫn thận b: tiểu cầu thận c: tế bào sắc tố B. Thận cá bị xuất huyết (H & E, 40X)

C. Tỳ tạng cá khỏe (H & E, 10X) a: tủy trắng b: tủy đỏ

c: trung tâm đại thực bào sắc tố

D. Tỳ tạng bị sung huyết và xuất huyết (H & E, 40X)

Hình 4.4 Mô thận và tỳ tạng cá tra bị nhiễm A. hydrophila ((cid:188)) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

22

4.3.2 Những biến đổi mô học do vi khuẩn E. ictaluri

khuẩn E. ictaluri cũng Kết quả quan sát tiêu bản mô học ở thí nghiệm tiêm vi cho thấy sự biến đổi mô học không đáng kể ở các cơ quan gan, thận và ty tạng. Biến đổi nhiều nhất chỉ thấy ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml và 1×107 CFU/ml. Trong đó gan chỉ xuất hiện hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các tĩnh mạch (Hình 4.5 B).

Thịnh (2002) hiện tượng sung huyết kéo dài sẽ làm vỡ Theo Nguyễn Quốc mạch máu, giải thoát nhiều enzim tiêu hóa (tiêu hóa protein, lipid,…) từ các bạch cầu làm cho tổ chức viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử, những tổn thương diễn ra tòan bộ tổ chức gan làm cho gan không còn chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết mật, làm cho chất độc không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể kết hợp với các yếu tố khác làm cá chết.

.5 D) Ở thận cũng ghi nhận được hiện tượng sung huyết và xuất huyết (Hình 4 Tất cả các động vật có xương sống đều có phản ứng khi có vật lạ xâm nhập vào cơ thể, nhằm đào thải các tác nhân xâm nhập, phản ứng này gọi là phản ứng sưng viêm hay phản ứng miễn nhiễm, tác giả cũng cho rằng phản ứng miễn dịch được khởi động do sự giải thoát các amin hoạt động từ mạng lưới vi mạch của vùng bị vi khuẩn tấn công, những chất này gây tăng cường máu dẫn đến vùng viêm, đồng thời làm giãn các mao mạch và các khe hở liên bào của Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu tế bào nội mô mao mạch, chính điều này gây ra hiện tượng sung huyết ở vùng bị viêm (Roberts, 1995 được trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Không có hiện tượng hoại tử xảy ra ở gan và thận. Điều này không giống với các thí nghiệm trước đây. Theo một số tác giả thì khi vi khuẩn tấn công vào cơ thể cá thì gây tổn hại đến các mô, các biểu hiện thường gặp là xung huyết, xuất huyết và hoại tử. Baxa et al., (1990) đã ghi nhận có hiện tượng hoại tử ở gan, thận và tỳ tạng khi gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá nheo. Nguyễn Thị Ngọc Hân (2006) cũng ghi nhận có hiện tượng hoại tử dạng hạt và hoá lỏng ở nghiệm thức 1×105 CFU/ml và 1×106 CFU/ml.

được xem là cơ quan mà vi khuẩn

Cũng như gan và thận, tỳ tạng cũng E. ictaluri tấn công chủ yếu sau khi xâm nhập vào cá tra (Nguyễn Thị Ngọc Hân, 2006). Tuy nhiên biến đổi cấu trúc mô học ở tỳ tạng của cá trong thí nghiệm cũng chỉ là hiện tượng sung huyết và xuất huyết (Hình 4.5 F). Theo Trần Hồng Ửng (2003) khi quan sát tiêu bản mô tỳ tạng dưới kính hiển vi thấy cá bệnh mủ gan có phần tủy trắng nhiều hơn ở cá khỏe. Nguyên nhân là do tủy trắng là vùng chủ yếu sản xuất ra các tế bào bạch cầu, khi cơ thể cá bị vi khuẩn tấn công thì kích thích tủy trắng hoạt động mạnh hơn để sản xuất ra các

23

loại tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống đáp ứng miễn dịch tiêu diệt vi khuẩn.

Trong khi đó phân tích mô học của Trần Thị Ngọc Hân (2006), Nguyễn Quốc Thịnh (2002) đều cho thấy tổn thương ở gan, tỳ tạng và thận là nhiều nhất, các cơ quan này có hiện tượng sung huyết, xuất huyết dẫn đến hoại tử.

Kết quả cho thấy, những biến đổi mô học ở gan, thận và tỳ tạng của cá trong thí nghiệm chủ yếu chỉ là hiện tượng sung huyết và xuất huyết, không như những nghiên cứu trước đây đều ghi nhận còn có hiện tượng hoại tử dạng hạt hoặc hoá lỏng ở cả ba cơ quan.

Tóm lại: cá ở hai thí nghiệm gây cảm nhiễm có những biến đổi mô học ở gan, thận và tỳ tạng đều không đáng kể. Chỉ có hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các cơ quan, không xuất hiện hiện tượng hoại tử.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

24

B A

b

c

a

c

C D

a

b

F E

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

a

b

c

A. Gan cá khỏe (H & E, 10X) a: tế bao gan b: xoang tĩnh mạch gan

c: trung tâm đại thực bào sắc tố

B. Gan bị xuất huyết (H & E, 40X)

C. Thận cá khỏe (H & E, 10X) a: ống dẫn thận b: tiểu cầu thận

c: tế bào sắc tố

D. Thận bị sung huyết (H & E, 10X)

E. Tỳ tạng cá khỏe (H & E, 10X) a: tủy trắng b: tủy đỏ

c: trung tâm đại thực bào sắc tố

F. Tỳ tạng bị sung huyết (H & E, 40X)

Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri ((cid:188))

25

4.4 Kết quả tái định danh vi khuẩn

Sau khi gây cảm nhiễm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, sau đó vi khuẩn đã tái phân lập được tiến hành tái định danh vi khuẩn dựa theo phương pháp của Bergey (1974) và dựa theo dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). Việc tái phân lập và định danh vi khuẩn hết sức cần thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng. Nó giúp xác định chính xác tác nhân gây bệnh vá có thêm chứng cớ cho các trường hợp nhiễm bệnh. Bởi vì tỉ lệ chết chưa hẳn là dấu hiệu tốt của vấn đề bệnh, mà nó còn có thể là kết quả của vấn đề môi trường xấu hoặc do vi khuẩn gây ra. Hơn nữa vai trò của vi khuẩn chỉ được công nhận khi nó luôn được phân lập từ cá bệnh đó và trong gây cảm nhiễm thực nghiệm (Từ Thanh Dung, 1997).

Tái định danh vi khuẩn gồm các bước nhuộm Gram, quan sát hình dạng và tính di động, các phản ứng Oxidase, Catalase, O/F, O/129, Esculin, khả năng phân giải acid amin (Arginine, Lysine, Ornithine), khả năng sử dụng đường (Arabinose, Glucose, Inositol, Rhamnose, Sucrose, Salicin), khả năng sử dụng Urease...

4.4.1 Tái định danh vi khuẩn A. hydrophila

Trong 70 mẫu cá bệnh thu được trong thời gian gây cảm nhiễm, đã tái phân Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu lập vi khuẩn 52 mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA, ủ ở 28oC sau 24 giờ và đã thu được 156 chủng vi khuẩn. Sau đó dựa vào những đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản đã chọn được 12 chủng vi khuẩn tiến hành tái định danh vi khuẩn.

1 2 1 2 3 4

A B

Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310

A. Chỉ tiêu acid amin (1. đối chứng, 2. arginine)

B. Các chỉ tiêu: 1. Citrate, 2. SIM, 3. Esculin, 4. TSI.

26

Qua kết quả kiểm tra nhuộm Gram, quan sát tính di động và các phản ứng test sinh hóa cho thấy chủng phân lập từ cá tra bệnh trong thí nghiệm và chủng gốc ban đầu được phân lập từ cá bệnh ngoài tự nhiên đều có khuẩn lạc dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn, kháng với O/129. Phản ứng dương tính với Oxidase, Catalase, Indole, VP, Gelatin, có khả năng phân giải Arginine, không có khả năng sinh H2S, có khả năng lên men các môi trường đường, có khả năng thủy phân Esculin, cho phản ứng âm tính với Urease (Hình 4.6 & Hình 4.7)

5. rhamnose, 6. sucrose, 7. salicin)

B B A 1 2 3 4 5 6 7

B. Test O/129

Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 A. Khả năng phân giải đường (1. arabinose, 2. glucose, 3. inositol, 4. mannitol, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Chủng Xương-CĐ3L310 sai khác chỉ tiêu H2S (+) và inositol (-) so với dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). Nguyễn Thị Như Ngọc (1997) cũng ghi nhận A. hydrophila có khả năng phân giải arginine. Theo kết quả ghi nhận của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998), A. hydrophila vẫn có khả năng phân giải ornithin. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2002) còn ghi nhận, A. hydrophila có khả năng sử dụng H2S, sử dụng citrate và cho phản ứng dương tính với lysine.

4.4.2 Tái định danh vi khuẩn E. ictaluri

Sau khi gây cảm nhiễm, trong quá trình theo dõi thí nghiệm đã thu được 52 mẫu cá bệnh và đã tái phân lập vi khuẩn 39 mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA, ủ ở 28oC sau 48 giờ và đã thu được 117 chủng vi khuẩn. Sau đó dựa vào những đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản đã chọn được 12 chủng vi khuẩn tiến hành tái định danh vi khuẩn.

27

2 3 4 2 3 4 1 1

B A

A. Các chỉ tiêu acid amin (1. đối chứng, 2. arginine, 3. lysine, 4. ornithine)

B. Các chỉ tiêu: 1. TSI, 2. SIM, 3. Citrate, 4. Asculin

Hình 4.8 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Tỷ-PT207

Qua kết quả kiểm tra nhuộm Gram, quan sát hình dạng và tính di động và các phản ứng test sinh hóa cho thấy chủng phân lập từ cá tra bệnh trong thí nghiệm và chủng gốc ban đầu được phân lập từ cá bệnh ngoài tự nhiên đều có khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu tắng đục, rìa có dạng không đồng nhất, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, không di động, phản ứng Oxidase âm tính và cho phản ứng với Catalase. Trong các phản ứng lên men đường chỉ có đuờng glucose cho phản ứng dương tính còn các đường khác đều âm tính. Có khả Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu năng phân giải Ornithin và Lysine, không có khả năng sinh H2S, cho phản ứng âm tính với Citrate, Urease, Indole và VP, không có khả năng thủy phân Gelatin và Esculin (Hình 4.8).

Chủng Tỷ-PT207 sai khác chỉ tiêu khả năng sinh gas từ glucose(+) so với dòng chuẩn của Inglis et al., (1993).

4.5 Một số hạn chế trong quá trình thí nghiệm

Nhiệt độ phòng gây cảm nhiễm không ổn định ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thí nghiệm, điều này ảnh hưởng đến tỉ lệ cá chết.

Không theo dõi được các yếu tố thủy hóa của môi trường trong thời gian thí nghiệm.

Không có dòng chuẩn vi khuẩn trong quá trình tái định danh vi khuẩn, điều này ảnh hưởng đến tính chính xác khi so sánh kết quả.

28

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

− Ở cả hai thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và

E. ictaluri đều thấy xuất hiện cá chết ở các nghiệm thức, trừ nghiệm thức đối chứng.

− Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm.

− Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml là 37 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm có giá trị LD50= 106,5 CFU/ml.

− Trong cả hai thí nghiệm, khi quan sát biến đổi mô học chỉ thấy có hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các cơ quan gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

5.2 Đề xuất

− Cần có dòng chuẩn khi tái định danh vi khuẩn.

− Cần có dụng cụ đo pH và nhiệt độ nước hằng ngày.

− Ổn định nhiệt độ phòng gây cảm nhiễm ở điều kiện 27oC-28oC trong

thời gian thí nghiệm gây cảm nhiễm.

− Gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra và thu mẫu ở những mốc thời gian khác nhau nhằm xác định ảnh hưởng của vi khuẩn đến quá trình biến đổi cấu trúc mô.

29

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Angka, S.L. 1990. The Pathology of the Walking catfish Clarias batrachus (L), infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila Asian Fish Sci. 3: 343- 351. In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.

2. Aydin, S. and A. Cilta. 2004. Systemic Infections of Aeromonas hydrophila in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum): Gross Pathology, Bacteriology, Clinical Pathology, Histopathology and Chemotherapy. In Journal of Animal and Veterinary Advances 3 (12): 810-819.

3. Azad, I. S., Rajendran, K. V., Rajan, J. J. S., Vijayan, K. K. and Santiago, T. C. 2001. Virulence and histopathology of Aeromonas hydrophila (SAH 93) in experimentally infected tilapia, Oreochromis mossambicus (L.). In Journal of Aquaculture in the Tropics 16(3): 265-275.

4. Baxa, D. V., J. M. Groff, A. Wishkovsky and R. P. Hedrick. 1990. Susceptibility of nonictalurid fishes to experimental infection with Edwardsiella ictaluri. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 8: 113-117.

5. Bergey, U. 1974. Pathogenicity of lactobacilli.

6. Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam. 2006. Ngày truy cập 26/02/2007. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu http://www.monre.gov.vn/monrenet/default.aspx?tabid=210&ItemID=103 72

7. Bùi Quang Tề. 2006. Bệnh học thủy sản.

8. De Figueirredo, J. and Plum. J. A. 1977. Virulence of different isolates of Aeromonas hydrophila in channel catfish. Aquaculture. 349-354

9. Dương Nhựt Long. 2006. Giảp pháp kĩ thuật góp phần nâng cao chất lượng và khai thác bền vững sản phẩm cá Tra nuôi xuất khẩu vùng ĐBSCL. http://mekongfish.net.vn/modules/new/index.php?storytopic=0,2start=10.

10. Đoàn Nhật Phương. 2001. Xác định LD50 và thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

11. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại học thủy sản nha Trang, 345 trang.

12. Esteve, C., E. G. Biosca and C. Amaro. 1993. Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 16: 15-20.

13. Francis- Floyd R., M.H. Beleau, P.R. Waterstat and P.R. Bowser. 1987. Effect of water temperater on the clinical outcome of infection with

30

Edwardsiella ictaluri in Channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the American Veterinary Medical Assosiation 1991, 1413-1416

14. Ferguson H. W, J.F. Turnbull, A. Shinn, K.Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish. 2001. Bacillary nercrosis in farmed Pangasius hypophthalamus (Sauvage) from the Mekong Delta, Viet Nam. Journal of Fish Diseases 2001, 24, 509- 513.

15. Hà Yên. 2005. Lập ban điều hành sán xuất và tiêu thụ cá tra, basa. http://www.vnn.vn/kinhte/congnongngunghiep/2005/05/435019. Ngày truy cập: 26/02/2007.

16. Hawke J.P. 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508-1512.

17. Inglis, V., R. Roberts and N. R. Bromage. 1993. Bacterial Diseases of

Fish.

18. Klesius, P.H. and W.M. Sealey. 1995. Chacracterization of serum antibody in enteric septicemia of catfish. In Journal of aquatic animal Heath: 205-210.

19. Lawrence M.L., R.K. Cooper and R.L. Thune. 1997. Attenuation, persistence and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA Mutant. Infection and Immunity, Nov. 1997, p.4642-4652. Vol. 65, No. 11.

20. Lê Thị Bé Năm. 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu nội tạng cá Tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

21. Lewis, D.H. and J.A.Plumb. 1979. Bacterial diseases p.15-24. In Principal diseases of farm raised catfish. Southern Cooperative Ser. 225 Auburn University. Alabama.

22. Lương Trần Thục Đoan. 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá Tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

trắm cá

23. Ngô Thị Ngọc Thủy. 1998. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ ở cỏ (Ctenopharyngodonidelus) và chọn chủng chế vaccine phòng bệnh. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

24. Nguyễn Bạch Loan. 2004. Ngư loại I. Bài giảng.

25. Nguyễn Quốc Thịnh. 2002. Nghiện cứu mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

26. Nguyễn Thị Như Ngọc. 1997. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus, Bleeker). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

31

27. Phan Thị Mỹ Hạnh. 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do E. ictaluri trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu long. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

28. Plumb J.A., 1999. Fish diseases and disorders. Aquaculture and aquatic Environments, Auburn University, Alabama 36849 USA. 3: Viral, Bacterial and Fungal infections.

29. Rahman, M.H., S. Suzuki and K. Kawai. 2000. The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus.

30. Reed, L. J. and H. Muench. 1938. A simple method of estimating fifty percent end points. American Journal of Hygiene 27: 493 – 497.

31. Roselynn, M. and W. Stevenson. 1988. Vaccination against Aeromonas hydrophila. In Fish Vaccination. 9: 112 – 123.

32. Saitanu, K.S., Wongsawang and K. Poonsuk. 1982. Red sore disease in carp (Cyprinus carpio L) J. Aquat. Animal Dis. 3: 79-86. (In Thai). In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.

33. Takahashi, Y., T. Kajiwaki and T. Itami. 1986. Characteristics of vibriostatic agent-sensitive Aeromonas hydrophila isolated from ayu Plecogrossus altivelis and its pathogenicity. In Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 52(4): 1727-1733.

34. Tanasomwang, V. and K. Saitanu. 1979. Ulcer disease in striped catfish Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu (Pangasius pangasius) J. Aquat. Animal. Dis. 2: 131-133. In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992.

35. Thompson, K. and A. Adams. 1998. Characterisation of Aeromonas hydrophila Extracellular Products with Reference to Toxicity, Virulence, Protein Profiles and Antigenicity.

36. Trần Anh Dũng. 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. LVCH. Khoa thủy sản, ĐHCT.

37. Trần Hồng Ửng. 2003. Bước đầu xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh trắng gan. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

38. Trần Thị Ngọc Hân. 2006. Khảo sát mô học cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT.

39. Trương Quốc Phú. 2004. Quản lý môi trường ao nuôi. Bài giảng.

40. Từ Thanh Dung. 1997. Tài liệu tập huấn thực hành kí sinh trùng và vi khuẩn.

41. Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm

32

42. Từ Thanh Dung. 2005. Bài giảng bệnh học thủy sản.

43. Williams, M.L and M.L. Lawrence. 2005.

Identification and characerization of a two component hemolysin from E. ictaluri. Journal of aquatic animal Heath. 108: 281-189.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

33

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A

Phương pháp định danh vi khuẩn

1. Chỉ tiêu về hình thái

Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc

Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặc điểm sau:

Hình dạng khuẩn lạc: tròn, dạng sợi, dạng rễ cây, không có dạng cố định. Rìa khuẩn lạc: nguyên dạng, dạng thùy, dạng sợi.. Bề mặt khuẩn lạc: dạng đều, hơi lồi, lồi hình vòm Kích cỡ khuẩn lạc: chấm li ti, nhỏ, trung bình, lớn Màu sắc khuẩn lạc: kem, trắng (đục hay trong suốt), đen, cam… Tạo sắc tố ( đổi màu môi trường) có hay không ? sắc tố màu gì ? - - - - - -

Nhuộm Gram

Nhuộm gram để quan sát hình dạng, kích thước và xác định vi khuẩn thuộc nhóm gram âm hay gram dương.

Thông thường vi khuẩn có các hình dạng: hình cầu, hình chuỗi, hình que ngắn, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu hình que dài, hình cong.

Phương pháp

- Sử dụng lame sạch, que cấy tiệt trùng, cho một ít nước muối sinh lý lên lame.

- Cho một ít vi khuẩn lên giọt nước muối trên lame và trãi đều. - Để lame khô tự nhiên. - Hơ lướt lame qua ngọn đèn cồn để cố định vi khuẩn. - Để lame nguội và tiến hành nhuộm. - Nhuộm crystal violet khoảng 1 phút. - Rửa lame bằng nước. Nhuộm iodine khoảng 1 phút. - Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone khoảng 10 giây. - Rửa lại bằng nước và để khô. - Nhuộm safranine khoảng 2 phút. - Rửa lại bằng nước sạch và để khô. - Quan sát trên kính hiển vi quang học ở vật kính 40 X và 100X có giọt dầu.

Kết quả

(cid:190) Gram dương: màu xanh/tím (cid:190) Gram âm: màu đỏ/hồng

2 Các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

Tính di động

34

Test này dùng để kiểm tra khả năng di chuyển độc lập của vi khuẩn.

Nhiều loại vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm mao. Sự di động này có thể quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40X để xác định khả năng di động của vi khuẩn.

Phương pháp

- Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle - Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hòa vào nước muối sinh lý chứa vi khuẩn.

- Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn.

- Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lên lamelle. - Đặt lame lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 40X để kiểm tra tính di động của vi khuẩn.

Phản ứng Oxydase

Phương pháp

- Chạm nhẹ que thử vào một khuẩn lạc trêm đĩa agar. - Quan sát que thử trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc.

Kết quả

(cid:190) Que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng Oxydase dương tính (+) và Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu không chuyển màu âm tính (-).

Phản ứng Catalase

Phương pháp

- Nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2. Kết quả

(cid:190) Vi khuẩn cho phản ứng Catalase dương tính (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch H2O2; ngược lại khi không sủi bọt thì phản ứng Catalase âm tính(-)

Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test)

Phương pháp

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O-F đã tiệt trùng. - Tiệt trùng que cấy thẳng và để nguội. - Dung đầu que cấy lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm.

- Phủ lên 1 trong 2 ống nghiệm 0,5-1 ml dầu parafin và để vào tủ ầm ở nhiệt độ 28-30oC

- Kiểm tra hằng ngày đến 7 ngày. So sánh màu của 2 ống nghiệm và ghi nhận kết quả theo bảng dưới đây

35

Kết quả

Ống tiếp xúc không khí Kết quả Ống phủ dầu parafin

Xanh lá cây Xanh lá cây Xanh lá cây Vàng Không phản ứng với glucose Phản ứng kiềm tính Phản ứng oxy hóa Phản ứng lên men Xanh lá cây Xanh lơ ở phần trên Vàng Vàng

Phản ứng O/129

Test này dùng để phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas và Vibrio. Vi khuẩn Aeromonas kháng (âm tính). Vibrio nhạy cảm (dương tính) với hợp chất này.

Phương pháp

- Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý tiệt trùng và lắc nhẹ

- Dùng pipet tiệt trùng hút vi khuẩn trong ống nghiệm cho 5 giọt lên đĩa agar.

- Tiệt trùng que trải thủy tinh bằng cồn 95o và trãi đều vi khuẩn trên đĩa agar.

- Đậy nắp để khoảng 1 phút - Dán các đĩa giấy tẩm O/129 ở nồng độ 10µg và 150µg lên đĩa agar. - Ủ trong tủ ấm ở 28oC- 30oC và đọc kết quả sau 24 giờ Kết quả

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu (cid:190) Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên một vòng tròn vô trùng ≥ 15 mm

quanh đĩa tẩm O/129

Môi trường dinh dưỡng dùng để test O/129 phải có nồng độ muối thích hợp cho vi khuẩn Vibrio phát triển, thông thường sử dụng môi trường TSA hoặc NA + 1.5% NaCl

Phản ứng Decarboxylase

Môi trường: Decarboxylase + 0,5% yeast extract. Thêm 1% amino acid (Arginnine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có amino acid.

Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm. Sau đó phủ lên mỗi ống 0,5 ml parafin tiệt trùng. Để trong tủ ấm ở 30oC.

- Đọc kết quả từ 1- 4 ngày.

Kết quả

(cid:190) Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng và ngược lại.

36

Khả năng sinh Indole

Môi trường: Nutrient broth

Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Để nguội. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC.

- Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử kovac’ s vào ống nghiệm. Kết quả

(cid:190) Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại.

Phản ứng Voges-proskauer (VP)

Môi trường: MR-VP broth

Thuốc thử: A: Hòa tan 5 g alpha naphthol trong 100 ml ethyl alcohol. B: Hòa tan 40 g KOH trong 100 ml nuớc cất.

Phương pháp - Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ 0,6 ml thuốc thử A và 0,2 ml thuốc thử B vào ống nghiệm. - Lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút.

Kết quả

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

(cid:190) Môi trường chuyểng màu hồng cho phản ứng (+) và ngược lại.

Phản ứng tạo Nitrite từ nitrate

Môi trường: Nitrate broth

Thuốc thử: A: Hòa tan 0,8% sulphanilic acid trong 5-N acid acetic.

B: Hòa tan 0,5% alpha-napthylmin 5-N acid acetic.

Phương pháp - Cho 3 ml môi trườngvào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Để nguội. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC.

- Sau 48 giờ nhỏ 1 ml thuốc thử A và 1 ml thuốc thử B vào ống nghiệm.

Kết quả

(cid:190) Môi trường chuyển màu đỏ trong vòng 1-2 phút cho phản ứng (+) và ngược lại.

Khả năng sử dụng Citrate Môi trường: Simmon’ s Citrate agar. Đun sôi và khuấy cho tan.

Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút.

37

- Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. - Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 30oC. - Đọc kết quả sau 2-7 ngày.

Kết quả

(cid:190) Vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường cho kết quả (+) và ngược lại.

Khả năng thủy phân Starch Môi trường: Nutrient agar + 0,5% Starch. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội khoảng 45oC, đổ môi trường ra đĩa petri. Thuốc thử Lugol’ s Iodine: Hòa tan KI và Iodone trong 10 ml nước cất rồi thêm tiếp cho đủ 100 ml.

Phương pháp - Cấy vi khuẩn lên đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử Lugol’ s Iodine lên bề mặt agar. - Đọc kết quả trong vòng 30 phút.

Kết quả

(cid:190) Nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) và ngược lại.

Khả năng thủy phân Gelatin Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Môi trường: Nutrient agar + 1% Gelatin. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội khoảng 45oC, đổ môi trường ra đĩa petri

Phương pháp - Cấy vi khuẩn lên đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử HgCl lên bề mặt agar. - Đọc kết quả trong vòng 30 phút.

Kết quả

(cid:190) Nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) và ngược lại.

Khả năng sử dụng các nguồn Carbohydrate

Môi trường: Nitrate broth 0,4% Bromothymol blue (1,6%) 1% đường (glucose, arabinose, xylose, galactose, sucrose...)

Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Để nguội. Dùng môi trường đường tương ứng. - Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Đọc kết quả trong vòng 2-7 ngày.

38

Kết quả

(cid:190) Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại.

Khả năng sử dụng Urê

Môi trường: 0,1% Pepton + 0,0012% Phenol red + 0,1% glucose. Thêm 2% urê cho phản ứng. Môi trường đối chứng không có Urê.

Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Đọc kết quả trong vòng 2 ngày.

Kết quả

(cid:190) Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có Urê chuyển màu hồng.

Khả năng sử dụng đường glucose, sucrose, galactose, sinh gas và H2S Môi trường: TSI (60g/1000ml nước cất). Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội.

Phương pháp

- Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. - Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng và chừa lại khoảng 1-2 cm thạch đứng trong ống nghiệm và để nguội.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu - Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt

độ 30oC.

- Đọc kết quả sau 14-28 giờ.

Kết quả

(cid:190) Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm, vi khuẩn sinh gas tạo bọt khí trong ống nghiệm. (cid:190) Vi khuẩn chỉ lên men đường glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (K/A). (cid:190) Vi khuẩn lên men đường glucose và lactose hoặc surose cho màu vàng ở cả phần thạch ngiêng và phần thạch đứng (A/A). (cid:190) Vi khuẩn chỉ lên men đường lactose hoặc sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A/K). (cid:190) Vi khuẩn không lên men đường glucose, lactose hoặc surose cho màu đỏ ở cả phần thạch nghiêng và phần thạch đứng (K/K).

Môi trường Esculin

Môi trường: Bile esculin agar

Phương pháp: Cấy vi khuẩn thẳng xuống đáy và trên bề mặt môi trường. Ủ ở nhiệt độ 30oC. Đọc kết quả sau 7 ngày.

Kết quả (cid:190) Nếu môi trường có màu cho phản ứng (+) và ngược lại.

39

PHỤ LỤC B

Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô

Thu mẫu ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định bằng dung dịch formol trung tính 10% trong lọ nhựa, sau đó thực hiện các bước sau:

1. Rửa mẫu sau khi cố định

Mẫu mô sau khi cố định trong dung dịch NBF khoảng 24-48 giờ tiến hành rửa dưới vòi nước. Sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý mẫu.

2. Cắt tỉa và định hướng

Mẫu trước khi đưa vào quy trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 3-5mm. Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý.

3. Quy trình xử lý mẫu (quy trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy)

Loại nước

Việc loại nước phải đảm bảo nguyên tắc là loại hết nước trong mẫu mô mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bao trong mẫu mô bị thay đổi.

Quá trình loại nước đuợc thực hiện bằng cách nhúng mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 70% đến 100%. Thời gian khử nước phụ thuộc Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vào độ dày của mẫu mô.

Làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian)

Vì cồn và paraffin không hòa tan vào nhau nên sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cần phải loại khỏi mẫu mô để tránh tình trạng mô có thể bị co rút khi tẩm paraffin. Dung môi trung gian vừa hòa tan được cồn và paraffin là xylen, xylen ít độc và có tính thấm nhanh.

Quá trình này được thực hiện bằng cách ngâm mẫu mô trong xylen qua 2 lọ. Thời gian ngâm mẫu trong mỗi lọ dao động từ 2 giờ đến 2 giờ 30 phút. Ngoài ra để tăng khả năng ngấm paraffin và để loại hoàn toàn cồn ra khỏi mẫu mô, trước khi chuyển sang bước ngấm paraffin, mẫu mô được ngâm trong lọ paraffin hòa tan trong xylen.

Tẩm Paraffin

Paraffin là chất nền để đảm bảo cho tế bào giữ nguyên hình dạng khi cắt vì thế sau khi làm trong mẫu, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin.

Ngâm mẫu qua 2 lọ paraffin, thời gian mỗi lọ khoảng 1 giờ ở nhiệt độ khoảng 56oC

Lọ 1: Paraffin + sáp ong với tỉ lệ 1:1

Lọ 2: paraffin + sáp ong với tỉ lệ 7:3

40

Các bước loại nước, tẩm dung môi trung gian, tẩm paraffin được thực hiện trên máy Paraffin Embeding Procedures.

Cồn 70% .............................................................................................1 giờ Cồn 80% .............................................................................................1 giờ Cồn 95% .............................................................................................1 giờ Cồn 95% .............................................................................................1 giờ Cồn 95% .............................................................................................1 giờ 30 Cồn 100% ...........................................................................................1 giờ 30 Cồn 100% ...........................................................................................1 giờ 30 Xylen 1................................................................................................2 giờ Xylen 2................................................................................................2 giờ Paraffin + Xylen (1:1).........................................................................2 giờ 30 Paraffin + sáp ong (1:1) ......................................................................2 giờ 30 Paraffin + sáp ong (7:3) ......................................................................2 giờ 30

4. Đúc khuôn (cid:190) Chất nền để đúc khuôn là paraffin: sáp ong nóng chảy (57oC-60oC) tỉ lệ 7:3 (cid:190) Đổ một ít paraffin vào khuôn (cid:190) Gắp mẫu mô cho vào khuôn(cid:198) đặt mẫu ngay ngắn và ấn cho mẫu sát vào đáy khuôn(cid:198) tiếp tục đổ paraffin đầy khuôn.

(cid:190) Đặt vào tủ lạnh hoặc ngăn lạnh để paraffin đặc lại. (cid:190) Lấy khối mô ra khỏi khuôn và đặt trong tủ lạnh để làm rắn lại.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

5. Cắt mẫu

Sử dụng máy microtome để cắt mẫu. Mẫu phải được làm lạnh khi cắt.

Chuẩn bị máy cắt Đặt lưỡi dao vào máy cắt sao cho lưỡi dao lệch với mặt cắt một góc 15o-40o

Tiến hành cắt

(cid:190) Đặt khối mẫu vào máy cắt lát mỏng, chỉnh cho khối mẫu nagng và thẳng đứng.

(cid:190) Điều chỉnh độ dày lát cắt, có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12µm.

(cid:190) Sau khi cắt bằng mặt khối paraffin và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày về vạch 4-6µm và cắt mẫu.

(cid:190) Mẫu cắt tạo thành dãy băng dài, cho dãi băng vào nước ấm ở nhiệt độ 45oC-50oC cho dãy paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn đạt yêu cầu.

6. Dán mẫu

(cid:190) Dán mẫu bằng dung dịch Mayer ’ albumin.

(cid:190) Thoa dung dịch lên lame, đặt một đầu lame vào chậu nứơc ấm nghiệng một góc 45o và nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặc lên phiến lame.

41

(cid:190) Cho lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45oC-50oC

(cid:190) Để qua đêm cho paraffin tan ra và mẫu được khô.

7. Nhuộm mẫu

Quy trình nhuộm mẫu được thực hiện trên máy và tiến hành theo các bước sau:

Xylene 1..............................................................................................5 phút Xylene 2..............................................................................................5 phút Xylene 3..............................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Cồn 70% .............................................................................................2 phút Rửa nước.............................................................................................5 phút Haematoxyline ....................................................................................1 phút Rửa nước.............................................................................................5 phút 1% acid alcohol...................................................................................10 giây Rửa nước.............................................................................................3 phút Eosin ...................................................................................................3 phút Cồn 95% .............................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Xylen...................................................................................................5 phút Xylen...................................................................................................5 phút

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

8. Dán Lamelle vào lame

(cid:190) Để mẫu giữ được lâu và tăng tính chiết quang của mẫu, dùng keo enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu.

(cid:190) Nhỏ một giọt keo lên mẫu, đặt lamelle nghiêng 45o và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống từ để tránh bọt khí.

9. Đọc kết quả

(cid:190) Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10X để quan sát tổng quát tiêu bản. Nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh của hematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng Eosin.

(cid:190) Các tiêu bản đẹp sẽ được quan sát lần lượt ở độ phóng đại 40X, 100X (nhỏ giọt dầu).

(cid:190) Chụp hình những tiêu bản đẹp, đặc trưng.

42

PHỤ LỤC C

Bảng số lượng cá chết hàng ngàytrong thí nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri

1

2

3

4 5 6 7 8 9 10

Nghiệm thức (CFU/ml) Đối chứng 1×105 1×105 1×105 1×106 1×106 1×106 1×107 1×107 1×107 1×108 1×108 1×108

Lần lặp lại 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 5 3

0 0 0 0 1 0 0 3 5 4 3 2 5

0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Bảng số lượng cá chết hàng ngàytrong thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila

7

9

8

2

3

5

6

4

10

1 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 0 0 0 0 3 2 3 2 6 7 4 8 6

Nghiệm thức (CFU/ml) Đối chứng 2,16×103 2,16×103 2,16×103 2,16×104 2,16×104 2,16×104 2,16×105 2,16×105 2,16×105 2,16×106 2,16×106 2,16×106

Lần lặp lại 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 4 3 5 3 3 4 2 1 0 2 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

43