ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------
VƢƠNG THANH HƢƠNG
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus
stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG
KHÁNG SINH TRONG SỮA
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - Năm 2017
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------
VƢƠNG THANH HƢƠNG
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus
stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. MAI THỊ ĐÀM LINH
Hà Nội - Năm 2017
Luận văn thạc sỹ
MỞ ĐẦU
Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 bởi Alexander Flemming, chất
kháng sinh được coi là công cụ hữu hiệu trong việc điều trị bệnh cho người và động
vật. Chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi,
trồng trọt, nuôi truồng thủy hải sản, … có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi trồng
chống lại bệnh tật. Việc sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi đã được chứng
minh là làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, khả năng thu nhận thức ăn của vật
nuôi đề kháng lại các bệnh tật. Do hiệu quả nhanh và mạnh, chất kháng sinh hiện
nay được sử dụng tràn lan và phổ biến trong chăn nuôi mà không được kiểm soát.
Điều này dẫn đến một thực trạng là hiện tượng tồn dư chất kháng sinh trong vật
nuôi gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm. Tại Việt Nam, trong chăn nuôi
gia súc, gia cầm hiện nay người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức ăn có chứa
chất tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh cho vật nuôi và giúp
vật nuôi mau ăn chóng lớn. Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng
sinh trong thực phẩm từ vật nuôi này vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần.
Trong ngành sản xuất sữa hiện nay, việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng
và chữa bệnh cho bò (phổ biến là bệnh viêm vú bò) là nguyên nhân gây ra sự tồn dư
thuốc kháng sinh trong mô và trong sữa của bò. Kháng sinh tồn dư trong sữa bò, dê,
cừu gây ức chế vi khuẩn được dùng trong quá trình chế biến sữa, đặc biệt là quá
trình chế biến phomat, sữa chua khi phải dùng vi khuẩn để lên men. Đồng thời sự
tồn dư lượng kháng sinh trong sữa gây nguy hiểm cho trẻ em và người già, là những
đối tượng dùng sữa nhiều.
Các nước Châu Âu đã ngừng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ năm
2006. Mỹ và Thái Lan sẽ ngừng sử dụng trong năm 2017. Quốc tế đã có rào cản của
riêng mình để nói không với thực phẩm chứa kháng sinh. Ở Việt Nam, vấn đề kiểm
tra và kiểm soát dư lượng kháng sinh trong sữa đang được quan tâm. Trước đòi hỏi
ngày càng cao về chất lượng và độ an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ đồng
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 1
Luận văn thạc sỹ
vật của con người, ngoài việc tăng cường quản lý các công đoạn sản xuất thì việc
xác định nhanh hàm lượng kháng sinh tồn dư trong thực phẩm là điều rất cần thiết.
Có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa
như phương pháp sắc ký, phương pháp sắc ký miễn dịch, phương pháp ELISA,...
Các phương pháp này hầu hết có độ nhạy cao, kết quả khá chính xác. Tuy nhiên quy
trình thường phức tạp, cần có trang thiết bị đi kèm và cần kỹ thuật viên chuyên
nghiệp cao. Hơn nữa quá trình kiểm nghiệm đều phải lấy mẫu ngay và thực hiện
trong phòng thí nghiệm.
Hiện nay, các phương pháp phân tích bằng vi sinh vật được sử dụng phổ biến
để xác định dư lượng kháng sinh vì tính đơn giản, tiện lợi của nó. Có nhiều test vi
sinh vật đã được nghiên cứu và ứng dụng để xác định kháng sinh trong nhiều loại
sản phẩm. Geobacillus stearothermophilus là chủng vi sinh vật ưa nhiệt, rất nhạy
cảm với kháng sinh, được sử dụng phổ biến trong các test của nước ngoài. Tuy
nhiên các test này có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở
ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam. Để chủ động trong nghiên cứu cũng như
đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử
dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng
kháng sinh trong sữa”.
Mục tiêu của đề tài
Xây dựng được quy trình chế tạo test thử từ bào tử vi khuẩn Geobacillus
stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa tươi nguyên liệu.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 2
Luận văn thạc sỹ
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sản xuất sữa tƣơi ở Việt Nam:
Là quốc gia đông dân với mức tăng trưởng dân số cao, khoảng 1,2%/năm,
Việt Nam được đánh giá là thị trường tiềm năng cho các hãng sản xuất sữa. Với tỷ
lệ tăng trưởng GDP 6-8%/năm, thu nhập bình quân đầu người tăng 14,2%/năm cùng
với xu hướng cải thiện sức khỏe và tầm vóc của người Việt khiến nhu cầu sử dụng
các loại sữa và các sản phẩm từ sữa luôn ở mức cao. Theo dự báo của Hiệp hội Sữa
Việt Nam (VDA), lượng sữa tiêu thụ bình quân đầu người tại Việt Nam vào năm
2010 đạt 15 lít/năm và sẽ tăng gần gấp đôi, lên mức 28 lít/năm vào năm 2020 [15].
Tăng trưởng doanh thu ngành sữa chủ yếu là sữa bột và sữa nước, chiếm 74% tổng
giá trị thị trường. Tuy nhiên, năng lực sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa trong
nước được dự báo sẽ không theo kịp nhu cầu tiêu thụ, đặc biệt là trong lĩnh vực sản
xuất sữa tươi. Lượng sữa tươi nguyên liệu trong nước chỉ đáp ứng được 30% nhu
cầu sử dụng [15]. Trong khi đó, chất lượng sữa thấp, không ổn định do nguồn cung
cấp chủ yếu từ các hộ chăn nuôi nhỏ, năng suất thấp.
Nắm bắt được tiềm năng tăng trưởng của thị trường, ngày càng có nhiều
doanh nghiệp tham gia vao ngành chế biến sữa Việt Nam. Đặc biệt, đa phần các
doanh nghiệp hiện đang tập trung đầu tư phát triển vùng nguyên liệu của riêng mình
dưới nhiều hình thức nhằm giải quyết được nhược điểm lớn nhất của ngành sữa Việt
Nam là thiếu hụt nguyên liệu. Một trong những doanh nghiệp sữa thành công nhất
với việc tạo lập vùng nguyên liệu để phát triển sản phẩm là Công ty Cổ phần sữa
TH (nhãn hiệu sữa TH true milk). Các doanh nghiệp khác cũng không đứng ngoài
cuộc đua phát triển vùng nguyên liệu như Công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk,
Công ty cổ phần Thực phẩm dinh dưỡng NutiFood Việt Nam, … Sức hấp dẫn của
thị trường sữa Việt Nam không chỉ kích thích các doanh nghiệp nội địa mở rộng sản
xuất mà còn thu hút nhiều nhà đầu tư nước ngoài bỏ vốn vào ngành. Ví dụ, doanh
nghiệp sữa Friesland Campina Việt Nam (nhãn hiệu sữa Cô gái Hà Lan) đang xúc
tiến đẩy mạnh phát triển vùng nguyên liệu tại tỉnh Hà Nam theo hình thức hợp tác
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 3
Luận văn thạc sỹ
với các hộ nông dân, hình thành các trang trại chăn nuôi bò sữa quy mô gia đình (50
- 80 bò sữa/trại) khác với mô hình trại lớn 500 - 1000 bò sữa/trại của các doanh
nghiệp khác. [15]
Có rất nhiều doanh nghiệp tham gia vào ngành chế biến sữa do họ nắm bắt
được tiềm năng tăng trưởng của thị trường. Điều này dẫn đến sự cạnh tranh gay gắt
của các hãng sữa trong việc đưa ra sự lựa chọn sản phẩm sữa tốt nhất cho người tiêu
dùng. Vấn đề chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của các sản phẩm này được
đặt lên hàng đầu. Một vấn đề đang được quan tâm hiện nay là xuất hiện sự tồn dư
của chất kháng sinh trong các sản phẩm sữa. Nguyên nhân là do người dân sử dụng
kháng sinh bừa bãi trong chăn nuôi, quy trình sử dụng không được kiểm soát. Do đó
việc kiểm soát chất lượng sữa, đặc biệt là dư lượng kháng sinh trong sữa ngay tại
nguồn là vấn đề đang được quan tâm và đẩy mạnh.
Hình 1.1. Quy trình kiểm soát chất lượng sữa đầu vào trước khi xử lý
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 4
Luận văn thạc sỹ
1.2. Tình hình sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi:
1.2.1. Trên thế giới:
Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản, không chỉ để phòng và trị bệnh mà còn được dùng như một chất kích thích
sinh trưởng ở liều thấp (2,5 - 50 ppm) [8,52]. Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò sữa nói riêng là rất lớn. Việc sử dụng
kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí nghiệm của
Stokstad và Juke năm 1949 [65] khi cho gia cầm ăn thức ăn có bổ sung
Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của gia
cầm tăng rõ rệt. Vì thế, người ta đã đưa vào thức ăn của gia súc, gia cầm nhiều loại
thuốc kháng sinh như Oxytetracycline, Aureomycine, Penicillin, Streptomycine.
Mỹ là nước đầu tiên phát hiện ra hiệu quả sử dụng kháng sinh làm chất kích
thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi. Ở Mỹ hàng năm có khoảng 6 triệu pao
(xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi. Theo thống kê, xấp xỉ
80% số gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% bò thịt được nuôi dưỡng bằng thức
ăn có bổ sung kháng sinh. Ước tính cứ mỗi USD chi phí cho kháng sinh dùng trong
thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2-4 USD [33]. Cơ quan quản lý Dược
phẩm và Thực phẩm (FDA) Mỹ đã ban hành các quy định về việc cho phép sử dụng
kháng sinh để kích thích tăng trọng từ năm 1951. Theo Hội đồng nghiên cứu Quốc
Gia Hoa Kỳ (NRC), 1998, Mỹ và Canada đã cho phép sử dụng 17 loại kháng sinh
vào thức ăn cho lợn, trong đó có 8 loại phải ngừng sử dụng trước khi giết mổ từ 5-
70 ngày. Liều lượng bổ sung thường rất thấp tùy theo loại kháng sinh, nhưng nếu sử
dụng Chlotetracycline hay Zinbacitracilin thì hàm lượng đó là 30 đến 40 ppm. [33]
Ở Anh và Pháp, trung bình một năm có khoảng 75% số động vật được dùng
kháng sinh để điều trị và gần 60% động vật được dùng kháng sinh để phòng bệnh.
Ở Anh, Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung vào
thức ăn chăn nuôi, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh [52]. Theo số liệu của
Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn
nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của các thành
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 5
Luận văn thạc sỹ
phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong dân y, 33% trong điều trị thú y và 15%
như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được
sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin 9%; Tetracycline 66%; Macrolide 12%;
Aminoglycoside 4%; Fluoroquinolone 1%; Trimethomprimsulfamid 2% và các
kháng sinh khác 6% [10].
Việc bổ sung kháng sinh với liều lượng thấp được xác nhận là cải thiện về
trọng lượng vật nuôi, giảm lượng thức ăn cho vật nuôi, giúp vật nuôi chống lại bệnh
tật. Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc
thuốc thú y nói chung và kháng sinh nói riêng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy
sản đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư thuốc trong sản phẩm, ảnh hưởng
xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trường cũng như hiệu quả điều trị bệnh [20,23].
Chính vì vậy, để tăng cường kiểm soát dư lượng thuốc, các nước phát triển đã có
những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát nghiêm ngặt. Ngày 22/12/2009 EU đã ban
hành quyết định số 37/2010 thay cho quyết định số 2377/90 EC quy định giới hạn
tồn dư thuốc thú y cho phép trong sản phẩm động vật [34]. Hoa Kỳ và Liên minh
Châu Âu cho phép dư lượng tối đa của kháng sinh trong thịt và phủ tạng động vật là
100 µg/kg, trong khi đó, Nhật Bản chỉ cho phép 20 µg/kg và Hàn Quốc là 10 µg/kg
[17,22,28]. Do phát hiện ra những độc tính của Chloramphenicol (CAP) lên cơ quan
tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi do suy tủy, gây tử
vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu đã cấm sử dụng CAP trong thú y. [3]
1.2.2. Tại Việt Nam:
Ở Việt Nam kháng sinh được sử dụng tràn lan để phòng bệnh và trị bệnh nên
tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt và sữa là rất phổ biến. Có tới 60-70% tổng
các thuốc đang dùng để phòng trị bệnh cho vật nuôi là thuốc hóa học trị liệu trong
đó chủ yếu là thuốc kháng sinh [16]. Theo Lã Văn Kính và cộng sự (2007), tỷ lệ sử
dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở nước ta là rất cao: 100% các cơ sở chăn nuôi có
sử dụng Oxytetracycline, 67% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Chloramphenicol
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 6
Luận văn thạc sỹ
(mặc dù thuốc này đã bị cấm không được dùng để điều trị), 30% có sử dụng
Olaquindox, 77% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Dexamethasol [12,13].
Công bố nghiên cứu của khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh có 628 hộ chăn nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi
sử dụng kháng sinh không hợp lý như liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa
bệnh cho gia súc cho đến khi nào bán được. Kết quả khảo sát tình hình sử dụng
kháng sinh trong chăn nuôi gà trên địa bàn tỉnh Bình Dương cho thấy có 26 loại
kháng sinh đã được sử dụng. Trong đó, loại được sử dụng nhiều nhất là
Chloramphenicol (chiếm 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin
(10%), Gentamycin (8,35%), nhóm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%), các
cơ sở sử dụng kháng sinh không hợp lý chiếm 17,22%, chủ yếu là sai về liều lượng
(12,57%) và liệu trình điều trị (3,09%) đồng thời số cơ sở không tuân thủ các quy
định về thời gian ngưng thuốc trước khi giết mổ chiếm tới 40,13% [14,18].
Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các hộ chăn nuôi trên địa bàn Hà
Nội, kết quả nghiên cứu của Lê Thị Ngọc Diệp cho thấy kháng sinh thuộc hai
nhóm Quinolones và Macrolides được sử dụng nhiều nhất với tỷ lệ tương ứng là
78,14% và 86,89%. Các nhóm kháng sinh khác là Polipeptides (54,92%),
Aminoglycosides (50,96%), β-lactams (4,58%) và Tetracycline (46,58%) [5]. Từ
năm 2003 - 2006, kết quả phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng
trong 150 mẫu thịt và gan của gia cầm, gia súc thu thập tại Hà Nội của Khoa
Thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy:
đã phát hiện tồn dư thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline trong 18 mẫu, chiếm tỷ
lệ 12%. Có 5,5% số mẫu trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có tồn dư
kháng sinh Tetracycline. Tại các khu vực chăn nuôi ở miền nam cũng nhận thấy
có 4 cơ sở chiếm 22,2% các mẫu thịt gà có tồn dư các loại kháng sinh
Tetracycline, Amoxyline, Erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần
so với ngưỡng cho phép [14].
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 7
Luận văn thạc sỹ
Các bệnh của bò thường được điều trị bằng kháng sinh như bệnh nhiễm
khuẩn nặng, viêm vú, viêm tử cung, viêm phổi, viêm móng, khớp, tiêu chảy,… Kết
quả nghiên cứu của Sa Đình Chiến và Cộng sự [4] cho thấy bệnh viêm vú đang gây
thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi. Tỷ lệ viêm vú lâm sàng của bò sữa mới nhập
vào địa bàn Mai Sơn, Sơn La là 27,46 %, viêm vú phi lâm sàng là 48,16 %. Có
nhiều nguyên nhân dẫn đến phát sinh phát triển bệnh viêm vú. Kháng sinh được sử
dụng để điều trị bệnh viêm vú bò sữa là: Amoxilin, Lincomycin, Ciprofloxacin,
Norfloxacin, Cefazolin, Neomycin, Tetracyclin, Gentamycin.
Hình 1.2. Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi trên địa bàn tỉnh
Bình Dương [18]
1.3. Tồn dƣ chất kháng sinh trong thực phẩm:
Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7405:2004 [1] về sữa tươi nguyên liệu - yêu
cầu kỹ thuật cho phép giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y như sau:
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 8
Luận văn thạc sỹ
Bảng 1.1. Giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh cho phép trong sữa
Tên chất
- Chloraphenicol Mức tối đa (g/kg) 0
- Coumaphos 0
- Penicillin 4
- Ampicillin 4
- Amoxicillin 4
- Oxacillin 30
- Cloxacillin 30
- Dicloxacillin 30
- Cephalexine 100
- Ceftiofur 100
- Gentamicin 100
- Tetracylin 100
- Oxytetracyllin 100
- Chlortetracyllin 100
- Sulfonamin 100
1.3.1. Nguyên nhân:
Dư lượng kháng sinh là tình trạng tồn tại của chất kháng sinh trong thực
phẩm (thịt, cá, trứng, sữa,...) ở dạng nguyên chất hay đã bị chuyển hóa mà việc sử dụng
những loại thực phẩm này có thể gây ra những tác hại không ngờ đối với người tiêu
dùng. Có hiện tượng dư lượng kháng sinh là do việc không tuân thủ quy định về sử dụng
kháng sinh trong thực phẩm, chăn nuôi, thuốc bảo vệ thực vật; sử dụng các chất kích
thích sinh trưởng, thuốc thú y trong chăn nuôi và thuốc bảo vệ thực vật ngoài danh mục
cho phép; sử dụng kháng sinh để bảo quản thực phẩm. Dư lượng kháng sinh là một trong
những nguyên nhân của tình trạng mất an toàn vệ sinh thực phẩm.
Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi, không chỉ để
đề phòng và trị bệnh mà còn được dùng ở liều thấp như một chất kích thích sinh
trưởng [6,30,52]. Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 9
Luận văn thạc sỹ
các chất kháng sinh trong chăn nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư
thuốc trong sản phẩm thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng cũng như
hiệu quả điều trị bệnh [20,23].
Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh chính:
- Kháng sinh có thể nhiễm vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa
kháng sinh.
- Kháng sinh có thể tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi do sử dụng thường
xuyên trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trọng cho gia súc (liều thấp)
hoặc cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh (liều trung bình).
- Kháng sinh có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi
sinh vật, để bảo quản thực phẩm.
- Kháng sinh sử dụng để chữa bệnh cho gia súc (liều cao).
1.3.2. Tác hại:
1.3.2.1. Nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng:
- Gây dị ứng, phản ứng quá mẫn: Theo các báo cáo về y tế, Penicillin là kháng
sinh thường gây dị ứng nhất. Kết quả nghiên cứu của Jones đã chỉ ra rằng có
khoảng 5-10% dân số mẫn cảm đối với Penicillin hoặc kháng sinh khác với biểu
hiện dị ứng da, mệt mỏi, nôn, thậm trí sốc ngay ở nồng độ thấp (1ppb) [48]. Đã có
trường hợp người bị nổi mẫn da trầm trọng vì uống sữa có dư lượng Penicillin (<1
IU/ngày tương đượng 0,003 IU/ml). Một số trường hợp khác gây ngứa da tay, da
mặt sau khi ăn thịt bò có tồn dư Penicillin hoặc thịt heo từ thú mới điều trị bằng
Penicillin cách đó 3 ngày. Gây sốc quá mẫn dẫn đến chết người ở người có cơ địa dị
ứng với kháng sinh.
- Gây ngộ độc: Cloramphenicol là loại kháng sinh cấm sử dụng trên thế giới
do gây thiếu máu suy tủy (phụ thuộc liều), đôi khi gây thiếu máu bất sản (không
phụ thuộc liều) ở những cá thể đặc ứng do di truyền có thể dẫn đến tử vong. Một số
thuốc như Nitrofurans, Quinoxalinedinoxides và Nitroimidazoles cần có sự kiểm
soát nghiêm ngặt vì sự tích lũy thuốc do dùng lâu ngày có thể gây suy gan, suy thận
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 10
Luận văn thạc sỹ
thậm chí gây ung thư, đột biến gen (do các loại kháng sinh chủ yếu tồn dư tại gan
thận là cơ quan lọc thải trừ phân giải chất dinh dưỡng).
- Chất kháng sinh còn gây ra những mối nguy hiểm tiềm tàng cho các thế hệ
sau. Nếu sử dụng kháng sinh Nitrofurane trong thời gian mang thai có thể gây quái
thai, dị dạng.
- Tạo dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh: Đề kháng kháng sinh hiện nay đang
là vấn đề toàn cầu bởi trong vòng 15 - 20 năm trở lại đây chưa có một kháng sinh
kiểu mới nào được phát hiện trong khi không có kháng sinh nào là không bị kháng
do sử dụng các sản phẩm động vật có tồn dư kháng sinh. Theo kết quả nghiên cứu
của một số tác giả cho thấy ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh
tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh
Tetracycline là 88,6%, Ciprofloxacine là 82,3% [12].
1.3.2.2. Nguy cơ đối với môi trường:
Những chất kháng sinh không rõ nguồn gốc được tổng hợp bằng các loại phụ
gia gây ô nhiễm môi trường nặng nề không kém rác thải công nghiệp. Chất kháng
sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con đường khác đều được
thải ra môi trường. Ảnh hưởng của việc thải chất kháng sinh đến môi trường được
thể hiện ở các khía cạnh sau:
+ Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất: chất kháng sinh dù bằng con đường nào
được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bừng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh
hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường.
+ Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi
trường: chất thải của vật nuôi khi điều trị hoặc nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có
kháng sinh, không chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hóa hấp thu mà còn chứa
rất nhiều loại vi sinh vật kháng thuốc, nhất là các chủng vi khuẩn đa kháng. Chúng
là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường.
1.3.2.3. Nguy cơ đối với công nghệ chế biến bảo quản thực phẩm:
Chất kháng sinh có thể gây trì hoãn sự khởi đầu tích cực của các vi sinh vật
có lợi trong sản xuất bơ, phomat, sữa chua chỉ với nồng độ 1ppb. Kháng sinh còn
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 11
Luận văn thạc sỹ
làm giảm bớt mùi, vị và độ axit trong các sản phẩm, làm giảm quá trình đông tụ của
sữa, đồng thời nó cũng là nguyên nhân không thể chấp nhận được với sự chín muồi
của phomat [48]. Sự có mặt của kháng sinh trong thịt gây nên những tác dụng ngoài
mong muốn trong sản xuất xúc xích và các sản phẩm lên men thịt khác.
Người tiêu dùng khó nhận biết được những sản phẩm có tồn dư kháng sinh
nếu không có chuyên môn. Vấn đề này cần phải được bắt đầu giải quyết từ quy
trình nuôi gia súc, gia cầm. Khi đó sẽ cải thiện được chất lượng của thực phẩm chế
biến từ động vật cũng như tránh được tình trạng kháng kháng sinh cho người. Do đó
cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng thuốc kháng sinh trong thực
phẩm để hạn chế được những tác dụng nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng
thuốc kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép.
1.4. Các phƣơng pháp phát hiện dƣ lƣợng kháng sinh trong sữa:
Hiện nay, việc phân tích nhóm kháng sinh trong các nền mẫu sinh học (có
nguồn gốc từ động vật) rất đa dạng, trong đó tập trung vào các phương pháp chính
như: Xác định định tính nhờ vi sinh vật [6,24,58], xác định bán định lượng bằng
phương pháp ELISA, định lượng kháng sinh bằng phương pháp quang phổ hấp thụ
phân tử [25], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [9,21,62],…
1.4.1. Phương pháp khẳng định (lý hoá)
Phương pháp này cho phép có thể nhận diện chất kháng sinh tồn dư, định
lượng chính xác và đối chiếu MRL (dư lượng tối đa cho phép).
1.4.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (còn được gọi là Sắc ký lỏng áp suất cao) là một
kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần
trong hỗn hợp. Hiện nay, HPLC đang ngày càng phát triển và được ứng dụng rất
nhiều trong các ngành phân tích định tính và định lượng đặc biệt được ứng dụng
trong phân tích dư lượng kháng sinh sữa, phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu , các
chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…
Khả năng phát hiện dư lượng kháng sinh: HPLC có khả năng phát hiện tất cả
các kháng sinh có mặt trong thực phẩm, các kháng sinh thuộc nhóm Betalactams,
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 12
Luận văn thạc sỹ
Tetracyclines, Sulphonamides, Macrolides, Chloramphenicol,… William và cộng
sự đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng kháng sinh tetracycline trong các
mẫu thịt và sữa bò với ngưỡng phát hiện là 20-50 ppb trong mẫu thịt và 4-8 ppb
trong các mẫu sữa [68], xác định được dư lượng kháng sinh Sulfamethazine ở 3
trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với
giới hạn cho phép [26]. Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng
kháng sinh Cefotaxime và Cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng
là 0,1 và 0,3 ng/ml [64]. Tác giả W. Hela và cộng sự [41] đã phát triển phương pháp
HPLC với detector DAD để xác định 12 kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid (SAs)
trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà).
Tại Việt Nam, TCVN 8345- 2010 [2] qui định phương pháp xác định 10 SAs
trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa
Cephalexine. Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác
như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh
trong các mẫu phân tích. HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản
xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [40].
Hình 1.3. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 13
Luận văn thạc sỹ
1.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS):
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách
các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance
liquid chromatography - HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận
khối phổ (Mass spectrometry - MS). Phương pháp này đã được nghiên cứu để phát
hiện đồng thời tồn dư nhóm Phenicol gồm Chloramphenicol (CAP), Thiamphenicol
(TAP) và Florfenicol (FF) trong một số sản phẩm có nguồn gốc động vật.
Trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu thành công phương pháp xác định
dư lượng CAP (Chloramphenicol) trong sữa bằng kỹ thuật sắc ký khác nhau. Gần
đây với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật sắc ký, áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng
khối phổ để phân tích CAP có nhiều ưu điểm nổi trội. Nhóm tác giả Yanbin Lu,
Quing Shen [69] đã xác định được 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ
từ 2-10 ppb bằng sự tương tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với
sắc ký lỏng khối phổ chế độ bẫy tứ cực. Tác giả George Stubbings và cộng sự [39]
đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phát
triển và thẩm định phương pháp phân tích dư lượng 30 thuốc thú y trong thịt gia
súc, gia cầm.
Ở trong nước, việc áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phát hiện dư
lượng kháng sinh trong thực phẩm đã được triển khai. Kết quả nghiên cứu của Vũ
Thị Trang [19] về việc xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides
trong thịt gia súc gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã
chỉ ra rằng phương pháp phân tích LC-MS/MS có độ nhạy cao, phân tích nhanh và
chính xác, có thể áp dụng phân tích dư lượng 10 SAs với độ tin cậy cao.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 14
Luận văn thạc sỹ
Hình 1.4. Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
1.4.1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là
chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp
mỏng đồng nhất và được cố định trên các bản kính hoặc bản kim loại. Pha động là
một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định
trong từng mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử
trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với
những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm và một số loại thực phẩm như
sữa, mật ong, thịt, cá, … Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện
của các kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được
lượng kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với Streptomycin, Kanamycin,
Gentamycin [53], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone-Methanol-
Ammonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform-Methanol-
Ammonia, 1:1:1 trong phân tích Tetracycline.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 15
Luận văn thạc sỹ
Ưu điểm của phương pháp khẳng định lý hóa:
Nhận diện rõ ràng, khả năng định lượng tốt, có độ nhạy cao, thích hợp cho
việc khẳng định các chất cấm, các chất có dư lượng tối đa cho phép.
Nhược điểm của phương pháp khẳng định lý hóa:
Qui trình rất phức tạp (chuẩn bị, tách chiết, làm sạch), đòi hỏi thiết bị đắt
tiền, cần kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao, một số kháng sinh không có qui trình
phân tích bằng phương pháp này. Do vậy phương pháp này không phù hợp cho các
phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương.
1.4.2. Phương pháp sử dụng kỹ thuật nano
Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có nhiều đặc tính siêu
việt. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong tạo các cảm biến
sinh học cho độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Hiện nay, việc ứng dụng các aptamer (là
các oligonucleotide ssDNA, RNA hoặc các peptid có khả năng liên kết đặc hiệu với
các phân tử đích) trong tạo cảm biến sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm
nghiên cứu. Lã Thị Huyền và cộng sự [11] đã công bố các kết quả cho thấy có thể
sử dụng kỹ thuật nano để xác định sự có mặt của chất kháng sinh trong các mẫu
nghiên cứu, cụ thể như:
- Tạo được thư viện các aptamer (có bản chất ADN) có độ đa dạng cao để làm
nguồn sàng lọc, thu nhận aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với
từng kháng sinh trong số 4 kháng sinh thường sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin,
Streptomycin, Neomycin và Tetracycline.
- Thu nhận và gắn kết aptamer với các hạt nano (hạt nano vàng hoặc sillica
phát quang) để tạo phức hệ DNA-Au/DNA-sillica có khả năng gắn kết đặc hiệu với
từng kháng sinh: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline.
- Sử dụng phức hệ DNA-Au/DNA-sillica để tạo được KIT xác định nhanh,
chính xác dư lượng kháng sinh Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline
trong sữa với thời gian 1,5-2 giờ và độ nhạy > 99%, độ đặc hiệu > 98%.
Ưu điểm: xác định chính xác dư lượng kháng sinh trong sữa với thời gian
ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 16
Luận văn thạc sỹ
Nhược điểm: Cần có trang thiết bị đắt tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được
đào tạo chuyên sâu.
1.4.3. Phương pháp sàng lọc (screening method)
Đây là phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hoặc
một nhóm chất ở một nồng độ quan tâm hay để phân biệt giữa các mẫu đạt và mẫu
không đạt yêu cầu vệ sinh. Phương pháp này thường được thiết kế để tránh tối đa
kết quả âm tính giả. Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc
thường được tiến hành trước khi định danh và định lượng chính xác.
1.4.3.1. Phương pháp sắc ký miễn dịch
Hiện nay các test nhanh trên cơ sở sắc ký miễn dịch được sử dụng để phát
hiện nhanh và tương đối chính xác các loại kháng sinh trong sữa ngay tại địa điểm
thu mua, cho kết quả trong thời gian ngắn (khoảng 1-2 phút). Test thường ở dạng
que thử, được sử dụng phổ biến, rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Que thử dạng sắc kí
miễn dịch dựa trên cơ sở phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại test thử nhanh dạng sắc ký miễn
dịch như:
- Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc nhóm -lactam của
hãng Ar Brown - Nhật Bản cho kết quả sau 5 phút với độ nhạy từ 3-20 ppb tùy từng
loại kháng sinh như với Penicillin 3 ppb, Ceftiofur 5ppb, Cloxacillin 4ppb,...
- Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc các nhóm -
lactam, Tetracycline, Streptomycin, Chloramphenicol của hãng Ballya - Trung
Quốc cho kết quả chỉ sau 3-5 phút với độ nhạy từ 0,3-100 ppb tùy từng loại kháng
sinh như Penicillin G 1,5-2ppb, Tetracycline 10 ppb, Streptomycin 100 ppb,
Chloramphenicol 03 ppb,…
- Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamides trong
sữa của hãng Nankai Biotech - Trung Quốc cho kết quả sau 10 phút với độ nhạy từ
3-30 ppb tùy từng loại kháng sinh, nhóm Beta-lactams từ 2-4 ppb trong 5 phút, …
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 17
Luận văn thạc sỹ
Ưu điểm:
Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; phát hiện
được nhiều nhóm kháng sinh trong sữa, cho kết quả nhanh, có thể sử dụng các mẫu
khác nhau, bán định lượng; thích hợp dùng để kiểm soát nguyên liệu đầu vào.
Nhược điểm:
Giá thành nguyên liệu cao, có thể phản ứng chéo.
Hình 1.5. Một số loại que thử sắc ký miễn dịch
1.4.3.2. Phương pháp ELISA:
Vài năm gần đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản
ứng giữa kháng nguyên - kháng thể đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được
cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng
lọc. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dựa trên phản
ứng giữa kháng nguyên - kháng thể trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.
Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng,
enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã
xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ
màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp ELISA có khả năng phát hiện hầu hết những chất kháng sinh
thường có mặt trong thực phẩm như nhóm Beta-lactams, nhóm Chloramphenicol,
nhóm Macrolides, nhóm Tetracyclines, nhóm Aminoglycosides, nhóm Sulphonamides.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 18
Luận văn thạc sỹ
Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp
ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những
yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ
dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Abhishek Gaurav và cộng sự [38] đã
nghiên cứu trên 133 mẫu sữa thu thập được từ nhà sản xuất sữa thuộc 5 huyện của
Punjab, Ấn Độ vào tháng 5/2013 và đã thử nghiệm, phân tích tình trạng tồn dư
kháng sinh Tetracycline. Kết quả cho thấy có 18 mẫu sữa có tồn dư Tetracycline.
Tỷ lệ Tetracycline được phát hiện trong các mẫu sữa thuộc 5 huyện trong phạm vi
từ 0-46 là 15%. Nồng độ các mẫu sữa có chứa dư lượng kháng sinh Tetracycline
trong phạm vi từ 16-134 là 5ppm .
Với mục đích đưa việc xác vào xét nghiệm cận lâm sàng, nghiên cứu của
Hua-Jin Zeng và cộng sự năm 2011 đã sử dụng kháng thể thu được từ việc tạo miễn
dịch với Sparfloxacin trên thỏ kết hợp với huyết tương bò. Sau khi tối ưu hóa,
phương pháp ELISA đã xác định hàm lượng Sparfloxacin từ 5ng/mL đến 2mg/mL
với độ thu hồi từ 87,7 đến 106,2% [42]. Năm 2012, cũng với kỹ thuật ELISA gián
tiếp, tác giả Jiang Jinqing đã xác định được hàm lượng Sparfloxacin trong mẫu sữa
bò với khoảng xác định từ 0,036 đến 92,5 ng/mL với giới hạn phát hiện là 0,019
ng/mL, hệ số tương quan đạt 0,9844 [46].
Ở Việt Nam, từ năm 2002 đến nay phương pháp ELISA đã được sử dụng
trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất
lượng với các chỉ tiêu CAP (Chloramphenicol), AOZ (3-amino-2-oxazolidone để
kiểm tra Furazolidone) và AMOZ (5-methylamorfolino-3-amino-2-oxazolidone để
kiểm tra Furaltadone). Phạm Kim Đăng và cộng sự đã sử dụng kít ELISA do CER
Vương Quốc Bỉ sản xuất để phân tích tồn dư chất kháng sinh Quinolone trong tôm tại
một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc. Kết quả được khẳng định lại bằng phương
pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Kết quả cho thấy, bộ kít ổn định để phân
tích các Quinolone được thử vào trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là
0,07ppb. Tác giả cũng cho rằng khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 19
Luận văn thạc sỹ
phòng thí nghiệm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định
lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) [7].
Ưu điểm:
Phương pháp ELISA có ưu điểm: nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện;
không đòi hỏi thiết bị đắt tiền; không cần nhân viên chuyên môn cao; chi phí thử
nghiệm mẫu thấp do có thể thử nghiệm đồng thời số lượng mẫu lớn; một bộ kit có
thể phân tích được 50-80 mẫu.
Nhược điểm:
Một số hóa chất trong bộ kit phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định;
độ chính xác không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký do
đó phương pháp này chỉ thích hợp với các phân tính sàng lọc hơn là các phân tích
định lượng.
Hình 1.6. Hệ thống phân tích ELISA
1.4.3.3. Phương pháp sử dụng vi sinh vật:
Để kiểm tra dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm có nguồn gốc
động vật, phương pháp xác định dựa vào quá trình ức chế sự sinh trưởng của vi sinh
vật thường được sử dụng [57,55]. Phương pháp dựa trên sự ức chế vi sinh vật của
chất kháng sinh nhờ việc hình thành vòng vô khuẩn trên đĩa thạch. Người ta có thể
sử dụng mẫu đặt trực tiếp lên đĩa thạch hoặc dùng dung dịch chiết tách từ mẫu nhỏ
vào khoanh giấy thấm rồi đặt lên đĩa thạch.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 20
Luận văn thạc sỹ
Test vi sinh vật được thiết kế theo các hướng:
1. Sử dụng một chủng vi sinh vật ở cùng một điều kiện môi trường: Test một
đĩa dùng chủng Bacillus subtilis (test thận Bỉ).
2. Sử dụng một chủng vi sinh vật nhưng điều kiện môi trường khác nhau (pH
khác nhau) như New Two Plate Test [29].
3. Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở cùng điều kiện môi trường.
4. Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở các điều kiện môi trường khác
nhau (pH khác nhau). Điển hình là test 4 đĩa Châu Âu (FPT-Four Plate Test), test
cải tiến test 4 đĩa CPMA (Combined Plate Microbial Assay). Các chủng vi sinh vật
thường sử dụng là B.subtilis pH 7.2, Kocuria varians pH 8, B.cereus pH 6, E.coli
pH 8, Geobacillus stearothermophilus pH 7.
5. Đọc kết quả dựa vào phản ứng lên men, kết hợp với chỉ thị màu.
Hình 1.7. Test thận Bỉ sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
Vi sinh vật chính thức được dùng để thực hiện đầu tiên là Sarcina lutea trong
test thận của Van Schothorst và đã trở thành phương pháp chính thức được sử dụng
ở Hà Lan năm 1973. Vào khoảng thời gian đó, ở Đức đã nghiên cứu test BGA có sử
dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và đã được một số nước dùng để thử nghiệm [60].
Vào năm 1980, EU sử dụng phương pháp test 4 tấm trong đó 3 tấm là môi trường
thạch agar có bổ sung bào tử vi khuẩn B. subtilis BGA ở pH 6; 7,2 ; 8 và 1 tấm là vi
khuẩn Micrococcus luteus ở pH 8. Môi trường có pH 7.2 được bổ sung với
trimethoprim (TMP) để tăng độ nhạy cho sulfonamides. Trong một thời gian dài các
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 21
Luận văn thạc sỹ
kết quả của thử nghiệm này đã được sử dụng [51]. Ferrini et al. [35] đã nghiên cứu
phương pháp sáu tấm, bao gồm 4 tấm ở trên có bổ sung thêm tấm chứa vi khuẩn B.
cereus và tấm có vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu trên đã cho phép xác định được
nhóm kháng sinh trong sữa và sàng lọc ban đầu chỉ trong một bước.
Khả năng phát hiện tốt nhất đối với các kháng sinh nhóm β-lactam là các
chủng Geobacillus stearothermophilus, Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis,
trong khi đó đối với các kháng sinh macrolide là chủng K. rhizophila. Giới hạn phát
hiện Tetracycline thấp khi sử dụng chủng Bacillus cereus, còn đối với Quinolone là
Escherichia coli và Yersinia ruckeri. Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các
chủng G. stearothermophilus và Bacillus pumilus. Chủng B. subtilis được sử dụng
để phát hiện sự hiện diện của các Aminoglycoside [31].
Ưu điểm:
Trang thiết bị đơn giản, cần ít mẫu; phổ phát hiện rộng, tương đối nhạy (tùy
vào chủng vi sinh vật và môi trường), thời gian phát hiện tương đối nhanh, giá
thành rẻ; có thể tự động hoá, rất tiện để sàng lọc; dễ thực hiện, không cần kỹ thuật
viên tay nghề cao.
Nhược điểm:
Không định lượng được, độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủng vi sinh vật
sử dụng. Một số chất kháng sinh như Chloramphenicol, Nitrofurane, Nitroimidasole
không phát hiện được dù có nồng độ cao do các chủng vi sinh vật không mẫn cảm
với những chất này.
Có rất nhiều chủng vi sinh vật được sử dụng trong phương pháp này, chúng
được sử dụng như là một chỉ thị sinh học cho việc xác định dư lượng kháng sinh. Việc
lựa chọn đúng loài vi sinh vật chỉ thị đóng vai trò qua trọng đối với kết quả của phương
pháp. Để lựa chọn đúng loại vi sinh vật ta dựa vào những đặc điểm của mẫu nguyên liệu,
đặc điểm của loại kháng sinh cần xác định và nhiều yếu tố liên quan khác. Đề tài lựa
chọn chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus vì đây là chủng rất nhạy cảm với
kháng sinh và là chủng vi sinh vật ưa nhiệt. Chúng có thể tồn tại ở nhiệt độ cao mà ở
nhiệt độ đó một số vi sinh vật khác không tồn tại được, giúp tránh lây nhiễm các chủng
khác trong không khí gây khó khăn trong quá trình xây dựng test.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 22
Luận văn thạc sỹ
1.5. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus và ứng dụng trong việc phát hiện
nhanh dƣ lƣợng kháng sinh trong sữa:
1.5.1. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:
Đây là vi khuẩn được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1920 [32]. Năm 1986, vi
khuẩn này được đặt tên là Bacillus stearothermophilus [27,44]. Năm 2001, nhóm các
nhà khoa học từ Moscow [70] đã bắt đầu phân tích các hệ sinh thái vi sinh vật của các
mỏ dầu ở nhiệt độ cao ở Kazakhstan. Sau khi phun nước nóng từ biển Caspian để thay
thế nước ban đầu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng có sự gia tăng vi sinh vật và đa
dạng sinh trưởng. Nguồn nước nóng, mặn và nước oxy hóa đã tạo điều kiện thuận lợi
cho sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa khí, ưa nhiệt và hình thành nội bào tử của
thermophiles. Sau khi phân tích các đặc điểm di truyền và sinh lý, các nhà khoa học xác
định chỉ một phần thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus. Sau khi kiểm tra kỹ
lưỡng các loại vi khuẩn dựa trên đặc điểm về hình thái, sinh lý học, và phát sinh loài, họ
thấy nó thuộc một đơn vị phân loại riêng biệt là Geobacillus. Vi khuẩn này đã chính thức
đổi tên Geobacillus stearothermophilus vào năm 2004 [67].
G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được phân
lập từ một số địa điểm quan trọng tại Hoa Kỳ như: trên gỗ mục nát ở Florida, đất đã
được sử dụng kỹ thuật làm giàu và suối nước nóng ở công viên Quốc gia
Yellowstone. Những địa điểm này thể hiện đặc điểm của nó là một vi khuẩn khử
nitơ, có khả năng sinh trưởng trong các môi trường nóng khác nhau và có tên là
Geobacillus mà chữ “Geo” có nghĩa là trái đất [70].
1.5.1.1. Phân loại:
Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus thuộc: [70]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Geobacillus
Loài: G. stearothermophilus
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 23
Luận văn thạc sỹ
Hình 1.8. Cây phát sinh dựa trên sự sắp xếp gen 16S rRNA [70]
1.5.1.2. Đặc điểm của Geobacillus stearothermophilus:
Vi khuẩn G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong các môi trường
ấm như: đất, cát sa mạc, vùng biển và suối nước nóng. G. stearothermophilus là
trực khuẩn ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Về
mặt lâm sàng, vi khuẩn này cũng có vai trò quan trọng trong việc chứng minh rằng
quá trình khử trùng phòng thí nghiệm đang hoạt động đúng tiến trình [60]. Cả hai
chỉ số sinh học và hóa học được sử dụng để xác định sự hiện diện của bào tử G.
stearothermophilus trên bề mặt đã trải qua một quá trình khử trùng [59,70]. Vi
khuẩn này cũng được sử dụng như là một chỉ số sinh học để chứng minh độ sạch
của các sông suối, cũng như nguồn chính cung cấp các enzyme chịu nhiệt được sử
dụng trong các ứng dụng công nghiệp [70]. G. stearothermophilus còn có ý nghĩa
trong việc xác minh các thực phẩm bị hư hỏng, chủ yếu là sữa và sữa chua [36,43].
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 24
Luận văn thạc sỹ
Đặc điểm hình thái
Geobacillus stearothermophilus là vi khuẩn Gram dương, hình que, có thể
sinh trưởng đơn lẻ hoặc chuỗi, có khả năng tạo thành bào tử, có thể tạo thành nội bào
tử khi môi trường dinh dưỡng bị suy giảm. Thành tế bào của vi khuẩn có cấu trúc của
vi khuẩn Gram dương điển hình. Chúng có cấu tạo gồm một lớp peptidoglycan dày
xung quanh màng sinh chất [67]. Lớp peptidoglycan này chứa DAP hoặc axit meso-
diaminopimelic và có chứa lượng axit teichoic đáng kể với axit muramic giúp bảo vệ
thành tế bào trong suốt quá trình phân chia. [70]
Bề mặt của vi khuẩn này có chứa một lớp vỏ, lớp S-layer, các protein. Các
lớp này kết tinh trên bề mặt các protein giống như các lớp S-layer của các vi khuẩn
khác, chúng có mối liên quan chặt chẽ với các tế bào của vi khuẩn [67].
Đặc điểm sinh hóa
G. stearothermophilus có phản ứng catalase và oxidase dương. Vi khuẩn này
sử dụng hoàn toàn các hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, axit amin, axit hữu cơ
và oxy là chất nhận điện tử cuối cùng [67,70]. G. stearothermophilus cũng là vi
khuẩn khử nitơ. Vi khuẩn được tìm thấy trong đất công nghiệp và phân compost và
nó tham gia vào quá trình khử nitơ trong phân bón từ NO3 xuống NO2 dễ bay hơi
hoặc N2 [70].
Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện sinh trưởng: Vi khuẩn này có khả năng di động, hiếu khí. G. stearothermophilus sinh trưởng ở nhiệt độ khác nhau, từ 30-75oC, chịu axit với dải
pH từ 2-11 và nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở 50-65°C. Đặc biệt loài vi khuẩn này có thể sống sót ở nhiệt độ cao đến 130oC [59]. Vi khuẩn dễ dàng sinh trưởng và phân
lập trong phòng thí nghiệm vi sinh [70]. G. stearothermophilus là chủng vi khuẩn
rất dễ bị ức chế bởi kháng sinh, đặc biệt là nhóm β-lactam [54,61,66,45].
- Đặc điểm nuôi cấy:
Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn,
rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề
mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB):
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 25
Luận văn thạc sỹ
vi khuẩn sinh trưởng làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như
vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
- Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số
nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường cung cấp đủ
nguồn carbon (như Glucose) và nitơ (như Peptone).
Hình 1.9. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus trên môi trường thạch [31]
1.5.1.3. Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:
Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus có dạng elip đến hình cầu,
có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với
các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử G.stearothermophilus có chứa
một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic.
Hình 1.10. Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus [63]
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 26
Luận văn thạc sỹ
Cấu tạo bào tử Geobacillus stearothermophilus:
Bào tử G. stearothermophilus là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các
thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về
tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử được bọc trong
một vỏ dày gồm nhiều lớp:
- Lớp màng ngoài: Màng ngoài nằm ở ngoài cùng, đó là các phần còn sót
lại của tế bào mẹ, có khi có khi không, khi dày, khi xốp, chiếm 2 - 10% khối
lượng khô của bào tử. Màng ngoài gồm 2 lớp, lớp ngoài dày 6nm, lớp trong dày
19nm.
- Lớp áo bào tử: Lớp áo bào tử là một lớp peptidoglycan dày trong đó gồm
nhiều loại protein khác nhau. Lớp áo bào tử thường chứa các protein lắp ráp và các
yếu tố hình thái quan trọng. Lớp áo này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự nảy
mầm của bào tử.
- Lớp vỏ bào tử: Vỏ bào tử chiếm thể tích rất lớn (36 - 60%). Lớp này có
vai trò như một lớp rào cản và là nguồn gốc kháng nguyên bề mặt của bào tử.
Lớp vỏ bào tử có phản ứng với lectin để tạo liên kết với các olysaccharide nằm
trong các sợi trên lớp vỏ bào tử.
- Lõi bào tử: còn gọi là thể chất nguyên sinh của bào tử. Lõi gồm 4 phần:
thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân.
1. Áo bào tử
2. Lớp màng ngoài
3. Vỏ bào tử
4. Vách tế bào
5. Lớp màng trong
6. Lõi bào tử
Hình 1.11. Cấu tạo bào tử vi khuẩn [49]
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 27
Luận văn thạc sỹ
Sự hình thành và nảy mầm của bào tử:
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:
1. Hình thành những búi chất nhiễm sắc.
2. Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền
bào tử.
3. Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.
4. Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy
nhiều peptioglican và tổng hợp dipicolinat canxi, tính chiết quang tăng cao.
5. Kết thúc việc hình thành áo bào tử.
6. Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử. Bào tử thành thục, bắt đầu có tính
kháng nhiệt.
7. Nang bào vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài.
Hình 1.12. Quá trình hình thành bào tử
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và
nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 28
Luận văn thạc sỹ
tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng.
Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.
- Sự nảy mầm của bào tử: Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh
dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình này gồm 3
giai đoạn: hoạt hóa, nẩy mầm và sinh trưởng.
Protein có chứa nhiều systein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm,
xúc tiến sự hoạt động của enzyme proteinaza. Khi đó lượng protein trong áo bào tử
giảm xuống. Các cation bên ngoài có thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương
lớp vỏ lên, sau đó làm tan ra và tiêu thoái đi. Khi đó nước bên ngoài sẽ xâm nhập
vào lớp lõi bào tử làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hoá
lên, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào.
Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, chiết quang cao… bắt đầu
giảm dần, lượng BPA - Ca, acid amin, polipeptit dần dần mất đi, bắt đầu xảy ra việc
tổng hợp ADN, ARN và protein trong lõi bào tử. Bào tử chuyển sang thành tế bào
dinh dưỡng. Khi nảy mầm, bào tử mầm có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm
ngang ra. Lúc đó thành tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh do đó nâng cao khả
năng tiếp nhận thêm ADN ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp. Cuối cùng, bào
tử chứa một số enzyme sửa chữa ADN, ADN sẽ được sửa chữa trong quá trình nảy
mầm và tăng trưởng sau khi lõi đã được hoạt hóa trở lại.
Sức đề kháng của bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:
Bào tử có sức đề kháng cao với các yếu tố vật lý và hóa học như nhiệt độ, tia
cực tím, áp suất và chất sát trùng. Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do:
- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng
làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
- Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử
kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với
nhiệt độ.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 29
Luận văn thạc sỹ
- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại
dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào
bên ngoài.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng
làm cho các tính chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
1.5.2. Ứng dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus trong việc phát hiện
nhanh dư lượng một số kháng sinh trong sữa:
Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus là chủng vi khuẩn được ứng dụng
rộng rãi nhất trong các test của Châu Âu như: Improved Agar Diffusion test,
Delvotest SP-NT, Charm AIM – 96, Disk Assay Plate Method, Copan Milk test,…
[47]. Vi khuẩn thường được dùng ở dạng bào tử do khả năng chống chịu tốt với
những điều kiện bất lợi, dễ thương mại hóa, điều kiện bảo quản và sử dụng dễ dàng.
Hình 1.13. Test thử dư lượng kháng sinh trong sữa của hãng Delvotest
Năm 1962, Galesloot và cộng sự [37] đã sử dụng vi khuẩn Geobacillus
stearothermophilus hoặc G. calidolactis để phát hiện dư lượng kháng sinh trong
sữa. Phương pháp này được thực hiện bằng cách đặt miếng giấy có tẩm sữa lên môi
trường thạch dinh dưỡng có bổ sung vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus, sau đó ủ ở 55oC trong 2,5 giờ. Tiến hành quan sát sự ức chế của vi khuẩn lên khu vực
có chứa miếng giấy tẩm để biết được sự hiện diện của kháng sinh trong sữa. Phương
pháp này có độ nhạy đối với kháng sinh Penicillin khoảng 0.0025 IU/ml. Tuy nhiên
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 30
Luận văn thạc sỹ
phương pháp này không phù hợp do đòi hỏi người thực hiện phải có chuyên môn
cao và có nhược điểm là chỉ thực hiện được trong phòng thí nghiệm.
Năm 1969, Mol. H. [56] đã phát triển phương pháp của Galesloot. Phương
pháp này được thực hiện bằng cách đặt miếng giấy có thấm môi trường chứa:
Peptone 20%, Glucose 20% đã được làm khô, sau đó thấm sữa và đặt trên môi
trường agar có bổ sung bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis. Sau đó đem ủ ở 63oC trong 6 giờ và quan sát sự hiện diện của kháng
sinh. Mặc dù phương pháp này được đánh giá tốt hơn phương pháp của Galesloot
nhưng có một số nhược điểm như: rất khó nhận ra vùng ức chế, thể tích mẫu không
đủ để thực hiện nhắc lại.
Năm 1990, Lameris và cộng sự [50] đã nghiên cứu phương pháp phát hiện
dư lượng kháng sinh trong sữa bằng cách bổ sung vào môi trường dinh dưỡng từ 105 đến 108 bào tử/ml vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis
vào trong ống hình trụ, ủ ở nhiệt độ thích hợp là khoảng 55°C đến 70°C, tốt nhất là
60°C đến 65°C và ủ trong khoảng thời gian tương đối ngắn khoảng 1,5 đến 4 giờ,
tốt nhất là 2-3 giờ có thể quan sát được sự thay đổi màu sắc của môi trường.
Các nghiên cứu đã chứng minh được vai trò quan trong của vi khuẩn
Geobacillus stearothermophilus trong việc sản xuất ra các test thử để phát hiện
nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa. Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam chưa có
đơn vị nào sử dụng chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để sản xuất
test phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa dạng ống thạch mà chủ yếu
nhập ngoại với giá thành rất cao. Do vậy việc nghiên cứu chế tạo được các test
thử từ vi khuẩn này ở điều kiện Việt Nam là rất có ý nghĩa, góp phần tạo ra sản
phẩm có chất lượng tốt nhưng giá thành rẻ đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm
có nguồn gốc trong nước.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 31
Luận văn thạc sỹ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Bộ Khoa học và Công nghệ (2004), TCVN 7405:2004, Sữa tươi nguyên liệu - yêu
cầu kỹ thuật.
2. Bộ Khoa học và Công nghệ (2010), TCVN 8345-2010, Thủy sản và sản phẩm
thủy sản. Xác định dư lượng Sulfonamid. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
3. Bộ NN & PTNT (2009), Quyết định số 15/2009/TTBNN ngày 17 tháng 3 năm
2009, Danh mục một số hóa chất, kháng sinh cấm trong nhập khẩu, sản
xuất, kinh doanh và sử dụng thuốc thú y.
4. Sa Đình Chiến và cộng sự (2005), Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu bệnh viêm
vú bò sữa nuôi tại Sơn la và biện pháp phòng trị, Sơn La, tr.50-54.
5. Lê Thị Ngọc Diệp (2003), “Một số kết quả khảo sát tình hình sử dụng thuốc
kháng sinh trong chăn nuôi gà và tồn dư kháng sinh trong thịt, trứng
gà trên địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, (1),
tr.40-43.
6. Phạm Kim Đăng, Marie-Louise Sippo, Guy Degand, Caroline Douny, Guy
Maghuin-Rogister (2007), “Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính
kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật theo
quy định số 2002/657/EC (bài tổng hợp)”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật
Nông nghiệp, 5(1), tr. 24-30.
7. Phạm Kim Đăng và cộng sự (2008), “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân
tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển
khu vực phía Bắc”, Tạp chí Khoa học và phát triển, 6(3), tr.261-267.
8. Phạm Kim Đăng, Nguyễn Tú Nam, Bùi Thị Tho, Phạm Hồng Ngân (2012),
“Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà tại Hải Phòng”,
Tạp chí khoa học và Kỹ thuật thú y, Hội thú y Việt Nam, 19(5), tr. 92-98.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 70
Luận văn thạc sỹ
9. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào
nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, nhà
xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh.
10. Phạm Khắc Hiếu (2009), Giáo trình dược lý học thú y, nhà xuất bản Bộ giáo dục
Việt Nam.
11. Lã Thị Huyền và cộng sự (2015), Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu chế tạo
và sử dụng bộ Kit phát hiện kháng sinh trong sữa bằng kỹ thuật nano,
Viện Công nghệ Sinh học.
12. Nguyễn Văn Kính (2010), Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh và kháng
kháng sinh ở Việt Nam, Nhóm nghiên cứu của GARP-Việt Nam, tr.34.
13. Lã Văn Kính và cộng sự (2007), Báo cáo tổng kết đề tài : Nghiên cứu sản xuất
thịt lợn an toàn chất lượng cao, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
14. Dương Văn Nhiệm (2005), Phân tích bước đầu tồn dư Tetracycline trong thịt
lợn trên thị trường Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học thú y, Chieng Mai
University Thailand & Freie Universitot Berlin Germany.
15. Đặng Quang (2015), “Thị trường sữa tươi Việt Nam: tiềm năng còn rộng mở”,
Tạp chí Công thương, (18), tr.13-15.
16. Bùi Thị Tho (2003), Bài giảng thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong
chăn nuôi, nhà xuất bản Hà Nội.
17. Thông tư số 03/2012/TT-BNNPTNT, Danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh
cấm sử dụng, hạn chế sử dụng, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
18. Đinh Thiện Thuật, Nguyễn Ngọc Tuấn, Võ Thị Trà An, Lê Thanh Hiển, Võ Bá
Lân, Khương Thị Ninh (2003), “Bước đầu khảo sát tình hình sử dụng
kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt và thịt
thương phẩm trên địa bàn tỉnh Bình Dương”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật
Thú y, 1(1), tr.50-57.
19. Vũ Thị Trang (2012), Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định
dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia
cầm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 71
Luận văn thạc sỹ
II. Tài liệu tiếng Anh:
20. Alali, W. Q., Scott, H. M., Christian, K. L., Fajt, V. R., Harvey, R. B., Lawhorn,
D. B. (2009), “Relationship between level of antibiotic use and resistance
among Escherichia coli isolates from integrated multi-site cohorts of
humans and swine”, Prev Vet Med, 90, pp. 160-167.
21. Al-Rimawi F. and Maher K. (2011), “Analysis of chloramphenicol and its
related Compound 2- Amino-1-(4-nitrophenyl)propane-1,3-diol by
Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with UV-
Detection”, Chromatography Research International, Vol 2011, Acticle
ID 482308.
22. Barbara Chiavarino (1998), “Determination of sulfonamid antibiotics by gas
chromatography coupled with atomic emission detection”, Journal of
Chromatography B, 706, pp. 269-277.
23. Bogaard van den A.E., and Stobberingh E.E. (2000), “Epidemiology of
resistance to antibiotics. Links between animals and humans”,
International journal of antimicrobial agents 14, 4(75), pp. 327-335.
24. Bogaerts, R. and Wolf, F (1980), “A standardized method for the detection of
residues of antibacterial substances in fresh meat – A report of the
working group of the Scientific Veterinary Commission of the European
Communities concerning a proposal for a common microbiological
method, the so-called EEC fourplate method”, Fleischwirtschaft, 60 pp.
667-669.
25. Chukwuenweniwe J E., Johnson S. and Sunday A A. (2003). “An alternative
colorimetric method for the determination of chloramphenicol”, Tropical
Journal of Pharmaceutical Research, 2(2), pp. 215-221.
26. Chung HH., Lee JB., Chung YH. and Lee KG. (2009), “Analysis of
sulfonamide and quinolone antibiotic residues in Korean milk using
microbial assays and high performance liquid chromatography”,
Analytical Methods, 113 (1), pp. 297-301.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 72
Luận văn thạc sỹ
27. Coorevits, A, Dinsdale, AE, Halket, G, Lebbe, L, De Vos, P, Van Landschoot,
A, Logan, NA (2012), "Taxonomic revision of the genus Geobacillus:
emendation of Geobacillus, G. stearothermophilus, G. jurassicus, G.
toebii, G. thermodenitrificans and G. thermoglucosidans (nom. corrig.,
formerly 'thermoglucosidasius'); transfer of Bacillus thermantarcticus to
the genus as G. thermantarcticus comb. nov.; proposal of Caldibacillus
debilis gen. nov., comb. nov.; transfer of G. tepidamans to Anoxybacillus
as A. tepidamans comb. nov.; and proposal of Anoxybacillus
caldiproteolyticus sp. nov.", International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 62, pp. 85-1470.
28. Dal-Ho Kim, Dai Woon Lee (2003), “Comparison of separation conditions and
ionization methods for the liquid chromatography–mass spectrometric
determination of sulfonamid”, Journal of Chromatography A, 984, pp.
153-158.
29. Dang, P. K., Degand, G., Caroline, D., Ton, V. D., Maghuin-Rosister, G.
&Scippo, M. L. (2011), “Optimization of a new two-plate screening
method for the detection of antibiotic residues in meat”, International
Journal of Food Science and Technology, 46, Issue 10, pp.2070–2076.
30. Dang Pham Kim, Claude Saegerman, Caroline Douny, Ton Vu Dinh, Bo Ha
Xuan, Binh Dang Vu, Ngan Pham Hong, Marie-Louise Scippo (2013),
“First Survey on the Use of Antibiotics in Pig and Poultry Production in
the Red River Delta Region of Vietnam”, Food and Public Health, 3(5),
pp. 247-256.
31. De Brabander H.F., Noppe H., Verheyden, K. et al. (2009), Review. Residue
analysis: Future trends from a historical perspective, 1216, pp. 7964-
7976.
32. DONK P.J. (1920), “A highly resistant thermophilic organism", Journal of
Bacteriology , 5, pp. 373-374.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 73
Luận văn thạc sỹ
33. Ensminger M.E., Oldfield J.E., Heinemann W.W. (1990), Feeds and Nutrition
the Ensminger Publishing Company, USA, pp. 593–666.
34. European Commission. (2010), “Commission Regulation No 37/2010 of 22
December 2009 on pharmacologically active substances and their
classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal
origin”, Official Journal, 15, pp. 1-72.
35. Ferrini AM, Mannoni V, Aureli P (2006), Food Addit Contam, 23, pp:16–24
36. Furukawaa, S., Watanabea, T., Koyamaa, T., Hirataa, J., Narisawaa, N.,
Ogiharaa, H., Yamasakib (2003), ”Inactivation of food poisoning bacteria
and Geobacillus stearothermophilus spores by high pressure carbon
dioxide treatment”, Appl Environ Microbiol, 69(12) pp. 7124-7129.
37. Galesloot et al. (1962), Neth. Milk & Dairy J., 16, pp. 89-95.
38. Gaurav A, Gill JPS, Aulakh RS and Bedi JS (2014), “ELISA based monitoring
and analysis of tetracycline residues in cattle milk in Punjab”, Veterinary
World 7(1), pp. 26-29.
39. George Stubbings, Timothy Bigwood (2009), “The development and validation
of a multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–
MS/MS) procedure for the determination of veterinary drug residues in
animal tissue using a QuEChERS (QUick, Easy, CHeap, Effective,
Rugged and Safe) approach”, Analytica Chimica Acta, 637 , pp. 68-78.
40. Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C.
(2004), “Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid
chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic
columns in pharmaceutical development and production working under
current good manufacturing practice”. Journal of Chromatography A, pp.
1036.
41. Hela W. et al. (2003), “Determination of sulfonamid in animal tissues using
cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC–
DAD for detection”, Food Chemistry 83, pp. 601–608.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 74
Luận văn thạc sỹ
42. Hua-Jin Zenga, RanYangb, BingLiub, Li-FangLeib, Jian-JunLib, Ling-BoQu
(2012), “Simple and sensitive determination of sparfloxacin in
pharmaceuticals and biological samples by immunoassay”, Journal of
Pharmaceutical Analysis, 2(3), pp.214–219.
43. Hwang, Andy, Huang, Lihan (2009), ”Ready-to-Eat Foods: Microbial Concerns
and Control Measures”, CRC Press, pp. 88.
44. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2001),
Notification that new names and new combinations have appeared in
volume 50, part 2, of the IJSEM , 51, 795–796.
45. Jevinova P, Dudrikova E, Sokol J, Nagy J, Mate D, Pipova M, Cabadaj R.
(2003), Determination of oxytetracycline residues in milk with the use of
HPLC method and two microbial inhibition methods. Bull. Vet. Inst.
Pulawy. ,47, pp.211-216.
46. Jiang Jinqing, Zhang Haitang, An Zhixing, Xu Zhiyong, Yang Xuefeng, Huang
Huaguo và Wang Ziliang (2012), “Development of an Heterologous
Immunoassay for Ciprofloxacin Residue in Milk”, Physics Procedia, 25,
pp.1829 - 1836.
47. John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James T. Staley, Stanley T.
Williams (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Ed,
pp. 613-693.
48. Jones G.M. (1999), On-farm tests for drug residues in milk, Virginia Coop
erative Extension, pp. 404-401.
49. Kumar N, Thakur G, Raghu HV, Singh N, Sharma PK, et al. (2013), “Bacterial
Spore Based Biosensor for Detection of Contaminants in Milk”, J Food
Process Technol, 4(11).
50. Lameris et a1. (1990), Method for determination of the presence of antibiotics,
pp. 1-7.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 75
Luận văn thạc sỹ
51. Mariel G. Pikkemaat (2009), “Microbial screening methods for detection of
antibiotic residues in slaughter animals”, Analytical and Bioanalytical
Chemistry, 395(4), pp. 893-905.
52. MCEVOY, J. D. G. (2002), “Contamination of animal feedingstuffs as a cause
of residues in food: a review of regulatory aspects, incidence and control”,
Analytica Chimica Acta, 473, pp. 3-26.
53. McGlinchey TA., Rafter PA., Regan F., McMahon GP (2008), “A review of
analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide
residues in food matries”, J. Analytica chemica acta, 624, pp. 1-15.
54. Messer W, Leslie J, Houghtby G, Peeler J, Barnett J. (1982), “Bacillus
stearothermophilus disc assay for detection of inhibitors in milk”, J.
Assoc. Official Anal. Chem, 65 (5), pp. 1208-1214.
55. Mitchell JM, Griffiths MW, McEwen SA, McNab WB, Yee AJ (1998), J Food
Prot ,61, pp.742–756.
56. Mol H. et al. (1969), Neth. Milk & Dairy. J., 23, pp. 153-162.
57. Myers RP (1964), Rev Environ Contam Toxicol, 7, pp. 11–36.
58. Myllyniemi, A.L., Rintala, R., Backman, C., Niemi, A. (1999),
“Microbiological and chemical identification of antimicrobial drugs in
kidney and muscle samples of bovine cattle and pigs”, Food additives &
Contaminants, 16, pp. 339-351.
59. Nazina, T.N., Tourova, T.P., Poltaraus, A.B., Novikova, E.V., Grigoryan, A.A.,
Ivanova, A.E., Lysenko, A.M., Petrunyaka, V.V., Osipov, G.A., Belyaev,
S.S., Ivanov, M.V (2001), “Taxonomic study of aerobic thermophilic
bacilli”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 51, pp. 433-446.
60. Nouws, J.F.M., Schothorst, M.v. and ziv G. (1979), “A critical evaluation of
several microbial test methods for residues of antimicrobial drugs in
ruminants”, Arch Lebensm Hyg, 30, pp.4-8.
61. Reybroeck W. (1995), “Evaluation of screening tests for the detection of
antimicrobial residues in milk”, International Dairy Federation,
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 76
Luận văn thạc sỹ
Symposium on residues of antimicrobial drugs and other inhibitors in
milk. Kiel, Germany, pp. 182-186.
62. Robert L. T. and Fischer L.J. (1978), “High Performance Liquid-
Chromatographic Assay for Chloramphenicol in Biological Fluids”,
Clinical Chemistry, 24(5), pp. 778-781.
63. Rossi F., Kylian O., Hasiwa M. (2006), Plasma Processes Polym, 3, pp. 431.
64. Samanidou VF., Tsochatzis ED., and Papadoyannis IN. (2006), “HPLC
determination of cefotaxime and cephalexine residues in milk and
cephalexine in veterinary formulation”, Microchimica Acta, Vol.160 (4),
pp. 471-475.
65. Stokstad, E.L.R. and T.H. Jukes. (1949), Further observations on the animal
protein factor, Proceedings of the Society of Biological and Experimental
Medicine, 73, pp. 523–528.
66. Suhren G, Beukers R. (1998), Delvotest SP for detection of cloxacillin and
sulfamethoxazole in milk: IDF interlaboratory study. J. Assoc. Official
Anal. Chem, 81, pp.978-990.
67. Todar Kenneth (2008), "Surface Structure of Bacillus", Textbook of
Bacteriology.
68. William A. M. and Raida HK. (1995), Rapid Determination of Tetracycline
Antibiotics in Milk and Tissues Using Ion-Pairing High-Performance
Liquid Chromatography, 43 (4), pp. 931-934.
69. Yanbin Lu, Qing Shen, Zhiyuan Dai, Hong Zhanghai, Honghai Wang (2011),
“Development of an on-line matrix solid-phase dispersion/fast liquid
chromatography-tandem mass spectrometry system for the rapid and
simultaneous determination of 13 Sulfonamid in grass carp tissue”,
Journal of Chromationgraphy A, 1218, pp. 929-937.
70. Zeigler, Daniel R. (2001), "The Genus Geobacillus." , Bacillus Genetic Stock
Center, 3, pp. 7-11.
Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 77
