Nhiễm trùng lao

Chia sẻ: Vo Canh Tung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

204
lượt xem 54
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tác nhân gây bệnh: Mycobacterium gồm những trực khuẩn kháng acid, hiếu khí tuyệt đối, không sinh bào tử. Vi khuẩn gây bệnh lao cho người gồm: M. tuberculosis (trực khuẩn lao người); M. bovis (trực khuẩn lao bò); Atypical mycobacterium (trực khuẩn lao không điển hình)

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nhiễm trùng lao

QUY TRÌNH XEÙT NGHIEÄM VI SINH LAÂM SAØNG NHIEÃM TRUØNG LAO Phaïm Thaùi Bình NHIEÃM TRUØNG LAO VAØI NEÙT VEÀ BEÄNH LAO 1
Tình hình nhieãm lao Tyû leä ca nhieãm/100,000 ngöôøi > 300 > 50-100 200- 300 ≤ 50 100- 200 khoâng coù soá lieäu Taùc nhaân gaây beänh ð Mycobacterium goàm nhöõng tröïc khuaån khaùng acid, hieáu khí tuyeät ñoái, khoâng sinh baøo töû. ð Vi khuaån gaây beänh lao cho ngöôøi goàm: ð M. tuberculosis (tröïc khuaån lao ngöôøi) ð M. bovis (tröïc khuaån lao boø) ð Atypical mycobacterium (tröïc khuaån lao khoâng ñieån hình) ð Vi khuaån gaây beänh nhôø yeáu toá taïo thöøng (cord factor) vaø lôùp saùp D. Baûng phaân loaïi Mycobacterium Nhoùm Moät soá doøng vi khuaån gaây beänh ôû ngöôøi M. tuberculosis (beänh lao ôû ngöôøi), M. bovis (beänh M. tuberculosis lao ôû boø vaø ngöôøi), M. africanum (beänh lao ôû Baéc complex vaø Trung Phi) , M. ulcerans (nhieãm truøng da ôû vuøng nhieät ñôùi). Runyon group I M. kansasii (gaây beänh phoåi) ; M. marinum (gaây (Photochromogens) nhieãm truøng da). Runyon group II M. scofulacearum (vieâm haïn h coå ôû treû em), (Scotochromogens) M. gordonae, M. xenopi (gaây beänh phoåi). M. avium, M. inteacellulare (gaây beänh phoåi, Runyon group III thöôøng ôû beänh nhaân AIDS); M. malmoense (gaây (Nonchromogens) beänh phoåi). Runyon group IV M. chelonae, M. photuitum (hoaïi sinh, ít gaây beänh (Rapid growers) tröø ngöôøi suy giaûm ñeà khaùng). 2
Caùc daïng beänh lao Lao phoåi (80%) Caùc theå lao khaùc (20%): ð Lao maøng naõo (5%) ð Lao haïch (30%) ð Lao maøng phoåi (25%) ð Lao tieát nieäu (10%) ð Lao xöông (10%) ð Lao khaùc (20%): tieâu hoùa , ñöôøng hoâ haáp treân , maøng ngoaøi tim.... Cô cheá gaây beänh 90-95% mang maàm beänh Laønh beänh töï nhieân Nhieãm truøng caáp tính (AIDS...) Caùc theå lao 10% chuyeån töø daïng tieàm taøng sang daïng hoaït ñoäng Laây nhieãm 3
NHIEÃM TRUØNG LAO QUY TRÌNH XEÙT NGHIEÄM LAO Laáy vaø chuyeân chôû beänh phaåm Laáy maãu trong loï voâ truøng (ñaøm vaø caùc beän h phaåm) hoaëc tube voâ truøng (beänh phaån khaùc) Beänh phaåm laø ñaøm thì phaûi laáy 03 laàn lieân tieáp nhau: ð Laàn 1: ngay khi chaån ñoaùn. Chuyeån beänh phaåm ð Laàn 2: buoåi saùng sôùm cuûa ñeán phoøng xeùt nghieäm ngaøy thöù 2. caøng sôùm caøng toát (toát ð Laàn 3: buoåi saùng sôùm cuûa nhaát ≤ 2 giôø). ngaøy thöù 3. Beänh phaåm khaùc thì laáy ngay Phoøng xeùt nghieäm phaûi khi coù chaån ñoaùn. phaân tích beänh phaåm ngay khi nhaän. 4
Chuaån bò beänh phaåm ð Beänh phaåm laø ñaøm Caàn phaûi xöû lyù ñeå loaïi tröø taïp nhieãm tröôùc khi nuoâi caáy. ð Ñoái vôùi caùc beänh phaåm khaùc Thöïc hieän khaûo saùt tröïc tieáp vaø nuoâi caáy treân beänh phaåm maø khoâng caàn xöû lyù ñeå loaïi tröø taïp nhieãm. ð Moät soá phöông phaùp xöû lyù beänh phaåm: - Phöông phaùp sodium hydroxide - Phöông phaùp N-acetyl-L-cystein sodium hydroxide - Phöông phaùp Zephiran-trisodium phosphate Chuẩn bị bệnh phẩm Sodium hydroxide (Petroff) N-acetyl L-cystein sodium hydroxide Nguyeân taéc Nguyeân taéc NaOH loaïi tröø vi khuaån khaùc coù trong beänh phaåm. Tuy NALC coù taùc duïng laøm tan ñaøm, NaOH vôùi noàng ñoä nhieân, NaOH cuõng ñoäc vôùi Mycobacteria neân caàn phaûi thaáp loaïi tröø vi khuaån taïp nhieãm vaø giaûm taùc ñoäng ñaûm baûo: noàng ñoä NaOH khoâng quaù 2% vaø thôøi gian ñoái vôùi tröïc khuaån lao. tieáp xuùc vôùi NaOH khoâng quaù 30 phuùt. Thuoác thöû Thuoác thöû - Dung dòch ñeäm: laáy theå tích baèng nhau sodium - Dung dòch söû duïng: NaOH 4% citrate 2.9% vaø NaOH 4%, troän ñeàu, haáp 121oC/ Caùch thöïc hieän 15 phuùt. Baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng. - Dung dòch söû duïng (NALC-NaOH): 0.5g NALC - Laáy theå tích baèng nhau NaOH vaø beänh phaåm cho pha trong 100ml dung dòch ñeäm. Söû duïng trong vaøo tube 50ml vaø troän ñeàu. 24 giôø sau khi pha. - UÛ 15 phuùt/ nhieät ñoä phoøng. Laéc ñeàu sau 5 phuùt. Caùch thöïc hieän - Theâm vaøo nöôùc hoaëc dung dòch phosphate buffer pH 6.8 ñeå ngöng taùc duïng cuûa NaOH (coù theå khi - Laáy theå tích baèng nhau NALC-NaOH vaø beänh thöïc hieän giai ñoaïn naøy neáu ly taâm ngay). phaåm cho vaøo tube 50ml vaø troän ñeàu. - Ly taâm 4000rpm/15 phuùt vaø loaïi boû dòch noåi. - UÛ 15 phuùt/ nhieät ñoä phoøng. Laéc ñeàu sau 5 phuùt. - Trung hoøa caën baèng caùch nhoû töøng gioït HCl 2M - Theâm vaøo nöôùc hoaëc dung dòch phosphate coù chöùa 2% phenol red. Vöøa nhoû vöøa laéc ñeàu cho buffer pH 6.8 ñeå ngöng taùc duïng cuûa NaOH. ñeán khi caën ñoåi töø ñoû sang vaøng thì ngöng. - Ly taâm 4000rpm/15 phuùt vaø loaïi boû dòch noåi. - Hoøa tan caën trong 1-2ml nöôùc (hoaëc NaCl 0.85%) - Hoøa tan caën trong 1-2ml nöôùc (hoaëc NaCl voâ truøng. 0.85%) voâ truøng. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology, 2003, 2nd edition, WHO 5
Khaûo saùt tröïc tieáp Xöû lyù loaïi tröø taïp nhieãm Beänh phaåm: ñaøm Nhuoäm khaùng acid (Ziehl Neelsen/ Kinyoun) ð Phaùt hieän söï hieän dieän cuûa tröïc khuaån khaùng acid (AFB) coù trong Ly taâm beänh phaåm Beänh phaåm khaùc laáy caën ð Ñaùnh giaù haøm löôïng cuûa AFB coù trong beänh phaåm (ñaøm): - (+/-): 1® 2 AFB/ 300 QT - (1+): 1® 9 AFB/100 QT Khi keát quaû nhuoäm khaùng acid (+) thì khoâng - (2+): 1® 9 AFB/ 10 QT ñöôïc keát luaän laø döông tính vôùi M. tuberculosis - (3+): 1® 9 AFB/ 1 QT maø chæ traû lôøi coù hieän dieän tröïc khuaån khaùng acid (AFB: acid fast bacilli). - (4+): > 9 AFB/ 1 QT Moâi tröôøng nuoâi caáy Moâi tröôøng Thaønh phaàn Moâi tröôøng khoâng choïn loïc Lowenstein Tröùng, muoái khoaùng, glycerol, boät khoai taây, malachite Jensen (LJ) green (0.025%) Ogawa Tröùng, muoái khoaùng, glycerol, malachite green (0.025%) Middlebrook Muoái khoaùng, vitamin, cofactor, oleic acid, albumin, 7H10 catalase, glycerol, dextrose, malachite green (0.025%) Middlebrook 7H10, casein hydrolysate 0.1%, malachite green (0.025%) 7H11 Moâi tröôøng choïn loïc Tröùng, muoái khoaùng, glycerol, boät khoai taây, malachite Gruft LJ green (0.025%), penicillin (50U/ml), nalidixic acid (35mg/ml) 7H11, carbenicillin (50mg/ml), amphotericin B (10mg/ml), Selection 7H11 Polymycin B (200U/ml), trimethoprim (20 mg/ml) 7H10, malachite green (0.025%), cycloheximide (360mg/ml), Selection 7H10 lincomycin (2mg/ml), nalidixic acid (20mg/ml) 7H11, 0.5 mL OADC (Oleic acid, Bovine albumin, Dextrose, Catalase) enrichment and 0.1 mL of PANTA (Polymyxin B, MGIT (Mycobacteria Amphotericin B, Nalidixic acid, Trimethoprim, Azlocillin). Chaát Growth Indicator Tube) phaùt huyønh quang nhaïy vôùi oxygen ñöôïc gaén baèng silicon ôû ñaùy tube. 6
Quy trình nuoâi caáy phaùt hieän lao Xöû lyù beänh phaåm ñeå loaïi tröø taïp Ñaøm nhieãm Duøng pipet voâ truøng laáy 03 gioït (khoaûng 0.1ml) vaø caáy vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. UÛ ôû 35-37oC/2-5%CO2 Beänh phaåm - 1-2 tuaàn (moâi tröôøng loûng) khaùc - 3-4 tuaàn (moâi tröôøng ñaëc) Baùo caùo theo keát quaû nuoâi caáy Ñònh danh, khaùng sinh ñoà. Keát quaû Baùo caùo Neáu khoâng coù ñieàu kieän ñeå ñònh Khoâng moïc AÂm nghieäm danh vaø khaùng sinh ñoà thì: 1-9 khuùm khuaån (+) ð Nhuoäm khaùng acid vaø traû keát quaû 20-100 khuùm khuaån (1+) cho laâm saøng. ð Gôûi chuûng vi khuaån ñeán PXN tham >100 khuùm khuaån (2+) chieáu ñeå ñònh danh vaø KSÑ Moïc daøy ñaëc (3+) Ngoaïi nhieãm Ngoaïi nhieãm Ñònh danh M. tuberculosis baèng thöû nghieäm sinh hoùa (-) MOTT Nhuoäm khaùng acid: Niacin AFB (+) (+) M. simiae (+) (-) (-) M. bovis M. chelonae M. africanum Catalase 68oC Nitrate ®nitrite (+) (-) (+) M. africanum M. tuberculosis Elme. W. Koneman, 1997, Color Atlas and textbook Diagnostic Microbiology, 5th edition, Lippincott. Pyrazinamidase 7
Ñònh danh M. tuberculosis baèng thöû nghieäm saéc kyù mieãn dòch Khaùng sinh ñoà tröïc tieáp treân beänh phaåm Noàng ñoä khaùng sinh (mg/ml) Khaùng sinh Middlebrook 7H10 Lowenstein Jensen Isoniazid 0.2 0.2 Beänh phaåm (neáu laø ñaøm Streptomycin 2 4 caàn phaûi loaïi Rifampicin 1 40 tröø taïp nhieãm) Ethambutol 2 2 Pyrazinamide 50 - AFB (+) Pha loaõng beänh phaåm theo keát quaû AFB INH Ñoái INH Ñoái chöùng Noàng ñoä chöùng AFB/QT beänh phaåm 10 10-2 vaø 10-3 Duøng pipet Pasteur nhoû 3 gioït beänh phaåm Herbert M. Sommers, 1967, Clinically significant Mycobacteria: their recognition and identification, 2rd (moãi noàng ñoä) leân caùc moâi tröôøng khaùng sinh ñoà. edition, American Society of Clinical Pathologists Elme. W. Koneman, 1997, Color Atlas and textbook UÛ 35oC/2-5%CO2/2-4 tuaàn Diagnostic Microbiology, 5th edition, Lippincott. 8
Khaùng sinh ñoà baèng phöông phaùp pha loaõng khaùng sinh trong thaïch Noàng ñoä khaùng sinh (mg/ml) Vi khuaån moïc treân Khaùng sinh Middlebrook 7H10 Lowenstein Jensen moâi tröôøng phaân laäp Isoniazid 0.2 0.2 Streptomycin 2 4 Rifampicin 1 40 Ethambutol 2 2 Laáy vi khuaån cho vaøo 3ml Tween Pyrazinamide 50 - albumin, troän ñeàu vaø ñieàu chænh ñoä ñuïc töông ñöông McF 1 baèng NaCl 0.85% INH Ñoái INH Ñoái chöùng chöùng RF PYZ RF PYZ Herbert M. Sommers, 1967, Clinically significant Pha loaõng 10-2 vaø 10-4. Duøng pipet Pasteur nhoû 3 Mycobacteria: their recognition and identification, 2rd edition, American Society of Clinical Pathologists gioït huyeàn dòch (moãi noàng ñoä) leân caùc moâi tröôøng Elme. W. Koneman, 1997, Color Atlas and textbook khaùng sinh ñoà. UÛ 35oC/2-5%CO2/2-4 tuaàn Diagnostic Microbiology, 5th edition, Lippincott. Khaùng sinh ñoà baèng phöông phaùp Etest Vi khuaån moïc treân moâi tröôøng phaân laäp Laáy vi khuaån cho vaøo NaCl troän ñeàu vaø ñieàu chænh ñoä ñuïc töông ñöông McF 3-4 Duøng taêm boâng voâ truøng Ñaët que Etest treân beà maët Ñoïc keát quaû giaù trò MIC traõi huyeàn dòch treân moâi moâi tröôøng vaø uû 35-37oC/ tröôøng Middlebrook 7H11 5% CO2/ 1-2 tuaàn 9
Khaùng sinh ñoà baèng Automated AST/MGIT 960 ð Moâi tröôøng KSÑ: MGIT AST coù boå sung khaùng sinh - Isoniazid - Rifampicin - Ethambutol - Streptomycin ð Thôøi gian nuoâi uû: 2-3 tuaàn NHIEÃM TRUØNG LAO PHÖÔNG PHAÙP KHAÙC CHAÅN ÑOAÙN LAO 10
Phaùt hieän lao baèng thöû nghieäm IDR IDR (Intradermo reaction) hay coøn goïi Tuberculin skin test hoaëc Mantoux test. Tieâm Tuberculin P.P.D (purified protein derviative) vaøo ñaùnh giaù phaûn öùng quaù maãn muoän ñoái vôùi lao. IDR ñöôïc chæ ñònh trong caùc tröôøng hôïp: ð Hoã trôï chaån ñoaùn phaùt hieän lao. ð Saøng loïc ñeå ñaùnh giaù tyû leä nhieãm truøng trong coäng ñoàng ñònh kyø. Tieâm 0.1ml PDD Tuberculin 5TU döôùi da ð Ñaùnh giaù trong vieäc chuûng ngöøa, (BCG vaccine), phoøng beänh hoaëc ñieàu tra dòch teã hoïc. >15-20mm 10-15mm Khoâng 5-10mm phaûn öùng Coù theå chöa Coù theå ñaõ chuûng Khoaûn g 90% Khoaûn g 100% töøng bò phôi ngöøa BCG hoaëc coù khaû naên g coù khaû naêng nhieãm lao ñaõ töøn g phôi nhieãm lao nhieãm lao nhieãm lao J. Keith Struthers, 2003, Clinical Bacteriology, Mannson publishing Sau 72 giôø ño ñöôøng kính phaûn öùng Phaùt hieän lao baèng caùch thöû nghieäm saéc kyù mieãn dòch 11
Phaùt hieän lao baèng thöû nghieäm PCR 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min Beänh Ly trích PCR ñaëc hieäu vôùi phaåm DNA M. tuberculosis Ñieän di treân gel agarose (a) DNA ladder (b) Chöùng noäi taïi (c) Vaïch DNA cuûa M. tuberculosis Maãu (-): 2, 3 Maãu (+): 1, 4 Chöùng (+): 5 Phaùt hieän Chöùng (-): 6 saûn phaåm PCR Thang chuaån: 7 Phaùt hieän lao khaùng thuoác baèng giaûi trình töï gen M. tuberculosis khaùng thuoác laø do ñoät bieán ôû moät soá vuøng giôùi haïn trong boä gen Tinh saïch saûn phaåm PCR PCR giaûi trình töï (30X) 96oC/20s 50oC/20s 60oC/4min Tuûa vaø tinh saïch saûn phaåm PCR giaûi trình töï Ñieän di Beänh PCR phaùt hieän ñoät Ly trích mao quaûn phaåm bieán khaùng thuoác DNA Lane M, 1-kbp ladder; Lane 1, rpoB; Lane 2, katG; Lane 3, mabA-inhA; Lane 4, embB; Phaân tích Lane 5, pncA; Lane 6, rpsL; keát quaû Lane 7, rrs; Kieåm tra saûn phaåm PCR Lane 8, gyrA. baèng caùch ñieän di 12