Các Ph ng Pháp Nhân Gi ng In Vitro Lan H Đi pươ ố ồ ệ
Ph n I: M Đuầ ở ầ
Cu c s ng ngày càng phát tri n, nhu c u t o m t g c v n nh mang màuộ ố ể ầ ạ ộ ố ườ ỏ
xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà c a ng i dân ngày càng cao.V n nhi u h ,ủ ườ ố ề ọ
nhi u ch ng lo i, màu s c phong phú l i t n ít di n tích nên vi c ch n tr ng và t oề ủ ạ ắ ạ ố ệ ệ ọ ồ ạ
m t v n lan nh trong khuôn viên nhà là s l a ch n c a nhi u cá nhân, nhi u hộ ườ ỏ ự ự ọ ủ ề ề ộ
gia đình.Trong s nh ng lo i phong lan đc nuôi tr ng n c ta hi n nay, bênố ữ ạ ượ ồ ở ướ ệ
c nh nh ng loài t ng đi d tr ng nh Mokaro, Dendro, lan Vũ N …thì v n cóạ ữ ươ ố ễ ồ ư ữ ẫ
nh ng loài lan thích h p v i m t s khu v c đa lý nh t đnh, c th là Đa Lan –ữ ợ ớ ộ ố ự ị ấ ị ụ ể ị
loài hoa ch có th nuôi tr ng trong đi u ki n lí t ng c a Đà L t .[4]ỉ ể ồ ề ệ ưở ủ ạ
Không quá kén ch n và h n ch n i tr ng nh Đa Lan song H Đi p cũng làọ ạ ế ơ ồ ư ị ồ ệ
m t trong nh ng gi ng lan quý l i khó tr ng. Do đó, đòi h i ng i tr ng ph i cóộ ữ ố ạ ồ ỏ ườ ồ ả
đôi chút am hi u v loài hoa này.Thích h p v i đi u ki n trong nhà l i là m t trongể ề ợ ớ ề ệ ạ ộ
nh ng gi ng lan đc yêu thích không ch v màu s c, ki u dáng mà còn mang m tữ ố ượ ỉ ề ắ ể ộ
nét đp r t sang tr ng, trang nhã. Chính vì v y, H Đi p đã nhanh ch ng tr thànhẹ ấ ọ ậ ồ ệ ố ở
s n ph m tr ng tr t đc nhi u ng i a chu ng và mang l i hi u qu kinh t caoả ẩ ồ ọ ượ ề ườ ư ộ ạ ệ ả ế
không ch Vi t Nam mà còn nhi u n c trên th gi i nh :Đài Loan, Hàn Qu c,ỉ ở ệ ở ề ướ ế ớ ư ố
Nh t B n, M …Bên c nh đó, hoa H Đi p r t lâu tàn, đ b n bông cao, giàu s cậ ả ỹ ạ ồ ệ ấ ộ ề ứ
quy n rũ nên nó đã đc l a ch n làm v t trang trí, t o c nh quan trong các ngàyế ượ ự ọ ậ ạ ả
l , t t.V n là m t loài r t khó nhân gi ng b i H Đi p th ng cho h s nhân r tễ ế ố ộ ấ ố ở ồ ệ ườ ệ ố ấ
th p trong đi u ki n v n m. Đ có đc s l ng l n cây gi ng đng đu vàấ ề ệ ườ ươ ể ượ ố ượ ớ ố ồ ề
s ch b nh đáp ng nhu c u th tr ng là m t v n đ th t nan giãi. Do đó, vi c nhânạ ệ ứ ầ ị ườ ộ ấ ề ậ ệ
gi ng b ng k thu t nuôi c y mô ra đi t o ra hàng lo t cây con n đnh v m t diố ằ ỷ ậ ấ ờ ạ ạ ổ ị ề ặ
truy n, s ch b nh, giá c l i ph i chăng là r t h u ích. ề ạ ệ ả ạ ả ấ ữ
Xu t phát t th c ti n này c ng v i s đam mê c a chính b n thân mình, tôiấ ừ ự ễ ộ ớ ự ủ ả
đã ti n hành tìm ki m s u t p t đó đa ra đ tài: “ế ế ư ậ ừ ư ề Các ph ng pháp nhân gi ng inươ ố
vitro lan H Đi p”. ồ ệ
SVTH: Bùi Th Thu Nhi L p 07S1 ị ớ
1
Các Ph ng Pháp Nhân Gi ng In Vitro Lan H Đi pươ ố ồ ệ
Ph n II: N i Dungầ ộ
II.1. T ng quan tài li uổ ệ
1.1. L ch s và thành t u c a nuôi c y mô [5]ị ử ự ủ ấ
1.1.1. Trên th gi iế ớ
Năm 1902, nhà thông thái Haberlant l n đu tiên đa ra ý t ng c y mô c aầ ầ ư ưở ấ ủ
sinh v t ra ngoài c th nh ng ông đã dùng t bào quá chuyên bi t nên không thànhậ ơ ể ư ế ệ
công. Mô đng v t đc c y tr c tiên do A.Carrel(1919), đn năm 1934 mô th cộ ậ ượ ấ ướ ế ự
v t m i đc nuôi c y.ậ ớ ượ ấ
Năm 1934 White đã thành công trong vi c phát hi n ra s s ng vô h n c aệ ệ ự ố ạ ủ
vi c nuôi c y t bào r cà chua.ệ ấ ế ễ
Năm 1964 Ball là ng i đu tiên tìm ra m m r t nuôi c y ch i ng n. Ôngườ ầ ầ ễ ừ ấ ồ ọ
đã thành công trông vi c chuy n cây con c a cây sen c n và cây White Lupin tệ ể ủ ạ ừ
môi tr ng nuôi c y t i thi u, tuy nhiên vi c nhân gi ng v n ch a hoàn ch nh. Sauườ ấ ố ể ệ ố ẫ ư ỉ
đó, nhi u nhà nghiên c u đã khám phá nh ng thành ph n dinh d ng qua tr ng c nề ứ ữ ầ ưỡ ọ ầ
thi t cho s phát tri n c a t bào đc nuôi c y (White (1951),Gauthere (1939),Vanế ự ể ủ ế ượ ấ
Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)).
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hi n ra các h p ch t có th đi u khi nệ ợ ấ ể ề ể
s n y ch i.ự ả ồ
Năm 1962, Murashige và Skoog đã c i ti n môi tr ng nuôi c y đánh d uả ế ườ ấ ấ
m t b c ti n trong k thu t nuôi c y mô. Môi tr ng c a h dùng làm c s choộ ướ ế ỷ ậ ấ ườ ủ ọ ơ ở
vi c nuôi c y nhi u lo i cây và v n còn s d ng r ng r i cho đn ngày nay.ệ ấ ề ạ ẫ ử ụ ộ ả ế
Năm 1960-1964, Morel cho r ng có th nhân gi ng vô tính lan b ng nuôi c yằ ể ố ằ ấ
đnh sinh tr ng.T k t qu đó, lan đc xem là cây nuôi c y mô đu tiên đcỉ ưở ừ ế ả ượ ấ ầ ượ
th ng m i hoá. T đó đn nay, công ngh nuôi c y mô t bào th c v t đã đcươ ạ ừ ế ệ ấ ế ự ậ ượ
phát tri n v i t c đ nhanh trên nhi u cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972),ể ớ ố ộ ề
Miller và Murashige (1976)) và đc ng d ng th ng m i hóa.ượ ứ ụ ươ ạ
1.1.2. Vi t NamỞ ệ
Nuôi c y mô t bào th c v t đã đc phát tri n Vi t Nam sau chi n tranhấ ế ự ậ ượ ể ở ệ ế
th gi i k t thúc (1975). Phòng thí nghi m nuôi c y mô và t bào đu tiên đc xâyế ớ ế ệ ấ ế ầ ượ
d ng đu tiên vi n sinh h c, vi n khoa h c Vi t Nam(KHVN) do ti n sĩ Lê Thự ầ ở ệ ọ ệ ọ ệ ế ị
Mu i đng đu. B c đu t p trung nghiên c u nh ng v n đ c b n nh nuôiộ ứ ầ ướ ầ ậ ứ ữ ấ ề ơ ả ư
c y bao ph n, nuôi c y mô s o và protoplast. Các k t qu đu tiên v nuôi c yấ ấ ấ ẹ ế ả ầ ề ấ
thành công bao ph n lúa và thu c lá đc công b năm 1978 ấ ố ượ ố (Leâ Thò Muoäi vaø cs,,
SVTH: Bùi Th Thu Nhi L p 07S1 ị ớ
2
Các Ph ng Pháp Nhân Gi ng In Vitro Lan H Đi pươ ố ồ ệ
1978; Leâ Thò Xuaân vaø cs,, 1978). Ti p đó là thành công v protoplast thu c lá vàế ề ở ố
khoai tây (Lê Th Mu i và Nguy n Đc Thành(1978),Nguy n Đc Thành và Lê Thị ộ ễ ứ ễ ứ ị
Mu i 1980,1981).Trong cùng th i gian t i phân vi n KHVN t i Tp.HCM, mu i h nộ ờ ạ ệ ạ ộ ơ
n a là t i Đi h c Nông ử ạ ạ ọ
Nghi p I (ĐHNNI) Hà N i và Vi n Khoa H c K Thu t Nông Nghi p Vi t Namệ ộ ệ ọ ỹ ậ ệ ệ
(KHKTNNVN) và các phòng thí nghi m nuôi c y mô và t bào cũng đc thànhệ ấ ế ượ
l p ch y u t p trung vào vi nhân gi ng khoai tây . Hi n nay, chúng ta có r t nhi uậ ủ ế ậ ố ệ ấ ề
phòng thí nghi m nuôi c y mô không nh ng các tr ng đi h c các vi n nghiênệ ấ ữ ở ườ ạ ọ ệ
c u (vi n Di Truy n Nông Nghi p(DTNN), vi n Rau Qu Trung ng(RQT )) màứ ệ ề ệ ệ ả ươ Ư
c m t s t nh và c s s n xu t(Yên Bái ,H ng Yên, Thanh Hóa….). Gi aở ả ộ ố ỉ ơ ở ả ấ ư ữ
nh ng năm 1980 tr l i đây, các h ng nghiên c u ng d ng nuôi c y mô và tữ ở ạ ướ ứ ứ ụ ấ ế
bào th c v t phát tri n m nh. Nh ng k t qu khích l đã đt đc trong lĩnh v c viự ậ ể ạ ữ ế ả ệ ạ ượ ự
nhân gi ng khoai tây(vi n Công Ngh Sinh H c (CNSH), ĐHNNI, vi nố ệ ệ ọ ệ
KHKTNNVN), d a, chu i, mía (vi n CNSH, ĐHNNI, vi n KHKTNNVN, vi nứ ố ệ ệ ệ
RQT ) m t s cây hoa phong lan (phân vi n CNSH thành ph H Chí Minh),Ư ộ ố ệ ố ồ
H ng, Cúc, C m Ch ng(vi n CNSH, vi n DTNN) và cây công nghi p nh b chồ ẩ ướ ệ ệ ệ ư ạ
đàn (vi n DTNN, vi n Lâm Nghi p). M t s k t qu b c đu đã ghi nh n trongệ ệ ệ ộ ố ế ả ướ ầ ậ
l nh v c ch n dòng t bào nh ch n dòng t bào kháng b nh (Lê Bích Th y và cs,,ỉ ự ọ ế ư ọ ế ệ ủ
1994), ch n dòng ch u mu i ,ch u m t n c (Nghuy n T ng Vân và cs ,,1994;ọ ị ố ị ấ ướ ễ ườ
Đinh Th Phòng và cs,, 1994). Các k t qu v dung h p cây lai t bào ch t vàị ế ả ề ợ ế ấ
chuy n gen l c l p c ng thu đc k t qu lý thú (Nguy n Đc Thành và cs,, 1988;ể ụ ạ ủ ượ ế ả ễ ứ
Nguy n Đc Thành và cs,, 1993, 1997) nuôi c y bao ph n đ t o dòng thu n đãễ ứ ấ ấ ể ạ ầ
đc ng d ng nhi u vi n CNSH và DTNN. Nuôi c y các d c li u quý đ b oượ ứ ụ ề ở ệ ấ ượ ệ ể ả
t n ngu n gen và t o các t bào có hàm l ng các ch t sinh h c quan tr ng caoồ ồ ạ ế ượ ấ ọ ọ
cũng đã và đang phát tri n.ể
1.2. Các giai đo n nhân gi ng invitro [5]ạ ố
Cho t i nay vi c nhân gi ng invitro đã áp d ng cho nhi u lo i cây (350 loài,ớ ệ ố ụ ề ạ
Murashige (1974) chia quy trình nhân gi ng ra làm 4 giai đo n :ố ạ
Nuôi c y kh i đu, tái sinh ch i, c m ch i.ấ ở ầ ồ ụ ồ
Nhân nhanh ch i, c m ch i trong đi u ki n invitro.ồ ụ ồ ề ệ
T o cây con hoàn ch nh, hu n luy n cây con.ạ ỉ ấ ệ
Ph c h i, chuy n cây ra tr ng trong đi u ki n t nhiên.ụ ồ ể ồ ề ệ ự
1.3. Các ph ng pháp nhân gi ng invitro [5]ươ ố
1.3.1. Nuôi c y đnh sinh tr ngấ ỉ ưở
SVTH: Bùi Th Thu Nhi L p 07S1 ị ớ
3
Các Ph ng Pháp Nhân Gi ng In Vitro Lan H Đi pươ ố ồ ệ
M t ph ng th c d dàng nh t đt đc m c tiêu trong nuôi c y mô t bàoộ ươ ứ ễ ấ ạ ượ ụ ấ ế
th c v t là nuôi c y đnh sinh tr ng (bao g m nuôi c y ch i đnh và nuôi c y ch iự ậ ấ ỉ ưở ồ ấ ồ ỉ ấ ồ
bên). Sau khi vô trùng, m u s đc nuôi c y trên môi tr ng thích h p ch a đyẫ ẽ ượ ấ ườ ợ ứ ầ
đ các ch t dinh d ng khoáng vô c và h u c ho c môi tr ng khoáng có bủ ấ ưỡ ơ ữ ơ ặ ườ ổ
sung ch t kích thích sinh tr ng thích h p. T m t đnh sinh tr ng, sau m t th iấ ưở ợ ừ ộ ỉ ưở ộ ờ
gian nuôi c y nh t đnh m u s phát tri n thành m t ch i hay nhi u ch i. Ch i ti pấ ấ ị ẫ ẽ ể ộ ồ ề ồ ồ ế
t c phát tri n thân, ra lá và r đ thành m t cây hoàn ch nh. Cây con đc chuy nụ ể ể ể ộ ỉ ượ ể
d n ra đt và thích nghi bình th ng.ầ ấ ườ
1.3.2. Nuôi c y mô s oấ ẹ
Mô s o là m t kh i t bào phát tri n vô t ch c, hình thành do s phân hóaẹ ộ ố ế ể ổ ứ ự
c a các t bào đã đc phân hóa. Mô s o s phát tri n nhanh khi môi tr ng có sủ ế ượ ẹ ẽ ể ườ ự
hi n di n c a auxin. Kh i mô s o có kh năng phát tri n thành cây con hoàn ch nhệ ệ ủ ố ẹ ả ể ỉ
trong đi u ki n môi tr ng không có ch t kích thích t o mô s o. Nuôi c y mô s oề ệ ườ ấ ạ ẹ ấ ẹ
đc th c hi n đi v i các lo i th c v t không có kh năng nhân gi ng thông quaượ ự ệ ố ớ ạ ự ậ ả ố
nuôi c y đnh sinh tr ng. Cây tái sinh t mô s o có đc tính gi ng nh cây m . Tấ ỉ ưở ừ ẹ ặ ố ư ẹ ừ
m t c m t bào mô s o có th tái sinh cùng m t lúc nhi u ch i h n là nuôi c yộ ụ ế ẹ ể ộ ề ồ ơ ấ
đnh sinh tr ng, tuy nhiên m c đ bi n d t bào soma l i cao h n.ỉ ưở ứ ộ ế ị ế ạ ơ
1.3.3. Nuôi c y t bào đnấ ế ơ
Kh i mô s o đc nuôi c y trong môi tr ng l ng và đc đt trên máy l cố ẹ ượ ấ ườ ỏ ượ ạ ắ
có t c đ đi u ch nh thích h p s tách ra thành nhi u t bào riêng l g i là t bàoố ộ ề ỉ ợ ẽ ề ế ẽ ọ ế
đn.T bào đn đc l c và nuôi c y trên môi tr ng đc bi t đ tăng sinh kh i.ơ ế ơ ượ ọ ấ ườ ặ ệ ể ố
V i các ch t thích h p đc b sung vào môi tr ng, t bào có kh năng s n xu tớ ấ ợ ượ ổ ườ ế ả ả ấ
các ch t có ho t tính sinh h c. Sau m t th i gian nuôi c y kéo dài trong môi tr ngấ ạ ọ ộ ờ ấ ườ
l ng t bào đn đc tách ra và tr i trên môi tr ng th ch.ỏ ế ơ ượ ả ườ ạ
+ Khi môi tr ng th ch có b sung auxin, t bào đn phát tri n thành t ngườ ạ ổ ế ơ ể ừ
c m có mô s o.ụ ẹ
+ Khi môi tr ng th ch có t l cytokinine/auxin thích h p, t bào đn cóườ ạ ỷ ệ ợ ế ơ
kh năng tái sinh thành cây con hoàn ch nh.ả ỉ
1.3.4. Nuôi c y protoplast-chuy n genấ ể
Protoplast (t bào tr n) là t bào đn đc tách b i v cellullose, có s c s ngế ầ ế ơ ượ ở ỏ ứ ố
và duy trì đy đ các ch c năng s n có.ầ ủ ứ ẵ
Trong đi u ki n nuôi c y thích h p, protoplast có kh năng tái sinh màng tề ệ ấ ợ ả ế
bào, ti p t c phân chia và tái sinh cây hoàn ch nh (tính toàn th th c v t). Khi tế ụ ỉ ể ở ự ậ ế
bào ch t m t vách và ti n hành dung h p, hai protoplast có kh năng dung h p v iấ ấ ế ợ ả ợ ớ
SVTH: Bùi Th Thu Nhi L p 07S1 ị ớ
4
Các Ph ng Pháp Nhân Gi ng In Vitro Lan H Đi pươ ố ồ ệ
nhau t o t bào lai, đc tính này cho phép c i thi n gi ng cây tr ng. Quá trình dungạ ế ặ ả ệ ố ồ
h p protoplast có th th c hi n trên hai đi t ng cùng loài hay khác loài.ợ ể ự ệ ố ượ
1.3.5. Nuôi c y h t ph n đn b iấ ạ ấ ơ ộ
H t ph n th c v t đc nuôi c y trên nh ng môi tr ng thích h p t o môạ ấ ở ự ậ ượ ấ ữ ườ ợ ạ
s o. Mô s o này đc tái sinh thành cây hoàn ch nh là cây đn b i. ẹ ẹ ượ ỉ ơ ộ
II.2. Tìm hi u v nhân gi ng lan H Đi pể ề ố ồ ệ
2.1. Ngu n g c và đc đi m c a lan H Đi p [4]ồ ố ặ ể ủ ồ ệ
2.1.1. Ngu n g cồ ố
Lan H Đi p là gi ng lan có tên g i Phalaenopsis, thu c h ph Vandeae.ồ ệ ố ọ ộ ọ ụ
Tên g i Phalaenopsis b t ngu n t ti ng Hi L p trong đó Phalaina có nghĩa là “conọ ắ ồ ừ ế ạ
b m” và Opsis có nghĩa là “gi ng nh ”.ướ ố ư
Lan H Đi p đc khám phá năm 1750, đu tiên đc ông Rumphius đt tênồ ệ ượ ầ ượ ặ
là Angraecum album, năm 1753 Linne đi tên thành Epidendrum, 1825 nhà th c v tổ ự ậ
Hà Lan đnh danh l i là Phalaenopsis. ị ạ
Loài hoa này có xu t x mi n B c Australia, n Đ và các n c Đôngấ ứ ở ề ắ Ấ ộ ướ
Nam Á nh Philippine, Inđônêsia, bán đo Đông D ng. Quê h ng c a lan Hôư ả ươ ươ ủ
Đi p là các n c c a vùng Đông Nam Á, r ng Vi t Nam không có loài Phalaenopsisệ ướ ủ ừ ệ
amabilis, ch có 5 loài t ng t đc bi t là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa,ỉ ươ ự ượ ế
Phalaenopsis lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu-cervi. Lan H Đi pồ ệ
đc tr ng m i n i trên th gi i, h u h t là Đc, Nh t b n, Ph n Lan, Đàiượ ồ ở ọ ơ ế ớ ầ ế ở ứ ậ ả ầ
Loan, Thái Lan và M . Cây con đc nuôi c y mô nhi u các n c Ph n Lan, Tháiỹ ượ ấ ề ở ướ ầ
Lan, Đài Loan…Hi n nay gi ng H Đi p có trên 70 loài và càng ngày càng lai t o raệ ố ồ ệ ạ
r t nhi u.ấ ề
2.1.2. Đc đi mặ ể
Lan H Đi p là cây đn thân, ng n, lá to, dày, m c sát vào nhau. Hoa n luânồ ệ ơ ắ ọ ở
phiên h t cái này đn cái khác, th i kì n hoa thay đi theo loài và th ng n trongế ế ờ ở ổ ườ ở
vài tháng. Phát hoa m c t nách lá, dài, chùm hoa n t ng cái, 3 đài to tròn, hai cánhọ ừ ở ừ
xoè r ng kín, s c đp. Môi hoa cong d p có hai râu dài nên c đóa hoa trong gi ngộ ắ ẹ ẹ ả ố
nh con b m b m. Hai hàng hoa x p đu đn 2 bên cành, kh đong đa nh đànư ươ ướ ế ề ặ ẽ ư ư
b m xinh x n đang bay l n ch p ch n. Tr có hình bán nguy t v i hai phân kh iướ ắ ượ ậ ờ ụ ệ ớ ố
u lên, ch a đy ph n hoa. S hoa trên cành bi u th s c s ng c a cây. S l ngứ ầ ấ ố ể ị ứ ố ủ ố ượ
SVTH: Bùi Th Thu Nhi L p 07S1 ị ớ
5