TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14355:2025
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH ASEN VÔ CƠ BẢNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ
NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT HYDRUA HÓA (HG-AAS) SAU KHI PHÂN HỦY BẰNG VI SÓNG VÀ
TÁCH BẰNG CỘT CHIẾT PHA RẮN (SPE)
Animal feeding stuffs - Determination of inorganic arsenic by hydride generation atomic
absorption spectrometry (HG-AAS) after microwave extraction and separation by solid phase
extraction (SPE)
Lời nói đầu
TCVN 14355:2025 được xây dựng trên cơ sở tham khảo BS EN 16278:2012 Animal feeding stuffs -
Determination of inorganic arsenic by hydride generation atomic absorption spectrometry (HG-AAS)
after microwave extraction and separation by solid phase extraction (SPE).
TCVN 14355:2025 do Viện Chăn nuôi biên soạt., Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu
chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH ASEN VÔ CƠ BằNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ
NGUYÊN TỬ VỚI KỸ THUẬT HYDRUA HÓA (HG-AAS) SAU KHI PHÂN HỦY BẰNG VI SÓNG VÀ
TÁCH BẰNG CỘT CHIẾT PHA RẮN (SPE)
Animal feeding stuffs - Determination of inorganic arsenic by hydride generation atomic
absorption spectrometry (HG-AAS) after microwave extraction and separation by solid phase
extraction (SPE)
CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan
đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này cần thiết lập các thao tác an toàn
thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình xác định asen vô cơ trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp
phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa (HG-AAS) sau khi phân hủy bằng vi sóng và tách bằng
cột chiết pha rắn (SPE).
Phương pháp đã được thử nghiệm thành công trong chương trình thử liên phòng với khoảng nồng độ
từ 0,19 mg/kg đến 2,7 mg/kg (giá trị HORRAT < 2; giá trị HORRAT là giá trị Horwitz-Ratio). Giới hạn
định lượng của phương pháp là á 0,1 mg/kg.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn dưới đây là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu ghi
năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên
bản mới nhất (bao gồm cả các sửa đổi).
TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.
TCVN 4851 (ISO 3696) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và
phương pháp thử
TCVN 6952 (ISO 6498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.
3 Nguyên tắc
Asen vô cơ bao gồm asenit [Asen(III)] và asenat [Asen(V)]. Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp để
xác định asen vô cơ [Tổng của asen(III) và asen(V)]. Phần mẫu thử đại diện được xử lý với axit
clohydric loãng và dung dịch hydro peroxit, sau đó hỗn hợp được làm nóng bằng vi sóng. Bằng cách
này, asen vô cơ được tách chiết và asen(III) được oxi hóa thành asen(V). Asen vô cơ được tách ra
khỏi các hợp chất asen khác bằng cách chiết pha rắn (SPE) và nồng độ của asen vô cơ trong dịch
chiết SPE được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa
(HG-AAS). Hơi Hydrua được dẫn vào một cuvet đã được làm nóng bằng dòng khí mang và bị phân
hủy. Vì asen (III) và asen (V) có độ nhạy khác nhau đối với kỹ thuật hydrua, do đó cần đảm bảo asen
(V) bị khử thành asen (III) nhằm tránh sai số trong quá trình đo.
4 Thuốc thử
Nồng độ của asen trong thuốc thử và trong nước sử dụng phải đủ thấp để không làm ảnh hưởng đến
kết quả của phép thử. Tất cả thuốc thử phải tinh khiết hoặc tương đương, trừ trường hợp đặc biệt.
Sử dụng nước phù hợp với loại 2 của TCVN 4851 (ISO 3696).
4.1 Axit clohydric (HCl), nồng độ ≥ 30 % với khoảng p (HCl) ≥ 1,15 g/mL.
CHÚ THÍCH: Chỉ sử dụng axit clohydric có độ tinh khiết cao hoặc đã được làm sạch bằng cách chưng
cất dưới điểm sôi.
4.2 Dung dịch axit clohydric (HCl).
4.2.1 Dung dịch axit clohydric nồng độ 0,4 mol/L để rửa giải cho SPE
Pha loãng 20 mL axit clohydric (4.1) thành 0,5 L bằng nước cất
4.2.2 Dung dịch axit clohydric nồng độ 0,055 mol/L sử dụng cho dung dịch tách chiết
Pha loãng 5,8 mL axit clohydric (4.1) thành 1 L bằng nước cất
4.2.3 Dung dịch axit clohydric nồng độ 2,6 mol/L sử dụng cho quá trình phân hủy sơ bộ mẫu.
Pha loãng 270 mL axit clohydric (4.1) thành 1 L bằng nước cất
4.2.4 Dung dịch axit clohydric nồng độ 4,7 mol/L sử dụng cho HG-AAS.
Pha loãng 500 mL axit clohydric (4.1) thành 1 L bằng nước cất
4.3 Hydro peroxit (H2O2), nồng độ ≥ 30 %.
4.4 Dung dịch tách chiết mẫu:
H2O2 3 % trong dung dịch HCl 0,055 mol/L
Pha loãng 20 mL hydro peroxit (4.3) đến 200 mL bằng dung dịch axit clohydric 0,055 mol/L (4.2.2).
4.5 Axit acetic, ρ(CH3COOH) = 1,05 g/mL.
4.6 Dung dịch axit acetic loãng, nồng độ 0,5 mol/L để rửa cột SPE.
Pha loãng 15 mL axit acetic (4.5) đến 0,5 L bằng nước cất.
4.7 Natri hydroxit, hàm lượng ≥ 98 %.
4.8 Natri hydroxit, nồng độ 0,1 mol/L để chỉnh pH.
Hòa tan 0,4 g natri hydroxit (4.7) với nước và định mức đến 100 mL
4.9 Amoni cacbonat, hàm lượng ≥ 99,999%.
4.10 Dung dịch đệm amoni cacbonat, nồng độ 40 mmol/L
Hòa tan 0,384 g amoni cacbonat (4.9) với nước cất và định mức đến 100 mL
4.11 Metanol (CH3OH), loại tinh khiết dùng cho HPLC, giúp hoạt hóa chất hấp thụ SPE.
4.12 Natri borohydrua, hàm lượng ≥ 96%.
4.13 Dung dịch natri borohydrua để tạo hydrua
Hòa tan 2,5 g natri hydroxit (4.7) trong một lượng nước nhỏ, thêm vào 2,5 g natri borohydrua (4.12) và
thêm nước vừa đủ 500 mL. Chuẩn bị dung dịch mới mỗi ngày trước bước hydrua hóa và lọc dung
dịch trước khi sử dụng nếu cần thiết.
Dung dịch natri borohydrua có sẵn trên thị trường có thể sử dụng.
CHÚ THÍCH: Nồng độ yêu cầu có thể thay đổi một chút tùy theo hệ thống, do đó các hướng dẫn của
nhà sản xuất cần phải được tuân thủ.
CẢNH BÁO - Người sử dụng phải tuân thủ các hướng dẫn an toàn trong khi thao tác với natri
borohydrua. Natri borohydrua phản ứng với axit, và điều này có thể tạo thành hỗn hợp khí nổ
hydro, cần chuẩn bị một hệ thống chiết cố định tại khu vực thực hiện phép đo.
4.14 Axit L-Ascorbic, hàm lượng s 99,7%.
4.15 Kali iốt (KI), hàm lượng s 99,5%.
4.16 Dung dịch khử sơ bộ dùng để chiết mẫu.
Hòa tan 1,25 g kali iốt (4.15) và 1,25 g axit L-Ascorbic (4.14) trong 250 mL axit ciohydric2,6 mol/L
(4.2.3). Chuẩn bị dung dịch mới mỗi ngày phân tích.
Nồng độ yêu cầu có thể thay đổi một chút tùy theo hệ thống, do đó các hướng dẫn của nhà sản xuất
cần phải được tuân thủ.
CHÚ THÍCH Thêm phần thể tích silicone 0,1% (4.21) vào dung dịch có thể làm giảm sự tạo bọt trong
hệ thống tách chiết pha khi-lỏng.
4.17 Dung dịch cân bằng SPE.
Hỗn hợp thể tích theo tỷ lệ 1:1 dung dịch amoni cacbonat 40 mmol/L (4.10) với dung dịch tách chiết
(4.4) Cần 2 mL dung dịch cho mỗi cột SPE .
4.18 Dung dịch chuẩn gốc asen
Nên sử dụng các chất chuẩn có sẵn trên thị trường với nồng độ khối lượng là 1000 mg/L. Dung dịch
chuẩn gốc trong dung dịch axit nitric pha loãng được ưu tiên sử dụng.
4.19 Dung dịch chuẩn trung gian asen
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc asen (4.18) trong nước qua nhiều bước như sau:
4.20 Dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn bị 6 dung dịch chuẩn làm việc, bao gồm một dung dịch trắng, nồng độ các dung dịch chuẩn
làm việc nằm trong khoảng tuyến tính của chất cần phân tích bằng cách pha loãng các dung dịch
chuẩn trung gian(4.19). Dải tuyến tính phụ thuộc vào thiết bị sử dụng. Sự tương thích phù hợp của
các dung dịch chuẩn làm việc phải được thực hiện (quá trình khử sơ bộ dựa theo Bảng 2). Cần phải
điều chỉnh nồng độ axit của dung dịch chuẩn làm việc phù hợp với nồng độ axit của mẫu thử nghiệm.
Khoảng nồng độ xây dựng đường chuẩn được khuyến nghị sử dụng nằm trong khoảng từ 0,25 μg/L
đến 8 μg/L. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc cho mỗi lần phân tích.
CHÚ THÍCH Ví dụ về quá trình xây dựng đường chuẩn được liệt kê ở Phụ lục B, Bảng B.2.
4.21 Chất chống tạo bọt silicone ≥ 30%.
5 Thiết bị và dụng cụ
Để giảm thiểu sự nhiễm bẩn, tất cả thiết bị và dụng cụ tiếp xúc trực tiếp với mẫu và các dung dịch cần
phải được xử lý cẩn thận. Tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh, vì có thể gây nhiễm asenat.
5.1 Máy nghiền phòng thí nghiệm, có khả năng nghiền tới cỡ hạt nhỏ hơn hoặc bằng 0,5 mm.
5.2 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg.
5.3 Lò vi sóng với bình phân hủy kín, có khả năng lập trình nhiệt độ.
5.4 Giấy/que chỉ thị pH, pH trong khoảng từ 4 đến 7.
5.5 Máy ly tâm, có khả năng ly tâm với tốc độ tối thiểu là 4000 r/min (2100 g).
5.6 Cột chiết pha rắn, có pha tĩnh trao đổi điện tích âm mạnh.
Cột Strata SAX (Phenomenex), 500 mg/ 6 mL đã được chứng minh là ổn định với quy trình này. (Các
cột SPE tương đương từ các nhà sản xuất khác với hiệu suất tương tự cũng có thể được sử dụng).
CHÚ THÍCH Kiểm tra khả năng lưu giữ asen vô cơ của cột SPE.
5.7 Bơm hút chân không dùng cho quá trình rửa giải SPE.
5.8 Bình định mức, dung tích: 100 mL, 150 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL.
5.9 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, có hệ thống ghi kết quả, cuvet thạch anh chịu nhiệt và thiết
bị hydrua hóa.
5.10 Đèn nguyên tố đặc thù, (đèn phóng điện không điện cực (được khuyến nghị sử dụng) hoặc
đèn catot rỗng cho asen.
5.11 Hệ thống dòng chảy tự động cho hydrua hóa
6 Cách tiến hành
6.1 Yêu cầu chung
CHÚ Ý: Quy trình được miêu tả bằng sơ đồ (Phụ lục B). Bảng B.1 cung cấp thông tin về các
dung dịch và dụng cụ được sử dụng cho các bước khác nhau của phương pháp: Vi sóng, SPE
và HG- AAS.
Việc lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử không nằm trong quy trình này. Các phương pháp lấy mẫu và
chuẩn bị mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) và TCVN 6952 (ISO 6498) được khuyến nghị sử dụng.
6.2 Phá mẫu bằng vi sóng
Cân khoảng 0,2 g mẫu thử đồng nhất (cỡ hạt mẫu < 0,5 mm), chính xác đến 1 mg, cho vào bình phân
hủy kín của lò vi sóng. Thêm vào 10 mL dung dịch tách chiết (4.4). Dung dịch sau đó được làm nóng
bằng lò vi sóng sử dụng chương trình nhiệt như ở Bảng 1.
Bảng 1 - Chương trình nhiệt của lò vi sóng
Bước Nhiệt độ Thời gian
1 90 °C 25 min
2 Làm mát 7 min (thời gian có thể thay đổi, theo hướng
dẫn của nhà sản xuất)
Sau khi xử lý bằng lò vi sóng, mẫu được làm mát về nhiệt độ phòng. Dịch mẫu được chuyển sang ống
ly tâm và ly tâm trong vòng 10 min ở tốc độ ≥ 4000 r/min (2100 g).
CHÚ THÍCH Dịch chiết phía trên được dùng cho bước làm sạch bằng cột SPE sau đó và có thể được
bảo quản trong ống sạch ở 4 °C trong tối đa 3 tuần.
6.3 Tách chiết pha rắn SPE asen vô cơ
CHÚ Ý: Nên cho dung dịch vào cột SPE với tốc độ nhỏ giọt. Khoảng 5 min rửa giải cho 2 mL
dung dịch.
6.3.1 Hoạt hóa cột SPE
Cột chiết pha rắn SPE được hoạt hóa bằng 2 mL metanol (4.11).
CHÚ Ý: Cần để cột SPE chảy đến khi khô
6.3.2 Cân bằng hấp thụ cột SPE
Cột chiết pha rắn SPE được hoạt hóa bằng 2 mL dung dịch cân bằng cột SPE (4.17).
CHÚ Ý: Cần để cột SPE chảy đến khi khô
6.3.3 Đệm hóa dung dịch mẫu
Hỗn hợp 3 mL dịch chiết mẫu thử (6.2) với 3 mL dung dịch đệm amoni cacbonat 40 mmol/L (4.10).
Đảm bảo pH của dung dịch khoảng 6,5 ± 1 bằng giấy/que chỉ thị pH (5.4). Nếu cần điều chỉnh giá trị
pH bằng axit acetic (4.6) và natri hydroxit (4.8).
Ly tâm dung dịch đệm mẫu thử ở tốc độ > 4000 r/min (2100 g) ít nhất trong 10 min để loại bỏ các hạt
cặn.
6.3.4 Nạp dung dịch mẫu vào cột SPE
4 mL dung dịch đệm mẫu sau khi ly tâm (6.3.3) được nạp vào cột SPE.
CHÚ Ý: Cần để cột SPE chảy đến khi khô 6.3.5 Rửa cột SPE
Rửa cột SPE bằng 3 mL axit acetic (4.6). 0,5 mol/L
CHÚ Ý: Để cột SPE chảy đến khi khô, dùng bơm chân không(50 kPa đến 70 kPa) hút ít nhất
trong 5 min trước bước rửa giải cuối cùng 6.3.6
6.3.6 Rửa giải cột SPE
Lượng As(V) lưu giữ trong cột SPE được rửa giải bằng 1,25 mL axit clohydric 0,4 mol/L (4.2.1).
CHÚ Ý: Thu toàn bộ dịch mẫu rửa giải vào trong lọ nhựa phù hợp bằng cách hút chân không
(thường từ 50 kPa đến 70 kPa) ít nhất 5 min.
CHÚ THÍCH Dịch mẫu rửa giải (6.3.6) thường được bảo quản ở nhiệt độ tối đa là 4 °C trong vòng tối
đa 3 ngày cho đến khi tiến hành phân tích.
6.4 Xác định asen vô cơ
6.4.1 Yêu cầu chung
Asen vô cơ được xác định là tổng lượng asen có trong dịch mẫu rửa giải SPE. Thực hiện quá trình
khử sơ bộ dung dịch mẫu thử (6.3.6) và xây dựng đường chuẩn (4.20) trước khi xác định asen vô cơ.
6.4.2 Khử sơ bộ
Bước này phụ thuộc vào hệ thống hydrua hóa được sử dụng. Do đó, hệ thống được tối ưu hóa trước
khi sử dụng, và có thể sử dụng thể tích dung dịch lớn hơn hoặc nhỏ hơn thể tích khuyến nghị (Bảng
2) nếu cần thiết.
Bảng 2 - Ví dụ về quy trình khử sơ bộ dung dịch mẫu thử trước khi đo bằng HG-AAS
Dung dịch mẫu thử (6.3.6) 1 mL
Dung dịch kali iốt/axit L-Ascorbic với axit clohydric (4.16) Thêm vào 7 mL dung dịch sau đó trộn đều
Ủ 60 min ở nhiệt độ phòng
Axit clohydric 2,6 mol/L (4.2.3) Thêm vào 6 mL dung dịch sau đó trộn đều
Ủ 60 min ở nhiệt độ phòng
Tất cả các mẫu bao gồm cả các dung dịch chuẩn đều phải được xử lý giống nhau. Axit clohydric
(4.2.3) và chất khử (4.16) cần được sử dụng cùng nồng độ trong tất cả các dung dịch mẫu thử (xem
Phụ lục B, Bảng B.2).
6.4.3 Cài đặt máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (quy trình HG-AAS)
Để thiết lập lịch trình thử nghiệm, đầu tiên cần điều chỉnh hệ thống theo hướng dẫn vận hành của nhà
sản xuất. Sau đó để tối ưu hóa cài đặt, chú ý đến thời gian dòng khí lưu thông và lượng natri
borohydrua được đưa vào. Thông số cài đặt được liệt kê trong Bảng 3.
Bảng 3 - Cài đặt cho máy đo asen HG-AAS
Nhiệt độ buồng 900 °C
Bước sóng 193,7 nm
Độ rộng khe 0,5 nm
Xử lý tín hiệu Chiều cao đỉnh với hiệu chỉnh nền
Thời gian đo 4 s
6.4.4 Xác định bằng HG-AAS
Dung dịch mẫu khử sơ bộ và dung dịch chuẩn khử sơ bộ được đo trực tiếp bằng máy đo quang phổ
hấp thụ nguyên tử với cuvet thạch anh đã được làm nóng bằng điện cùng với hệ thống dòng chảy tự
động (5.11). Hệ thống nên được lập trình để trộn một lượng dung dịch mẫu và/hoặc dung dịch chuẩn
(6.4.2), đã được pha loãng bằng axit clohydric (4.2.4) và dung dịch borohydrua (4.13). Hỗn hợp
khí/lỏng được phân tách bằng bộ tách dòng argon. Dòng khí argon tách và vận chuyển các hydrua
asen đến cuvet thạch anh để thực hiện phản ứng nguyên tử hóa và đo độ hấp thụ nguyên tử của
asen.
Dung dịch chuẩn được đo đầu tiên, sau đó đến dung dịch mẫu thử. Đo lại dung dịch chuẩn ở cuối mỗi
mẻ phân tích.
Mẫu kiểm soát chứa hàm lượng asen vô cơ đã biết trước nồng độ và được phân tích song song với
mẫu thử, mẫu kiểm soát cần được thực hiện cùng tất cả các bước trong quy trình từ bước phân hủy
bằng lò vi sóng. Mẫu trắng cũng được chuẩn bị và thực hiện tất cả các bước trong quy trình.
7 Tính kết quả
Đường chuẩn và nồng độ chất phân tích trong dung dịch mẫu được tính bằng phần mềm hệ thống
AAS
Hàm lượng asen vô cơ W, biểu thị bằng số miligam trên một kilogam được tính theo công thức:
(1)
Trong đó:
ctlà nồng độ của asen trong dung dịch mẫu thử, tính bằng microgam/L( μg/L);
V1là tổng thể tích của dung dịch khử sơ bộ, tính bằng mililit (ở đây là 14 mL);
V2là thể tích mẫu trong bước khử sơ bộ, tính bằng mililit (mL) (ở đây là 1 mL);
V3là thể tích từ dịch chiết SPE, tính bằng mililit (mL) (ở đây là 1,25 mL);
V4là thể tích đưa vào SPE, tính bằng mililit (mL) (ở đây là 4 mL);
V5là tổng thể tích dung dịch đệm mẫu, tính bằng mililit (mL) (ở đây là 6 mL);
V6là thể tích dịch nổi của dung dịch đệm mẫu, tính bằng mililit (mL) (ở đây là 3 mL);
mextr là khối lượng của dung dịch tách chiết sau bước ly chiết bằng lò vi sóng, tính bằng gam(g)
(ở đây là 10 g);
ρlà mật độ của dung dịch tách chiết, tính bằng gam/mililit (g/mL) (ở đây là 1 g/mL);
mtlà khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam(g).
Nếu các giá trị trong dấu ngoặc được sử dụng, công thức (1) được rút gọn thành:
(2)
Nếu cần thiết có thể trừ đi nồng độ của asen vô cơ trong chất trắng từ ct.
8 Độ chụm
8.1 Yêu cầu chung