TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14389:2025
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS LATEROSPORUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC
VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
Fertilizers - Enumeration of Bacillus laterosporus by colony count technique and confirmation
by polymerase chain reaction (PCR)
Lời nói đầu
TCVN 14389:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề
nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công
bố.
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS LATEROSPORUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC
VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
Fertilizers - Enumeration of Bacillus laterosporus by colony count technique and confirmation
by polymerase chain reaction (PCR)
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Bacillus laterosporus (Brevibacillus laterosporus)
trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch và khẳng định bằng
phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua sự có mặt của gen đặc hiệu cpbA.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp
dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm.
TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu
chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - chuẩn
bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.
3 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau đây:
3.1
Bacillus laterosporus (Bacillus laterosporus)
Brevibacillus laterosporus (Brevibacillus laterosporus)
Vi khuẩn thuộc chi Brevibacillus, có tế bào hình que, di động, đặc trưng bởi việc sản xuất bào tử hình
oval hoặc bầu dục dạng “thể ký sinh hình xuồng” độc đáo gắn vào một bên của bào tử.
Vi khuẩn này có khả năng đối kháng với nhiều loại vi khuẩn/nấm gây bệnh cây trồng, có khả năng
phân hủy các chất thải hữu cơ cải tạo đất và/hoặc sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật.
3.2
Thể ký sinh hình xuồng (Canoe-Shaped Parasporal Body - CSPB)
Thể ký sinh còn được biết đến với hình chữ C (C-shape) đính ở một phía cạnh bào tử; được hình
thành và tồn tại cùng bào tử.
3.3
Gen đặc hiệu cpbA (spore coat-canoe shaped parasporal complex protein A)
Gen mã hóa cho protein cpbA 28 kDa liên quan đến phức hợp spore coat - CSPB (SC-CSPB), gen
mã hoá cho protein này là duy nhất và bảo tồn cao ở các chủng Bacillus laterosporus. Cặp mồi phát
hiện gen cpbA (có kích thước 709 bp) được chứng minh không nhân bản vùng ADN ở các loài
Brevibacillus hay Bacillus khác.
3.4
Định lượng Bacillus laterosporus (Bacillus laterosporus enumeration)
Việc xác định số lượng tế bào vi khuẩn Bacillus laterosporus (3.1) (CFU/g hoặc CFU/mL) trong một
khối lượng hoặc thể tích cụ thể của phân bón vi sinh vật khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn
này.
4 Nguyên tắc
Định lượng Bacillus laterosporus trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm số lượng đơn vị khuẩn
lạc đặc trưng phát triển trên môi trường thạch MYP và được khẳng định thông qua đặc điểm hình thái
tế bào, bào tử và sự có mặt của gen đặc hiệu cpbA (kích thước 709 bp).
5 Môi trường, hóa chất
5.1 Yêu cầu chung
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết chuyên dùng cho phân tích vi sinh vật và theo khuyến cáo của
nhà sản xuất. Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO
11133:2014).
5.2 Nước, nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương để pha chế hoá chất, môi trường nuôi
cấy vi sinh vật [xem TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987)].
5.3 Môi trường thạch mannitol lòng đỏ trứng Polymyxin (thạch MYP)
5.3.1 Môi trường thạch MYP cơ bản
5.3.1.1 Thành phần
Cao thịt bò 1,0 g
Tryptone (pepton từ casein) 10,0 g
D-mannitol (C6H14O6) 10,0 g
Sodium chloride (NaCl) 10,0 g
Đỏ phenol (C19H14O5S) 0,025 g
Thạch 20,0 g
Nước cất 1 000 mL
5.3.1.2 Chuẩn bị:
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 000 mL nước. Phân phối môi
trường với lượng phù hợp vào các bình thủy tinh (6.2.2). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở 121
°C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở
25 °C, dùng máy đo pH (6.1.7).
5.3.2 Dung dịch polymyxin B
5.3.2.1 Thành phần
Polymyxin B sulfate 106 IU
Nước 100 mL
5.3.2.2 Chuẩn bị:
Hòa tan Polymyxin B sulfate trong 100 mL nước và lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 μm (6.2.5) để khử
trùng.
5.3.3 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng
Chọn các quả trứng gà còn nguyên vẹn và rửa sạch vỏ bằng xà phòng. Tráng sạch dưới vòi nước
chảy. Trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2), ngâm ngập trứng trong Etanol 95 % trong 30 s và để khô. Đập
vỡ quả trứng và tách riêng lòng đỏ trứng gà bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ này sang nửa vỏ
còn lại. Cho lòng đỏ vào ống ly tâm 50 mL (6.2.8), bổ sung nước (5.2) đã hấp khử trùng theo thể tích
với tỷ lệ 1:4 và khuấy bằng cách lắc đều theo một chiều, ủ hỗn hợp trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở nhiệt
độ 44 °C đến 47 °C trong 2 h, sau đó để hỗn hợp trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5) ở (4 ± 1) °C trong 18
h đến 24 h để tạo kết tủa. Kết thúc thời gian ủ, thu dung dịch nhũ tương ở phía trên, bảo quản dung
dịch nhũ tương ở nhiệt độ ở (4 ± 1)°C và sử dụng trong vòng 72 h.
5.3.4 Môi trường thạch MYP hoàn chỉnh
5.3.4.1 Thành phần
Môi trường thạch MYP cơ bản (5.3.1) 90,0 mL
Dung dịch polymyxin B (5.3.2) 1,0 mL
Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.3) 10,0 mL
5.3.4.2 Chuẩn bị
Môi trường thạch MYP cơ bản sau khi hấp tiệt trùng (5.3.1) được làm nguội ở nhiệt độ phòng về nhiệt
độ khoảng 44 °C đến 47 °C. Trong thời gian làm nguội môi trường, ủ dung dịch nhũ tương lòng đỏ
trứng (5.3.3) trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C. Sau đó, cho lần lượt các dung
dịch polymyxin B (5.3.2) và dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.3) vào môi trường thạch MYP cơ
bản (5.3.1), trộn đều hỗn hợp. Phân phối lượng khoảng 18 mL đến 20 mL môi trường vào các dĩa
Petri (6.2.3). Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng bằng cách lật úp
các đĩa thạch và ủ trong tủ ấm (6.1.3) ở nhiệt độ 25 °C đến 37 °C trong 20 min đến 25 min. Nếu chưa
dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở (4 ± 1) °C trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5), sử dụng trong vòng
một tuần. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2).
CHÚ THÍCH: Ưu tiên sử dụng các sản phẩm thương mại trong thành phần có sẵn Polymyxin (5.3.2)
và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
5.4 Môi trường Luria-Bertani (LB)
5.4.1 Thành phần
Tryptone (peptone từ casein) 10,0 g
Cao nấm men 5,0 g
Sodium chloride (NaCl) 5,0 g
Thạch 20,0 g
Nước cất 1 000 mL
CHÚ THÍCH: Không bổ sung thạch khi chuẩn bị môi trường LB lỏng, ưu tiên sử dụng các môi trường
thương mại (nếu có).
5.4.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 000 mL nước. Phân phối môi
trường với lượng phù hợp vào các bình thủy tinh (6.2.2). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở
nhiệt độ 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH
là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, dùng máy đo pH (6.1.7). Phân phối lượng khoảng 18 mL đến 20 mL môi trường
vào các đĩa Petri (6.2.3) đã được chuẩn bị. Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước
khi sử dụng bằng cách lật úp các đĩa thạch và ủ trong tủ ám (6.1.3) ở nhiệt độ 25 °C đến 37 °C trong
20 min đến 25 min. Nếu chưa dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở (4 ± 1) °C trong ngăn mát tủ lạnh
(6.1.5), sử dụng trong vòng một tuần. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2).
5.5 Dung dịch pha loãng
5.5.1 Thành phần
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Nước 1 000 mL
5.5.2 Chuẩn bị
Hòa tan sodium chloride trong 1 000 mL nước đựng trong bình thủy, tinh (6.2.2). Phân phối dung dịch
pha loãng, với lượng 90,0 mL vào mỗi bình thủy tinh (6.2.2) và 9,0 mL vào mỗi ống nghiệm (6.2.12).
Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Sai số
cho phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %.
5.6 Hoá chất tách chiết ADN và PCR
Ưu tiên sử dụng các bộ kít thương mại (nếu có) hoặc các quy trình tách chiết ADN hoặc PCR phù
hợp với điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
5.7 Cặp mồi oligonucleotit
Thông tin về trình tự oligonucleotit phát hiện vi khuẩn Bacillus laterosporus được nêu trong Bảng 1.
Bảng 1 -Trình tự oligonucleotit phát hiện vi khuẩn Bacillus laterosporus[5]
Gen Mồi Trình tự oligonucleotit Nồng độ gốc Nhiệt độ
gắn mồi
Kích thước
(bp)
cpbA C28S-F 5’- CTGCTACTAGTTGATCTAAG -3' 10 pmol/μL 57,0 °C 709
C28S-R 5’- CTGATTGGTAGCTTAGGTA -3’ 10 pmol/μL
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016
(ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị
6.1.1 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì nhiệt độ (121 ± 3) °C, tương đương áp suất tối thiểu 101,3
kPa.
6.1.2 Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.
6.1.3 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ (25 đến 37) °C ± 1 °C.
6.1.4 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.
6.1.5 Tủ lạnh, ngăn đông có thể duy trì nhiệt độ ổn định ở (- 20 ± 1) °C và ngăn lạnh duy trì nhiệt độ
ổn định ở (4 ± 1) °C
6.1.6 Máy trộn vortex, có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.
6.1.7 Máy do pH, có bù nhiệt, chính xác đến ± 0,1 đơn vị ở 25 °C.
6.1.8 Cân kỹ thuật, có thể cân chính xác đến 0,01 g.
6.1.9 Kính hiển vi quang học, vật kính có độ phóng đại 4 X, 10 X, 40 X và vật kính dầu 100 X.
6.1.10 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ lên đến (99 ± 1) °C.
6.1.11 Máy ly tâm, có thể vận hành ở gia tốc 13 000 g và điều chỉnh nhiệt độ đến (4 ± 1) °C.
6.1.12 Máy PCR, có khả năng khuếch đại được ADN của mẫu.
6.1.13 Máy quang phổ đo nồng độ ADN, có khả năng đo mẫu vi thể tích (1 μL), bước sóng bao phủ
được 260 nm và 280 nm.
6.1.14 Hệ thống điện di ngang, điện di axit nucleic, có thể điều chỉnh hiệu điện thế, cường độ dòng
điện và thời gian.
6.1.15 Máy chụp ảnh gei điện di, có nguồn sáng tia tử ngoại (UV-light base).
6.1.16 Máy lắc, có thể vận hành liên tục, tốc độ tối đa đạt 300 r/min.
6.2 Dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được tiệt trùng ở điều kiện 121 °C, 15 min, sử
dụng nồi hấp áp lực (6.1.1) và sấy khô bằng tủ sấy (6.1.4), nếu cần, trước khi tiến hành thử nghiệm.
6.2.1 Micropipet, có thể phân phối 0,05 mL ± 0,002 mL, 0,1 mL ± 0,02 mL, 1,0 mL ± 0,02 mL và 10
mL ± 0,2 mL.
6.2.2 Bình cấy hoặc bình thủy tinh, có dung tích thích hợp, có nút đậy kín hoặc nắp vặn thích hợp.
6.2.3 Đĩa Petri, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh không màu, trong suốt, đường kính 90 mm, sâu tối
thiểu là 10 mm.
6.2.4 Đầu hút vô trùng các loại, có khả năng chịu nhiệt.
6.2.5 Màng lọc, bằng xenluloza axetat, cỡ lỗ 0,22 μm.
6.2.6 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc kim loại có thể tiệt trùng.
6.2.7 Que cấy, đầu tròn bằng nhựa hoặc kim loại.
6.2.8 Ống ly tâm, 15 mL và 50 mL, bằng nhựa chịu nhiệt, có vạch chia đến 5 mL.
6.2.9 Lam kính, bằng thủy tinh chịu nhiệt, trong suốt, kích thước 25 × 75 mm, dày 1 mm đến 1,2 mm.
6.2.10 Lamen kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước 22 × 22 mm, dày 0,13 mm đến 0,16 mm.
6.2.11 Đèn cồn, bằng inox hoặc thủy tinh chịu nhiệt.
6.2.12 Ống nghiệm, bằng thủy tinh hoặc nhựa chịu nhiệt, có nắp đậy.
6.2.13 Ống ly tâm, bằng nhựa chịu nhiệt, dung tích 1,5 mL và 2,0 mL, có vạch chia đến 0,5; 1 ; 1,5
và 2,0 mL.
6.2.14 Ống PCR, bằng nhựa chịu nhiệt, thành mỏng, dung tích 0,2 mL.
7 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt
quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
8 Cách tiến hành
8.1 Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng mẫu
Dùng cân kỹ thuật (6.1.8) cân 10 g mẫu hoặc dùng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút
10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.2) chứa 90 mL dung dịch pha loãng (5.5). Trộn đều mẫu trên
máy lắc (6.1.16) cho đến khi đồng nhất, ủ mẫu trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở 80 °C trong 10 min để diệt
các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử. Dung dịch phía trên sau khi phần tử nặng
lắng xuống được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu có độ pha loãng 10-1.
Dùng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống
nghiệm (6.2.12) chứa 9 mL dung dịch pha loãng (5.5). Tránh đầu hút chạm vào dung dịch pha loãng.
Trộn kỹ trên máy trộn vortex (6.1.6) khoảng 10 s, dung dịch thu được có nồng độ 10-2. Lặp lại quy
trình để thu được dung dịch có các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo.
CHÚ THÍCH: Hoạt hóa mẫu (nếu có) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính
xác.
8.2 Cấy và ủ mẫu
Sử dụng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 0,1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ pha
loãng cho vào mỗi đĩa Petri (6.2.3) chứa môi trường thạch MYP (5.3). Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa.
Dùng que dàn mẫu (6.2.6) dàn đều dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt, sử dụng một
que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min để dịch
cấy hấp thụ vào bề mặt thạch.
Lập úp các đĩa đã chuẩn bị và nuôi trong tủ ấm (6.1.3) ở 30 °C trong 24 h đến 48 h. Nếu sau thời gian
trên, các khuẩn lạc chưa hình thành hoặc hình thành nhưng không thể hiện đặc trưng nhận dạng, ủ
đĩa thêm 24 h đến 48 h.
8.3 Đếm và nhận diện khuẩn lạc
Trên môi trường thạch MYP, khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định là các khuẩn lạc có màu hồng
nhạt (không lên men hoặc lên men mannitol yếu) và được bao quanh bởi một vùng kết tủa (cho thấy
hình thành lecithinase); khuẩn lạc kích thước khoảng 2 đến 4 mm, dạng tròn, bờ không đều, mép rìa
hơi lượn sóng, bề mặt hơi lồi ở giữa; vùng kết tủa thường không lan rộng và chỉ bao quanh khuẩn lạc
(xem Hình 1).
CHÚ THÍCH: Trên môi trường thạch MYP, khuẩn lạc của một số vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn
Bacillus cereus (ví dụ Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis) xuất hiện màu sắc, hình dạng tương tự
như Bacillus laterosporus giả định. Các khuẩn lạc này có thể được nhận diện và loại trừ bằng phép
thử khẳng định.
Đếm các khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có
chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.
Khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.
Hình 1 - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử của vi khuẩn Bacillus laterosporus
(A, B) Khuẩn lạc và vòng kết tủa bao quanh khuẩn lạc sau 48 h nuôi cấy trên môi trường thạch
MYP (C) Bào tử sau 96 h; (a) Bào tử sinh dưỡng; (b) Bào tử có gắn thể kí sinh hình xuồng dạng
chữ C.
8.4 Phép thử khẳng định
Từ mỗi đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy ít nhất năm khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định để thực hiện
phép thử khẳng định.
Dùng que cấy đầu tròn (6.2.7) lấy sinh khối các khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định cấy trên đĩa
Petri chứa môi trường LB (5.4), ủ đĩa ở 30 °C trong thời gian nhất định được nêu rõ khi thực hiện các
thử nghiệm trong phép thử khẳng định (xem phụ lục A).
Các kết quả của phép thử khẳng định được nêu trong Bảng 2. Các khuẩn lạc giả định như sau được
xác định là Bacillus laterosporus.
Bảng 2 - Các kết quả của phép thử khẳng định
STT Đặc điểm Phép thử Kết quả Hình
1 Đặc điểm tế
bào, bào tử
Gram Gram dương Xem Hình A.1 Phụ lục A
2 Hình dạng tế
bào
Tế bào hình que, thường xếp đơn lẻ
hoặc theo cặp, ít khi tạo chuỗi, chiều