TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14390:2025
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS COAGULANS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ
KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
Fertilizers - Enumeration of Bacillus coagulans by the colony count technique and
confirmation by polymerase chain reaction (PCR)
Lời nói đầu
TCVN 14390:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề
nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công
bố.
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS COAGULANS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ
KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
Fertilizers - Enumeration of Bacillus coagulans by the colony count technique and
confirmation by polymerase chain reaction (PCR)
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Bacillus coagulans (Lactobacillus sporogenes,
Weizmannia coagulans, Heyndrickxia coagulans) trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn
lạc trên môi trường thạch và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua sự có
mặt của gen đặc hiệu marC hoặc comK.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp
dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm
TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu
chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước. Chuẩn
bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.
3 Thuật ngữ và định nghĩa
Tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau
3.1
Bacillus coagulans (Bacillus coagulans)
Lactobacillus sporogenes (Lactobacillus sporogenes)
Weizmannia coagulans (Weizmannia coagulans)
Heyndrickxia coagulans (Heyndrickxia coagulans)
Là trực khuẩn gram dương, loài mang đặc điểm hình thái và sinh hoá điển hình của cả hai chi Bacillus
và Lactobacillus: sinh bào tử, có khả năng sinh tổng hợp axit lactic.
3.2
Gen đặc hiệu marC (marC specific gene)
Là gen mã cho protein marC, vùng gen này là duy nhất và bảo tồn cao ở loài Bacillus coagulans mà
không hiện diện ở các loài Bacillus khác.
3.3
Gen đặc hiệu comK (comK specific gene)
Là gen mã cho protein comK, vùng gen này là duy nhất và bảo tồn cao ở loài Bacillus coagulans mà
không hiện diện ở các loài Bacillus khác.
3.4
Định lượng Bacillus coagulans (Bacillus coagulans enumeration)
Xác định số lượng tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Bacillus coagulans (3.1) trong một khối lượng
hoặc thể tích cụ thể của mẫu phân bón chứa vi sinh vật được tính bằng đơn vị CFU/g hoặc CFU/mL
khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.
4 Nguyên tắc
Định lượng Bacillus coagualans trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm số lượng đơn vị khuẩn
lạc đặc trưng phát triển trên môi trường thạch MRS được bổ sung 0,5% CaCO3 và được khẳng định
thông qua đặc điểm hình thái tế bào và sự có mặt của gen đặc hiệu marC (kích thước khoảng 990 bp)
hoặc comK (kích thước khoảng 543 bp) bằng kỹ thuật PCR.
CHÚ THÍCH: Tiến hành chạy PCR với 1 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen một gen (marC hoặc comK)
hoặc chạy PCR lần lượt với cả 2 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại cả 2 gen (marC và comK) trong trường
hợp có sự nghi ngờ về kích thước sản phẩm đặc hiệu hoặc có sự không tương thích giữa các khuẩn
lạc có cùng hình thái nhưng kết quả khác về sự có mặt của gen đặc hiệu.
5 Môi trường, hoá chất
5.1 Yêu cầu chung
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết chuyên dùng cho phân tích vi sinh vật và theo khuyến cáo của
nhà sản xuất. Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO
11133:2014).
5.2 Nước, Nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương để pha chế hoá chất, môi trường nuôi
cấy vi sinh vật theo mô tả trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987).
5.3 Môi trường thạch MRS (De Man-Rogosa-Sharpe agar) được bổ sung 0,5 % Calcium
Carbonate (CaCO3)
5.3.1 Thành phần
Lab-Lemco (Cao thịt) 10,0 g
Yeast extract (Cao nấm men) 5,0 g
Peptone 10,0 g
Glucose (C6H12O6) 20,0 g
Polyoxyethylene sorbitan mono-oleate (Tween 80) 1,0 mL
Triammonium citrate (C6H17N3O7) 2,0 g
Sodium acetate (C2H3NaO2) 5,0 g
Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H2O) 0,2 g
Manganese (II) sulphate tetrahydrate (MnSO4.4H2O) 0,05 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 2,0 g
Bổ sung thành phần Calcium carbonate (CaCO3) 5,0 g
Thạch (Agar) 20,0 g
Nước cất 1 000 mL
5.3.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 mL nước. Phân phối môi trường với lượng phù hợp vào bình
thủy tinh (6.2.1) sao cho lượng môi trường phân phối vào không được vượt quá 70 % thể tích thực
của bình. Không vặn chặt nắp bình và khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C. Điều
chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc HCl 1 N sao cho sau khi khử trùng pH môi trường nằm
trong khoảng từ 6,0 đến 6,5 (khoảng pH 6,2 đến 6,6 trước khi khử trùng) ở 25 °C. Làm nguội môi
trường ở nhiệt độ phòng đến 50 °C đến 60 °C. Phân phối môi trường vào các đĩa Petri (6.2.8) với thể
tích 13 mL đến 15 mL trong tủ cấy vô trùng (6.1.1).
CHÚ THÍCH: Cần phải trộn đều môi trường đến khi CaCO3 được phân tán đều trong dịch trước khi
phân phối môi trường vào đĩa Petri.
5.4 Dung dịch pha loãng
5.4.1 Thành phần
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Nước 1 000 mL
5.4.2 Chuẩn bị
Hoà tan sodium chloride trong 1 000 mL nước. Phân phối vào bình thủy tinh với thể tích phù hợp
(6.2.1). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C trong 15 min. Sau
hấp khử trùng bảo quản ở nhiệt độ phòng
5.5 Hoá chất tách chiết ADN và PCR
Có thể sử dụng các bộ kít thương mại (nếu có) hoặc các quy trình tách chiết ADN hoặc PCR phù hợp
với điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
5.6 Các cặp mồi oligonucleotide
Thông tin về trình tự oligonucleotide đặc hiệu phát hiện Bacillus coagulans trong Bảng 1.
Bảng 1 - Trình tự oligonucleotide của mồi đặc hiệu phát hiện Bacillus coagulans[5;6]
Gen Tên mồi Trình tự oligonucleotid (5'-3')
Nồng độ
gốc
(pmol/μL)
Nhiệt độ
gắn mồi
(°C)
Kích thước
(bp)
marC BC1-F ACAGGGCTTTCAGATACCCG 10
60
≈ 990
BC1-R CGGGGATCCGTCCATCAAAA 10
comK BC2-F GAATGCATTATGCAACATGGG 10 ≈ 543
BC2-R CCAGGCTTAAATCCAATACAG 10
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016
(ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị
6.1.1 Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.
6.1.2 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì nhiệt độ (121 ± 3) °C, tương đương áp suất tối thiểu 101,3
kPa.
6.1.3 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.
6.1.4 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ (25 đến 37) °C ± 1 °C.
6.1.5 Lò vi sóng, có dung tích 20 L đến 35 L.
6.1.6 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ nhiệt độ lên đến (99 ± 1) °C.
6.1.7 Máy trộn vortex, có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.
6.1.8 Kính hiển vi quang học, có vật kính 4X, 10X, 40X và vật kính dầu 100X.
6.1.9 Máy đo pH, có bù nhiệt, độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị ở 25°C.
6.1.10 Máy PCR, có khả năng khuếch đại được ADN của mẫu.
6.1.11 Hệ thống máy điện di ngang ADN, có thể điều chỉnh cường độ dòng điện và thời gian.
6.1.12 Máy chụp ảnh gel điện di, có nguồn sáng tia tử ngoại (UV-light base).
6.1.13 Cân kỹ thuật, có thể cân chính xác đến 0,01 g.
6.2 Dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được khử trùng ở điều kiện 121 °C, 15 min, sử
dụng nồi hấp áp lực (6.1.2) và sấy khô bằng tủ sấy (6.1.3), trước khi tiến hành thử nghiệm.
6.2.1 Bình cấy hoặc bình thủy tinh, có dung tích thích hợp, có nút đậy kín hoặc nắp vặn thích hợp.
6.2.2 Cốc thủy tinh, có vạch chia thể tích và dung tích thích hợp.
6.2.3 Ống đong, có vạch chia thể tích và dung tích thích hợp.
6.2.4 Ống falcon, có nắp vặn và dung tích thích hợp.
6.2.5 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc kim loại có thể tiệt trùng.
6.2.6 Micropipet, có thể phân phối 0,05 mL ± 0,002 mL; 0,1 mL ± 0,02 mL; 1,0 mL ± 0,02 mL và 10
mL ± 0,2 mL.
6.2.7 Ống PCR, bằng nhựa chịu nhiệt, thành mỏng, dung tích 0,2 mL.
6.2.8 Đĩa Petri, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh không màu, trong suốt, đường kính 90 mm, sâu tối
thiểu là 10 mm hoặc đĩa có đường kính 200 mm, cao 30 mm.
6.2.9 Lam kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước (25 × 75) mm, dày (1 đến 1,2) mm.
6.2.10 Lamen kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước (22 × 22) mm, dày (0,13 đến 0,16) mm.
6.2.11 Đầu hút vô trùng các loại, có khả năng chịu nhiệt.
6.2.12 Đèn cồn, bằng inox hoặc thủy tinh chịu nhiệt.
6.2.13 Que cấy, bằng nhựa hoặc kim loại, đầu tròn.
7 Lấy mẫu
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt
quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
8 Cách tiến hành
8.1 Pha loãng mẫu thử
Dùng cân kỹ thuật (6.1.13) cân 10 g mẫu hoặc dùng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2,11)
hút 10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.1) chứa 90 mL dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (5.4.2).
Trộn đều mẫu bằng máy trộn vortex (6.1.7) cho đến khi mẫu đồng nhất và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt
(6.1.6) ở 80 °C trong 10 min để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử. Dung
dịch trên sau khi các phần tử nặng lắng xuống được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu có độ pha
loãng 10-1.
Dùng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.11) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống
falcon (6.2.4) hoặc bình thủy tinh (6.2.1) chứa 9 mL dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (5.4.2).Tránh
chạm đầu hút vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ trên máy trộn vortex (6.1.7) khoảng 10 s, dung dịch
thu được có độ pha loãng 10-2. Lặp lại qui trình để thu được dung dịch có các độ pha loãng thập phân
tiếp theo. Mẫu thử nghiệm được tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng phù hợp.
CHÚ THÍCH: Hoạt hoá mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính xác, nếu có.
8.2 Cấy và ủ
Sử dụng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.11) hút 0,1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ pha
loãng cho vào mỗi đĩa Petri (6.2.8) chứa môi trường dinh dưỡng MRS được bổ sung 0,5% CaCO3
(5.3.2). Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa.
Dùng que dàn mẫu (6.2.5) dàn đều dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt. Sử dụng que
dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min để dịch cấy
hấp thụ vào bề mặt thạch.
Lập úp các đĩa đã chuẩn bị và nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở 45 °C trong 36 h đến 48 h. Nếu sau thời gian
trên, các khuẩn lạc chưa hình thành hoặc hình thành nhưng không rõ ràng, ủ đĩa thêm 12 h.
8.3 Đếm và nhận diện khuẩn lạc
Đếm các khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có chứa
từ 10 đến 300 khuẩn lạc.
Trên môi trường MRS được bổ sung 0,5% CaCO3, khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định là các khuẩn
lạc có vòng phân giải CaCO3 (sinh axit lactic phân giải CaCO3 được bổ sung vào trong môi trường
nuôi cấy), khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt trơn có xuất hiện vòng tròn đồng tâm, tâm lồi và mép viền
khuẩn lạc không đều (xem Hình 1).
Khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.
Hình 1 - Hình thái khuẩn lạc Bacillus coagulans trên môi trường MRS dược bổ sung 0,5%
CaCO3 sau 48 h nuôi cấy ở 45 °C; (A) Khuẩn lạc mặt trước; (B) Khuẩn lạc mặt sau.
8.4 Phép thử khẳng định
Từ các đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy ít nhất 05 khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định để thực hiện phép
thử khẳng định.
Dùng que cấy đầu tròn (6.2.13) lấy sinh khối trực tiếp từ các khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định để
thực hiện các phép thử khẳng định (xem phụ lục A).
Các kết quả của phép thử khẳng định được nêu trong Bảng 2. Các khuẩn lạc giả định như sau được
xác định là Bacillus coagulans.
Bảng 2 - Các kết quả của phép thử khẳng định
STT Đặc điểm Phép thử Kết quả Hình
1Đặc điểm tế
bào
Gram Gram dương Xem Hình A.1 Phụ
lục A
Hình dạng tế
bào Tế bào hình que, không tạo chuỗi
2 Gen đặc hiệu Gen marC Dương tính, kích thước khoảng 990 bp Xem Hình A.2 và
A.3 Phụ lục A
Gen comK Dương tính, kích thước khoảng 543 bp
CHÚ THÍCH: Tiến hành chạy PCR với 01 cặp mồi đặc hiệu (khuếch đại gen marC hoặc gen comK)
hoặc tiến hành chạy 2 mỗi lần lượt (khuếch đại gen marC và gen comK) trong trường hợp có sự nghi
ngờ về kích thước sản phẩm đặc hiệu hoặc có sự không tương thích giữa các khuẩn lạc có cùng hình
thái nhưng có kết quả khác nhau về sự có mặt của gen đặc hiệu.
9 Tính và biểu thị kết quả
9.1 Tính số lượng Bacillus coagulans trong mẫu thử
- Số lượng khuẩn lạc Bacillus coagulans, a, trên mỗi đĩa Petri được tính theo công thức (1)
(1)
Trong đó:
blà số lượng khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định cho thấy có đặc điểm như phép thử
khẳng định;
Alà số lượng khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định được lấy để thực hiện phép thử khẳng
định;
Clà tổng số khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định đếm được trên đĩa Petri.
Kết quả được làm tròn đến số nguyên gần nhất.
- Số lượng vi khuẩn Bacillus coagulans, N, trong một đơn vị kiểm tra, được tính bằng đơn vị hình
thành khuẩn lạc trên gam (CFU/g) hoặc trên mililit (CFU/mL), đã được nhận dạng hoặc khẳng định có
trong mẫu thử được tính theo công thức (2):
(2)
Trong đó:
Σa là tổng số khuẩn lạc Bacillus coagulans đếm được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại ở
hai độ pha loãng liên tiếp, a tính được từ Công thức (1):
Vlà thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa Petri, tính bằng mililit (mL);
n1là số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;
n2là số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;
dlà độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất được giữ lại.
Kết quả được làm tròn đến một chữ số sau dấu phẩy. Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá
trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10x, trong đỏ X là số mũ của 10.
9.2 Báo cáo kết quả trong trường hợp đặc biệt
Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN
6404:2016 (ISO 7218:2007).
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:
a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);
c) Phương pháp thử đã sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này;