TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14391:2025
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS MYCOIDES BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ
KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Fertilizers - Enumeration of Bacillus mycoides by colony count technique and confirmation by
polymerase chain reaction and gene sequencing
Lời nói đầu
TCVN 14391:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề
nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công
bố.
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS MYCOIDES BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ
KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Fertilizers - Enumeration of Bacillus mycoides by colony count technique and confirmation by
polymerase chain reaction and gene sequencing
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Bacillus mycoides trong phân bón vi sinh vật bằng
kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch và khẳng định bằng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự
gen.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng
phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm.
TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - chuẩn
bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.
TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu
chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật
3 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
3.1
Bacillus mycoides
Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch MYP, có đặc điểm hình thái đặc trưng
của Bacillus mycoides: khuẩn lạc có màu hồng, bao quanh bởi một vòng kết tủa, bề mặt có dạng sợi
đặc trưng, các sợi này phát triển theo hình xoắn ốc uốn cong theo chiều kim đồng hồ hoặc ngược
chiều kim đồng hồ (thường được gọi là "rhizoid")[4].
3.2
Gen Tuf
Gen Tuf mã hóa yếu tố kéo dài không bền nhiệt (Elongation Factor Thermo unstable - EF-Tu) là một
trong những protein phổ biến nhất ở vi khuẩn, hoạt động như một GTPase thiết yếu, đảm bảo tính
chính xác của quá trình dịch mã thông qua xúc tác cho phản ứng gắn axit amin thích hợp vào chuỗi
polypeptide đang tổng hợp. Sau khi aminoacyl-tRNA gắn vào mRNA, hoạt tính GTPase gây ra sự
thay đổi cấu trúc giúp EF-Tu thoát khỏi ribosome.
3.3
Định lượng Bacillus mycoides (Bacillus mycoides enumeration)
Việc xác định số lượng tế bào vi khuẩn Bacillus mycoides (3.1) (CFU/g hoặc CFU/mL) trong một khối
lượng hoặc thể tích cụ thể của phân bón vi sinh vật khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.
4 Nguyên tắc
Định lượng Bacillus mycoides trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm số lượng đơn vị khuẩn lạc
đặc trưng phát triển trên môi trường thạch MYP và khẳng định thông qua phản ứng chuỗi polymerase
(PCR) kết hợp giải trình tự đoạn gen Tuf (500 bp).
5 Môi trường, hóa chất
5.1 Yêu cầu chung
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết chuyên dùng cho phân tích vi sinh vật và theo khuyến cáo của
nhà sản xuất. Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO
11133:2014).
5.2 Nước, nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương để pha chế hoá chất, môi trường nuôi
cấy vi sinh vật [xem TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987)].
5.3 Môi trường thạch mannitol lòng đỏ trứng Polymyxin (thạch MYP)
5.3.1 Môi trường thạch MYP cơ bản
5.3.1.1 Thành phần
Cao thịt bò 1,0 g
Tryptone (peptone từ casein) 10,0 g
D-mannitol (C6H14O6) 10,0 g
Sodium chloride (NaCl) 10,0 g
Đỏ phenol (C19H14O5S) 0,025 g
Thạch 20,0 g
Nước cất 1 000 mL
5.3.1.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 000 mL nước. Phân phối môi
trường với lượng phù hợp vào các bình thủy tinh (6.2.2). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở 121
°C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Chình pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở
25 °C, dùng máy đo pH (6.1.7).
5.3.2 Dung dịch polymyxin B
5.3.2.1 Thành phần
Polymyxin B sulfate 106 IU
Nước 100 mL
5.3.2.2 Chuẩn bị
Hòa tan Polymyxin B sulfate trong 100 mL nước và lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 μM (6.2.5) để khử
trùng.
5.3.3 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng
Chọn các quả trứng gà còn nguyên vẹn và rửa sạch vỏ bằng xà phòng. Tráng sạch dưới vòi nước
chảy. Trong tủ cấy vi sinh (6.1.2), ngâm ngập trứng trong Etanol 95% trong 30 s và để khô. Đập vỡ
quả trứng và tách riêng lòng đỏ trứng gà bằng cách chuyền lòng đỏ từ nửa vỏ này sang nửa vỏ còn
lại. Cho lòng đỏ vào ống ly tâm 50 mL có vạch chia (6.2.8), bổ sung nước (5.2) đã hấp khử trùng theo
thể tích với tỷ lệ 1:4 và khuấy bằng cách lắc đều theo một chiều, ủ hỗn hợp trong bể ổn nhiệt (6.1.10)
ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C trong 2 h, sau đó để hỗn hợp trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5) ở (4 ± 1) °C
trong 18 h đến 24 h để tạo kết tủa. Kết thúc thời gian ủ, thu dung dịch nhũ tương ở phía trên, bảo
quản dung dịch nhũ tương ở nhiệt độ ủ (4 ± 1) °C và sử dụng trong vòng 72 h.
5.3.4 Môi trường thạch MYP hoàn chỉnh
5.3.4.1 Thành phần
Môi trường MYP cơ bản (5.3.1) 90,0 mL
Dung dịch polymyxin B (5.3.2) 1,0 mL
Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.3) 10,0 mL
5.3.4.2 Chuẩn bị
Môi trường thạch MYP cơ bản sau khi hấp tiệt trùng (5.3.1) được làm nguội ở nhiệt độ phòng đến
nhiệt độ khoảng 44 °C đến 47 °C. Trong thời gian làm nguội môi trường, ủ dung dịch nhũ tương lòng
đỏ trứng (5.3.3) trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C. Sau đó, cho lần lượt các dung
dịch polymyxin B (5.3.2) và dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.3) vào môi trường thạch MYP cơ
bản (5.3.1), trộn đều hỗn hợp. Phân phối các lượng khoảng 18 mL đến 20 mL môi trường vào Các đĩa
Petri (6.2.3). Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng bằng cách lật úp
các đĩa thạch và ủ trong tủ ấm (6.1.3) ở nhiệt độ 25 °C đến 37 °C trong 20 min đến 25 min. Nếu chưa
dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở (4 ± 1) °C trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5), sử dụng trong vòng
một tuần. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2).
CHÚ THÍCH: Ưu tiên sử dụng các sản phẩm thương mại trong thành phần có sẵn Polymyxin (5.3.2)
và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
5.4 Môi trường Luria-Bertani (LB)
5.4.1 Thành phần
Tryptone (peptone từ casein) 10,0 g
Cao nấm men 5,0 g
Sodium chloride (NaCl) 5,0 g
Thạch 20,0 g
Nước cất 1 000 mL
CHÚ THÍCH: Không bổ sung thạch khi chuẩn bị môi trường LB lỏng, ưu tiên sử dụng các môi trường
thương mại (nếu có).
5.4.2 Chuẩn bị
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 000 mL nước. Phân phối môi
trường với lượng phù hợp vào các bình thủy tinh (6.2.2). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở
nhiệt độ 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Chình pH sao cho sau khi khử trùng pH
là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, dùng máy đo pH (6.1.7). Phân phối các lượng khoảng 18 mL đến 20 mL môi
trường vào các đĩa Petri (6.2.3) đã được chuẩn bị. Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch
trước khi sử dụng bằng cách lật úp các đĩa thạch và ủ trong tủ ấm (6.1.3) ở nhiệt độ 25 °C đến 37 °C
trong 20 min đến 25 min. Nếu chưa dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở (4 ± 1) °C trong ngăn mát tủ
lạnh (6.1.5), sử dụng trong vòng một tuần.
5.5 Dung dịch pha loãng
5.5.1 Thành phần
Sodium chloride (NaCl) 8,5 g
Nước 1 000 mL
5.5.2 Chuẩn bị
Hòa tan sodium chloride trong 1 000 mL nước đựng trong bình thủy tinh (6.2.2). Phân phối dung dịch
pha loãng với lượng 90,0 mL vào các bình thủy tinh (6.2.2) và 9,0 mL mỗi ống nghiệm (6.2.12). Không
vặn chặt nắp bình và khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Sai số cho
phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %.
5.6 Hoá chất tách chiết ADN
Ưu tiên sử dụng các bộ kít thương mại (nếu có) hoặc các quy trình tách chiết ADN phù hợp với điều
kiện thực tế của phòng thử nghiệm và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, (có thể tham khảo
hóa chất và phương pháp tách chiết tại phụ lục B).
5.7 Hóa chất cho phản ứng PCR (Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi tổng hợp)
Sử dụng các bộ kit thương mại và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc trộn các thành
phần riêng lẻ của các hãng thương mại theo khuyến cáo của hãng gồm: Đệm phản ứng (buffer),
Magnesium chloride (MgCI2), dung dịch hỗn hợp deoxynucleotide triphosphates (dNTPs; c=2,5 mmol/
L (mỗi loại)), enzyme Taq polymerase.
5.8 Trình tự oligonucleotide
Thông tin về trình tự oligonucleotide để phát hiện Bacillus mycoides được nêu trong Bảng 1.
Bảng 1 - Trình tự oligonucleotide của mồi Tuf2
Tên mồi Trình tự oligonucleotide Nồng độ sử dụng
Trình tự cặp mồi Tuf2 nhân đoạn gen với kích thước khoảng 500 bp
Tuf2-F 5'- AVGGHTCTGCHYTDAAAGC-3' 10 pmol/μL
Tuf2-R 5’- GTDAYRTCHGWWGTACGGA-3' 10 pmol/μL
Trình tự nucleotide của đoạn gen Tuf được chứng minh là trình tự phù hợp để phân biệt Bacillus
mycoides với các loài trong chi Bacillus [2].
5.9 Hóa chất nhuộm Gram
Bộ thuốc nhuộm Gram cho vi khuẩn của các hãng được cung cấp trên thị trường. Tùy thuộc vào điều
kiện thực tế để lựa chọn hóa chất phù hợp và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc làm theo
mô tả trong phụ lục A1.
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016
(ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị
6.1.1 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì nhiệt độ (121 ± 3) °C, tương đương áp suất tối thiểu 101,3
kPa.
6.1.2 Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.
6.1.3 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ (25 đến 37) °C ± 1 °C.
6.1.4 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.
6.1.5 Tủ lạnh, với ngăn đông có thể duy trì nhiệt độ ổn định ở -20 °C ± 1 “C và ngăn lạnh duy trì nhiệt
độ ổn định ở (4 ± 1) °C.
6.1.6 Máy trộn vortex, có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.
6.1.7 Máy đo pH, có bù nhiệt, chính xác đến ±0,1 đơn vị ở 25 °C.
6.1.8 Cân kỹ thuật, cân chính xác đến 0,01 g.
6.1.9 Kính hiển vi quang học, vật kính có độ phóng đại 4 X, 10 X, 40 X và vật kính dầu 100 X.
6.1.10 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ lên đến (99 ± 1) °C.
6.1.11 Máy ly tâm, có thể vận hành ở gia tốc 13 000 g và nhiệt độ đến (4 ± 1) °C.
6.1.12 Máy PCR, có khả năng khuếch đại được ADN của mẫu.
6.1.13 Máy quang phổ đo nồng độ ADN, có khả năng đo mẫu vi thể tích (1 μL), bước sóng bao phủ
được 260 nm và 280 nm.
6.1.14 Hệ thống máy điện di ngang ADN, có thể điều chỉnh cường độ dòng điện, hiệu điện thế và
thời gian.
6.1.15 Máy chụp ảnh gel điện di, có nguồn sáng tia tử ngoại (UV-light base).
6.1.16 Máy lắc, có thể vận hành liên tục, tốc độ tối đa đạt 300 r/min.
6.2 Dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải tiệt trùng ở điều kiện 121 °C, 15 min sử dụng nồi
hấp áp lực (6.1.1) và sấy khô bằng tủ sấy (6.1.4) trước khi tiến hành bất kỳ thử nghiệm nào.
6.2.1 Micropipet, có thể phân phối 0,05 mL ± 0,002 mL, 0,1 mL ± 0,02 mL, 1,0 mL ± 0,02 mL và 10
mL ± 0,2 mL.
6.2.2 Bình cấy hoặc bình thủy tỉnh, có dung tích thích hợp, có nút đậy kín hoặc nắp vặn thích hợp.
6.2.3 Đĩa Petri, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh không màu trong suốt, đường kính 90 mm, chiều sâu
tối thiểu là 10 mm.
6.2.4 Đầu hút vô trùng các loại, có khả năng chịu nhiệt.
6.2.5 Màng lọc, bằng xenluloza axetat, cỡ lỗ 0,22 μM.
6.2.6 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc kim loại có thể tiệt trùng.
6.2.7 Que cấy, đầu tròn bằng nhựa hoặc kim loại.
6.2.8 Ống ly tâm, 15 mL và 50 mL, làm bằng nhựa chịu nhiệt, có vạch chia đến 5 mL.
6.2.9 Lam kính, bằng thủy tinh chịu nhiệt, trong suốt, kích thước 25 × 75 mm, độ dày 1 mm đến 1,2
mm.
6.2.10 Lamen kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước 22 × 22 mm, dày 0,13 mm đến 0,16 mm.
6.2.11 Đèn cồn, làm bằng inox hoặc thủy tinh chịu nhiệt.
6.2.12 Ống nghiệm, bằng thủy tinh hoặc nhựa chịu nhiệt, có nắp đậy.
6.2.13 Ống ly tâm 1,5 mL và 2,0 mL, bằng nhựa chịu nhiệt, có vạch chia đến 0,5; 1,1,5 và 2,0 mL.
6.2.14 Ống PCR, bằng nhựa chịu nhiệt, thành mỏng, dung tích 0,2 mL.
6.2.15 Ống đong nhựa, có vạch chia thể tích 1 L, 500 mL.
7 Lấy mẫu
Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018 [1].
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt
quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
8 Cách tiến hành
8.1 Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng mẫu
Dùng cân kỹ thuật (6.1.8) cân 10 g mẫu hoặc dùng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút
10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.2) chứa 90 mL dung dịch pha loãng (5.5). Trộn đều mẫu trên
máy lắc (6.1.16) cho đến khi đồng nhất mẫu. Dung dịch phía trên sau khi phần tử nặng lắng xuống
được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu có độ pha loãng 10-1.
Dùng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống
nghiệm (6.2.12) chứa 9 mL dung dịch pha loãng (5.5). Tránh đầu hút chạm vào dung dịch pha loãng.
Trộn kỹ trên máy trộn vortex (6.1.6) khoảng 10 s, dung dịch thu được có nồng độ 10-2. Lặp lại qui trình
để thu được dung dịch có các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo.
CHÚ THÍCH: Hoạt hóa mẫu (nếu có) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính
xác.
8.2 Cấy và ủ mẫu
Sử dụng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 0,1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ pha
loãng cho vào mỗi đĩa Petri (6.2.3) chứa môi trường thạch MYP (5.3). Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa.
Dùng que dàn mẫu (6.2.6) dàn đều dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt. Sử dụng một
que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min để dịch
cấy hấp thụ vào bề mặt thạch.
Lật úp các đĩa đã chuẩn bị và nuôi trong tủ ấm (6.1.3) ở 30 °C trong 16-20 h. Nếu sau thời gian trên,
các khuẩn lạc chưa hình thành hoặc hình thành nhưng không thể hiện đặc trưng nhận dạng, ủ đĩa
thêm 24 h đến 36 h.
8.3 Đếm và nhận diện khuẩn lạc
Trên môi trường thạch MYP (5.3), khuẩn lạc Bacillus mycoides giả định là các khuẩn lạc có màu hồng
(không lên men mannitol) và thường được bao quanh bởi một vùng kết tủa (cho tháy hình thành
lecithinase); khuẩn lạc bề mặt có dạng sợi hình rễ cây đặc trưng "rhizoid" (xem Hình 1).
CHÚ THÍCH Trên môi trường thạch MYP, khuẩn lạc của Bacillus pseudomycoides xuất hiện màu sắc,
hình dạng tương tự như Bacillus mycoides giả định. Các khuẩn lạc này có thể được nhận diện và loại
trừ bằng phép thử khẳng định.
Đếm các khuẩn lạc Bacillus mycoides giả định ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có chứa
từ 10 đến 300 khuẩn lạc.
Khuẩn lạc Bacillus mycoides giả định được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.
Hình 1- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bacillus mycoides trên môi trường thạch MYP
(A) Khuẩn lạc Bacillus mycoides trên môi trường thạch MYP sau 20 h ở 30 °C; (B) Khuẩn lạc
Bacillus mycoides và các loài vi khuẩn khác trên môi trường thạch MYP sau 20 h ở 30 °C
8.4 Phép thử khẳng định
Từ mỗi đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy ít nhất năm khuẩn lạc Bacillus mycoides giả định để thực hiện phép
thử khẳng định.
Dùng que cấy (6.2.7) lấy sinh khối các khuẩn lạc Bacillus mycoides giả định cấy trên đĩa Petri chứa
môi trường LB (5.4), ủ đĩa ở 30 °C trong thời gian nhất định được nêu rõ khi thực hiện các thử nghiệm
trong phép thử khẳng định (xem phụ lục A).
Các khuẩn lạc giả định thu được kết quả như trong Bảng 2 được xác định là Bacillus mycoides.
Bảng 2 - Các kết quả của phép thử khẳng định
STT Đặc điểm Phép thử Kết quả Hình
1 Đặc điểm tế bào Gram Gram dương Xem Hình A.1 Phụ