TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14392:2025
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS LICHENIFORMIS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ
KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
Fertilizers - Enumeration of Bacillus licheniformis by colony count technique and confirmation by
polymerase chain reaction (PCR)
Lời nói đầu
TCVN 14332:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề
nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công
bố.
PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS LICHENIFORMIS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ
KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
Fertilizers - Enumeration of Bacillus licheniformis by colony count technique and confirmation
by polymerase chain reaction (PCR)
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Bacillus licheniformis có trong phân bón vi sinh vật
bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase
(PCR) thông qua sự có mặt của gen đặc hiệu.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp
dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6404: 2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật
TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước. Chuẩn
bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy
TCVN 13637:2023 (ISO 21148:2017), Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Hướng dẫn chung về kiểm tra chỉ tiêu vi
sinh vật
3 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
3.1
Bacillus licheniformis
Là trực khuẩn gram dương, có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh và/hoặc tăng hiệu quả
tổng hợp sinh khối của cây trồng, và đặc trưng bởi có khả năng sản sinh nội bào tử. Đây là loài vi
khuẩn có hình thái khuẩn lạc đa dạng như khuẩn lạc có thể có hình tròn với mép khuẩn lạc đều hoặc
không đều, có nếp gấp, chia thùy hoặc có lông; khuẩn lạc có màu trắng kem, bề mặt khuẩn lạc
thường nhăn nheo, gồ ghề với các khối u nổi hoặc giống như lông.
3.2
Mồi đặc hiệu gen gyrA (gyrase subunit A)
gyrA là gen mã hóa cho protein ADN gyrase tiểu phần A có vai trò trong quá trình sao mã của ADN,
đây là gen bảo thủ có mặt ở tất cả các loài vi khuẩn. Gen có sự đa hình cao giữa các nhóm vi khuẩn.
Một vùng của trình tự gen gyrA có sự đa hình cao và phân biệt được các loài thuộc chi Bacillus như
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus licheniformis, Bacillus mojavensis, Bacillus
subtilis, Bacillus subtilis subsp. spizizenii và Bacillus vallismortis. Mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân
vùng bảo thủ của Bacillus licheniformis có kích thước 734 bp và vùng này không có mặt ở các loài
Bacillus khác [3].
3.3
Mồi đặc hiệu gen gyrB (gyrase subunit B)
gyrB là gen mã hóa cho protein ADN gyrase tiều phần B có vai trò trong quá trình sao mã của ADN,
đây là gen bảo thủ có mặt ở tất cả các loài vi khuẩn. Gen có sự da hình cao giữa các nhóm vi khuẩn.
Một vùng của trình tự gen gyrB có sự đa hình cao và phân biệt được các loài thuộc chi Bacillus như
Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus vallismortis, Bacillus sonorensis, Bacillus atrophaeus. Mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân
vùng bảo thủ của Bacillus licheniformis có kích thước 613 bp và vùng này không có mặt ở các loài
Bacillus khác [4].
4 Nguyên tắc
Định lượng Bacillus licheniformis trong phân bón chứa vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm số lượng đơn vị
khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường dinh dưỡng NA và được khẳng định dựa trên hình thái khuẩn lạc,
đặc điểm tế bào và sự có mặt của trình tự gen đặc hiệu (gyrA có kích thước 734 bp) hoặc gyrB có
kích thước 613 bp).
CHÚ THÍCH: Việc phân tích hai trình tự gen đặc hiệu chỉ được được tiến hành khi có sự nghi ngờ về
sản phẩm PCR của trình tự gen đặc hiệu trên mẫu phân tích với sản phẩm PCR trên mẫu đối chứng
dương (kiểm tra trên chủng chuẩn Bacillus licheniformis).
5 Môi trường và hóa chất
5.1 Yêu cầu chung
Các môi trường, hóa chất sử dụng cho nuôi cấy, phản ứng hóa sinh phải đạt chất lượng phân tích và
thích hợp để phân tích vi sinh vật. Hóa chất sử dụng cho tách chiết ADN, chạy phản ứng PCR và điện
di phải đạt chất lượng để phân tích ADN.
5.2 Nước
5.2.1 Nước sử dụng để pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật là nước tinh khiết như nước cất, đã
khử khoáng hoặc loại bỏ ion hoặc nước có chất lượng tương đương theo mô tả trong TCVN
8128:2015.
5.2.2 Nước sử dụng cho phản ứng PCR là nước tinh khiết, không chứa DNAse, RNAse, có bán sẵn
trên thị trường hoặc có chất lượng tương đương.
5.3 Môi trường dinh dưỡng Nutrient agar (NA)
5.3.1 Thành phần
Cao thịt bò (beef extract) 1 g
Cao nấm men (yeast extract) 2 g
Pepton 5 g
Sodium chloride (NaCl) 5 g
Bột thạch (agar) 20 g
Nước cất 1000 mL
pH 7,0 ± 0,2 ở 25 °C
Ghi chú: Ưu tiên sử dụng môi trường pha sẵn. Sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Lưu ý: Môi trường dinh dưỡng NA lỏng là môi trường có thành phần như trên nhưng không bổ sung
bột thạch.
5.3.2 Chuẩn bị môi trường
Để pha 1000 mL môi trường từ các thành phần cơ bản khô, các bước thực hiện như sau:
Cân và hòa tan các thành phần theo tỷ lệ ở mục 5.3.1 trong nước cất. Phân phối môi trường với thể
tích không quá 500 mL vào các bình thủy tinh (6.2.1). Bổ sung agar theo tỷ lệ tương ứng 20 g/1000
mL môi trường. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 °C (6.1.2). Để nguội môi trường đến 50
°C đến 60 °C và phân phối môi trường vào các đĩa Petri (6.2.9) với thể tích 18-20 mL trong tủ cấy vô
trùng (6.1.1). Các đĩa môi trường đã chuẩn bị có thể được sử dụng ngay sau khi khô bề mặt hoặc bảo
quản ở nhiệt độ phòng hoặc để lạnh ở 4 °C. Lưu ý đĩa môi trường bảo quản chỉ được sử dụng khi xác
định không bị tạp nhiễm với nấm và vi khuẩn.
Làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng (đảm bảo không có các giọt nước trên bề mặt môi trường)
bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 30 °C đến 35 °C trong 30 min hoặc
điều chỉnh dựa trên thực tế.
5.4 Dung dịch pha loãng Sodium chloride (NaCl 0,85 %)
Cân và hòa tan 8,5 g NaCl trong 1000 ml nước, pH 7,0 ± 0,2. Phân phối vào bình thủy tinh với thể tích
phù hợp (6.2.1). Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C. Sau hấp khử trùng bảo quản
ở nhiệt độ phòng.
5.5 Hóa chất nhuộm Gram
Bộ thuốc nhuộm Gram cho vi khuẩn của các hãng được cung cấp trên thị trường. Tùy thuộc vào điều
kiện thực tế để lựa chọn hóa chất phù hợp và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoặc làm theo
mô tả trong TCVN 13637:2023 (ISO 21148:2017).
5.6 Hóa chất cho phản ứng PCR (Polymerase chain reaction - Chuỗi phản ứng trùng hợp)
Ưu tiên sử dụng hỗn hợp hóa chất cho phản ứng PCR pha sẵn của các hãng (PCR master mix) hoặc
trộn các thành phần riêng lẻ của các hãng thương mại theo khuyến cáo của hãng (Đệm phản ứng
(buffer), Magnesium chloride (MgCh), dung dịch hỗn hợp deoxynucleotide triphosphates (dNTPs;
c=2,5 mmol/ L (mỗi loại)), enzyme ADN polymerase.
5.7 Các cặp mồi oligonucleotide
Chi tiết của 02 cặp mồi đặc hiệu được nêu trong Bảng 1. Trình tự mồi để nhân đoạn gen gyrA và gyrB
được chứng minh là trình tự đặc hiệu để phân biệt Bacillus licheniformis với các loài trong chi Bacillus
bao gồm Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis,
Bacillus siamensis, Bacillus atrophareus [3][4].
Bảng 1 Trình tự oligonucleotide của mồi đặc hiệu
Tên mồi Trình tự oligonucleotide Nồng độ sử dụng
Trình tự đặc hiệu gyrA với kích thước 734 bp
Blich-gyrA_F 5'-AAGCCGGTGCACAGAAGAATAG-3' 10 pmol/μL
Blich-gyrA_R 5'-TCGATTTTCTTATCGCGCACT-3' 10 pmol/μL
Trình tự đặc hiệu gyrB với kích thước 613 bp
Blich-gyrB_F1 5'-AKACGGAAGTGACGGGAAC-3' 10 pmol/μL
Blich-gyrB_R1 5'-AGAAACTTTTCRAG CGCTT-3' 10 pmol/μL
5.8 Hóa chất điện di ADN
Hóa chất điện di ADN bao gồm dung dịch TAE 1X, agarose và dung dịch nhuộm ADN (ví dụ Redsafe-
lntron hoặc ethidium bromide). Dung dịch TAE 1X có thể sử dụng sản phẩm thương mại hoặc tự
chuẩn bị theo các thành phần 40 mM Tris, 20 mM Acetate và 1 mM EDTA (pH 8.6). Agarose và chất
nhuộm ADN sử dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thang ADN chuẩn kích thước 100 bp sử
dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
Chuẩn bị bản gel agarose 1,5 % với thể tích 100 mL thực hiện như sau:
Cân 1,5 g agarose và đưa vào bình thủy tinh có nắp vặn thể tích 250 mL. Bổ sung 100 mL dung dịch
TAE 1X và vặn lỏng nắp binh. Tiếp đến đun nóng bình bằng lò vi sóng trong 2-3 min đến khi agarose
tan hoàn toàn, dung dịch trong và đồng nhất. Lưu ý; nên dừng lò vi sóng sau mỗi 1 min tránh hiện
tượng trào dung dịch khỏi bình.
Để nguội dung dịch đến 50-55°C và bổ sung chất nhuộm ADN (ethidium bromide/ chất nhuộm huỳnh
quang ADN) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Chuẩn bị khuôn lược của khay điện di để trên mặt
phẳng. Đổ dung dịch nhẹ nhàng vào khuôn, tránh tạo bọt khí. Sau 20-30 min khay gel đông đặc có thể
được sử dụng ngay hoặc bảo quản cùng dung dịch TAE 1X trong điều kiện 4 °C được dùng trong
vòng 7 ngày.
6 Thiết bị, dụng cụ
Có thể sử dụng các dụng cụ dùng một lần thay cho các dụng cụ sử dụng nhiều lần nếu các thông số
kỹ thuật tương tự.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm, vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016
(ISO 7218:2007 with amendment 1:2013)] và cụ thể như sau:
6.1 Thiết bị
6.1.1 Tủ cấy vô trùng, tủ cấy vi sinh, luồng không khí thổi theo chiều dọc.
6.1.2 Nồi hấp áp lực, có nhiệt độ hơi nước bão hòa trong buồng có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121
°C ± 3 °C tương ứng áp suất tối thiểu 101,3 kPa.
6.1.3 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.
6.1.4 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 40 °C.
6.1.5 Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,1 g.
6.1.6 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh tự động về nhiệt độ, độ chính xác đến 1 °C.
6.1.7 Máy trộn vortex, tốc độ lắc đạt 1000 vòng/min, lắc tròn.
6.1.8 Kính hiển vi quang học, có độ phóng đại đến 1000 X.
6.1.9 Máy do pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.
6.1.10 Máy PCR nguyên lý hoạt động dựa trên việc điều chỉnh nhiệt độ của các giếng trong máy từ 4-
115 °C, quá trình gia nhiệt có thể lặp đi lặp lại 30-40 lần, có thể gia nhiệt ở nắp máy lên đến 115 °C.
6.1.11 Hệ thống máy điện di ngang ADN có thể điều chỉnh cường độ dòng điện và thời gian.
6.1.12 Máy soi gel ADN tiêu chuẩn, nguyên lý hoạt động dựa trên việc quan sát ADN được nhuộm
huỳnh quang dưới tia cực tím (UV).
6.1.13 Máy ly tâm cho ống eppendof (1,5-2 ml) có tốc độ quay tối đa 15000 vòng/min.
6.2 Dụng cụ
6.2.1 Bình thủy tinh có nắp vặn, có dung tích thích hợp (100 mL, 250 mL, 500 mL và 1000 mL).
6.2.2 Cốc thủy tinh, có dung tích thích hợp.
6.2.3 Ống dong nhựa có vạch chia thể tích 1 L, 500 mL
6.2.4 Ống falcon vô trùng, có nắp vặn, vô trùng và có dung tích 50 mL.
6.2.5 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.
6.2.6 Micropipet, có dung tích 10 mL, 1 mL, 0,1 mL; sử dụng đầu tip vô trùng.
6.2.7 Ống eppendof (1,5 hoặc 2 mL) làm bằng nhựa, vô trùng, hấp tiệt trùng được, chịu được lực ly
tâm 20000 g.
6.2.8 Ống phản ứng PCR có thể tích 200 μL VÔ trùng, không chứa Dnase hoặc Rnase, không bị
biến dạng khi hấp khử trùng ở 121 °C.
6.2.9 Đĩa Petri, đường kính 90 mm.
6.2.10 Lam kính, bằng thủy tinh.
6.2.11 Lamen, bằng thủy tinh.
7 Cách tiến hành
7.1 Lấy mẫu
Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018 [1] .
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt
quá trình vận chuyển và bảo quản.
Mẫu sau khi được tiếp nhận ở phòng thử nghiệm được bảo quản theo khuyến cáo của nhà sản xuất
nhằm đảm bảo sức sống của các tế bào vi khuẩn trong phân bón.
7.2 Các bước tiến hành
7.2.1. Chuẩn bị mẫu thử
Đối với mẫu phân bón dạng lỏng, lắc đều và dùng pipet (6.2.6) hút 10 mL, chính xác đến 10 μL vào
bình thủy tinh có nắp vặn vô trùng thể tích 250 mL (6.2.1). Đối với mẫu phân bón dạng rắn, cân 10
gam, bằng cân kỹ thuật (6.1.5) cho vào bình thủy tinh có nắp vặn vô trùng thể tích 250 mL (6.2.1). Bổ
sung 90 ml dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % vô trùng, trộn 5-10 min bằng máy trộn vortex (6.1.7) để
thu được độ pha loãng 10-1. Tiếp tục ủ mẫu rồi trộn 5-10 min nếu mẫu chưa đồng nhất. Mẫu sau đó
được đun nóng ở 80 °C trong bể ổn nhiệt (6.1.6) trong 10 min để diệt các tế bào sinh dưỡng của vi
sinh vật khác không có nội bào tử.
Mẫu pha loãng 10-1 được tiếp tục sử dụng để pha loãng ở các nồng độ thấp hơn.
Mẫu phân bón được tiếp tục pha loãng đến 10-2 - 10-8 trong dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % với thể
tích của mỗi nồng độ pha loãng là 10 ml đựng trong ống falcon vô trùng (6.2.4) hoặc bình thủy tinh thể
tích phù hợp (6.2.1). Các mẫu pha loãng sẽ được sử dụng ngay để cấy trải trên môi trường dinh
dưỡng không chọn lọc Nutrient agar.
CHÚ THÍCH 1: đối với một số mẫu phân bón có chất mang là tinh bột thì bỏ qua bước đun nóng ở 80
°C (nhận biết khi đun nóng mẫu, dung dịch sẽ bị hồ hóa).
CHÚ THÍCH 2: Nếu mẫu phân bón có chứa thành phần là phân vô cơ thì mẫu ban đầu nên được pha
loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất tránh vi sinh vật bị phân bón vô cơ làm ảnh hưởng sức sống
của vi khuẩn thử nghiệm. Trong trường hợp đó có thể điều chỉnh lượng phân bón ban đầu trước khi
pha loãng cho phù hợp và thuận tiện cho thao tác.
7.2.2 Cấy và ủ mẫu
Sử dụng pipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng hút 100 μL (0,1 mL) dịch đồng nhất của các mẫu pha loãng
và cấy trải bằng que cấy thủy tinh (6.2.5) trên môi trường dinh dưỡng Nutrient agar, ở mỗi một nồng
độ pha loãng cấy trên 3 đĩa. Sử dụng một que cấy thủy tinh (6.2.5) cho mỗi đĩa Petri.
Sau khi cấy, đĩa được ủ ở điều kiện 35 °C trong 16 - 24 h ở tủ ẩm (6.1.4). Sau thời gian ủ ấm, các
khuẩn lạc phát triển trên bề mặt đĩa thạch. Quá trình nuôi ủ có thể kéo dài đến 36 h để kiểm tra lại số
khuẩn lạc của mỗi nhóm trên đĩa nuôi cấy nồng độ thấp có thay đổi hay không. (2) Sau bước nuôi cấy
trên, đĩa petri nồng độ thấp có thể giữ ở điều kiện 25 °C từ 20 h đến 24 h để các vân trên bề mặt
khuẩn lạc phát triển rõ ràng của từng nhóm (nếu cần thiết).
7.2.3 Xác định nhóm vi khuẩn Bacillus licheniformis giả định và đếm khuẩn lạc
Lựa chọn các khuẩn lạc có hình thái của chi Bacillus sp. (là khuẩn lạc màu trắng đục hoặc trắng sữa,
bề mặt gồ ghề, có thể có nếp gấp, chia thùy, có vân hoặc không vân) và phân nhóm Bacillus
licheniformis giả định dựa trên sự tương đồng về hình thái.
CHÚ THÍCH: Trên môi trường không chọn lọc NA, khuẩn lạc của các loài thuộc chi Bacillus thường có
màu sắc, hình thái tương tự như Bacillus licheniformis nên thường được xếp vào nhóm Bacillus
lichenlformis giả định. Các nhóm khuẩn lạc này có thể được nhận diện và loại trừ bằng phép thử
khẳng định.
Đếm số khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp của mỗi nhóm Bacillus
licheniformis giả định (theo mục 8.1). Bacillus licheniformis giả định sẽ được khẳng định thông qua
phép thử khẳng định
7.2.4 Phép thử khẳng định
Từ mỗi nhóm Bacillus licheniformis giả định, lấy ít nhất năm khuẩn lạc để thực hiện phép thử khẳng
định.
Các nhóm khuẩn lạc giả định thu được kết quả như trong Bảng 2 được xác định là Bacillus
lichenirformis
Bảng 2 - Các kết quả của phép thử khẳng định
STT Đặc điểm Phép thử Kết quả Hình
1
Đặc điểm tế bào
Hình thái tế bào Tế bào hình que Xem hình A.2 Phụ
lục A
2 Nhuộm gram Gram dương Xem hình A.2 Phụ
lục A
3 Gen đặc hiệu
Gen đặc hiệu gyrA hoặc
gyrB bằng phương
pháp PCR
Dương tính với gen gyrA,
kích thước 734 bp hoặc
dương tính với gen gyrB,
kích thước 613 bp
Xem hình A.3 và
A.4 Phụ lục A
Tiến hành nhuộm Gram theo mô tả trong 13637:2023 (ISO 21148:2017). Hiển thị kết quả dưới kính
hiển vi quang học (6.1.8). Vi khuẩn Bacillus licheniformis là vi khuẩn gram (+) sẽ bắt màu tím hoặc
xanh.
Quá trình khẳng định vi khuẩn Bacillus licheniformis bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu cho
gen đặc hiệu được tiến hành như sau:
Lựa chọn 05 khuẩn lạc đơn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm khuẩn lạc Bacillus licheniformis giả định (từ đĩa
của mẫu pha loãng để có nồng độ thấp) để thực hiện phép thử khẳng định. Dùng đầu tip vô trùng lấy
sinh khối Bacillus licheniformis giả định từ quá trình nuôi trong môi trường dinh dưỡng lỏng hoặc trên
đĩa môi trường dinh dưỡng NA để tách chiết ADN .
Quá trình tách chiết ADN của các vi khuẩn Bacillus licheniformis giả định có thể được sử dụng các bộ
hóa chất tách chiết ADN vi khuẩn hoặc sử dụng các kỹ thuật tách chiết khác mà vẫn đảm bảo thu
được ADN đạt chất lượng sử dụng trong phản ứng PCR (nếu phù hợp). (Xem phụ lục A4)
CHÚ THÍCH: Đối với vi khuẩn Bacillus licheniformis, việc sử dụng kỹ thuật PCR khuẩn lạc (không tách
chiết DNA) là không phù hợp do không thu được kết quả ổn định.
Tiến hành chạy PCR trên máy PCR (6.1.10) với một trong hai cặp mồi đặc hiệu cho gen gyrA hoặc
gyrB. Chuẩn bị phản ứng PCR đày đủ các thành phần (xem Bảng 3).
Bảng 3. Thành phần phản ứng.
Thành phần Thể tích (μL)
H2O 7
Mồi xuôi F (10 pmol/μL) 1
Mồi ngược R (10 pmol/μL) 1
Hỗn hợp phản ứng PCR (PCR MasterMix 2X) 10
ADN của khuẩn lạc được tách chiết (10 ng/μL) 1
Tổng thể tích 20
CHÚ THÍCH: Hỗn hợp phản ứng PCR được chuẩn bị theo khuyến cáo của nhà sản xuất khi sử dụng
sản phẩm thương mại khác.