TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14441:2025
THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ K BIỂU THỊ ĐỘ TƯƠI CỦA CÁ -
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Fish and fishery products - Determination of K-value as a freshness index for fish - High
performance liquid chromatographic method (HPLC)
Lời nói đầu
TCVN 14441:2025 được xây dựng trên cơ sở tham khảo JAS 0023:2022 Testing method of K-value
as a freshness index for fish - High performance liquid chromatographic method;
TCVN 14441:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F11 Thủy sản và sản phẩm thủy
sản biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất
lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ K BIỂU THỊ ĐỘ TƯƠI CỦA CÁ -
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Fish and fishery products - Determination of K-value as a freshness index for fish - High
performance liquid chromatographic method (HPLC)
CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không không đề cập đến tất cả các vấn đề về an toàn liên quan
đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn
thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu
chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định chỉ số K biểu thị độ tươi của cá, tính từ hàm lượng
các hợp chất liên quan đến ATP trong cá tươi [giới hạn ở lớp Cá xương (Osteichthyes) và không bao
gồm cá đã rã đông] được đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và
phương pháp thử.
TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức
TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức
TCVN 10505-2 (ISO 8655-2), Dụng cụ đo thể tích có cơ cấu pittông - Phần 2: Pipet pittông
3 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
3.1
Hợp chất liên quan đến ATP (ATP-related compound)
Adenosin 5'-triphosphat (ATP), adenosin 5'-diphosphat (ADP), adenosin 5'-monophosphat (AMP),
inosin 5'-monophosphat (IMP), inosin (HxR) và hypoxanthin (Hx).
3.2
Chỉ số K (K-value)
Tỷ lệ của tổng hàm lượng HxR và Hx với tổng hàm lượng của các hợp chất liên quan đến ATP trong
các mẫu thử, được biểu thị bằng phần trăm [1].
Chú thích: Xem 9.2.3, Công thức (3).
4 Nguyên tắc
Bất hoạt các enzym nội sinh phân hủy các hợp chất liên quan đến ATP và chiết các hợp chất liên
quan đến ATP bằng acid perchloric loãng. Đo hàm lượng của các hợp chất liên quan đến ATP trong
dung dịch mẫu thử bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), với detector hấp thụ tia UV-VIS. Từ các
hàm lượng đó tính chỉ số K [1], [2].
5 Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác.
CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tuân thủ các quy định liên quan đến việc sử
dụng thuốc thử.
5.1 Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).
5.2 Acid perchloric, từ 60,0 % đến 62,0 % phần khối lượng.
5.3 Acid phosphoric, tối thiểu 85,0 % phần khối lượng.
5.4 Natri dihydrophosphat ngậm hai phân tử nước, từ 99,0 % đến 102,0 % phần khối lượng.
5.5 Dinatri hydrophosphat, tối thiểu 99,0 % phần khối lượng.
5.6 Chất chuẩn của các hợp chất liên quan đến ATP, nêu trong Bảng 1. Độ tinh khiết được khẳng
định bằng cách tách các tạp chất (bao gồm cả các hợp chất liên quan đến ATP khác) bằng HPLC. Độ
tinh khiết có thể được khẳng định bởi nhà cung cấp các chất chuẩn hoặc người sử dụng tiêu chuẩn
này.
Bảng 1 - Chất chuẩn của các hợp chất liên quan đến ATP
Hợp chất liên
quan đến ATP Tên các chất chuẩn Số CAS Độ tinh khiết
ATP Muối dinatri adenosin 5'-triphosphat ngậm một
phân tử nước 34369-07-8 ≥ 98 %
ADP Muối monokali adenosin 5'-diphosphat ngậm hai
phân tự nước 72696-48-1 ≥ 95 %
AMP Muối natri adenosin 5'-monophosphat ngậm một
phân tử nước 149022-20-8 ≥ 98 %
IMP Muối dinatri inosin 5'-monophosphat ngậm một
phân tử nước 352195-40-5 ≥ 98 %
HxR Inosin 58-63-9 ≥ 98 %
Hx Hypoxanthin 68-94-0 ≥ 98 %
5.7 Acid perchloric loãng, được chuẩn bị bằng cách cho 40,0 g acid perchloric (5.2) vào 440 ml
nước.
5.8 Dung dịch natri hydroxide, có nồng độ trong khoảng từ 1 mol/L đến 5 mol/L trong nước, có thể
sử dụng dung dịch natri hydroxide bán sẵn có cùng nồng độ.
5.9 Acid chlorhydric loãng, có nồng độ khoảng 1 mol/L trong nước. Có thể sử dụng acid chlorhydric
loãng bán sẵn có cùng nồng độ.
5.10 Dung dịch đệm phosphat
5.10.1 Dung dịch đệm phosphat 0,25 mol/L (pH 7,0)
Chuẩn bị dung dịch dinatri hydrophosphat 0,25 mol/L bằng cách pha loãng dinatri hydrophosphat (5.5)
trong nước. Chuẩn bị dung dịch natri dihydrophosphat 0,25 mol/L bằng cách pha loãng natri
dihydrophosphat ngậm hai phân tử nước (5.4) trong nước. Cho dung dịch natri dihydrophosphat 0,25
mol/L vào dung dịch dinatri hydrophosphat 0,25 mol/L đến khi hỗn hợp đạt pH 7,0.
CHÚ THÍCH: Sử dụng dung dịch đệm này trong trường hợp dùng cột silica gel nêu trong 6.1.2 a).
5.10.2 Dung dịch đệm phosphat 0,05 mol/L (pH 7,0)
Chuẩn bị dung dịch dinatri hydrophosphat 0,05 mol/L bằng cách pha loãng dinatri hydrophosphat (5.5)
trong nước. Chuẩn bị dung dịch natri dihydrophosphat 0,05 mol/L bằng cách pha loãng natri
dihydrophosphat ngậm hai phân tử nước (5.4) trong nước. Cho dung dịch natri dihydrophosphat 0,05
mol/L vào dung dịch dinatri hydrophosphat 0,05 mol/L đến khi hỗn hợp đạt pH 7,0.
5.10.3 Dung dịch đệm phosphat 1 mol/L (pH 2,9)
Chuẩn bị dung dịch natri dihydrophosphat 1 mol/L bằng cách pha loãng natri dihydrophosphat ngậm
hai phân tử nước (5.4) trong nước. Chuẩn bị dung dịch acid phosphoric 1 mol/L bằng cách pha loãng
acid phosphoric (5.3) trong nước. Cho dung dịch acid phosphoric 1 mol/L vào dung dịch natri
dihydrophosphat 1 mol/L đến khi hỗn hợp đạt pH 2,9.
CHÚ THÍCH: sử dụng dung dịch đệm này trong trường hợp dùng cột polyme nêu trong 6.1.2 b).
5.10.4 Dung dịch đệm phosphat 0,2 mol/L (pH 2,9)
Chuẩn bị dung dịch natri dihydrophosphat 0,2 mol/L bằng cách pha loãng natri dihydrophosphat ngậm
hai phân tử nước (5.4) trong nước. Chuẩn bị dung dịch acid phosphoric 0,2 mol/L bằng cách pha
loãng acid phosphoric (5.3) trong nước. Cho dung dịch acid phosphoric 0,2 mol/L vào dung dịch natri
dihydrophosphat 0,2 mol/L đến khi hỗn hợp đạt pH 2,9.
CHÚ THÍCH: sử dụng dung dịch đệm này trong trường hợp dùng cột polyme nêu trong 6.1.2 b).
5.11 Dung dịch chuẩn gốc của các hợp chất liên quan đến ATP
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc ATP, ADP, AMP, IMP, HxR và Hx, bằng cách thêm từng chất
chuẩn của các hợp chất liên quan đến ATP nêu trong 5.6 vào nước đến nồng độ khoảng 5 mmol/L.
Trong đó, dung dịch chuẩn gốc Hx có thể được chuẩn bị bằng cách thêm hypoxanthin vào nước đã
được gia nhiệt đến nhiệt độ khoảng 70 °C và để nguội.
CHÚ THÍCH: Hypoxanthin khó hòa tan trong nước nguội ở nồng độ nêu trên.
5.12 Dung dịch chuẩn
5.12.1 Dung dịch chuẩn dùng để đo độ hấp thụ
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ATP, ADP, AMP, IMP, HxR và Hx để đo độ hấp thụ bằng cách sử dụng
pipet một mức (6.5) hoặc pipet pittông (6.6) và bình định mức một vạch (6.4). Pha loãng 100 lần từng
dung dịch chuẩn gốc của các hợp chất liên quan đến ATP bằng dung dịch đệm phosphat 0,05 mol/L
(pH 7,0) (xem 5.10.2).
Cài đặt và vận hành thiết bị đo quang phổ (xem 6.2) theo hướng dẫn của nhà sần xuất. Đo độ hấp thụ
của các dung dịch chuẩn dùng để đo độ hấp thụ ở các bước sóng nêu trong Bảng 2, sử dụng dung
dịch đệm phosphat 0,05 mol/L (pH 7,0) (5.10.2) làm chuẩn. Nồng độ của hợp chất X liên quan đến
ATP trong mỗi dung dịch chuẩn gốc, cx,std, được tính bằng Công thức (1):
(1)
Trong đó:
cX, std là nồng độ của hợp chất X liên quan đến ATP trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng
micromol trên lít (μmol/L);
A(λx)là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn hợp chất X liên quan đến ATP dùng để đo độ hấp thụ,
xác định được ở các bước sóng λx nêu trong Bảng 2;
εxlà hệ số hấp thụ mol của hợp chất X liên quan đến ATP, tính bằng mol-1 L cm-1 (xem Bảng
2);
llà chiều dài đường quang của cuvet hấp thụ (xem 6.3), tính bằng centimet (cm);
V1là dung tích bình định mức đã dùng, tính bằng mililit (ml);
V2là thể tích dung dịch chuẩn gốc đã dùng, tính bằng mililit (ml).
Bảng 2 - Bước sóng đo và hệ số hấp thụ mol của các hợp chất liên quan đến ATP [3]
Hợp chất liên quan đến ATP Bước sóng đo
(nm)
Hệ số hấp thụ mol
(mol-1 L cm -1)
ATP 259 15 400
ADP 259 15 400
AMP 259 15 400
IMP 249 12 700
HxR 249 12 300
Hx 250 10 700
CHÚ THÍCH: Kết quả nghiên cứu về hệ số hấp thụ mol của HxR ở pH 7,0 được nêu trong Phụ lục A.
5.12.2 Dãy dung dịch chuẩn làm việc
Sử dụng pipet một mức (6.5) hoặc pipet pittông (6.6), lấy các dung dịch chuẩn gốc ATP, ADP, AMP,
IMP, HxR và Hx vào bình định mức một vạch (6.4) và thêm nước đến vạch. Sử dụng hỗn hợp này làm
hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc làm việc. Tùy thuộc vào loại cột nêu trong 6.1.2, chuẩn bị dãy các dung
dịch chuẩn làm việc có nồng độ bằng hoặc lớn hơn 4 mức từ hỗn hợp dung dịch chuẩn gốc làm việc
theo một trong các bước sau.
a) Trường hợp sử dụng cột silica gel: Dùng pipet một mức hoặc pipet pittông pha loãng hỗn hợp dung
dịch chuẩn gốc làm việc bằng nước. Trộn 4 phần thể tích dung dịch pha loãng này với 1 phần thể tích
dung dịch đệm phosphat 0,25 mol/L (pH 7,0) (xem 5.10.1) để chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc.
b) Trường hợp sử dụng cột polyme: Dùng pipet một mức hoặc pipet pittông pha loãng hỗn hợp dung
dịch chuẩn gốc làm việc bằng nước. Trộn 4 phần thể tích dung dịch pha loãng này với 1 phần thể tích
dung dịch đệm phosphat 1 mol/L (pH 2,9) (xem 5.10.3) để chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc.
CHÚ THÍCH: Các dung dịch chuẩn làm việc bền trong ít nhất 7 ngày khi được bảo quản ở 10 °C.
6 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể sau:
6.1 Hệ thống HPLC
6.1.1 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), có gắn bơm cấp chất lỏng, khoang cột (lò cột)
kiểm soát được nhiệt độ, detector UV-VIS cài đặt ở bước sóng 260 nm và hệ thống thu thập/tích phân
dữ liệu. Thiết bị có buồng khử khí ở bộ phận cấp pha động và hệ thống làm mát ở bộ bơm mẫu.
6.1.2 Cột, silica gel hoặc polyme có đặc tính sao cho các pic của hợp chất liên quan đến ATP xuất
hiện trong vòng 60 min và độ phân giải bằng hoặc cao hơn 1,5 khi đo nồng độ tối thiểu của dãy dung
dịch chuẩn làm việc theo 8.6. Khi sử dụng cột bảo vệ, chọn cột có cùng vật liệu nhồi như cột dùng để
đo. Các thông số kỹ thuật được đưa ra trong a) và b) là có sẵn.
a) Cột silica gel:
- vật liệu nhồi: silica gel được gắn nhóm adamantyl;
- vật liệu ống sắc ký: thép không gỉ;
- chiều dài: 250 mm;
- đường kính trong: 4,6 mm;
- cỡ hạt hình cầu: 5 pm.
CHÚ THÍCH: Một số cột silica gel gắn nhóm octadecyl cho thấy các pic của HxR hoặc Hx trùng với
các pic của tạp chất khi đo dung dịch mẫu và chỉ số K tính được cao hơn giá trị thực.
b) Cột polyme:
- vật liệu nhồi: gel polyvinyl alcol có cỡ hạt 40 nm;
- vật liệu ống sắc ký: thép không gỉ;
- chiều dài: 300 mm;
- đường kính trong: 7,5 mm;
- cỡ hạt hình cầu: 6 μm.
6.2 Thiết bị đo quang phổ, có thể đo ở các bước sóng 249 nm, 250 nm và 259 nm, có thể chứa các
cuvet có chiều dài đường quang 1 cm.
6.3 Cuvet, bằng thủy tinh thạch anh, chiều dài đường quang 1 cm.
6.4 Bình định mức một vạch, có độ chính xác tương đương hoặc cao hơn loại A của TCVN 7153
(ISO 1042), có dải thể tích bao phủ dải thể tích của quá trình chuẩn bị dung dịch.
6.5 Pipet một mức, có độ chính xác tương đương hoặc cao hơn loại A của TCVN 7151 (ISO 648).
6.6 Pipet pittông, thích hợp để pha loãng các dung dịch chuẩn, v.v..., theo TCVN 10505-2 (ISO
8655-2).
6.7 Bình chiết, có thể dùng cho quá trình chiết (xem 8.2) và bền với các dung dịch được sử dụng.
6.8 Màng lọc, bằng polytetrafluoroethylen (PTFE) ưa nước, thích hợp dùng cho dung dịch có tính
acid, cỡ lỗ nhỏ hơn hoặc bằng 0,45 μm. Bộ lọc và vỏ bọc ngoài phải là một khối và vật liệu vỏ phải
bền với dung dịch có tính acid, có thể sử dụng xyranh kèm theo.
6.9 Cân phân tích điện tử, có thể cân với độ chính xác đến ±10 mg và có thể cân trên 200 g.
6.10 Bộ đồng hóa, có thể khuấy mẫu thử và thuốc thử, đồng thời tạo huyền phù mẫu thử trong thuốc
thử trong quá trình chiết (xem 8.2).
6.11 Máy đo pH.
6.12 Giấy thử pH, có thể xác định từ pH 2,5 đến pH 3,5.
7 Chuẩn bị mẫu thử
Trong trường hợp mẫu thử có đầu, xương, nội tạng, da, vây, v.v..., cần loại bỏ và giữ lại cơ lưng. Loại
bỏ thịt sẫm màu, thu lấy thịt thông thường và đồng hóa bằng máy chế biến thực phẩm v.v... Sử dụng
mẫu đã đồng nhất làm mẫu thử. Tiến hành ngay thao tác nêu trong 8.1. Đối với các mẫu đông lạnh,
tiến hành chuẩn bị mẫu thử ngay sau khi rã đông hoặc rã đông một phần.
8 Cách tiến hành
8.1 Yêu cầu chung
Để tránh phân hủy các hợp chất liên quan đến ATP, làm lạnh mẫu và dịch chiết bằng nước đá và giữ
ở nhiệt độ thấp cho đến khi thực hiện thao tác trong 8.4, ngoại trừ quá trình thao tác thực nghiệm.
8.2 Chiết mẫu
Dùng cân (6.9), cân khoảng 2,0 g mẫu thử (xem Điều 7), chính xác đến 10 mg, cho vào bình chiết
(6.7), thêm acid perchloric loãng (5.7) đã làm lạnh bằng nước đá. Sử dụng bộ đồng hóa (6.10), khuấy
và tạo huyền phù mẫu thử trong acid perchloric loãng. Trong trường hợp huyền phù dính vào bộ đồng
hóa, rửa sạch bằng acid perchloric loãng đã được làm lạnh bằng nước đá và trộn đều cả hai để tạo
thành dịch chiết huyền phù. Tổng lượng acid perchloric loãng được sử dụng là khoảng 30 ml.
8.3 Điều chỉnh pH [4]
8.3.1 Cho dung dịch natri hydroxide vào dịch chiết huyền phù (xem 8.2) và khuấy để chỉnh pH trong
khoảng từ 2,5 đến 3,5. Kiểm tra pH bằng máy đo pH (6.11) hoặc giấy thử pH (6.12). Trong trường
hợp pH vượt quá 3,5, thêm acid chlorhydric loãng để chỉnh pH.
8.3.2 Tráng rửa sạch cặn bằng nước, chuyển toàn bộ dịch chiết huyền phù có pH đã được xác định
(xem 8.3.1) vào bình định mức một vạch (6.4). Thêm nước đến vạch và lắc để trộn đều.
8.3.3 Thu lấy tất cả hoặc một phần dịch chiết trong bình định mức một vạch (xem 8.3.2) và làm lạnh
phần thu được bằng nước đá ít nhất 30 min. Sử dụng dung dịch này làm dịch chiết đã chỉnh pH.
8.4 Loại bỏ protein
Lọc một phần dịch nổi phía trên từ dịch chiết đã chỉnh pH (xem 8.3.3) qua màng lọc (6.8) để thu được
dịch lọc.
8.5 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử
Sử dụng pipet một mức (6.5) hoặc pipet pittông (6.6) trộn 4 phần thể tích dịch lọc (xem 8.4) với 1
phần thể tích dung dịch đệm phosphat dưới đây. Sử dụng dung dịch này làm dung dịch mẫu thử. Sử
dụng một trong các dung dịch sau đây làm dung dịch đệm phosphat:
a) Khi sử dụng cột silica gel: dung dịch đệm phosphat 0,25 mol/L (pH 7,0) (xem 5.10.1);
b) Khi sử dụng cột polyme: Dung dịch đệm phosphat 1 mol/L (pH 2,9) (xem 5.10.3).
CHÚ THÍCH: Các dung dịch mẫu thử bền trong ít nhất 3 ngày khi được bảo quản ở 10 °C.
8.6 Phép đo
8.6.1 Cài đặt điều kiện vận hành
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cài đặt các điều kiện HPLC như sau:
CHÚ THÍCH: Trong trường hợp pha động chứa một lượng lớn ion kali, ion này sẽ phản ứng với ion
perclorat có trong dung dịch mẫu thử và tạo thành kết tủa, gây nhiễu phép đo bằng HPLC. Theo đó,
trong tiêu chuẩn này, sử dụng muối natri để chuẩn bị pha động.
a) Khi sử dụng cột silica gel:
1) Pha động: Dung dịch đệm phosphat 0,05 mol/L (pH 7,0) (xem 5.10.2):
2) Nhiệt độ cột: 40 °C;
3) Bước sóng đo: 260 nm;
4) Thể tích bơm: 10 μl.
b) Khi sử dụng cột polyme:
1) Pha động: Dung dịch đệm phosphat 0,2 mol/L (pH 2,9) (xem 5.10.4);
2) Nhiệt độ cột: 40 °C;
3) Bước sóng đo: 260 nm;
4) Thể tích bơm: 20 μl.
8.6.2 Phân tích HPLC
Ổn định toàn bộ hệ thống bằng cách thích hợp. Khẳng định sự dao động của đường nền không cản
trở việc đo các hợp chất liên quan đến ATP bằng cách chạy một mẫu trắng trong điều kiện quy định
(xem 8.6.1). Sau đó bơm một dãy dung dịch chuẩn làm việc và dung dịch mẫu thử (xem 8.5) lên cột.
Thứ tự bơm ngẫu nhiên.
8.6.3 Định danh
Định danh các pic riêng lẻ của các hợp chất liên quan đến ATP trong sắc ký đồ mẫu thử bằng cách so
sánh thời gian lưu của mẫu thử với thời gian lưu thu được từ các dung dịch chuẩn trong cùng điều
