TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14444:2025
BS EN 14526:2017
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ NHÓM SAXITOXIN TRONG NHUYỄN THỂ CÓ VỎ - PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ TẠO DẪN XUẤT TRƯỚC CỘT VÀ OXY HÓA
BẰNG PEROXIDE HOẶC PERIODAT
Foodstuffs - Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish - HPLC method using pre-
column derivatization with peroxide or periodate oxidation
Lời nói đầu
TCVN 14444:2025 hoàn toàn tương đương với BS EN 14526:2017;
TCVN 14444:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F11 Thủy sản và sản phẩm thủy
sản biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất
lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Lời giới thiệu
Độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể có vỏ (PSP) là dẫn xuất của saxitoxin. Các độc tố này được phát
hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ăn lọc ở nhiều nơi trên thế giới. Ngộ độc độc tố gây liệt cơ trong
nhuyễn thể có vỏ đặc trưng bởi các triệu chứng khác nhau, từ cảm giác ngứa ran nhẹ hoặc tê quanh
môi đến tê liệt hô hấp dẫn đến tử vong. Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp phân tích định lượng các
độc tố PSP này bằng cách chiết từ thịt nhuyễn thể có vỏ, sau đó làm sạch và tách bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang (FLD).
THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ NHÓM SAXITOXIN TRONG NHUYỄN THỂ CÓ VỎ - PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ TẠO DẪN XUẤT TRƯỚC CỘT VÀ OXY HÓA
BẰNG PEROXIDE HOẶC PERIODAT
Foodstuffs - Determination of saxitoxin-group toxins in shellfish - HPLC method using pre-
column derivatization with peroxide or periodate oxidation
CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao
tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến tất cả các vấn đề về an toàn liên quan trong
việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích
hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp [1] để định lượng saxitoxin (STX), decarbamoyl saxitoxin
(dcSTX), neosaxitoxin (NEO), decarbamoyl neosaxitoxin (dcNEO), gonyautoxin 1 và 4 (GTX1,4; tổng
các đồng phân), gonyautoxin 2 và 3 (GTX2,3; tổng các đồng phân), gonyautoxin 5 (GTX5 còn được
gọi là B1), gonyautoxin 6 (GTX6 còn được gọi là B2), decarbamoyl gonyautoxin 2 và 3 (dcGTX2,3;
tổng số đồng phân), N-sulfocarbamoyl-gonyautoxin 1 và 2 (C1,2; tổng các đồng phân) và N-
sulfocarbamoyl- gonyautoxin 3 và 4 (C3,4; tổng các đồng phân) [tùy thuộc vào sự sẵn có của các chất
chuẩn được chứng nhận (CRM)] trong vẹm, hàu, sò và nghêu (tươi sống). Thực tế phòng thử nghiệm
cho thấy tiêu chuẩn cũng có thể áp dụng cho các sản phẩm nhuyễn thể có vỏ [2], [3] và nhuyễn thể có
vỏ đã nấu chín khác. Phương pháp này đã được xác nhận giá trị sử dụng trong nghiên cứu liên phòng
thử nghiệm [4], [5] và cũng đã được kiểm tra xác nhận trong phép thử hiệu năng EURL nhằm thử
nghiệm tổng độc tính của các mẫu thử [6], Các độc tố không có sẵn trong nghiên cứu liên phòng thử
nghiệm đầu tiên [4], [5] như dcGTX2,3 và dcNEO được xác nhận giá trị sử dụng trong hai nghiên cứu
liên phòng thử nghiệm bổ sung [7], [8]. Các mức xác nhận giá trị sử dụng thấp nhất [4], [5], [8], được
tính bằng μg độc tố (dạng base tự do)/kg thịt nhuyễn thể có vỏ và cũng được biểu thị bằng μmol/kg
thịt nhuyễn thể có vỏ, được liệt kê trong Bảng 1.
Bảng 1 - Mức xác nhận giá trị sử dụng thấp nhất
Độc tố μg/kg μmol/kg
Saxitoxin (STX) [5] 22 c0,07 c
Gonyautoxin 2,3 (GTX2,3) [5] 114 b0,29 b
Gonyautoxin 5 (GTX5, B1) [5] 27 c0,07 c
dc-Saxitoxin (dcSTX) [5] 8 c0,03 c
Neosaxitoxin (NEO) [5] 33 c0,10 c
Gonyautoxin 1,4 (GTX1.4) [5] 61,4 c0,15 c
N-Sulfocarbamoyl-gonyautoxin 1,2 (C1,2) [5] 93 c0,20 c
N-Sulfocarbamoyl-gonyautoxin 3,4 (C3,4) [5] 725 b1,48 b
Gonyautoxin 6 (GTX6, B2) Xác định trực tiếp [4] 30 0,08
Xác định gián tiếp [9] 834 b2,11 b
dc-Gonyautoxin 2,3 (dcGTX2,3) [8] 271 a0,77 a
dc-Neosaxitoxin (dcNEO) [8] 594 b2,18 b
a Mức thêm chuẩn thấp nhất, độ thu hồi trung bình: 58 % [8].
b Nồng độ thấp nhất được thử nghiệm.
c Nồng độ thấp nhất được thử nghiệm với giá trị HorRat < 2 [4], [5].
Phép định lượng GTX6 (B2) không được nêu trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đầu tiên nhưng
một số phòng thử nghiệm đã phát hiện trực tiếp độc tố này sau khi chiết pha rắn có làm sạch bằng cột
trao đổi ion (SPE-COOH) và báo cáo nồng độ khối lượng bằng hoặc cao hơn 30 μg/kg trong các mẫu
nhất định. Vì lý do đó, phương pháp hiện tại có thể áp dụng để định lượng trực tiếp GTX6 (B2), tùy
thuộc vào sự sẵn có của chất chuẩn. Hiện tại, có thể xác định GTX6 sau khi thủy phân dịch chiết phân
đoạn 2 của quá trình làm sạch bằng cột SPE-COOH, được mô tả trong 6.4 theo NEO. Định lượng
gián tiếp GTX6 đã được xác nhận giá trị sử dụng trong hai nghiên cứu liên phòng thử nghiệm bổ sung
[7], [8].
Phép xác định định lượng C3,4 đã được nêu trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đầu tiên.
Phương pháp hiện tại có thể áp dụng để định lượng trực tiếp C3,4, tùy thuộc vào sự sẵn có của chất
chuẩn.
Nếu không có sẵn chất chuẩn, chỉ có thể định lượng C3,4 theo GTX1,4, nếu sử dụng cùng một quy
trình thủy phân đối với GTX6 (6.4) thì áp dụng dịch chiết phân đoạn 1 của quá trình làm sạch bằng cột
SPE-COOH, xem [10].
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và
phương pháp thử.
3 Nguyên tắc
CẢNH BÁO - Độc tố PSP là độc tố thần kinh có thể hấp thụ qua đường hô hấp hoặc đường
miệng. Do đó, cần áp dụng các biện pháp bảo vệ thích hợp.
Độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể có vỏ (PSP) được chiết ra sau khi đồng nhất thịt của nhuyễn thể
có vỏ bằng cách gia nhiệt với acid acetic. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được tinh sạch bằng chiết
pha rắn (SPE) sử dụng cột làm sạch C18. Dịch chiết được phân tích bằng HPLC cùng với detector
huỳnh quang sau khi oxy hóa bằng periodat hoặc peroxide. Phần lớn các độc tố (STX, C1,2, GTX5
(B1), dcSTX, GTX2,3 và dcGTX2,3) có thể được định lượng sau khi làm sạch bằng cột SPE-C18[1][1].
Quá trình oxy hóa các độc tố PSP tạo ra một số sản phẩm phản ứng, các sản phẩm này được tách
bằng HPLC pha đảo và phát hiện bằng detector huỳnh quang. Các sản phẩm phản ứng đối với độc tố
PSP thu được sau khi oxy hóa bằng peroxide và periodat được nêu trong Bảng 2. Ngoài ra, các sắc
ký đồ tương ứng được nêu trong Hình 1.
Các gonyautoxin GTX2 và GTX3 cũng như GTX1 và GTX4, các decarbamoyl gonyautoxin dcGTX2 và
dcGTX3, các N-sulfocarbamoyl-gonyautoxin C1 và C2 cũng như C3 và C4 là các đồng phân cấu trúc
và dẫn đến cả hai phương pháp oxy hóa các đồng phân cấu trúc sẽ cho các sản phẩm phản ứng
tương tự. Lượng các đồng phân cấu trúc được xác định bằng tổng của cả hai độc tố.
STX phản ứng với một sản phẩm oxy hóa cụ thể duy nhất không kể đến loại phản ứng oxy hóa (dù là
peroxide hoặc periodat). Điều tương tự cũng đúng với GTX2,3 cũng như GTX5 (B1) và C1,2. Ngược
lại, trong cả hai phản ứng oxy hóa, dcSTX và dcGTX2,3 tạo thành hai sản phẩm oxy hóa khác nhau,
xem Bảng 2. Độc tố dcNEO bị oxy hóa tạo thành hai sản phẩm oxy hóa chỉ với quá trình oxy hóa bằng
periodat. Mỗi độc tố NEO, GTX6 (B2), GTX1,4 và C3,4 tạo ra ba pic sau khi oxy hóa bằng periodat
[1][1] Dữ liệu này dựa trên quy trình được mô tả bởi Lawrence et al. [4] và cũng được công bố trong
AOAC 2005.06 [1].
nhưng chỉ sử dụng pic rửa giải thứ hai để định lượng (không oxy hóa bằng peroxide để định lượng).
Sự xuất hiện đồng thời của các độc tố PSP khác nhau trong nhuyễn thể có vỏ có thể ảnh hưởng đến
các kết quả phân tích, do một số độc tố PSP có thể (một phần) cho các sản phẩm phản ứng tương tự
(xem Bảng 2). Do đó, sắc ký đồ phải được diễn giải cẩn thận sau khi làm sạch trên cột SPE C18.
Bảng 2 - Sản phẩm phản ứng sau khi oxy hóa bằng periodat và peroxide
Độc tố Các sản phẩm oxy hóa
và trình tự rửa giải
HPLC
Cường độ Sản phẩm oxy hóa ở cùng thời gian lưu
peroxide periodat peroxide periodat peroxide periodat
STX một lần một lần ++ + NEO a {3} bNEO {3}: GTX6 (B2) {3}
dc-STX lần một {1} lần một {1} ++ - dcNEO {1}
lần hai {2} lần hai {2} + + NEO a {2} NEO {2}; GTX6 (B2) {2};
dcNEO {2}
NEO không lần một {1} — + GTX6 (B2) {1}
lần hai {2} lần hai {2} - ++ dcSTX {2} GTX6 (B2) {2}; dcSTX {2};
dcNEO {2}
lần ba {3} lần ba {3} - + STX STX; GTX6 (B2) {3}
C1,2 một lần một lần ++ +
C3,4 không lần một{1} — + GTX1,4 {1}
không lần hai {2} — ++ GTX1,4 {2}; dcGTX2,3{2}
không lần ba {3} — + GTX1,4 {3}; GTX2.3
GTX1,4 Không lần một {1} — + C3,4{1}
không lần hai {2} — ++ C3,4 {2}: dcGTX2,3 {2}
lần ba {3} lần ba {3} — ++ GTX2.3 C3,4 {3}; GTX2.3
GTX2.3 một lần một lần ++ ++ GTX1.4 a{3} C3,4{3}; GTX1.4 {3}
GTX5 (B1) một lần một lần ++ -
GTX6
(B2)
không lần một{1} — + NEO {1}
không lần hai {2} — ++ NEO {2}; dcSTX {2}; dcNEO
{2}
không lần ba {3} — - NEO {3}; STX
dcGTX2,3 lần một {1} lần một{1} ++ +
lần hai {2} lần hai {2} + ++ C3,4{2}; GTX1,4 {2}
dcNEO lần một {1} lần một{1} - ++ dcSTX {1}
lần hai {2} lần hai {2} - + dcSTX {2} dcSTX {2}: NEO {2}: GTX6
(B2) {2}
Cường độ: — không phát hiện
- rất thấp
+ thấp
++ cao
a Nồng độ cao của độc tố được chỉ định có thể ảnh hưởng đến việc định lượng bằng cách mô phòng
hàm lượng tăng.
b Các số trong ngoặc nhọn là thứ tự rửa giải.
a) Các độc tố không hydroxyl hóa: peroxide b) Các độc tố không hydroxyl hóa: periodat
c) Các độc tố N-hyroxyl hóa: peroxide d) Các độc tố N-hyroxyl hóa: periodat
CHÚ DẪN:
Y: tín hiệu của detector (V)
X: thời gian (phút)
Hình 1 - Sản phẩm phản ứng sau khi tạo dẫn xuất với peroxide và periodat (các pic để định
lượng được đánh dấu bằng mũi tên)
Để định lượng các độc tố N-hydroxyl hóa, cần chiết phân đoạn với làm sạch bằng cột SPE-COOH
(nêu trong Bảng 3) vì các sản phẩm oxy hóa của một số độc tố PSP [NEO và GTX6 (B2), GTX1,4 và
C3,4] là giống hệt nhau. Bước này tách các độc tố PSP thành ba nhóm riêng biệt, cụ thể là các độc tố
C, các độc tố GTX và nhóm saxitoxin bằng cách rửa giải với các pha động có cường độ ion khác
nhau. Các độc tố C rửa giải không bị giữ lại cùng với nước, các độc tố GTX (từ GTX1 đến GTX6 cũng
như dcGTX2 và dcGTX3) rửa giải bằng NaCl 0,05 mol/L trong khi nhóm saxitoxin (STX, NEO, dcNEO
và dc-STX) cần rửa giải bằng NaCl 0,3 mol/L. Các dịch chiết phân đoạn này có thể được phân tích
bằng HPLC sau khi oxy hóa bằng periodat hoặc peroxide
Bảng 3 - Thứ tự rửa giải độc tố sau khi làm sạch bằng cột SPE-COOH
Chiết phân đoạn Dịch rửa giải Rửa giải độc tố
1 Nước C1,2; C3,4
2 NaCl 0,05 mol/L dcGTX2,3; GTX2,3; GTX1.4; GTX5; GTX6 (B2)
3 NaCl 0,3 mol/L dcSTX; STX; NEO; dcNEO
4 Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và dung môi phù hợp dùng cho HPLC-FLD, nếu
không có quy định khác.
Nước phải được chưng cất trong bình thủy tinh hoặc khử khoáng trước khi sử dụng hoặc phải có độ
tinh khiết tương đương theo TCVN 4851 (ISO 3696).
Độ bền của dung dịch phải được xác định bởi phòng thử nghiệm, nếu chưa được quy định.
4.1 Methanol, loại dùng cho HPLC.
4.2 Acetonitril, loại dùng cho HPLC.
4.3 Dung dịch amoni format, nồng độ chất c = 0,3 mol/L
Hòa tan 1,892 g amoni format (tinh thể dạng bột) trong 100 ml nước.
4.4 Acid acetic băng.
4.4.1 Dung dịch acid acetic 1, p ≈ 1 % phần khối lượng
Pha loãng 1 ml acid acetic băng (4.4) bằng nước đến 100 ml.
4.4.2 Dung dịch acid acetic 2, c ≈ 0,1 mol/L
Pha loãng 572 μl acid acetic băng (4.4) bằng nước đến 100 ml.
4.4.3 Dung dịch acid acetic 3, c ≈ 0,1 mmol/L
Pha loãng 100 μl dung dịch acid acetic 2 (4.4.2) bằng nước đến 100 ml.
4.5 Amoni acetat
4.5.1 Dung dịch amoni acetat 1, c = 0,1 mol/L
Hòa tan 0,77 g amoni acetat (4.5) bằng nước đến 100 ml.
4.5.2 Dung dịch amoni acetat 2, c = 0,01 mol/L
Pha loãng 10 ml dung dịch amoni acetat 1 (4.5.1) bằng nước đến 100 ml.
4.6 Natri chloride
4.6.1 Dung dịch natri chloride 1, c = 0,05 mol/L
Hòa tan 0,29 g natri chloride (4.6) bằng nước đến 100 ml.
4.6.2 Dung dịch natri chloride 2, c = 0,3 mol/L
Hòa tan 1,75 g natri chloride (4.6) bằng nước đến 100 ml.
4.7 Acid chlorhydric, c = 1 mol/L.
4.8 Dung dịch dinatri hydrophosphat, c = 0,3 mol/L.
Hòa tan 4,26 g dinatri hydrophosphat trong 100 ml nước hoặc hòa tan 8,04 g dinatri hydrophosphat
ngậm 7 phân tử nước trong 100 ml nước.
4.9 Natri hydroxide
4.9.1 Dung dịch natri hydroxide 1, c = 1 mol/L
Hòa tan 4 g natri hydroxide (4.9) bằng nước đến 100 ml.
4.9.2 Dung dịch natri hydroxide 2, c = 0,2 mol/L
Pha loãng 10 ml dung dịch natri hydroxide 1 (4.9.1) bằng nước đến 50 ml.
4.10 Dung dịch hydro peroxide, w ≈ 10 %
Pha loãng 3 ml dung dịch hydro peroxide có bán sẵn trên thị trường, w = 30 % phần khối lượng bằng
6 ml nước. Chuẩn bị dung dịch mới mỗi ngày. Bảo quản cả hai dung dịch nơi tối ở nhiệt độ khoảng +4
°C.
4.11 Acid periodic
4.11.1 Dung dịch acid periodic 1, c = 0,1 mol/L
Hòa tan 0,227 9 g acid periodic (4.11) trong 10 ml nước.
