Tiªu chuÈn ch¨n nu«i TCVN 7135-
2002
Tiêu chuẩn việt nam TCVN 7135: 2002
Thịt và sản phẩm thịt - Định lượng E.coli -
Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC sử dụng màng lọc
Meat and meat products - Enumeration of Escherichia coli
Colony-count technique at 44oC using membranes
TCVN 7135: 2002 hoàn toàn t ng đng v i ISO 6391: 1997;ươ ươ ớ
TCVN 7135: 2002 do Ban k thu t tiêu chu n TCVN/TC/F8 Th t và s n ph m th t biên so n,ỹ ậ ẩ ị ả ẩ ị ạ
T ng c c tiêu chu n Đo l ng ch t l ng đ ngh , B Khoa h c và Công ngh ban hànhổ ụ ẩ ườ ấ ượ ề ị ộ ọ ệ .
1. Ph m vi áp d ngạ ụ
Tiêu chu n này qui đnh ph ng pháp đnh l ng Escherichia coli có trong t t c các lo iẩ ị ươ ị ượ ấ ả ạ
th t và s n ph m th t, k c th t gia c m. ị ả ẩ ị ể ả ị ầ
Ph ng pháp này cho phép phát hi n Escherichia coli (tip sinh h c 1) và các bi n th khôngươ ệ ọ ế ể
lên men lactoza ho c sinh tr ng k khí (xem tham kh o [1]).ặ ưở ỵ ả
Chú thích 1 - Ph ng pháp này có th không thích h p cho vi c ki m tra th t đã ch bi n có nhi uươ ể ợ ệ ể ị ế ế ề
vi khu n sinh bào t hi u khí.ẩ ử ế
Chú thích 2 - M t s ch ng Eschenchia coli gây b nh có th không phát hi n đc b ng ph ngộ ố ủ ệ ể ệ ượ ằ ươ
pháp này.
2. Tiêu chu n vi n d n ẩ ệ ẫ
TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983), Vi sinh v t h c - H ng d n chung v cách pha chậ ọ ướ ẫ ề ế
các dung d ch pha loãng đ ki m tra vi sinh v t.ị ể ể ậ
TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 :1996), Vi sinh v t trong th c ph m và trong th c ăn gia súc -ậ ự ẩ ứ
Nguyên t c chung v ki m tra vi sinh v t. ắ ề ể ậ
3. Đnh nghĩa ị
Trong tiêu chu n này áp d ng đnh nghĩa sau đây:ẩ ụ ị
3.1. E.coli (Escherichia coli): Vi khu n hình thành các khu n l c indol d ng tính (màu h ng) ẩ ẩ ạ ươ ồ ở
44oC trên màng xelulo axetat đt trên môi tr ng th ch m t trypton d i các đi u ki n quiặ ườ ạ ậ ướ ề ệ
đnh trong tiêu chu n này.ị ẩ
4. Nguyên t cắ
Nhìn chung, vi c phát hi n Escherichia coli c n đn ba giai đo n liên ti p d i đây.ệ ệ ầ ế ạ ế ướ
4.1. H i ph cồ ụ
C y m t l ng qui đnh c a huy n phù ban đu lên màng xenlulo ax tat đc đt trên môiấ ộ ượ ị ủ ề ầ ẹ ượ ặ
tr ng th ch glutamat khoáng c i ti n và nhi t đ 37ườ ạ ả ế ủ ở ệ ộ oC kho ng 4 h.ả
Chú thích - Qui trình này cho phép h i ph c l i các E. Coli b h h i do b o qu n đông l nh, doồ ụ ạ ị ư ạ ả ả ạ
1
Tiªu chuÈn ch¨n nu«i TCVN 7135-
2002
làm khô ho c do các đi u ki n l nh ho c b h h i do x lý nhi t ho c do hoá ch t. Đng th i cũngặ ề ệ ạ ặ ị ư ạ ử ệ ặ ấ ồ ờ
làm gi m n ng đ c a t t c các cacbon hidrat có th lên men n u chúng có m t trong m u th v iả ồ ộ ủ ấ ả ể ế ặ ẫ ử ớ
n ng đ cao, đu có th gây c n tr vi c sinh indol trong giai đo n phân l p ti p theo.ồ ộ ề ể ả ở ệ ạ ậ ế
4.2. Phân l pậ
Chuy n các màng trên môi tr ng th ch glutamat khoáng c i ti n giai đo n h i ph c sangể ườ ạ ả ế ở ạ ồ ụ
môi tr ng th ch m t trypton. ườ ạ ậ ủ nhi t đ 44ở ệ ộ oC trong th i gian t 18 h đn 20 h.ờ ừ ế
4.3. Phát hi nệ
S có m t E. Coli trên màng đc bi u hi n b ng s sinh indol t m i khu n l c.ự ặ ượ ể ệ ằ ự ừ ỗ ẩ ạ
4.4. Tính toán
Tính s l ng E. Coli có trong m t mililit ho c trong m t gam m u t s khu n l c indolố ượ ộ ặ ộ ẫ ừ ố ẩ ạ
d ng tính thu đc trên màng các đ pha loãng đã ch n đ thu đc các k t qu có ýươ ượ ở ộ ọ ể ượ ế ả
nghĩa.
5. D ch pha loãng, môi tr ng nuôi c y và thu c th ị ườ ấ ố ử
5.1. Khái quát
V th c hành t i phòng th nghi m hi n hành, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 721 8).ề ự ạ ử ệ ệ
5.2. D ch pha loãng.ị
Đ chu n b các dung d ch pha loãng, xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887).ể ẩ ị ị
5.3. Môi tr ng h i ph cườ ồ ụ : Th ch glutamat khoáng c i ti n ạ ả ế
5.3.1. Thành ph n.ầ
Natri glutamat 6,35 g
Lactoza 10,0
Natri fomat 0,25 g
L(-)-xystin 0,02 g
Axit L(-) aspactic 0,024 g
L(+)-aginin 0,02 g
Thiamin 0,001 g
Axit nicotinic 0,001 g
Axit pantothenic 0,001 g
Magie sunfat (MgSO4.7H2O) 0,100 g
S t (III) amoni xitrat [t i thi u là 15% Fe (m/m)]ắ ố ể 0,010 g
Canxi clorua (CaCl2.2H2O) 0,010 g
Dikali hidro phosphat 0,90 g
Amoni clorua 12,5 g
Th ch ạ12 g đn 18 gế1)
N cướ 1000 ml
1) Tu vào s c đông c a th ch ỳ ứ ủ ạ
2
Tiªu chuÈn ch¨n nu«i TCVN 7135-
2002
5.3.2. Chu n bẩ ị
Hoà tan amoni clorua trong n c. B sung các thành ph n khác vào và đun sôi. Ch nh pH saoướ ổ ầ ỉ
cho giá tr pH sau khi kh trùng là 6,7 25ị ử ở oC. Chuy n vào m i d ng c ch a thích h p (6.5)ể ỗ ụ ụ ứ ợ
100 ml môi tr ng này và kh trùng trong n i h p áp l c (6.1) nhi t đ 121ườ ử ồ ấ ự ở ệ ộ oC trong 10
phút.
5.3.3. Chu n b các đĩa th ch ẩ ị ạ
Rót vào các đã Petri vô trùng (6.6) t 12 ml đn 15 ml môi tr ng, đã đc làm ngu i đnừ ế ườ ượ ộ ế
47oC trong n i cách thu (6.10), và đ cho đông đc l i. Các đĩa này có th b o qu n trongồ ỷ ể ặ ạ ể ả ả
vòng m t tu n nhi t đ t 0ộ ầ ở ệ ộ ừ oC đn + 5ếoC.
Ngay tr c khi s d ng, làm khô các đĩa th ch này m t cách c n th n [thí d : Đ trongướ ử ụ ạ ộ ẩ ậ ụ ể
bu ng s y ho c t s y (6.4) 50ồ ấ ặ ủ ấ ở oC], t t nh t là m n p và đ m t th ch h ng xu ngố ấ ở ắ ể ặ ạ ướ ố
d i, cho đn khi các gi t n c nh trên m t th ch bi n m t. Không ti p t c làm khô thêm.ướ ế ọ ướ ỏ ặ ạ ế ấ ế ụ
.
Chú thích - Môi tr ng th ch c n đc làm khô đ đ sao cho 1 ml d ch m u c y đc h p thườ ạ ầ ượ ủ ể ị ẫ ấ ượ ấ ụ
hoàn toàn lên màng/ th ch trong vòng 15 phút (xem 9.2.3). ạ
5.4. Môi tr ng ch n l cườ ọ ọ : Th ch m t trypton (Xem tham kh o [3])ạ ậ ả
5.4.1. Thành ph nầ
Trypton (thu phân pepsin c a casein)ỷ ủ 20,0 g1)
Mu i m t (tinh ch )ố ậ ế 1,5 g2)
th ch ạt 12 g đn 18 gừ ế 3)
N cướ 1000 ml
1 ) Nên s d ng các lo i bán s n thu n l i cho vi c hình thành indol. ử ụ ạ ẵ ậ ợ ệ
2) Mu i m t Oxoid No.3 là m t thí d v s n ph m thích h p có bán s n. Thông tinố ậ ộ ụ ề ả ẩ ợ ẵ
này đa ra đ t o thu n ti n cho ng i s d ng tiêu chu n và t ch c Tiêu chu nư ể ạ ậ ệ ườ ử ụ ẩ ổ ứ ẩ
hoá qu c t không n đnh ph i s d ng s n ph m này. ố ế ấ ị ả ử ụ ả ẩ
3) Tu thu c vào s c đông c a th ch.ỳ ộ ứ ủ ạ
5.4.2. Chu n b ẩ ị
Hoà tan các thành ph n trên trong n c và đun đn sôi. Ch nh pH sao cho sau khi kh trùngầ ướ ế ỉ ử
giá tr pH là 7,2 25 ị ở oC. Chuy n t ng l ng 100 ml môi tr ng vào các d ng c ch a thíchể ừ ượ ườ ụ ụ ứ
h p và kh trùng trong n i h p áp l c (6.1) nhi t đ 121ợ ử ồ ấ ự ở ệ ộ oC trong 15 phút.
5.4.3. Chu n b các đĩa th chẩ ị ạ
Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.6) t 12 ml đn 15 ml môi tr ng, đã đc làm ngu i đnừ ế ườ ượ ộ ế
47oC trong n i cách thu (6.10), và đ cho đông đc l i. Các đĩa này có th b o qu n trongồ ỷ ể ặ ạ ể ả ả
vòng 4 ngày nhi t đ t 0ở ệ ộ ừ oC đn + 5ếoC.
Ngay tr c khi s d ng, làm khô các đĩa th ch này m t cách c n th n [thí d : Đ trongướ ử ụ ạ ộ ẩ ậ ụ ể
bu ng s y ho c t s y (6.4) 50ồ ấ ặ ủ ấ ở oC], t t nh t là m n p và đ m t th ch h ng xu ngố ấ ở ắ ể ặ ạ ướ ố
d i, cho đn khi các gi t n c nh trên m t th ch bi n m t. Không ti p t c làm khô thêm.ướ ế ọ ướ ỏ ặ ạ ế ấ ế ụ
5.5. Thu c th phát hi n lndol (Thu c th Vracko và Sherris)ố ử ệ ố ử
5.5.1. Thành ph nầ
ρ - Dimetylaminobenzaldehyt 5 g
A xít clohydric c(HCl) = 1mol/1 100 ml
3
Tiªu chuÈn ch¨n nu«i TCVN 7135-
2002
5.5.2. Chu n bẩ ị
Hoà tan thu c th trong axit clohidric và b o qu n nhi t đ phòng không quá m t tháng.ố ử ả ả ở ệ ộ ộ
6. Thi t b và d ng c thu tinhế ị ụ ụ ỷ
Thi t b thông th ng c a phòng thí nghi m phân tích vi sinh và đc bi t là: ế ị ườ ủ ệ ặ ệ
6.1 Thi t b kh trùng khô (t s y) ho c kh trùng t (n i h p áp l c)ế ị ử ủ ấ ặ ử ướ ồ ấ ự
Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) .
6.2. T mủ ấ , có kh năng duy trì nhi t đ 35ả ệ ộ ở oC ± 1oC ho c 37ặoC ± 1oC.
6.3. T mủ ấ , có kh năng duy trì nhi t đ 44 ả ệ ộ ở oC ± 0,5 oC.
6.4. Bu ng s y ho c t s yồ ấ ặ ủ ấ , đc thông gió b ng đi l u, có kh năng duy trì nhi t đ 50ượ ằ ố ư ả ệ ộ ở oC
± 1oC
6.5. ống nghi mệ, có kích th c 18 mm x 180 mm và bình ho c l có dung tích t 125 ml đnướ ặ ọ ừ ế
300 ml, dùng đ kh trùng và b o qu n môi tr ng nuôi c y.ể ử ả ả ườ ấ
6.6. Đĩa Petri, b ng thu tinh ho c ch t d o, đng kính t 90 mm đn 100 mm.ằ ỷ ặ ấ ẻ ườ ừ ế
6.7. Màng xenlulo axetat, có c l t 0,45 ỡ ỗ ừ µm đn 1 ,2 ếµm và đng kính 85 mm.ườ
6.8. Pipet, đc hi u chu n đ dùng cho vi sinh v t, có dung tích danh đnh 1 ml, đc chia đượ ệ ẩ ể ậ ị ượ ộ
0,1 ml và có đng kính l x t 2 mm đn 3 mm. ườ ỗ ả ừ ế
6.9. Que g tạ, b ng ch t d o ho c b ng thu tinh, thí d : que g t làm b ng đũa thu tinh cóằ ấ ẻ ặ ằ ỷ ụ ạ ằ ỷ
đng kính kho ng 3,5 mm, dài 20 cm, m t đo n đu dài kho ng 3 cm đc u n đ t oườ ả ộ ạ ầ ả ượ ố ể ạ
thành góc vuông và đu mút đc làm nh n.b ng nhi t. ầ ượ ẵ ằ ệ
6.10. N i cách thuồ ỷ, ho c thi t b t ng t , có th duy trì nhi t đ 47 ặ ế ị ươ ự ể ệ ộ ở oC + 0,2 oC.
6.11. Đèn c c tím sóng dài (365 nm),ự đc g n v i b l c thích h p đ lo i b c x UV d i 310ượ ắ ớ ộ ọ ợ ể ạ ứ ạ ướ
nm.
6.12. pH-met, chính xác đn ế± 0,1 đn v pH 25ơ ị ở oC.
7. L y m uấ ẫ
Vi c l y m u không qui đnh trong tiêu chu n này. Nên l y m u theo qui đinh trong TCVNệ ấ ẫ ị ẩ ấ ẫ
4833 - 1 : 2002 (ISO 3100 - 1 [4]).
Đi u quan tr ng là phòng th nghi m nh n đc đúng m u đi di n và không b h h ngề ọ ử ệ ậ ượ ẫ ạ ệ ị ư ỏ
ho c bi n đi trong su t quá trình v n chuy n ho c b o qu n.ặ ế ổ ố ậ ể ặ ả ả
8. Chu n b m u thẩ ị ẫ ử
Chu n b m u th theo tiêu chu n c th thích h p đi v i s n ph m có liên quan. N uẩ ị ẫ ử ẩ ụ ể ợ ố ớ ả ẩ ế
không có tiêu chu n c th thì các bên liên quan c n tho thu n v i nhau v v n đ này.ẩ ụ ể ầ ả ậ ớ ề ấ ề
Ph ng pháp l y m u đc khuy n ngh nêu trong TCVN 4833 - 2 : 2002 (ISO 3100 - 2 [5]).ươ ấ ẫ ượ ế ị
9. Cách ti n hànhế
9.1. Ph n m u th , huy n phù ban đu và d ch pha loãngầ ẫ ử ề ầ ị
Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887) và tiêu chu n c th thích h p liên quan đn s n ph m.ẩ ụ ể ợ ế ả ẩ
9.2. Qui trình h i ph cồ ụ
9.2.1. Dùng b k p vô trùng đt các màng xenlulô axetat (6.7) trong đi u ki n vô trùng lên b m tộ ẹ ặ ề ệ ề ặ
đã khô c a t ng c p hai đã có ch a môi tr ng th ch glutamat khoáng c i ti n (5.3.1), chú ýủ ừ ặ ứ ườ ạ ả ế
tránh t o b t khí d i màng. Dàn ph ng các màng m t cách nh nhàng b ng que g t vôạ ọ ở ướ ẳ ộ ẹ ằ ạ
trùng (6.9).
4
Tiªu chuÈn ch¨n nu«i TCVN 7135-
2002
Dùng pipet vô trùng (6.8) l y 1 ml huy n phù ban đu cho vào chính gi a m i màng. Dùngấ ề ầ ữ ỗ
que g t vô trùng (6.9), dàn đu ph n m u c y lên toàn b b m t c a màng, tránh không đạ ề ầ ẫ ấ ộ ề ặ ủ ể
tràn kh i màng.ỏ
9.2.2. Dùng các pipet vô trùng khác nhau (6.8) đ c y các th tích gi ng nhau c a các d ch có để ấ ể ố ủ ị ộ
pha loãng khác nhau chu n b t huy n phù ban đu lên các màng khác nhau, nh qui đnhẩ ị ừ ề ầ ư ị
trong 9.2.1.
Th i gian t khi chu n b m u th (đi u 8) đn khi c y d ch lên màng không đc v t quáờ ừ ẩ ị ẫ ử ề ế ấ ị ượ ượ
45 phút, tr khi có qui đnh khác trong các tiêu chu n có liên quan.ừ ị ẩ
9.2.3. Đ các đĩa đã nuôi c y trong t th n m ngang nhi t đ phòng kho ng 15 phút cho đnể ấ ư ế ằ ở ệ ộ ả ế
khi ph n m u c y ng p vào trong th ch. ầ ẫ ấ ậ ạ ủ các đĩa petri trong t m (6.2) 35ủ ấ ở oC ho c ặ ở
37oC trong 4 h ± 0,5 h, đ các màng/m t th ch h ng lên trên.ể ặ ạ ướ
9.3. Chuy n sang môi tr ng ch n l cể ườ ọ ọ
9.3.1. Dùng b k p có đu tù vô trùng chuy n các màng, v i ph n m u c y h ng lên trên, t môiộ ẹ ầ ể ớ ầ ẫ ấ ướ ừ
tr ng th ch glutamat khoáng c i bi n (5.3.1) sang môi tr ng th ch m t trypton (5.4).ườ ạ ả ế ườ ạ ậ
Màng m nói trên ph i dính vào m t th ch, tránh t o b t khí. Không s d ng que g t vì sẩ ả ặ ạ ạ ọ ử ụ ạ ẽ
làm phân tán m i khu n l c có m t, làm k t qu đnh l ng cao h n giá tr th c.ọ ẩ ạ ặ ế ả ị ượ ơ ị ự
9.3.2. ủ các đĩa này t 18 h đn 24 h trong t m (6.3) 44ừ ế ủ ấ ở oC, các màng/m t th ch h ng lên trên.ặ ạ ướ
Không ch ng các đĩa lên nhau quá ba chi c. ồ ế
9.4. Phát hi n đc tính tính indol c a các khu n l c trên màngệ ặ ủ ẩ ạ
9.4.1. Ghi nhãn trên n p c a m i đĩa đ nh n bi tắ ủ ỗ ể ậ ế
9.4.2. Dùng pipet l y 2 ml thu c th phát hi n indol (5.5) cho vào n p c a đĩa petri l t ng c, đtấ ố ử ệ ắ ủ ậ ượ ặ
t th n m ngang.ở ư ế ằ
9.4.3. Dùng b k p vô trùng l y màng ra kh i m t th ch t ng ng và cho vào thu c th indol.ộ ẹ ấ ỏ ặ ạ ươ ứ ố ử
N u c n ph i nghiêng n p sao cho t t c b m t c a màng đc th m t b ng thu c thế ầ ả ắ ấ ả ề ặ ủ ượ ấ ướ ằ ố ử
indol. Sau 5 phút, dùng pipet lo i b thu c th còn l i.ạ ỏ ố ử ạ
9.4.4. Đt màng d i đèn c c tím (6.11) trong 30 phút. Các khu n l c indol d ng tính có màuặ ướ ự ẩ ạ ươ
h ng.ồ
9.5. Đm khu n l cế ẩ ạ
Đm các khu n l c indol d ng tính (màu h ng) trên các màng, t t nh t là trên các màng cóế ẩ ạ ươ ồ ố ấ
t 15 khu n l c đn 150 khu n l c màu h ng.ừ ẩ ạ ế ẩ ạ ồ
10. Bi u th k t qu ể ị ế ả
S d ng chu n c sau đây đ xác đnh s l ng E. co li có m t.ử ụ ẩ ứ ể ị ố ượ ặ
10.1. Ph ng pháp tính ươ
10.1.1. N u m t ho c c hai màng l c c a m t đ pha loãng nh t đnh ch a t 15 khu n l c đnế ộ ặ ả ọ ủ ộ ộ ấ ị ứ ừ ẩ ạ ế
150 khu n l c màu h ng, thì tính giá tr trung bình s c a s khu n l c đm đc trênẩ ạ ồ ị ố ủ ố ẩ ạ ế ượ
màng.
Ch gi l i hai ch s có nghĩa, ti n hành nh sau: ỉ ữ ạ ữ ố ế ư
-N u s đó nh h n 100, thì làm tròn đn b i s g n nh t c a 5.ế ố ỏ ơ ế ộ ố ầ ấ ủ
-N u s đó l n h n 100 và k t thúc b ng s 5, thì làm tròn s đó đn b i s g n nh tế ố ớ ơ ế ằ ố ố ế ộ ố ầ ấ
c a 20;ủ
-N u s đó l n h n 100 và t n cùng không ph i là 5, thì làm tròn s đó đn b i s g nế ố ớ ơ ậ ả ố ế ộ ố ầ
nh t c a 10.ấ ủ
5