Xác định gen DREB3 của cây quýt (Citrus clementina) bằng phương pháp in silico

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> XÁC ĐỊNH GEN DREB3 CỦA CÂY QUÝT (Citrus clementina)<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN SILICO<br /> Cao Phi Bằng, Bùi Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ánh<br /> Trường Đại học Hùng Vương<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> DREB3 thuộc về họ gen DREB (dehydration-responsive element binding), họ tác nhân điều hòa<br /> phiên mã có vai trò quan trọng ở thực vật. Trong công trình này, nhờ sử dụng các phương pháp nghiên<br /> cứu in silico, chúng tôi đã xác định được gen DREB3 của cây quýt. CclDREB3 khá giống với các DREB<br /> thuộc phân nhóm A3 của các loài thực vật khác. Gen này có độ dài 1050 pb, mã hóa cho phân tử protein<br /> có kích thước 349 amino acid. Protein CclDREB3 có tính kiềm yếu với giá trị pI bằng 7,10. Mô hình cấu<br /> trúc 3D cho thấy vùng bảo thủ AP2 của CclDREB3 có cấu trúc bậc hai gồm một xoắn α và ba chuỗi β<br /> chạy song song ngược chiều.<br /> Từ khóa: cây quýt, DREB3, đặc điểm hóa - lí, in silico, mô hình 3D, xác định gen.<br /> <br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Cây quýt (Citrus clementina) thuộc họ Cam (Rutaceae), một trong những họ cây ăn quả quan<br /> trọng nhất trên thế giới. Quả của họ Cam có giá trị dinh dưỡng cao và rất giàu vitamin. Diện tích<br /> trồng các cây thuộc họ này ước đạt 8.785.549 ha trên toàn thế giới, sản lượng ước đạt khoảng trên<br /> 131 triệu tấn (FAOSTAT 2012). Ở Việt Nam, sản lượng hàng năm của các cây thuộc họ Cam, quýt<br /> đạt trên dưới 700 nghìn tấn (Thống kê Việt Nam 2012). Do có giá trị cao về kinh tế cũng như dinh<br /> dưỡng, cây quýt được lựa chọn để giải trình tự hệ gen.<br /> DREB nhóm A3 của Arabidopsis, còn được biết đến qua tên gọi ABI4 (protein không mẫn<br /> cảm với ABA-4, ABI4) thuộc họ các tác nhân điều hòa phiên mã DREB. Các protein thuộc họ này<br /> có chứa một vùng gắn ADN tên là AP2 (Apetala 2), vùng này có khả năng tương tác đặc hiệu với<br /> yếu tố DRE (yếu tố trả lời sự mất nước) có trình tự A/GCCGAC trong vùng khởi động của các gen<br /> thực thi. Qua đó hoạt hóa gen thực thi.<br /> Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng ABI4 là các tác nhân chính tham gia vào khả<br /> năng chịu khô hạn và ánh sáng cường độ mạnh ở thực vật. ABI4 được cảm ứng bởi các tác nhân<br /> hữu sinh và vô sinh. Đến lượt mình ABI4 kiểm soát sự biểu hiện các gen liên quan tới sự trả lời với<br /> tín hiệu đường, sự nảy mầm của hạt giống.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới xác định trình tự của gen DREB3 của cây quýt.<br /> Các đặc trưng vật lý và hóa học của các protein, kết quả phân tích cấu trúc và cây phả hệ sẽ được<br /> giới thiệu trong công trình này.<br /> 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Cơ sở dữ liệu<br /> Trình tự hệ gen của cây quýt được lấy từ Wu và nnk. Trình tự DREB3 của cây Arabidopsis<br /> (AtAIB) được lấy từ Sakuma và nnk.<br /> 2.2. Xác định các gen DREB3 ở cây quýt<br /> Protein DREB3 của cây Arabidopsis được dùng làm khuôn dò, chương trình TBLASTN<br /> <br /> 90 KHCN 2 (31) - 2014<br />  KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> được sử dụng để tìm kiếm các gen tương đồng trên dữ liệu hệ gen của cây quýt với giá trị e-value<br /> ở mức e-5.<br /> 2.3. Xác định các motif bảo thủ<br /> Các protein DREB3 của các cây Arabidopsis, cây nho, cây dương, cây lúa và cây quýt được<br /> sắp dãy bằng cách sử dụng phần mềm MEME.<br /> 2.4. Tạo cây phả hệ<br /> Các trình tự protein DREB3 và DREB2 của các cây Arabidopsis, cây nho, cây dương, cây<br /> lúa và DREB3 của cây quýt được sắp dãy bằng cách dùng phần mềm MAFFT [4]. Cây phả hệ<br /> được xây dựng từ các trình tự protein đã sắp dãy nhờ phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp<br /> Maximum Likelihood và tuân theo các tham biến: mẫu Jones-Taylor-Thornton (JTT), dữ liệu được<br /> xử lý là tất cả các vị trí và phương pháp Bootstrap với 1.000 lần lặp lại.<br /> 2.5. Các đặc điểm hóa - lý và cấu trúc không gian<br /> Các đặc điểm vật lí, hóa học của protein nghiên cứu được khảo sát nhờ các phần mềm của<br /> ExPASy.<br /> Cấu trúc không gian của phân tử protein được xây dựng nhờ sử dụng phần mềm Phyre2.<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Xác định gen DREB3 ở cây quýt<br /> Bảng 1. DREB3 của cây quýt và đặc điểm.<br /> Kích thước Kích thước Khối lượng Số lượng<br /> Tên Locus pI<br /> gen (pb) protein (aa) phân tử (kDa) Intron<br /> CclDREB3 Ciclev10033578m 1050 349 37,51 7,10 0<br /> <br /> Chương trình TBLASTN được sử dụng để tìm gen tương đồng trên toàn bộ hệ gen của cây<br /> quýt với khuôn dò là protein AtAIB của cây Arabidopsis (AT2G40220). Bước đầu chúng tôi xác<br /> định được một gen có thể mã hóa cho DREB thuộc nhóm A3 (DREB3) của cây quýt (bảng 1).<br /> Kết quả phân tích motif bảo thủ bằng phần mềm MEME cho thấy, protein suy diễn của gen<br /> này có chứa vùng AP2 (hình 1a) đặc trưng cho các protein cùng họ DREB. Bên cạnh đó, motif KG-<br /> GPxN (hình 1b) đặc trưng cho các DREB thuộc nhóm A2 và A3 cũng có mặt trên protein DREB3.<br /> Trong vùng AP2, amino acid K26 đứng trước motif WLG đặc trưng cho các DREB3. Tương tự,<br /> amino acid R1 cũng được tìm thấy đứng phía trước motif KGGPxN.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Trình tự vùng bảo thủ AP2 và motif KGGPxN được xây dựng từ các gen DREB3 của<br /> các cây Arabidopsis, cây lúa, cây táo, cây nho và cây quýt.<br /> Protein này được dùng làm khuôn để tìm các protein tương đồng ở các loài khác (orthologs)<br /> có trong cơ sở dữ liệu của NCBI, kết quả được trình bày ở bảng 2. Protein suy diễn có độ tương<br /> đồng cao với các DREB thuộc nhóm A3 của nhiều loài thực vật khác, mức độ tương đồng đạt trên<br /> 75%. Phép kiểm tra này cho phép khẳng định gen tìm được là DREB3.<br /> <br /> KHCN 2 (31) - 2014 91<br /> KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> Bảng 2. Các protein tương đồng khác loài gần nhất với các DREB3 của cây quýt<br /> có trong cơ sở dữ liệu của NCBI<br /> Chỉ Chỉ Mức Mức độ<br /> Giá trị Ký hiệu<br /> Miêu tả trên NCBI số cực số độ so tương<br /> E-value Genbank<br /> đại tổng sánh đồng<br /> PREDICTED: ethylene-responsive<br /> transcription factor ABI4-like [Setaria 112 112 18% 2E-26 89% XP_004963859.1<br /> italica]<br /> hypothetical protein<br /> SORBIDRAFT_09g016550 [Sorghum 111 111 18% 2E-26 89% XP_002440922.1<br /> bicolor]<br /> abscisic acid insensitive 4-1 [Genlisea<br /> 120 120 20% 2E-29 88% EPS59065.1<br /> aurea]<br /> Os05g0351200 [Oryza sativa Japonica<br /> 113 113 20% 9E-27 84% NP_001174376.1<br /> Group]<br /> hypothetical protein OsI_19581 [Oryza<br /> 113 113 20% 9E-27 84% EAY97659.1<br /> sativa Indica Group]<br /> hypothetical protein [Oryza sativa Japonica<br /> 113 113 20% 1E-26 84% AAV44075.1<br /> Group]<br /> PREDICTED: ethylene-responsive<br /> 112 112 22% 8E-27 75% XP_008649551.1<br /> transcription factor ABI4 [Zea mays]<br /> PREDICTED: dehydration-responsive<br /> element-binding protein 2F-like [Glycine 113 113 19% 2E-26 75% XP_003535164.2<br /> max]<br /> PREDICTED: dehydration-responsive<br /> element-binding protein 2F-like isoform 110 110 19% 3E-26 75% XP_006575245.1<br /> X2 [Glycine max]<br /> PREDICTED: dehydration-responsive<br /> element-binding protein 2F-like isoform 112 112 19% 3E-26 75% XP_003518110.1<br /> X1 [Glycine max]<br /> 3.2. Đặc điểm của DREB3 của cây quýt<br /> Gen DREB3 của cây quýt là gen mã hóa liên tục, với chiều dài 1050 pb. Protein suy diễn<br /> của nó có kích thước 349 amino acid, tương ứng với khối lượng 37,51 kDa. Protein DREB3 của<br /> cây quýt có tính kiềm yếu, với giá trị pI bằng 7,10 (bảng 1). Những đặc điểm này giống với đặc<br /> điểm của nhiều thành viên thuộc họ DREB của các loài<br /> thực vật khác.<br /> 3.3. Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của<br /> DREB3 của cây quýt<br /> Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của<br /> CclDREB3 được xây dựng nhờ chương trình Phyre2<br /> (hình 2). Kết quả chỉ ra vùng này có ba chuỗi b và một<br /> xoắn a. Cấu trúc xoắn này giống với cấu trúc vùng AP2<br /> của nhiều protein khác trong họ DREB, đảm bảo cho<br /> các DREB có khả năng tương tác với yếu tố cis trong Hình 2: Mô hình 3D cấu trúc bậc hai<br /> vùng AP2 của CclDREB3<br /> promoter của các gen đích.<br /> <br /> 92 KHCN 2 (31) - 2014<br />  KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG<br /> <br /> 3.4. Phân tích cây phả hệ<br /> Cây phả hệ được thiết lập từ các protein DREB2<br /> và DREB3 của cây Arabidopsis, cây lúa, cây dương,<br /> cây nho và DREB3 của cây quýt. Phù hợp với kết quả<br /> về phân tích motif bảo thủ cũng như xếp loại, DREB3<br /> của cây quýt nằm trên cùng nhánh với các DREB3<br /> của các thực vật khác.<br /> 4. KẾT LUẬN<br /> Trong công trình này chúng tôi đã xác định<br /> được một gen DREB3 của cây quýt trong hệ gen của<br /> loài cây này. Gen mã hóa DREB3 mã hóa liên tục, có<br /> chiều dài 1050 pb. Protein suy diễn có chiều dài 349<br /> amino acid. Protein này có độ tương đồng cao với các<br /> DREB thuộc phân nhóm A3 của các thực vật khác.<br /> Hơn nữa, protein này có mang vùng bảo thủ AP2 và<br /> motif KGGPxN và nhiều amino acid đặc trưng cho<br /> DREB thuộc phân nhóm A3. Riêng vùng AP2 có cấu<br /> trúc bậc hai gồm 3 chuỗi b và một xoắn a. Kết quả<br /> Hình 3: Cây phả hệ được xây dựng từ<br /> bước đầu này có ý nghĩa quan trọng, mở đường cho<br /> các DREB2 và DREB3<br /> việc nghiên cứu chức năng của DREB3 ở loài cây này.<br /> Lời cảm ơn<br /> Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ chương trình nghiên cứu khoa học<br /> cơ bản của Trường Đại học Hùng Vương.<br /> Tài liệu tham khảo<br /> 1. Bailey TL, Williams N, Misleh C, Li WW. 2006. MEME: discovering and analyzing<br /> DNA and protein sequence motifs. Nucleic acids research 34:W369-W73<br /> 2. Foyer CH, Kerchev PI, Hancock RD. 2012. The ABA-INSENSITIVE-4 (ABI4) transcrip-<br /> tion factor links redox, hormone and sugar signaling pathways. Plant Signal Behav 7:276-81<br /> 3. Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD, Bairoch A. 2003. ExPASy: the<br /> proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-8<br /> 4. Katoh K, Standley DM. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7:<br /> improvements in performance and usability. Mol Biol Evol 30:772-80<br /> 5. Kelley LA, Sternberg MJ. 2009. Protein structure prediction on the Web: a case study using<br /> the Phyre server. Nat Protoc 4:363-71<br /> 6. Liu Y, Heying E, Tanumihardjo SA. 2012. History, Global Distribution, and Nutritional<br /> Importance of Citrus Fruits. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 11:530-45<br /> 7. Mizoi J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2012. AP2/ERF family transcription fac-<br /> tors is plant abiotic stress responses. Biochem Biophys Acta 1819:86-96<br /> 8. Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2002.<br /> DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of arabidopsis DREBs, transcription factors<br /> <br /> KHCN 2 (31) - 2014 93<br />