Đề tài nghiên cứu: Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro

ộ ướ ứ ề ồ ị ử ẫ Đ  tài nghiên c u “Xác đ nh n ng đ  n c javel cho quá trình kh  m u phát

ưở ủ ấ ưở ế ồ ệ Ả ề ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng BAP, TDZ, NAA đ n quá hoa lan h  đi p.  nh h trình

ưở ể ủ ồ ệ ượ ế ng, phát tri n c a lan h  đi p lai (Phalaenopsis sp.) in vitro” đ c ti n hành sinh tr iạ t

ề ệ ệ ề ậ ọ ố ọ ỹ ờ phòng di truy n và ch n gi ng ­ Vi n Khoa h c K  thu t Nông nghi p mi n Nam,  th i gian

ệ ừ ế ệ ượ ố ể tháng 2/2009 đ n tháng 7/2009. Thí nghi m đ c b  trí theo ki u hoàn ự th c hi n t toàn

ử ẫ ề ằ ồ ộ ợ ồ Đ  tài nh m theo dõi n ng đ  javel thích h p cho quá trình kh  m u phát hoa lan h

ể ễ ủ ồ ệ ự ạ ổ

ệ đi p, quá trình t o protocorm và s  phát tri n r  c a lan h  đi p in vitro khi thay đ i  n ngồ

ưở ườ ấ ề ộ ấ đ  ch t đi u hoà sinh tr ng BAP, TDZ, NAA trong môi tr ng nuôi c y.

ươ ẫ ấ ử v Ph ng pháp kh  trùng m u c y:

ồ ệ ổ ồ ử ẫ ằ ộ Kh  trùng m u phát hoa lan h  đi p b ng cách thay đ i n ng đ  javel (20%, 40%,

ử ở ồ ả ố ế ộ 60%, 80%). Kh  trùng n ng đ  80% cho k t qu  t ấ t nh t.

ự ế ừ ạ v T o protocorm tr c ti p t mô lá:

ườ ự ế ợ ữ ạ ợ ứ Công th c môi tr ng có s  k t h p gi a BAP và TDZ thích h p cho quá trình t o

ườ protocorm: MS + đ ng (30 g/lít )+ PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) +

ạ TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít) + than ho t tính (2 g/lít), pH = 5,8.

ễ ủ ồ ự v Kích thích s  ra r  c a ch i:

ạ ễ ở ử ụ ứ ệ ồ ể S  d ng NAA đ  kích thích t o r lan H  Đi p in vitro, các công th c môi

ườ ướ ừ ­  MS + đ ng (30 g/lít) + n ạ c d a (5 ml/lít) + than ho t tính (2 g/lít) + agar (8

g/lít) + BAP (ĐC) (0,05 mg/lít).

ườ ướ ừ ­  MS + đ ng (30 g/lít) + n ạ c d a (5 ml/lít) + than ho t tính (2 g/lít) + agar (8

ả ố ế g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (0,5 mg/lít) (cho k t qu  t ấ t nh t).

ườ ướ ừ ­  MS + đ ng (30 g/lít) + n ạ c d a (5 ml/lít)+ than ho t tính (2 g/lít) + agar (8

g/lít )+ BAP (0,05 mg/lít ) + NAA (1 mg/lít).

ườ ướ ừ ­  MS + đ ng (30 g/lít) + n ạ c d a (5 ml/lít) + than ho t tính (2 g/lít) + agar (8

g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (1,5 mg/lít).

Ạ

ự Ờ Ả Ắ Ụ Ụ

Ả Ở Ầ ươ Trang t a: ........................................................................................................................ i L I C M T  ................................................................................................................. ii TÓM T T...................................................................................................................... iii M C L C ..................................................................................................................... iv DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................... vii DANH SÁCH CÁC B NG ........................................................................................ viii ng 1 M  Đ U ........................................................................................................1 Ch

ặ ấ

ụ

1.1 Đ t v n  ề đ  .............................................................................................................................. 1 1.2 M c tiêu và yêu  ầ c u............................................................................................................... 2 1.2.1 M c ụ tiêu .......................................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu  ầ c u ........................................................................................................................... 2

ươ Ổ Ệ Ch ng 2 T NG QUAN TÀI LI U ...............................................................................3

ị ấ ể ử

ấ ả ể ự ự ậ ớ ấ ự ậ ở ế ệ ể c quá trình phát tri n nuôi c y mô t bào th c v t Vi t

ự ế ấ

ỉ ưở ng ............................................................................................. 6 ấ

ấ ế bào 2.1 L ch s  phát tri n nuôi c y  mô ............................................................................................... 3 ộ ố ế ế 2.1.1 M t s  k t qu  tiêu bi u trong lĩnh v c nuôi c y mô th c v t trên th   i ................. 3 gi ơ ượ 2.1.2 S  l Nam ........................ 5 ươ 2.2 Các ph  bào th c  ng pháp nuôi c y mô t ậ v t .................................................................... 6 ấ 2.2.1 Nuôi c y đ nh sinh  tr 2.2.2 Nuôi c y mô  ẹ s o ............................................................................................................. 6 2.2.3 Nuôi c y t ơ đ n ....................................................................................................... 6

ấ

ạ ấ ấ ố

ẫ ử

ẫ

ạ ỉ

ề ữ ồ ạ ố i trong nhân gi ng cây ồ ề ặ ề ự ạ ẫ ử ụ ố

ộ ừ ẫ ệ ả ấ m u

ệ ượ ủ ng th y tinh ể ụ ế ấ ỹ bào trong nông Ứ ệ

ố ả ấ ả ả ạ

ả ả

2.2.4 Nuôi c y protoplast – lai  protoplast .............................................................................. 7 2.2.5 Nuôi c y h t  ph n .......................................................................................................... 7 2.3 Quy trình nhân gi ng in  vitro ................................................................................................ 7 2.3.1 Kh  trùng m u  ấ c y ......................................................................................................... 7 2.3.2 Tái sinh m u nuôi  ấ c y .................................................................................................... 8 2.3.3 Nhân  nhanh .................................................................................................................... 8 2.3.4 T o cây hoàn  ch nh ........................................................................................................ 8 ư 2.3.5 Đ a cây ra  ấ đ t................................................................................................................ 8 ấ 2.4 Nh ng v n đ  còn t n t tr ng ......................................................... 9 ấ ị 2.4.1 Tính b t đ nh v  m t di  truy n ....................................................................................... 9 2.4.2 S  ho i  m u .................................................................................................................... 9 2.4.3 S  d ng thu c kháng  sinh ............................................................................................ 10 ấ 2.4.4 Vi c s n xu t các ch t gây đ c t ấ c y .................................................................. 10 2.4.5 Hi n t th  ............................................................................................... 10 ậ 2.5  ng d ng k  thu t nuôi c y mô t nghi p .................................................. 11 2.5.1 Vi nhân  gi ng ................................................................................................................ 11 2.5.2 S n xu t và b o qu n cây s ch  ệ b nh ............................................................................ 12 ố 2.5.3 B o qu n và nhân gi ng in  vitro................................................................................... 12

ấ ự ậ ng th c v t

ưở ề 2.6 Ch t đi u hòa sinh tr (ĐHSTTV) ................................................................. 12 2.6.1  Auxin ............................................................................................................................. 12 2.6.2  Cytokinin....................................................................................................................... 13

ơ ượ ề ồ c v  lan h ệ

ạ ố ấ

ả hình

ọ ồ

ố ề ố

ử ụ ố

ồ ừ phát hoa Phalaenopsis ......................................................................

ừ mô lá Phalaenopsis ...........................................................................

ưở ng PLB thành cây con..................................................................................

ế ủ ị ồ  c a lan h ệ ƯƠ ươ Ậ Ệ Ệ 2.7 S  l đi p ......................................................................................................... 13 ị 2.7.1 V  trí phân  lo i ............................................................................................................. 13 ồ 2.7.2 Ngu n g c, xu t  ứ x  ...................................................................................................... 14 2.7.3 Mô t thái ............................................................................................................. 14 2.7.4 Tr ng tr t và chăm sóc ................................................................................................   17 2.7.5 Nhân gi ng truy n  th ng ............................................................................................. 20 2.8 Vi nhân gi ng ố Phalaenopsis ............................................................................................... 21 ồ 2.8.1 Nhân gi ng vô tính s  d ng ch i  ỉ đ nh......................................................................... 21 2.8.2 Tái sinh ch i t 22 2.8.3 Tái sinh PLB t 23 2.8.4 Tăng tr 23 2.9 Giá tr  kinh t đi p ............................................................................................. 24 _Toc241549069Ch NG PHÁP THÍ NGHI M ...............26 ng 3 V T LI U VÀ PH

ị ờ

ươ ệ ng ti n thí

ố ượ ng thí

ụ ế ị t b  và d ng

ế ệ ộ ướ ủ ồ ộ ạ ự ả ưở ủ ệ ế ả c javel đ n đ  s ch c a ng c a n ng đ  n

ủ ồ ấ ớ ưở Ả ệ ề ệ ộ ng c a n ng đ  BA,TDZ, đi u ki n nuôi c y t i quá trình

ừ ồ  lá cây h ệ 3.1 Th i gian và đ a  ể đi m .......................................................................................................... 26 3.2 Ph ệ nghi m ....................................................................................................... 26 3.2.1 Đ i t ệ nghi m ................................................................................................... 26 3.2.2 Trang thi ụ c  .............................................................................................. 26 3.3 Ti n hành thí  nghi m........................................................................................................... 28 3.3.1 Thí nghi m 1: Kh o sát s   nh h m uẫ ấ c y ........................................................................................................................................ .. 28 3.3.2 Thí nghi m 2:  nh h t oạ protocorm t đi p .................................................................................................. 29

ả ưở ự ả ủ ồ ưở ế ộ ng c a n ng đ  NAA đ n sinh tr ng, phát

ồ ệ

ệ 3.3.3 Thí nghiêm 3:Kh o sát s   nh h tri nể ủ c a cây lan h  đi p in  vitro ................................................................................................... 30 ố ử 3.4 X  lý s   li u......................................................................................................................... 31

ươ Ậ Ả Ả Ế Ch ng 4 K T QU  VÀ TH O LU N ......................................................................32

ẫ ế ủ Ả ưở ủ ồ ộ ướ ng c a n ng đ  n ộ ạ c javel đ n đ  s ch c a m u

ộ Ả ưở ủ ồ ấ ớ ề ệ ng c a n ng đ  BAP,TDZ, đi u ki n nuôi c y t i quá trình

ồ ệ ừ lá cây h  đi p in

ể ủ ủ ồ ưở Ả ế ộ ng c a n ng đ  NAA đ n sinh tr ng, phát tri n c a cây

ệ 4.1 Thí nghi m 1:  nh h ấ c y .................. 32 ệ 4.2 Thí nghi m 2:  nh h t oạ protocorm t vitro ......................................................................................... 35 ưở ệ 4.3 Thí nghi m 3:  nh h lan hồ ệ đi p in  vitro ................................................................................................................................ 43

ươ Ậ Ế Ề Ị Ch ng 5 K T LU N VÀ Đ  NGH  ..........................................................................49

5.1 K t ế ậ lu n ................................................................................................................................ 49 5.2 Đ  ề ị ngh ................................................................................................................................. 49

Ả Ệ Ế Ệ Ệ Ụ Ụ TÀI LI U THAM KH O .............................................................................................50 TÀI LI U TI NG VI T ...............................................................................................50 PH  L C ......................................................................................................................53

Ữ Ế Ắ DANH SÁCH CÁC CH  VI T T T

: 6 – Benzylaminopurine

: Thidiazuron

α : ­ Napthylacetic acid

ứ ố : Đ i ch ng

: Murashige and Skoog (1962)

ườ ề : Môi tr ng n n

: Ngày sau c yấ

ứ ệ : Nghi m th c

: Protocorm like body

: Indol acetic acid

ề ưở : Đi u hòa sinh tr ự ậ ng th c v t

: Polyvinylpyrolidone

ầ ặ ạ : L n l p l i

DANH SÁCH CÁC HÌNH

ồ ệ Hình 2.1: Cây và hoa lan h  đi p  (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail) ......... 14

ệ Hình 2.2: Hoa lan h  ồ đi p ......................................................................................................... 15

ồ ệ ổ ả ụ ạ ệ ề ạ i Tr i lan, Vi n KHNN Mi n Hình 2.3: Trái lan h  đi p 3 tháng tu i ( nh ch p t Nam) .......... 16

ồ ệ ủ

Hình 2.4: Keiki c a lan h  đi p  (http://www.orchidshome.com) ............................................ 16

ồ ệ ạ ộ ố ố ệ i Vi t Hình 2.6: M t s  gi ng lan h  đi p t Nam ...................................................................... 25

ồ ệ ậ ấ ẫ ộ

Hình 3.1: Phát hoa lan h  đi p, b  ph n l y m u  ấ c y .............................................................. 28

ẫ ấ ồ ệ ầ ẫ Hình 3.2: M u lá lan h  đi p ban đ u (a) và m u c y  (b) ........................................................ 29

ứ ấ ả ẫ ồ

Hình 4.1: M u n y ch i và hình thành hoa th  c p (20  NSC) ................................................. 34

ượ ạ ệ ố ề c t o ra trong đi u ki n t i (80 Hình 4.2: Protocorm đ NSC) ............................................... 42

ề ạ

ệ Hình 4.3: Protocorm t o ra trong đi u ki n sáng (80  NSC) ..................................................... 43

ồ ệ ở ạ  giai đo n 40 Hình 4.4: Cây lan h  đi p  NSC ........................................................................ 48

DANH SÁCH CÁC B NGẢ

ớ ồ ử ế ấ ả ộ ờ B ng 2.1: Các ch t dùng kh  trùng v i n ng đ  và th i gian khuy n cáo .....................7

Ả ưở ủ ồ ế ỷ ệ ộ ẩ ủ ễ ấ ng c a n ng đ  javel đ n t l nhi m n m và vi khu n c a ả ẫ B ng 4.1:  nh h m u ...33

Ả ưở ủ ồ ộ ỷ ệ ố ủ ng c a n ng đ  javel đ n t ế ỷ ệ ế  l ch t và t s ng c a l ả ẫ B ng 4.2:  nh h m u.............33

Ả ưở ủ ồ ấ ớ ỷ ệ ẫ ề ệ ộ ng c a n ng đ  BAP, TDZ, đi u ki n nuôi c y t m u lá i t l ả B ng 4.3:  nh h hình

thành protocorm .............................................................................................................35

Ả ưở ủ ấ ưở ả ứ ủ ề ng c a ch t đi u hoà sinh tr ế ng BAP, TDZ đ n ph n  ng c a ả B ng4.4: nh h ẫ m u.36

Ả ưở ủ ề ệ ng c a BAP, TDZ và đi u ki n nuôi c y t ấ ớ ỷ ệ ố i t s ng và t l ỷ ệ  l ả B ng 4.5:  nh h ch tế

ồ ệ ẫ ủ c a m u lá lan h  đi p in vitro .......................................................................................37

Ả ả ưở ấ ớ ủ ề ệ ả B ng 4.6:  nh h ng c a BAP, TDZ và đi u ki n nuôi c y t i kh  năng hình thành

ừ ẫ ồ ệ protocorm t m u lá lan h  đi p in vitro ........................................................................38

ả Ả ưở ấ ớ ủ ề ệ ướ ủ ng c a BAP, TDZ, đi u ki n nuôi c y t i kích th c c a B ng 4.7:  nh h protocorm

.......................................................................................................................................40

Ả ả ưở ạ ễ ủ ủ ồ ồ ệ ế ả ộ B ng 4.8:  nh h ng c a n ng đ  NAA đ n kh  năng t o r  c a cây lan h  đi p in

vitro ................................................................................................................................44

ả ưở Ả ủ ế ố ồ ệ ủ ng c a NAA đ n s  lá c a lan h  đi p in B ng 4.9:  nh h vitro ...............................45

ả Ả ưở ủ ế ướ ồ ệ ề ng c a NAA đ n kích th ủ c lá và chi u cao c a cây lan h  đi p B ng 4.10:  nh h in

vitro ................................................................................................................................46

ổ ơ ấ ể ệ ồ ố Trong quá trình chuy n đ i c  c u cây tr ng ngành nông nghi p thành ph  nói

ủ ả ướ ự ề ề ấ ả ộ riêng và c a c  n c nói chung, hoa lan ­ cây c nh là m t lĩnh v c có r t nhi u ti m

ế ủ ả ớ ộ ợ năng đem l ạ ợ i l i ích kinh t cho xã h i và phù h p v i hoàn c nh c a ngành nông

ữ ể ệ ầ ơ ế ế ủ ờ ố Hi n nay, thú ch i hoa ki ng không nh ng là nhu c u thi t y u c a đ i s ng xã

ộ ạ ệ ả ế ề ồ ộ h i, mà còn là m t ngành kinh doanh mang l i hi u qu  kinh t cao. Ngh  tr ng lan

ệ ể ặ ở hi n nay không còn là thú vui tiêu khi n mà đã tr  thành hàng hoá. M t hàng này

ổ ỉ ướ ị ườ ậ ế ớ ạ ồ không ch  trao đ i trong n c mà đã thâm nh p ra th  tr ng th  gi i, t o ra ngu n

ấ ẩ ị ạ ạ ệ ề ấ ướ ữ ầ hàng xu t kh u có giá tr , đem l i nhi u ngo i t cho đ t n c. Nh ng năm g n đây,

ở ề ướ ồ ể ố ồ ngành tr ng lan Tp.H  Chí Minh có chi u h ng phát tri n t t. Phong trào này lan

ữ ở ơ ở ả ứ ấ ơ ở ộ ộ r ng, không nh ng các c  quan nghiên c u, c  s  s n xu t mà còn các h  gia đình.

ệ ậ ạ ố ườ ầ ủ ư ng g n nh  không đ ỹ Trong giai đo n hi n nay, k  thu t nhân gi ng lan thông th đáp

ứ ị ườ ằ ố ươ ng cho th  tr ng. Do đó, nhân gi ng lan b ng ph ấ ng pháp nuôi c y in vitro ngày

ế ữ ị ườ ơ ồ ệ ệ ả ạ H n th  n a, trên th  tr ng hoa ­ cây c nh hi n nay, lan h  đi p là lo i lan có

ẹ ế ạ ắ ọ ồ hoa đ p, sang tr ng, đa d ng, màu s c phong phú, lâu tàn. Chính vì th , hoa lan h

ệ ầ ị ế ở ướ đi p mang ý nghĩa tinh th n và có giá tr  kinh t cao trong n c cũng nh ư ở ướ  n c

ả ự ự ấ ấ ươ ạ ngoài. Do kh  năng t sinh trong t nhiên r t th p, nên ph ng pháp gieo h t trong

ườ ượ ử ụ ể ạ ố ượ ủ ớ ố môi tr ng in vitro đ c s  d ng đ  t o s  l ng l n cây con c a gi ng lan này. Tuy

ọ ừ ạ ữ ườ ưở ồ ổ nhiên, nh ng cây con m c t h t th ng tăng tr ặ ề ng không đ ng đ u, lâu tr  hoa, đ c

ể ầ ấ ườ ườ ươ ấ ỉ đi m hoa không thu n nh t. Ng i ta th ụ ng áp d ng ph ng pháp nuôi c y đ nh sinh

ưở ể ữ ủ ữ ề ắ ạ ướ tr ng c a cây đ  gi nguyên nh ng tính tr ng quý v  màu s c, kích th c hoa, hình

ụ ừ ể ệ ố ồ ạ d ng cánh, ki u phân b  hoa trên tr c phát hoa. T  ngu n nguyên li u này, tùy theo

ụ ụ ươ ố ượ ể m c đích mà áp d ng các ph ng pháp nhân nhanh khác nhau đ  cho ra s  l ớ ng l n

ấ ắ ờ ồ cây đ ng nh t trong th i gian ng n.

ồ ệ ậ ượ ử ụ ổ ế ể ệ ấ ớ ộ V i lan h  đi p, hi n nay b  ph n đ ẫ c s  d ng đ  vô m u ph  bi n nh t là

ẫ ắ ưở ể phát hoa. Nguyên nhân là do khi c t phát hoa thì cây v n sinh tr ng và phát tri n bình

ườ ạ ượ ứ ủ ề ầ ậ ệ ồ th ng. Ngoài ra trên phát hoa còn ch a nhi u m m ng  nên t o đ c ngu n v t li u

ố ạ ế nhân gi ng phong phú, mang l ị i giá tr  kinh t cao.

ấ ừ ữ ứ ượ ề ề ế ạ Xu t phát t nh ng đi u trên, đ  tài nghiên c u đ c ti n hành t i phòng di

ệ ề ệ ề ậ ồ ọ ố ọ ộ ỹ truy n và ch n gi ng – Vi n Khoa h c K  thu t Nông nghi p mi n Nam g m 2 n i

ộ ướ ồ ử ẫ ồ ệ ủ ờ ị dung: Xác đ nh n ng đ  n c javel và th i gian kh  m u phát hoa c a lan h  đi p và

ả ưở ủ ấ ưở ế theo dõi  nh h ề ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng BAP, TDZ, NAA đ n quá trình sinh

ưở ể ủ ồ ệ tr ng, phát tri n c a lan h  đi p lai (Phalaenopsis sp.) in vitro.

ồ ệ ệ ẫ ồ ộ ợ ị ­  Xác đ nh n ng đ  javel thích h p cho vi c vào m u phát hoa cây lan h  đi p.

ề ồ ị ưở ự ợ ộ ấ ­  Xác đ nh n ng đ  ch t đi u hòa sinh tr ng thích h p cho s  hình thành

ừ ồ ệ protocorm t lá cây lan h  đi p.

ị ưở ể ­  Xác đ nh t ỷ ệ  l ợ  auxin/cytokinin thích h p cho quá trình sinh tr ng, phát tri n

ộ ấ ệ ề ớ ố ưở ứ ồ B  trí thí nghi m v i các m c n ng đ  ch t đi u hòa sinh tr ng (BAP, TDZ,

ồ ự ế ằ ạ ấ ồ ợ ộ NAA) khác nhau nh m tìm ra n ng đ  thích h p nh t cho quá trình t o ch i tr c ti p

ồ ệ ừ t ạ ễ ủ  lá và quá trình t o r  c a lan h  đi p.

Ổ Ệ T NG QUAN TÀI LI U

ử ể ấ ị 2.1 L ch s  phát tri n nuôi c y mô

ự ậ ế ớ ử ấ ị 2.1.1 L ch s  nuôi c y mô th c v t trên th  gi i

ậ ọ ườ ứ ề ướ Năm 1838, hai nhà sinh v t h c ng i Đ c là Shleiden và Schwam đã đ  x ng

ế ế ọ ơ ể ứ ạ ề ề ậ ơ ỏ ồ ị bào và nêu rõ: m i c  th  sinh v t ph c t p đ u g m nhi u đ n v  nh , các thuy t t tế

ợ ế ề ở ề ế bào h p thành. Các t bào phân hóa đ u mang các thông tin di truy n trong t bào

ị ộ ậ ứ ụ ữ ơ ừ ể ầ đ u tiên, đó là tr ng sau khi th  tinh, và là nh ng đ n v  đ c l p, t đó có th  xây

ờ ấ ế ế ể ẩ ộ ỳ Năm 1954, Skoog (Hoa K ) tình c  th y, n u thêm m t ch  ph m đã đ  lâu

ẹ ấ ườ ả ấ ị ủ c a DNA l y tinh d ch cá b  vào môi tr ố ng nuôi c y các m nh mô thân cây thu c

ụ ưở ệ ở lá thì tác d ng kích thích sinh tr ng tr  nên rõ r t.

ủ ệ ệ ệ ệ ớ Vi c phát hi n vai trò c a IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng v i vi c phát hi n

ủ ữ ướ ừ ộ ướ ế ấ ọ nh ng vai trò c a các vitamine và n c d a là m t b c ti n r t quan tr ng trong giai

ủ ị ứ ử ạ ấ ế ự ậ ề ậ đo n th  hai c a l ch s  nuôi c y mô t ệ ề  bào th c v t, đó là ti n đ  kĩ thu t cho vi c

ự ườ ệ ổ ề ặ ệ ọ ị xây d ng các môi tr ng xác đ nh v  m t hóa h c và cho vi c làm các thí nghi m  n

ủ ế ẫ ạ ọ ế ị đ nh d n đ n các giai đo n ti p theo c a ngành khoa h c này.

ứ ề ả ế ả ưở ố Năm 1957, Skoog và Miller công b  các k t qu  nghiên c u v   nh h ủ ng c a

ườ ố ớ ự ủ ấ ơ ỷ ệ t  l kinetin/auxin trong môi tr ng nuôi c y đ i v i s  hình thành c  quan c a mô

ấ ỷ ệ ả ố ẹ ướ ẹ s o thu c lá. Khi gi m th p t l kinetin/auxin mô s o có khuynh h ể ễ ng phát tri n r ,

ượ ạ ế ỷ ệ ế ẫ ướ ồ ở ạ ẹ ng i n u t c l l kinetin/auxin tăng thì d n đ n khuynh h ng t o ch i mô s o.

ệ ượ ượ ấ ớ ề ề ị Hi n t ng này đ c xác đ nh trên nhi u cây khác nhau và đóng góp r t l n vào đi u

ể ưở ủ ể ơ ế ấ khi n sinh tr ng, phát tri n, phát sinh c  quan c a mô t bào trong nuôi c y. Thành

ở ầ ủ ề ế ệ ẫ ọ công c a Skoog và Miller d n đ n nhi u phát hi n quan tr ng khác, m  đ u cho giai

ự ậ ủ ị ứ ạ ấ ử đo n th  3 c a l ch s  nuôi c y mô th c v t.

ể ố ươ ọ ơ ể ả ượ Năm 1960, Berman công b  có th  dùng ph ng pháp l c đ n gi n đ  thu đ c

ề ế ụ ế ầ ế ế ể huy n phù không có t bào dính c m mà h u h t là t ơ  bào đ n. Các t ơ  bào đ n có th

ườ ế ụ ố ạ ạ ớ ỹ ẹ gieo trên môi tr ng, ti p t c s ng, phân chia và tái t o l ậ i mô s o. Cùng v i k  thu t

ế ủ ề ả ạ ỉ gieo t bào c a Bergman, nhi u tác gi đã thành công trong t o cây hoàn ch nh t ừ ộ  m t

ấ ố ề ủ ế ứ ộ ự ậ ế t bào, ch ng minh m t cách r t t t v  tính toàn năng c a t bào th c v t.

ấ ế ả ự ậ Kh  năng nuôi c y t bào th c v t trong các bình lên men dùng trong công

ệ ạ ả ỉ ế ữ ể ở nghi p vi sinh và kh  năng tái t o cây làm hoàn ch nh t bào đã m  ra nh ng tri n

ệ ạ ớ ế ộ ế ấ ọ v ng m i trong vi c t o các dòng t ế  bào đ t bi n, các dòng t ộ ả  bào siêu s n xu t m t

ẩ ấ ộ ứ ấ ế ề ế ầ ả ộ ả s n ph m th  c p nào đó và kh  năng tăng t n su t đ t bi n trong di truy n đ t bi n  ở

ộ ừ ố ơ ấ Năm 1966, Guha và Mahes Wari công b  thành công cây đ n b i t nuôi c y

ộ ượ ấ ệ ạ ế ơ ộ túi ph n cây cà đ c d c (Datura inoxia). Đ n nay vi c t o cây đ n b i thông qua

ấ ấ ấ ở ấ ề ắ ạ nuôi c y túi ph n và h t ph n đã thành công r t nhi u cây (b p, lúa,...) và đóng góp

ự ễ ứ ệ ế ề ớ ọ ố vô cùng l n vào vi c tăng thêm ki n th c di truy n và th c ti n ch n gi ng.

ườ ự ự ủ ữ ế ể ầ ọ Ng i ta th c s  chú ý đ n tri n v ng c a protoplast vào đ u nh ng năm 1970,

ả ệ ậ khi các tác gi Nigata và Takebe (Nh t) thành công trong vi c làm cho protoplast tách

ầ ế ạ ạ ố ỏ ộ ừ t mô thu c lá tái t o v  cellulose, phân chia và t o nên m t ph n t bào trong môi

ườ ề ệ ả ỏ ợ ớ tr ng l ng. Do các protoplast có kh  năng dung h p v i nhau trong các đi u ki n

ấ ị ử ớ ặ ậ ơ ừ ấ nh t đ nh và h p thu các phân t l n ho c th m chí các c  quan t bên ngoài, các nhà

ấ ự ậ ặ ể ọ ế ậ ọ ớ ố ỹ nuôi c y mô th c v t đ t hy v ng l n vào k  thu t protoplast đ  ch n gi ng có k t  quả

ề ướ ộ ủ ế ấ Năm 1965, Ledoux và c ng tác viên đ  x ề ế ng v n đ  bi n tính c a t ự  bào th c

ằ ế ự ậ ạ ả ấ ạ ố ậ v t. Ông cho r ng t bào h t gi ng th c v t có kh  năng h p thu DNA ngo i lai vào

ế ể ắ ạ ớ ế ể ệ bào. DNA ngo i lai có th  g n v i DNA t ạ ộ  bào và có ho t đ ng bi u hi n trong t tính

ự ế ề ở ự ậ di truy n gây nên s  bi n tính th c v t.

ự ừ ạ ớ ệ T  năm 1980 ­ 1992, hàng lo t các thành công m i trong lĩnh v c công ngh

ượ ố ờ ử ườ ế ự ậ gen th c v t đã đ c công b . Nh  có plasmid, phân t DNA vòng th ng có trong t

ẩ ượ ắ ấ ạ ộ bào vi khu n, đ c l p ghép, c u trúc l ắ i sao cho plasmid có g n thêm m t gen xác

ự ề ệ ắ ớ ờ ỉ ị đ nh đã th c hi n thành công v i nhi u h  th c v t. ọ ự ậ Ch  trong th i gian ng n, các

ượ ồ ố thành công này đã đ c các công ty cây tr ng siêu qu c gia khai thác tri ệ ể t đ .

ự ậ ễ ấ ự ụ ứ ấ ấ ả Kh  năng  ng d ng nuôi c y mô th c v t d  th y nh t là trong lĩnh v c nhân

ụ ố ố ừ ậ ấ ỉ ưở gi ng và ph c tráng gi ng. Ngay t năm 1960, Morel đã nh n th y đ nh sinh tr ng

ấ ẽ ạ ị ủ c a các lo i đ a lan (Cybidium) khi đem nuôi c y s  hình thành các protocorm. Khi

ế ụ ắ ấ ượ ớ ể chia c t các protocorm và ti p t c nuôi c y thì thu đ c các protocorm m i. Khi đ

ấ ị ề ệ ể ể ơ ữ trong đi u ki n nh t đ nh thì protocorm có th  phát tri n thành cây lan con. H n n a

ế ỉ ưở ứ ấ ứ ặ các t bào đ nh sinh tr ng ch a r t ít ho c hoàn toàn không ch a virus.

ự ậ ệ ứ ụ ấ ố ượ Vi c  ng d ng nuôi c y mô th c v t trong nhân gi ng đ c Nozeran nâng lên

ấ ự ẻ ủ ứ ậ ộ ớ ồ m t m c m i khi ông nh n th y s  tr  hóa c a các ch i nách cây nho và cây khoai tây,

ề ầ ế ệ ề ấ ấ ấ ố đem nuôi c y và c y chuy n nhi u l n trong  ng nghi m. Ti p sau đó, nuôi c y mô

ụ ấ ả ươ ạ ố ớ ồ c áp d ng quy mô s n xu t th ạ ng m i đ i v i hàng lo t cây tr ng có ý nghĩa ượ đ kinh

ư ả ố ế t cao nh  chu i, cà phê, khoai tây, cây ăn qu  có múi.

ệ ấ ậ ỹ ướ ủ ạ Hi n nay, k  thu t nuôi c y mô đang b ứ c vào giai đo n th  4 c a quy trình

ể ấ ự ậ ượ ứ ụ ự ẽ ạ c  ng d ng m nh m  vào th c ạ phát tri n. Đó là giai đo n nuôi c y mô th c v t đ ti nễ

ệ ả ứ ấ ạ ấ ọ ố ố ọ ấ ch n gi ng, nhân gi ng, vào vi c s n xu t các ch t th  c p có ho t tính sinh h c và

ự ậ ậ ứ ề ậ nghiên c u lý lu n di truy n th c v t b c cao.

ơ ượ ấ ế ự ậ ở ệ 2.1.2 S  l ể c quá trình phát tri n nuôi c y mô t bào th c v t Vi t Nam

ỉ ớ ắ ầ ừ ự ậ ứ ấ Ở ệ  Vi t Nam, nghiên c u nuôi c y mô th c v t ch  m i b t đ u t năm 1975.

ấ ế ượ ự ạ ệ ọ ầ  bào đ u tiên đ c xây d ng t i Vi n Sinh H c, ệ Phòng thí nghi m nuôi c y mô t Vi nệ

ọ ệ ộ ứ ứ ượ ế ầ ị ể ớ Khoa H c Vi t Nam do ti n sĩ Lê Th  Mu i đ ng đ u. Ý th c đ ọ c tri n v ng to l n

ệ ạ ọ ồ ọ ố ố ủ c a ngành khoa h c hi n đ i này trong ch n gi ng và nhân gi ng cây tr ng nông

ệ ở ơ ở ự ọ ộ ệ nghi p, ứ  các c  s  thu c Trung Tâm Nghiên C u Khoa H c T  Nhiên và Công Ngh

ứ ệ ố ộ ồ ộ ộ ị ộ ố ơ Qu c Gia Hà N i, Tp.H  Chí Minh, m t s  đ n v  nghiên c u thu c B  Nông Nghi p

ứ ể ệ ệ ế ạ ộ ộ và Phát Tri n Nông Thôn, B  Lâm Nghi p, B  Y T , Vi n Nghiên C u H t Nhân...đã

ự ậ ừ ự ấ ướ ự ự chú ý xây d ng các phòng nuôi c y mô th c v t, t ng b ề c xây d ng ti m l c khoa

ứ ề ạ ộ ọ h c và đào t o cán b  nghiên c u v  ngành này.

ể ễ ả ấ Theo Nguy n Văn Uy n và các tác gi ự ứ , năm 1993, nghiên c u nuôi c y mô th c

ệ ạ ượ ộ ố ự ậ ở v t Vi t Nam đã đ t đ c m t s  thành t u sau:

ự ậ ằ ấ ầ ố Nhân gi ng khoai tây (Solanum tuberosum L) b ng nuôi c y mô th c v t (Tr n

ể ễ ầ ọ Văn Ng c,Tr n Văn Minh, Nguy n Văn Uy n).

ễ ễ ề ọ ố ị Nhân gi ng vô tính cây cà phê (h  Rubiacea) (Nguy n Th  Quy n, Nguy n Văn

Ứ ụ ấ ỏ ố ọ ọ ị ng d ng nuôi c y mô nhân gi ng cây c  ng t (h  Compositae) (Bùi Th

ườ ứ ể ễ ễ T ng Thu, Nguy n Đ c Minh Hùng, Nguy n Văn Uy n).

ằ ố ố ươ ấ ị Nhân gi ng chu i (Mussa spp.) b ng ph ng pháp c y mô (Đoàn Th  Ái

ứ ể ề ễ ề ễ ễ ị Thuy n, Nguy n Th  Quy n, Nguy n Đ c Minh Hùng, Nguy n Văn Uy n).

Ứ ụ ấ ố ng d ng nuôi c y mô trong nhân gi ng cây kiwi (Actinidia chinensis Planch)

ằ ắ ồ ố ươ ấ Nhân gi ng cây b t ru i (Nepenthes madagascariens) b ng ph ng pháp c y

ứ ằ ố ươ ấ Nhân gi ng d a Cayenene và Queen Long An b ng ph ng pháp nuôi c y mô)

ứ ễ ầ ỹ (Nguy n Đ c Minh Hùng, Tr n Văn Minh, Vũ M  Liên, Thái Xuân Du).

ằ ấ ố ỹ Nhân gi ng cây vani (Vanilla sp.) b ng nuôi c y mô (Vũ M  Liên).

ươ ấ ế 2.2 Các ph ng pháp nuôi c y mô t ự ậ  bào th c v t

ữ ộ ươ ể ạ ượ ụ ấ ế M t trong nh ng ph ng pháp đ  đ t đ c m c tiêu trong nuôi c y mô t bào

ự ậ ấ ỉ ưở ồ ỉ ấ ồ ồ th c v t là nuôi c y đ nh sinh tr ng (bao g m nuôi c y ch i đ nh và ch i bên).

ẫ ẽ ượ ấ ườ ứ ầ ủ ợ Sau khi vô trùng m u s  đ c nuôi c y trên môi tr ng thích h p ch a đ y đ

ưỡ ữ ơ ặ ơ ườ ấ dinh d ng khoáng vô c  và h u c  ho c môi tr ứ ng khoáng có ch a ch t kích thích

ưở ừ ỉ ợ ưở ả ấ ộ sinh tr ng thích h p. T  đ nh sinh tr ấ ờ ng sau m t kho ng th i gian nuôi c y nh t

ồ ế ụ ẫ ẽ ể ươ ể ề ồ ộ ồ ị đ nh m u s  phát tri n thành m t ch i hay nhi u ch i. Ch i ti p t c phát tri n v n

ể ở ạ ỉ ượ ể ầ thân t o lá đ  tr  thành cây hoàn ch nh. Cây con đ ấ ể c chuy n ra đ t đ  thích nghi d n

ố ế ẹ ộ ể ổ ứ ự ả Mô s o là m t kh i t bào phát tri n vô t ch c, hình thành do s  ph n phân

ủ ế ẹ ể ườ ự ệ bào đã phân hóa. Mô s o đã phát tri n nhanh khi môi tr ng có s  hi n hóa c a t di nệ

ệ ề ẹ ả ố ộ ỉ auxin. Kh i mô s o có kh  năng tái sinh thành m t cây hoàn ch nh trong đi u ki n môi

ườ ẹ ạ ấ tr ng không có ch t kích thích t o mô s o.

ẹ ượ ố ấ ườ ỏ ượ ặ ắ Kh i mô s o đ c nuôi c y trong môi tr ng l ng và đ c đ t trên máy l c có

ợ ẽ ề ế ỉ ẽ ọ ế ơ bào riêng r  g i là t bào đ n. ố ộ ề t c đ  đi u ch nh thích h p s  tách ra thành nhi u t Tế

ơ ượ ọ ườ ệ ể ố bào đ n đ ấ c l c và nuôi c y trên môi tr ặ ng đ c bi t đ  tăng sinh kh i.

ấ ờ ộ ườ ế ơ ượ Sau m t th i gian nuôi c y kéo dài trong môi tr ỏ ng l ng, t bào đ n đ c tách

ượ ả ườ ạ ườ ạ ế ra và đ c tr i trên môi tr ng th ch. Khi môi tr ổ ng th ch có b  sung auxin, t bào

ụ ế ẹ ườ ỉ ệ ạ ể ơ đ n phát tri n thành c m t bào mô s o. Khi trong môi tr ng th ch có t  l

ợ ế ả ơ ỉ cytokinin/auxin thích h p, t bào đ n có kh  năng tái sinh thành cây hoàn ch nh.

ấ 2.2.4 Nuôi c y protoplast – lai protoplast

ế ế ệ ề ớ ỏ Protoplast (t ầ  bào tr n) là t bào đã tách l p v  cellulose. Trong đi u ki n nuôi

ạ ạ ả ợ ế ế ụ ạ ấ c y thích h p, protoplast có kh  năng t o l i màng t bào, ti p t c phân chia và t o

ế ế ả ấ Khi t ợ  bào m t vách và ti n hành dung h p, hai protoplast có kh  năng dung

ạ ớ ế ệ ặ ả ố ồ ự ợ h p v i nhau t o ra t bào lai, đ c tính này cho phép c i thi n gi ng cây tr ng. S

ể ượ ợ ố ượ ự ệ dung h p protoplast có th  đ c th c hi n trên hai đ i t ng cùng loài.

ấ ượ ạ ữ ấ ườ ẹ ợ H t ph n đ c nuôi c y trên nh ng môi tr ể ạ ng thích h p đ  t o thành mô s o

ố 2.3 Quy trình nhân gi ng in vitro

ệ ủ ấ ệ ấ ấ ẩ ư Theo tài li u c a Street (1974) các ch t di ể ử t n m khu n đ  x  lý mô c y nh

ớ ồ ử ế ả ấ ộ ờ B ng 2.1: Các ch t dùng kh  trùng v i n ng đ  và th i gian khuy n cáo

ộ ồ N ng đ  (%)

9 ­ 10

10 ­ 12

1­2

0,1 ­ 1

4 ­ 50 mg/l

ạ ố ử ế ị ộ ọ ẫ ấ Kh  trùng m u c y là giai đo n t i quan tr ng quy t đ nh toàn b  quá trình

ả ạ ụ ạ ố ượ ệ ủ nhân gi ng in vitro. M c đích c a giai đo n này là ph i t o ra đ c nguyên li u vô

ể ư ấ trùng đ  đ a vào nuôi c y in vitro.

ầ ầ ấ ộ Vô trùng mô c y là m t thao tác khó, ít khi thành công ngay l n đ u tiên. Tuy

ế ượ ồ ầ ợ ờ ộ ử ậ v y, n u kiên trì tìm đ c n ng đ  và th i gian vô trùng thích h p thì sau vài l n th

ự ủ ụ ạ ộ ị ướ ấ M c đích c a giai đo n này là s  tái sinh m t cách đ nh h ng các mô c y. Quá

ượ ủ ế ự ể ề ỷ ệ ủ ợ trình này đ c đi u khi n ch  y u d a vào t ấ  c a các h p ch t auxin/cytokinin l

ạ ượ ư ườ ề ệ ấ ạ ngo i sinh đ c đ a vào môi tr ng nuôi c y. Tuy nhiên, bên c nh đi u ki n đó cũng

ớ ẫ ấ ổ ườ ư ả ầ c n quan tâm t ủ i tu i sinh lý c a m u c y. Th ng mô non, ch a phân hóa có kh

ơ ưở ườ ậ năng tái sinh cao h n các mô tr ng thành đã chuyên hóa sâu. Ng i ta cũng còn nh n

ẫ ấ ấ ằ ờ ỳ ưở ủ ưở th y r ng m u c y trong th i k  sinh tr ng nhanh c a cây trong mùa sinh tr ng cho

ả ấ ả ồ ế k t qu  r t kh  quan trong tái sinh ch i.

ượ ố ủ ệ ố ể ạ ạ Giai đo n này đ c coi là giai đo n then ch t c a quá trình. Đ  tăng h  s  nhân,

ư ườ ưỡ ề ạ ấ ng đ a thêm vào môi tr ng dinh d ng nhân t o các ch t đi u hòa sinh ta th tr ườ ngưở

ấ ổ ư ướ ừ ế ấ (auxin, cytokinin, gibberellin…), các ch t b  sung khác nh  n ị c d a, d ch chi t n m

ế ợ ế ố ớ ệ ộ ừ ộ ợ men,…k t h p v i các y u t nhi ố t đ , ánh sáng thích h p.Tùy thu c vào t ng đ i

ấ ườ ụ ự ể ằ ượ t ng nuôi c y, ng i ta có th  nhân nhanh b ng kích thích s  hình thành các c m

ể ủ ụ ự ồ ồ ồ ch i (nhân c m ch i) hay kích thích s  phát tri n c a các ch i nách (vi giâm cành)

ệ ạ ặ ừ ho c thông qua vi c t o cây t phôi vô tính.

ạ ượ ướ ấ ị ồ ượ ể ừ ườ ở Khi đ t đ c kích th c nh t đ nh, các ch i đ c chuy n t môi tr ng giai

ườ ườ ừ ầ ừ ữ ẻ ạ ễ ng t o r . Th ng t 2­3 tu n, t ồ  nh ng ch i riêng l ẽ  này s ạ đo n 3 sang môi tr xu tấ

ệ ễ ỉ Ở ở ườ ườ ổ hi n r  và tr  thành cây hoàn ch nh. ạ  giai đo n này ng i ta th ng b  sung vào môi

ườ ự ậ ạ ễ ứ ấ ọ tr ng nuôi c y các auxin là nhóm hormon th c v t quan tr ng có ch c năng t o r

ạ ư ỉ ừ ố ệ ấ ướ ủ ố Giai đo n đ a cây hoàn ch nh t ng nghi m ra đ t là b c cu i cùng c a quá

ố ướ ế ị ứ ụ ả trình nhân gi ng in vitro và là b c quy t đ nh kh  năng  ng d ng quá trình này trong

ể ạ ừ ạ ị ưỡ ố ố Đây là giai đo n chuy n cây con in vitro t tr ng thái s ng d  d ng sang s ng

ả ả ạ ả ề ệ ả ệ ộ ự ưỡ  d ng, do đó ph i đ m b o các đi u ki n ngo i c nh (nhi t đ , ánh hoàn toàn t sáng,

ẩ ể ể ộ ợ ườ ươ ư m đ , giá th ,…) phù h p đ  cây con đ t t ạ ỷ ệ ố  l s ng cao trong v n  m cũng nh

ồ ạ ữ ề ồ ấ 2.4 Nh ng v n đ  còn t n t ố i trong nhân gi ng cây tr ng

ề ặ ấ ị ề 2.4.1 Tính b t đ nh v  m t di truy n

ặ ậ ố ỹ ượ ử ụ ụ ằ ạ M c dù k  thu t nhân gi ng vô tính đã đ c s  d ng nh m m c đích t o ra

ể ấ ớ ố ượ ồ ồ ư ớ ươ ạ ng l n, nh ng ph ng pháp cũng t o ra ầ qu n th  cây tr ng đ ng nh t v i s  l nh ngữ

ị ế ế ấ ế ẹ ế ơ ị bi n d  t ấ  bào soma qua nuôi c y mô s o và nuôi c y t ữ  bào đ n. Nh ng bi n d  này

ượ ứ ậ ụ ệ ả ồ đ ố c nghiên c u v n d ng vào c i thi n gi ng cây tr ng (Evans và Sharp, 1986, 1988;

ư ữ ế ấ ị ượ Larkin, 1987) nh ng r t ít nh ng bi n d  có ích đ c báo cáo.

ị ế ị ế ồ ấ ườ ị ề ấ ượ ế Cây tr ng b  bi n d  t bào soma qua nuôi c y th ng là bi n d  v  ch t l ng,

ữ ế ề ấ ị ố ị ế ế ố ượ s  l ng, năng su t, và bi n d  này không di truy n. Nh ng nhân t gây ra bi n d  t

ầ ố ế ị ả ể ề ị ưở ề ủ ể ạ ở Ki u di truy n: t n s  bi n d  b   nh h ng b i ki u di truy n c a các lo i cây

ứ ộ ộ ể ộ ể ủ ả ồ ưở ị ự ầ Th  b i: m c đ  b i th  c a cây tr ng  nh h ế ự ế ng đ n s  bi n d  t nhiên và t n

ể ế ị ộ ề ộ ơ ị ị ể ố ế s  bi n d . Cây đa b i th  bi n d  nhi u h n cây nh  b i th .

ầ ố ế ố ầ ấ ố ầ ấ ề ề ề ị S  l n c y chuy n: s  l n c y chuy n càng nhi u thì cho t n s  bi n d  càng

ế ễ ể ề ắ ấ ơ ị cao. Bi n d  nhi m s c th  nhi u h n khi nuôi c y kéo dài (Amstrong và Phillips,

ố ầ ấ ầ ấ ữ ề ề ắ ả ờ ự 1988). S  l n c y chuy n ít và th i gian gi a hai l n c y chuy n ng n làm gi m s

ế ị ế ườ ự ế ả bi n d . Tái sinh t bào thông qua con đ ị ng phát sinh phôi cũng làm gi m s  bi n d ,

ư ề ả ồ nh ng không nhi u cây tr ng có kh  năng tái sinh qua quá trình phát sinh phôi.

ậ ủ ạ ồ ộ ượ ử ụ ấ ộ Lo i mô: các b  ph n c a cây tr ng đ c s  d ng trong nuôi c y mô có b  máy

ề ườ ấ ỉ ưở ồ di truy n khác nhau. Thông th ằ ng nuôi c y b ng đ nh sinh tr ng hay ch i bên

ậ ủ ư ẫ ấ ạ ị ể Có hai tác nhân làm h  m u nuôi c y in vitro: (1) B  vi sinh v t h y ho i, có th

ử ẫ ướ ườ ể ố ư ị kh  trùng m u tr ấ c khi nuôi c y vào môi tr ng. (2) B  virus hay th  gi ng nh  virus

ư ễ ẫ ả ưở ự ễ ề ạ xâm nhi m, không ho i m u nh ng có  nh h ng v  sau. Tuy nhiên có s  xâm nhi m

ư ậ ủ c a vi sinh v t nh  Agrobacterium, Baccilus, Corynebacterium, Erwinia,

ề ẽ ạ ẫ ế ắ ầ ể ẫ Pseudomonas vào nhu mô d n truy n s  h i m u khi t bào b t đ u phân chia. Đ

ễ ả ẫ ấ ỉ ở ự ự ệ ế gi m tác nhân gây nhi m, m u nuôi c y là mô phân sinh đ nh do đó s  s  bi t hóa t

ư ả ề ệ bào nhu mô dân truy n ch a x y ra quá trình bi t hóa.

ế ự ạ ề ạ ạ ấ ằ ố ẫ ủ Có nhi u lo i thu c kháng sinh trong nuôi c y mô, nh m h n ch  s  ho i m u c a

ư ậ vi sinh v t nh : AmphotericinB, Nystatin, Kanamycin, Rifambicin Vancomycin, và

ử ượ ừ ẩ ấ ố ơ penicilin kh  đ ố ấ c vi khu n gram (­) và gram (+), n m m c... t ng đ n ch t hay ph i

ồ ộ ử ậ ệ ụ ấ ộ ư ế ế bào, t bào ợ h p. N ng đ  kh  trùng 5 ­ 100 g/l ph  thu c vào v t li u nuôi c y nh  t tr nầ

ự ậ ấ ạ ả ố ớ ả ứ ụ ố hay mô. Mô th c v t r t nh y c m đ i v i tác d ng thu c kháng sinh và ph n  ng  khác

ả ấ ẩ ạ ủ ử ụ ự ủ ề ể ậ ấ

nhau lên ki u di truy n do đó ph i r t c n th n khi s  d ng. S  h y ho i c a ch t  kháng

ự ậ ả ở ử ồ ộ  plasmid hay mitochondria, x  lí càng lâu hay n ng đ sinh lên mô th c v t x y ra  càng

ễ ủ ế ẫ ổ ấ ấ ượ bào ch t hay DNA. Ch t kháng sinh đ c ế ự cao d  dàng d n đ n s  thay đ i gen c a t sử

ặ ự ẫ ượ ấ ư ễ ạ ẫ ườ ụ d ng ngăn ch n s  lây nhi m ho i m u, nh ng sau đó m u đ c c y sang môi tr ng

ệ ả ộ ừ ẫ ấ ấ ấ 2.4.4 Vi c s n xu t các ch t gây đ c t m u c y

ườ ệ ượ ấ ẫ ưở Th ng chúng ta hay th y hi n t ng hóa nâu hay hóa đen m u, sinh tr ủ ng c a

ị ư ẫ ặ ệ ượ ứ ề ẫ ấ ng này là do m u nuôi c y có ch a nhi u ẫ m u b  ngăn ch n hay h  m u. Hi n t ch tấ

ề ạ ơ ượ ư c đ a tanin hay hydrophenol, có nhi u trong mô già h n mô non. Than ho t tính đ vào

ườ ể ấ ề ặ ấ ợ môi tr ng đ  h p thu h p ch t phenol ngăn ch n quá trình hóa nâu và đen. Nhi u

ươ ự ượ ề ị ượ ọ ồ ề ph ả ng pháp làm gi m s  hóa nâu đ c đ  ngh  và đ c nhi u nhà khoa h c đ ng ý.

ử ụ ỏ ủ ẫ S  d ng m u nh  c a mô non.

ế ươ ử ẫ Gây ít v t th ng trên m u khi kh  trùng.

ẫ ị ấ Ngâm m u vào dung d ch ascorbic acid và citric acid vài gi ờ ướ  tr c khi c y.

ấ ườ ấ ầ ỏ Nuôi c y trong môi tr ng l ng oxy th p, không có đèn 1 ­ 2 tu n.

ẫ ừ ể ườ ấ ườ ộ ấ ồ Chuy n m u t môi tr ng có ch t kích thích sinh tr ng có n ng đ  th p sang

ườ ơ ộ ồ môi tr ng có n ng đ  cao h n.

ể ả ố ồ ỉ ệ Nhân gi ng vô tính in vitro ch  có hi u qu  khi cây con chuy n ra đ ng có t ỷ ệ  l

ộ ệ ượ ấ ố ấ ng trong nuôi c y mô làm cho t ỷ ệ  l cây s ng th p khi ố s ng cao. Có m t hi n t chuy nể

ỏ ễ ấ ấ ướ ệ ượ ủ ể c, đó là hi n t ng th y tinh th . cây ra kh i bình nuôi c y, cây non d  dàng m t n Đây

ộ ạ ượ ọ ằ ư ề ệ là m t d ng b nh sinh lý, đ c g i b ng nhi u tên khác nhau nh : Translucency,

ạ ượ ậ ấ c nh n th y khi nuôi Hyperhydration, Hyperhydric (Paek et al., 1991). D ng này đ c yấ

ườ ỏ ườ ượ ặ ệ ự ng l ng hay môi tr ng có hàm l ấ ng agar th p, đ c bi t khi có s  trao trên môi tr đ iổ

ơ ướ ậ ệ ượ ấ ả ở không khí th p, quá trình thoát h i n c t p trung trong cây, hi n t ng này x y ra

ứ ướ ủ ể ể ặ ố Đ c đi m cây th y tinh th : cây ch a n c trong su t.

ệ ượ ủ ể ệ ấ ặ Ngăn ch n hi n t ặ ứ ng th y tinh th : qua nghiên c u quá trình xu t hi n và đ c

ủ ộ ố ươ ữ ể ế ự ấ ứ ạ ệ ư ng th c h n ch  s  xu t hi n nh ủ ể đi m c a nh ng cây th y tinh th , có m t s  ph sau:

ự ấ ả ướ ằ ộ ườ ồ ấ Gi m s  tăng h p thu n c b ng cách tăng n ng đ  đ ng trong nuôi c y và dùng

ư ấ ấ ấ ươ ổ ự ổ ẩ các ch t có áp su t th m th u cao. Nh ng ph ng pháp này làm thay đ i s  t ng

ệ ụ ủ ứ ế ồ ợ ấ h p c u trúc không gian c a di p l c và  c ch  hình thành ch i.

ế ả ươ ử ế ẫ ấ ớ ườ ấ Gi m gây v t th ng trên m u qua ch t kh  trùng và ti p xúc v i môi tr ng c y

ặ ượ ự ể ở ộ ố ư ấ ồ ít nh t. ABA ngăn ch n đ ủ c s  hóa th y tinh th m t s  loài cây tr ng, nh ng

ấ ưở ụ các ch t kích thích sinh tr ng khác không có tác d ng.

ả ồ ườ ấ ộ ạ Gi m n ng đ  đ m trong môi tr ng nuôi c y.

ể ầ ườ ươ ả ưở ớ Chuy n cây in vitro thu n hóa ngoài v n  m không  nh h ng t ủ i cây th y tinh

ả ấ ằ ố Gi m ethylen trong bình nuôi c y b ng cách thông gió t t (Paek và Han).

ườ ả ộ ệ ộ ấ Tăng c ng đ  ánh sáng và gi m nhi t đ  trong phòng c y.

ế ươ ứ ự ủ ủ ệ ấ ả ấ ấ ả ậ K t lu n: ph ng th c hi u qu  nh t, ít nh t là gi m s  hóa th y tinh c a mô c y

ưở ủ ượ ướ ườ ằ ả ả ng c a hàm l ng n c trong môi tr ấ ng nuôi c y b ng in vitro, làm gi m  nh h cách

ộ ườ ệ ạ ườ ế ố ậ ệ ộ ề ng và t o đi u ki n môi tr ng (y u t v t lý, nhi t đ , ánh sáng, ồ tăng n ng đ  đ trao

Ứ ụ ấ ậ ỹ ế ệ 2.5  ng d ng k  thu t nuôi c y mô t bào trong nông nghi p

ề ứ ụ ệ ậ ả ố ố ồ ỹ K  thu t nhân gi ng in vitro có nhi u  ng d ng trong c i thi n gi ng cây tr ng:

ư ạ ố ồ ẹ ấ T o các cây con đ ng nh t và gi ng nh  cây m .

ộ ố ượ ớ ừ ộ ể ầ ắ ộ ờ Nhân m t s  l ng cây con l n t m t cá th  ban đ u trong m t th i gian ng n.

ệ ạ ạ T o ra các cây con s ch b nh.

ể ượ ố ộ ể ư ấ ả M t gi ng cây quý có th  đ c nhân ra nhanh chóng đ  đ a vào s n xu t.

ệ ố ượ ễ ổ Vi c trao đ i gi ng đ c d  dàng.

ố ượ ụ ậ ỹ Nhân gi ng vô tính in vitro đ c áp d ng ph  bi n. ổ ế K  thu t nhân nhanh in vitro

ớ ử ụ ể ậ ố ỏ ỹ ượ c nuôi khác v i các k  thu t khác do s  d ng các ki u nhân gi ng nh  in vitro, đ c yấ

ề ệ ổ ị ườ ệ ố ạ ấ ẳ ơ ng nuôi c y nhân t o và có h  s  nhân h n h n so trong đi u ki n  n đ nh và môi tr v iớ

ứ ụ Các  ng d ng nhân nhanh in vitro đ ượ ể ư c k  nh :

ầ ư ấ ệ ề ắ ờ ớ ớ Nhân nhanh các dòng lai m i trong th i gian ng n v i đi u ki n đ u t th p.

ị ệ ụ ồ ố Ph c tráng các gi ng cây tr ng b  b nh.

ạ ả ố ồ Nhân nhanh các gi ng cây tr ng có kh  năng nhân t o khó khăn.

ố ượ ề ả ặ ắ ả ờ Nhân nhanh s  l ố ẹ ng trong th i gian ng n và đ m b o đ c tính di truy n b  m .

ệ ả ả ả ấ ạ 2.5.2 S n xu t và b o qu n cây s ch b nh

ệ ệ ấ ạ ạ ả ả ố ừ ữ Công ngh  vi nhân gi ng có kh  năng s n xu t hàng lo t cây s ch b nh t nh ng

ị ệ ệ ằ ố ọ ượ cây b  b nh virus mà b ng bi n pháp hóa h c không phòng ch ng đ c.

ả ả ố 2.5.3 B o qu n và nhân gi ng in vitro

ươ ứ ạ ả ấ ớ ố Ph ố ng th c duy nh t an toàn cho lai gi ng và t o gi ng m i là ph i có ngân

ữ ậ ộ ấ ề ế ố ả t p đoàn gi ng cho đ n nay là m t v n đ  nan gi ữ i cho nh ng cây ố hàng gi ng. Gi tr ngồ

ả ả ằ ờ ộ ươ nhân vô tính hay đa b i. B o qu n in vitro trong th i gian dài b ng ph ng pháp sinh

ưở ướ ầ ả ế ượ ư ữ ế ầ ổ ộ ậ ng ch m b c đ u đã gi i quy t đ c m t ph n, nh ng nh ng bi n đ i di tr truy n cóề

ế ữ ể ạ ế ả ả ấ ờ ị kh  năng x y ra qua th i gian nuôi c y kéo dài, đ  h n ch  nh ng bi n d  này Withers

ị ả ề ả ằ ố ươ ạ và Street (1977) đã đ  ngh  b o qu n gi ng b ng ph ơ ở ủ ng pháp l nh sâu. C  s  c a

ươ ấ ủ ậ ả ặ ổ ở ệ ng pháp này là làm ch m hay ngăn ch n kh  năng trao đ i ch t c a mô nhi t ph đ  ­ộ

ượ ả ươ ư ạ ả c b o qu n theo ph ấ   ng pháp l nh sâu nh : nuôi c y ả 196oC. Có kho ng 40 loài đã đ tế

ế ầ ỉ ưở ẹ bào, mô s o, phôi, t bào tr n hay đ nh sinh tr ng (Karth, 1987).

ấ ưở ự ậ ề 2.6 Ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t (ĐHSTTV)

ề ấ ưở ượ ử ụ ấ Hai nhóm ch t đi u hòa sinh tr ng đ c s  d ng trong nuôi c y mô là auxin

ủ ế ủ ế ủ ụ ể ự Tác d ng sinh lý c a auxin ch  y u làm tăng th  tích c a t bào, kích thích s

ự ễ ưở ự ụ ủ ụ ồ hình thành r , kìm hãm s  sinh tr ả ng c a ch i bên, kìm hãm s  r ng hoa, r ng qu .

ạ ấ ợ ử ả ự Auxin ho t hóa các h p ch t cao phân t (protein, cellulose, pectin) và ngăn c n s

ả ượ ự ậ ấ ọ phân gi i chúng. Auxin đ c xem là hormone th c v t quan tr ng nh t vì chúng có vai

ấ ơ ả ố ợ ưở ệ ế ế ự trò r t c  b n trong quá trình ph i h p sinh tr ng và bi t hóa t ầ  bào c n thi t cho s

ườ ộ ố ấ ự ậ ủ ề ả ớ ỉ ể phát tri n bình th ng c a th c v t. Auxin cùng v i m t s  ch t đi u ch nh khác đ m

ự ạ ố ế ơ ể ự ậ ỉ ả b o cho s  t o thành kh i các t bào đang phân chia thành c  th  th c v t hoàn ch nh.

ấ ườ ử ụ ấ Trong nuôi c y mô th ư ng s  d ng các ch t nh :

α ­ ­ Naphthyl acetic acid (NAA)

­ 2,4­Dichlorphenol acetic acid (2,4D)

ự ụ ưở ủ ế ấ Cytokinin có tác d ng kích thích s  sinh tr ng c a t bào c y mô và làm tăng

ở ồ ự ạ ụ ồ ồ ộ ố ộ t c đ  phân bào.khi ờ ứ  n ng đ  cao, nó có tác d ng kích thích s  t o ch i, đ ng th i  c

ả ấ ủ ế ự ệ Cytokinin có hi u qu  r t rõ trên s  phân chia c a t bào, trong quá trình này

ầ ế ộ ỷ ư ệ ặ ắ cytokinin c n thi ả ế t nh ng chúng không có hi u qu  n u v ng m t auxin. Trong m t t

ạ ễ ạ ồ ườ ệ ữ l gi a cytokinin và auxin thì có kích thích t o ch i hay t o r , thông th ng cytokinin

ạ ơ ồ ự ạ ơ cao h n auxin thì kích thích t o ch i còn ng ượ ạ c l i auxin cao h n thì kích thích s  t o

ơ ể ự ậ ấ ớ ụ ườ ự ổ ợ ng s  t ng h p ễ r . Trong c  th  th c v t cytokinin có tác d ng r t l n là tăng c ADN

ấ ổ và protein, kích thích quá trình trao đ i ch t.

ấ ồ Bao g m các nhóm ch t: 6­Benzylaaminopurin(BAP), 6­furpurin aminoopurin

(kinetin), Zeatin, Thidiazuron(TDZ).

ọ ụ H  ph  (Subfamily):

ụ Tông ph  (subtribe):

Nhóm (Alliance):

ố Gi ng (Genus):

Loài (Species):

ệ ồ ệ ồ ệ ể ế Tên ti ng vi t: lan h  đi p, ti u h  đi p.

ồ ệ ượ ấ ầ ượ ị ướ Lan h  đi p đ c tìm th y vào năm 1750, đ u tiên đ c Rumphius xác đ nh d i

ồ ạ ế tên Angraecum. Đ n năm 1753, Linne đ i l i là Epidendrum amabile. Chi Phalaenopsis

ồ ệ ệ ọ do C. L Blume phát hi n vào năm 1825. Phalaenopsis hay còn g i là lan h  đi p. Tên

ệ ừ ế ấ ướ ạ Phalaenopsis xu t hi n t ti ng Hy L p: “Phalaina” (con b m đêm) và “opsis”(trông

ư ươ ướ ư ộ ố gi ng nh ), nghĩa là m t loài hoa có hình dáng nh  b m b m.

ồ ệ Hình 2.1: Cây và hoa lan h  đi p (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail)

ầ ượ ồ ệ Năm 1887, loài h  đi p lai đ u tiên đ ớ c J. Veitch đăng kí v i tên P. harriettiae,

ữ ề ấ ạ vi c k t h p gi a P.amabilis và P.violacea. Sau đó, có r t nhi u loài lan lai t o ra ừ ệ ế ợ t làm

ự ủ ề ạ tăng thêm s  đa d ng và huy n bí c a Phalaenopsis.

ư ố ố ồ ở ả Gi ng Phalaenopsis g m 21 loài lan phát sinh,  a nóng, s ng bán đ o Mã Lai,

Ấ ộ ố ỉ ặ Indonexia, Phillipine, các t nh phía đông  n Đ , và Châu Úc. Chúng s ng trên cây ho c

ậ ẩ ơ ộ trên đá, n i có khí h u nóng  m, đ  cao trên 2000m.

ể ắ ặ ồ ệ ừ Ở ệ  Vi ộ ố t Nam, chúng ta có th  b t g p m t s  loài lan h  đi p trong các khu r ng

ồ ệ ấ ồ ệ ồ ệ ư ẹ nh  P. coenu (h  đi p d p), P. mannii ( h  đi p  n), P.parishii ( h  đi p trung), P.

ồ ệ ộ ơ ả ộ ụ ạ ồ Lan h  đi p thu c nhóm lan đ n thân không có gi hành, g m m t tr c chính t o

ở ưở ạ ộ ụ ấ ắ ố ườ ượ ộ ỉ ra b i m t đ nh sinh tr ng ho t đ ng liên t c. Các đ t thân r t ng n và th ng đ c

ọ ở ế ẹ ề ọ ọ ướ c hình elip bao b c b i hai hàng b  lá x p d c chi u dài thân. Hai hàng lá m ng n x pế

ệ ẹ ạ ấ ướ ụ ọ ớ i cùng héo r ng thì m i có lá khác m c lên ố đ i di n, t o thành b  ôm l y thân, lá d từ

ưở ườ ự ữ ơ ạ ng bình th ng, do không có c  quan d  tr  chuyên ng n. Trong giai đo n tăng tr bi ọ tệ

ự ế ứ ộ ọ ướ ể ầ ấ ự ữ ượ c ch a tr c ti p trong b  lá m ng n c và chuy n d n lên phát nên ch t d  tr  đ hoa

ọ ổ ậ ươ ộ ườ ấ ễ khi cây ra hoa, chính vì v y mà m i t n th ng trên b  lá th ố ng r t d  gây ra th i

ườ ộ ừ ệ ở ộ ố ể nhũn. Thông th ng m t cây có t ạ ộ  4 ­ 5 lá ho t đ ng, cá bi m t s  loài có th  có ít t

ề ặ ơ ơ h n (P. borneo, P.violaceae) ho c nhi u h n .

ộ ụ ỗ ụ ồ ế ồ ồ M i tr c lá có hai ch i x p ch ng, ch i bên trên cho ra m t tr c phát hoa sau khi

ồ ướ ộ ườ ự ố ề ợ ả ứ c m  ng ra hoa, ch i bên d i cho ra m t cây con trong tr ạ ng h p có s  c  v  ho t

ễ ấ ị ọ ừ ố ủ ự ẹ ề ấ R  b t đ nh khí sinh r t nhi u, m c t g c c a thân xuyên qua b  lá. S  phân

ủ ễ ụ ạ ưở ễ ậ ớ ớ ủ ố ng c a cây. R  m p v i l p mô x p ộ nhánh c a r  ph  thu c vào giai đo n tăng tr đ cặ

ơ ướ ụ ư ệ ễ ố ớ tr ng cho r  khí sinh dày, làm nhi m v  hút h i n c trong không khí, trong l p x p

ậ ượ ấ ễ ứ ề ạ ẩ ộ ệ   c n m và nhi u lo i vi khu n lam c ng sinh. Mô r  ch a di p ể này có th  phân l p đ l cụ

ể ự ệ ợ có th  th c hi n quá trình quang h p.

ở ườ ụ ộ ọ Phát hoa hình thành nách lá (th ng là m t phát hoa). Hoa m c thành c m,

ố ứ ế ạ ờ ng tính, đ i x ng hai bên. Bao hoa d ng cánh, r i nhau, x p thành hai vòng: ba ưỡ l m nhả

ứ ả ả ắ ạ ơ vòng ngoài và hai m nh vòng trong bé h n, m nh th  ba có màu s c và hình d ng khác

ọ ố ườ ứ ụ ậ ị ế ng kéo dài ra ch a tuy n m t. Nh  và nh y ẳ h n g i là cánh môi. G c cánh môi th dính

ấ ạ ườ ạ ấ ố ở ướ H t ph n th ng dính l i thành kh i ph n, có chuôi và gót dính phía d i. Hai

ộ ụ ồ ầ ấ ở ớ ố kh i ph n ngăn cách nhau b i trung đ i. B  nh y g m ba lá noãn dính nhau thành b u

ướ ụ ơ ề ả ở d ị ả i, mang nhi u noãn, đính bên (Hoàng Th  S n, 2003). C  cành hoa n  liên t c h n

ề ả ộ ỗ ử n a năm. Trung bình m t phát hoa cho 7 – 15 hoa. M i hoa b n kho ng 2 tháng.

ồ ệ ở ằ ả ủ ạ ả ọ ộ Qu  c a lan h  đi p thu c lo i qu  nang, m  b ng các khe nút d c theo hai bên

ứ ấ ể ừ ủ ề ạ ạ ả ố ng c a giá noãn. Qu  lan ch a r t nhi u h t, tùy vào gi ng, loài mà h t có th  t ườ đ vài

ế ạ ầ ể ạ ưở ả ạ ạ ở ng thành, h t n trăm đ n vài ngàn h t. H t c n tr i qua 130 – 150 ngày đ  h t tr sau

ạ ỏ ượ ạ ị ế ư ạ ụ ầ ớ ứ c gió mang xa nh  h t b i, ph n l n h t b  ch t vì ch a phôi 90 ngày. H t nh  đ ch aư

ễ ả ả ạ ấ ầ ố phân hóa. Theo Bernard (1909), h t lan mu n n y m m ph i nhi m n m Rhizoctonia  vì

ạ ấ ụ ự ự ệ ậ ở ườ i ta lo i n m này có tác d ng kh i phát s  tái l p phân bào. Trong th c nghi m, ng có

ử ụ ứ ằ ấ ẩ ơ ố ể th  đánh th c các “ phôi s  khai” (protocorm) khi s  d ng s c th m th u b ng cách  nuôi

ạ ườ ứ ấ c y h t trên môi tr ng ch a sucrose.

ồ ệ ổ ả ụ ạ ệ ề ạ i Tr i lan, Vi n KHNN Mi n Hình 2.3: Trái lan h  đi p 3 tháng tu i ( nh ch p t Nam)

ồ ệ ủ Hình 2.4: Keiki c a lan h  đi p (http://www.orchidshome.com)

ỉ ộ ọ ừ ộ ộ ố ỏ ư ắ ố Keiki ch  m t cây con m c t m t m t trên cu ng hoa. M t s  loài hoa nh  nh

ườ ệ ượ ạ ố ượ ng t o Keiki trên cu ng hoa. Hi n t ng này đ c Williams P. lueddemanniana th mô

ả ầ t đ u tiên vào năm 1894 (Williams và Williams, 1894).

ể ượ ở ộ ố ề Keiki còn có th  đ c hình thành ộ  nhi u loài Phalaenopsis và m t s  loài thu c

ướ ậ ợ ẽ ạ ệ ề các chi lai. Các cây Phalaenopsis d ồ i đi u ki n nuôi tr ng không thu n l i s  t o ra

ặ ệ ỉ ố keiki trên cu ng hoa, đ c bi ị ắ ỏ t khi đ nh đã b  c t b .

ặ ấ ồ ệ ệ ề ể ồ ượ Vi c tr ng và chăm sóc lan h  đi p g p r t nhi u khó khăn, đ  có đ ữ c nh ng cây

ạ ẹ ầ ả ố ứ ậ ờ

ề ỏ kh e m nh, cho hoa đ p c n ph i t n nhi u công s c và th i gian chăm sóc, vì v y  vi cệ

ợ ủ ệ ầ ệ ố ề ể ề ố ế ể ượ tìm hi u đi u ki n s ng phù h p c a gi ng lan này là đi u ki n c n thi t đ  có đ c

ồ ệ ộ ở ệ ớ ự ưở ị ả ủ H  đi p là m t loài lan vùng nhi t đ i mà s  tăng tr ng c a chúng ch u  nh

ư ắ ồ ệ ệ ở ữ ủ ệ ấ ỉ ng c a hai mùa m a n ng rõ r t. Tuy nhiên lan h  đi p ch  xu t hi n nh ng ưở h vùng

ự ế ể ề ặ ố ộ ệ ộ ộ ữ ẩ t đ  và  m đ  gi a ừ ẩ r ng  m ho c ven su i. Không có s  bi n đ ng đáng k  v  nhi mùa

ơ ồ ệ ồ ệ ỉ ặ ế ố ư m a và mùa khô n i h  đi p sinh s ng, vì th  cây h  đi p không có mùa ngh  m c dù  do

ồ ệ ưở ậ ơ ự ấ ợ ề ờ ế s  b t l i v  th i ti t trong mùa khô, cây h  đi p tăng tr ớ ng ch m h n chút ít so v i

ư ệ ự ề ệ ộ ồ ệ ợ ưở nhiên). Nhi t đ  thích h p cho lan h  đi p sinh tr ng mùa m a (trong đi u ki n t và

ồ ệ ể phát tri n là 18oC vào ban đêm và 22oC ­ 25oC vào ban ngày. Tuy nhiên h  đi p là loài

ị ể ố ơ ưở ố ở ấ ng khá t b t t lan ch u nóng h n đa s  các loài khác, do đó nó cũng có th  tăng tr cứ

ệ ộ ơ n i nào nhi t đ  không quá 35oC vào ban ngày và 25oC vào ban đêm.

ữ ệ ề ộ ộ Đây là loài lan có biên đ  khá r ng v  ánh sáng, ánh sáng h u hi u cho loài lan

ế ớ ợ ộ này là 30%. Vì th  v i giàn che có đ  che sáng 70% là thích h p. Đây là loài lan duy

ị ượ ự ế ư ế ủ ầ ơ c ánh sáng y u, nh ng th c t nhu c u ánh sáng c a chúng cao h n ấ nh t ch u đ nhi u,ề

ế ồ ệ ấ ầ ặ ơ ế ự t cho s vì th  không nên đ t lan h  đi p vào n i quá râm mát. Ánh sáng r t c n thi tăng

ồ ệ ớ ộ ư ả ậ ưở ệ ơ H  đi p v i b  lá màu xanh đ m ch a ph i là cây lí t ng cho vi c ra hoa, h n

ệ ề ệ ẳ ồ ượ ặ ơ c đ t n i ữ n a cây tr ng trong đi u ki n này có kh  năng kháng b nh kém. Cây lan đ có

ả ớ ộ ừ ế ẹ ố ánh sáng khu ch tán v a ph i v i b  lá có màu xanh, có ánh sáng nh  màu vàng là t t

ồ ệ ượ ế ồ ớ ờ ế Ở ệ  Vi t Nam, n u cây lan h  đi p đ c tr ng v i 12 gi chi u sáng trong ngày,

ờ ậ ượ ự ế ể ố ẽ ả trong đó kho ng 1 ­ 2 gi cây nh n đ c ánh sáng tr c ti p, cây s  phát tri n t t

ạ ơ ồ ệ ả ự ữ ướ ơ ữ ệ H  đi p là lo i đ n thân, không có gi hành nên không d  tr  n c, h n n a di n

ố ơ ủ ả ế ả ấ ớ ỉ tích b c h i c a b n lá khá l n và chúng không có mùa ngh  vì th  ph i cung c p cho

ượ ướ ầ ủ ườ ư ố ỗ chúng l ng n c đ y đ  và th ng xuyên trong su t năm. Trong mùa m a m i ngày

ả ướ ừ ữ ộ ầ ư ầ ờ ộ ầ i cho chúng 2 l n, tr  nh ng ngày có m a, m t l n vào 9 gi sáng, m t l n ph i t lúc 3

ờ ướ ư ậ ẽ ả ờ ố ả ề  chi u. T i nh  v y s  đ m b o cho cây khô ráo khi tr i t ọ i vì đ ng n ướ ở c nách gi lá

ể ấ ố ố ố ướ ể ướ su t đêm có th  gây th i lá. T t nh t nên t ướ ừ i t ố  trên xu ng và t i nghiêng đ  n c

ắ ọ ướ ờ ế ở ế ầ không đ ng trên hoa. Vào mùa n ng nên t i chúng 3 l n/ngày. N u th i ti t tr  nên

ả ợ ạ ướ ấ ớ ướ ể ị ướ quá l nh thì ph i đ i cho n ơ c  m h n m i t i cây đ  cây không b  rét vì n c quá

ồ ệ ầ ộ ẩ ầ ẩ ả Lan h  đi p c n đ   m cao vào ban ngày, lá c n không khí  m kho ng 80%.

ể ướ ể ộ ẩ ề ậ ầ Ở ạ c nhi u trong ch u, c n đ  đ   m không khí cao. vùng khô h n, Không đ  n chúng

ộ ẩ ằ ặ ộ ướ ậ ể c (không đ  đáy ch u ầ ta c n tăng đ   m b ng cách đ t cây phía trên m t khay n đ ngụ

ướ ệ ề ể ạ vào n c). Không nên đ  cây trong đi u ki n khô h n quá lâu.

ầ ượ ễ ể ấ ẩ Cây c n đ c thông thoáng cao đ  tránh vi khu n và vi n m gây viêm nhi m.

ộ ố ẩ ễ ẽ ễ ể ả ầ ắ ỏ ữ ế ấ ầ ề i quy t nh ng v n đ  này, c n c t b  ph n M t s  vi khu n r  s  làm úng r . Đ  gi lá bị

ể ệ ề ố ướ ị c khi x t ễ nhi m, dùng thu c mancozeb, sau đó đ  cây trong đi u ki n khô ráo tr thu cố

ể ệ ử ử ộ kh  trùng benzyl konium chloride đ  di t bào t ậ  quanh cây và ch u. Sau đó tăng đ

ể ạ ỏ ử thông thoáng cho cây lên đ  lo i b  hoàn toàn nguyên nhân này. Trong khi x  lí cây nên

ể ể ế ượ ự gi ữ ề ặ ượ  b  m t đ c khô ráo trong giây lát. N u không th  đ  cây đ c thông thoáng t

ể ả ệ ộ ẹ ạ ấ nhiên có th  gi m nhi t đ  vào ngày nóng và s y khô nh  cho cây vào đêm l nh.

ử ụ ạ ở ậ ậ Nên s  d ng các lo i ch u thông thoáng, có vòm đáy gi ữ ướ  n ạ c. Các lo i ch u

ấ ằ ậ ữ ẩ ậ ớ m khi gió l n. Còn các ch u có ự nh a giúp mau khô thoáng, ch u b ng đ t giúp gi kích

ướ ể ố ợ ộ ẩ ẽ ả ậ th ể ộ ễ c phù h p đ  b  r  phát tri n t t vì các ch u quá to s  làm gi m đ   m.

ể ỏ ố ớ ộ ớ ử ụ ậ Đ i v i các cây trong ch u cao 13, 18, 25 cm thì s  d ng m t l p giá th  (v  cây,

ạ ố ả ạ ớ ộ ậ ồ t. Tr ng cây vào ch u, sau ớ d n) dày kho ng 13 cm tr n v i 20% than ho t tính lo i t đó

ề ặ ỗ ợ ể ươ ễ ử ụ ỗ ợ ng t ự ể ữ ẩ  đ  gi m cho r . S  d ng h n h p ậ thêm lên b  m t ch u h n h p giá th  t giá

ẩ ướ ể ợ th  phù h p, không quá khô cũng không quá  m t.

ượ ồ ườ ươ ệ ươ ữ ề ặ ơ ự Cây nên đ c tr ng trong v n  m ho c nh ng n i có đi u ki n t ng t

ả ượ ư ừ ể ồ nh ng ph i đ c thông khí t hai phía. Chúng ta còn có th  tr ng cây bên ngoài nhà

ướ ẩ ợ ộ kính, trong các hành lang, sân nhà có rào, h ầ ng nam, khi đó cây c n có  m đ  phù h p

ượ ử ổ ướ ừ ủ ể ạ ứ và h ng đ c ánh sáng v a đ , nên đ  cây c nh c a s  h ề ng nam, nhi u bóng râm là

ườ ầ ượ ầ ầ ầ ỗ Thông th ng c n bón phân cho cây 2 l n m i tu n. Cây c n đ c bón phân

ườ ể ữ ượ ử ụ ạ ng xuyên vì chúng không th  gi đ c phân bón lâu. Nên s  d ng các lo i bình th x tị

ụ ấ ấ ưỡ ố ấ ấ ữ ẩ ể ướ ướ đ  t i t là giúp lá h p th  ch t dinh d ng t t nh t và dùng thêm ch t gi m pha

ư ạ vào phân. Phân bón tùy giai đo n nh  sau:

ộ ạ ấ ồ ­  Khi cây ra hoa nên bón 6,9N ­ 10,8P ­ 27,1K vào mùa thu. N ng đ  đ m th p

ưở ễ ưở ố ạ giúp lá tăng tr ng, P giúp r  tăng tr ng t ứ t và K giúp cây c ng cáp, t o phát

ử ụ ể ế ị ­  Vào tháng 5 đ n tháng 10, s  d ng dung d ch: 17,5N ­ 4,6P ­ 22,5K đ  cây phát

ầ ướ ừ ế ế ­  T  tháng 10 đ n tháng 12 c n t i 20,3N ­ 3,3P ­ 17K giúp cho t bào phân chia

ộ ố ườ ế ử ụ ẽ ị ề ế ợ nhanh. Tuy nhiên, m t s  tr ng h p cây s  b  m m và y u n u s  d ng quá lâu.

ắ ỏ ễ ư ỏ ủ ẩ ị ử ớ Chú ý c t b  r  h  h ng c a cây và r a v i dung d ch mancozeb chu n trong 10

ử ụ ể ệ ạ ẩ phút. S  d ng dao s ch khu n đ  phòng b nh cho cây.

ể ể ầ ớ ờ ượ ạ Vào th i đi m có hoa c n chú ý t o dáng cho cành hoa s m đ  có đ c vòm hoa

ắ ầ ộ ụ ể ầ ờ ẹ đ p. Khi c m hoa b t đ u r , chúng ta không nên di chuy n cây, th i gian này c n  tăng

ưỡ ườ c ng ánh sáng và dinh d ng cho cây.

ữ ằ ố ạ 2.7.5.1 Nhân gi ng h u tính b ng h t

ự ụ ấ ủ ự ủ ệ Trong thiên nhiên s  th  ph n c a lan do côn trùng th c hi n. Cánh môi c a hoa

ấ ạ ặ ạ ệ ậ ợ ế ậ ớ t thu n l i cho côn trùng đ u vào, ti p xúc v i lan có hình d ng và c u t o đ c bi kh iố

ấ ườ ng, đ  đ t t ể ạ ỷ ệ ụ ấ  l th  ph n thành công cao, con ph n và mang ph n đi. Thông th ng ấ iườ

ự ậ ượ Năm 1899, nhà th c v t Pháp Noel Bernard đã khám phá ra đ c nguyên nhân

ặ ủ ấ ễ ế ế ự ể ả ầ ạ

làm cho h t lan có th  n y m m liên quan đ n s  có m t c a n m r . N u không có  n mấ

ể ả ồ ớ ấ ườ ạ ng cho h t ầ ộ c ng sinh thì lan không th  n y m m. V i vai trò là ngu n cung c p đ lan,

ễ ợ ủ ấ ậ ấ ồ ệ ố h  th ng r  s i c a n m xâm nh p vào trong phôi và cung c p ngu n cacbon cho phôi

ứ ệ ằ ấ ườ ở Năm 1922, Knudsun đã nghiên c u thành công vi c thay n m b ng đ ng môi

ư ể ể ạ ạ ả ầ ạ ạ ườ ng th ch đ  gieo h t. Gieo h t in vitro có th  làm cho các h t ch a chín n y m m tr và

ử ể ử ả ễ ả ả ơ ủ ệ vi c kh  trùng c  qu  d  dàng h n. Khi q a đã chín 2/3 có th  kh  trùng qu  bàng  dung

ố ẩ ể ấ ạ ồ ỏ ộ

ị d ch thu c t y và c n. Sau đó dùng m t con dao tách v  và l y h t ra đ  lên môi  ngườ tr

ạ ả ề ệ ầ ấ ượ ể nuôi c y trong đi u ki n vô trùng. Sau khi h t n y m m đ c 30 ­ 60 ngày chuy n cây

ườ ễ ườ ớ ừ ể con sang môi tr ng m i. R  th ng hình thành khi cây con có t ấ  2 ­ 3 lá. C y chuy n

ậ ộ ả ỗ ồ ờ cây con sau m i 30 ­ 60 ngày đ ng th i gi m m t đ  cây trong bình.

ố ừ ạ ế ấ ả Quá trình nhân gi ng t ể  h t cho đ n khi cây có th  ra hoa m t kho ng 4 năm

ặ ề ộ ặ ổ ậ ở ể ơ ố ế ọ  các cây h  lan là bi n ho c nhi u h n tùy gi ng. Tuy nhiên, m t đ c đi m n i b t  dị

ườ ề ễ ạ ự ạ ả x y ra th ng xuyên và d  dàng, đi u này đã giúp mang l i s  đa d ng cho các loài lan

ư ạ ố nh ng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân gi ng vì các cây con t o thành t ừ ạ  h t

ằ ố ế 2.7.5.2 Nhân gi ng vô tính b ng cách tách chi t

ờ ụ ấ ố ớ ầ ưở Th i v  tách chi ế ố t t t nh t đ i v i các loài lan là vào đ u mùa tăng tr ng. Trong

ộ ố ể ạ ậ ặ ồ t ho c tr ng trong các nhà kính mang ti u khí h u nhân t o thì có ệ ẩ ề đi u ki n  m đ  t thể

ờ ỳ ố ưở ủ ượ ắ ờ ừ ạ Vào th i k  cu i mùa sinh tr ng c a cây, cây đ c c t r i thành t ng đo n lan

ữ ắ ỏ ấ ậ ờ ộ ẫ và v n gi ễ ư ồ ử  nguyên trong ch u. Sau m t th i gian, l y cây đem c t b  các r  h  r i r a

ử ể ị ệ ế ạ ặ ầ ố ệ t h t m m m ng gây b nh. Sau đó đ t các đo n ằ b ng dung d ch kh  trùng đ  tiêu di lan

ế ữ ể ớ ở ơ ệ ẩ ề ộ ừ v a tách chi ậ t vào gi a ch u m i. Đ  cây n i có đi u ki n  m đ  và ánh sáng thích

ạ ụ ể ể ớ ừ ưở ể ố ợ h p v i t ng lo i c  th  đ  cây sinh tr ng và phát tri n t t.

ữ ơ ả ư ồ ư Nh ng loài lan đ n thân nh  Phalaenopsis không có gi hành nh ng tr ng lâu

ố ắ ồ ề ễ ễ ắ ẫ ầ ọ năm cây v n cao lên, có nhi u r  gió. Mu n c t tr ng nên c t ph n ng n có 3 r , bôi

ố ể ậ ễ ắ ầ ố ớ ỗ thu c kích thích ra r , dùng giá th  th t thoáng v i than g  to. Ph n bên g c cây c t  sát

ở ỗ ắ ể ẽ ầ ế ặ ẽ ả s  n y ra 2 ­ 3 cây con nách lá g n ch  c t. Có th  dùng dây k m si ữ t ch t gi a thân

ướ ỗ ộ ẽ ọ ắ ỏ ừ ắ i ch  c t s  m c ra 2 ­ 3 cây con. Khi hoa tàn thì c t b  ch a 3 ­ 4 m t phía cây, d trên

ẽ ọ ữ ể ắ ồ phát hoa, nh ng m t này s  m c lên cây con. Phalaenopsis tr ng lâu năm có th  ra cây

ệ ằ ố ươ ế ạ ượ ề Vi c nhân gi ng vô tính b ng ph ng pháp tách chi ố t truy n th ng t o đ c cây

ơ ữ ệ ố ư ấ ấ ấ ấ ố ờ ồ con đ ng nh t nh ng th i gian nhân gi ng r t dài và h  s  nhân r t th p, h n n a cây

ứ ố ạ con t o thành có s c s ng không cao.

ấ ễ ả ể ạ ế ế ệ ầ ạ ậ ấ ố ị H u h t các gi ng lan r t d  x y ra bi n d , vì v y vi c nuôi c y h t không th  t o

ạ ầ ể ả ấ ấ ồ ồ ậ c cây con đ ng nh t (Arditti, 1992). Vì v y, đ  s n xu t cây con đ ng lo t c n ượ đ ph iả

ươ ố ụ áp d ng ph ng pháp nhân gi ng vô tính.

ẫ ấ ạ ấ ố ớ ồ Khó khăn l n nh t trong nhân gi ng vô tính Phalaenopsis là ngu n m u r t h n

ế ử ụ ư ề ể ấ ơ

ồ ỉ ch  do chúng là lan đ n thân, s  d ng ch i đ nh đ  nuôi c y nh  nhi u loài lan khác  sẽ

ươ ơ ữ ẹ ườ ổ làm t n th ng cây m  (Intuwong và Sagawa, 1974). H n n a, Phalaenopsis th ng

ề ấ ợ ừ ề ặ ắ ườ ấ ẫ ộ t nhi u h p ch t phenol t b  m t c t ra môi tr ng nuôi c y, gây đ c cho m u ế ti (Fast,

ộ ố ươ ố ượ M t s  ph ng pháp nhân gi ng vô tính Phalaenopsis thành công đ c trình bày

ử ụ ồ ỉ ố 2.8.1 Nhân gi ng vô tính s  d ng ch i đ nh

ồ ỉ ị ổ ủ ươ ặ ả ượ Ch i đ nh c a cây Phalaenopsis khi b  t n th ỗ ng ho c già c i có kh  năng đ c

ượ ồ ừ ề ặ ộ ủ ở ố ừ ạ t o ra đ c m t ho c nhi u ch i t ồ  các ch i ng g c. T  quan sát này, các nhà làm

ạ ầ ướ ủ ễ ấ ẻ ạ ắ n đã m nh d n c t ph n phía d i các r  khí c a cây và nuôi c y riêng l chúng ườ v để

ớ ố nhân thành các cây m i theo ý mu n.

ươ ượ ổ ế ể ừ ầ ể ấ ồ Ph ng pháp này đ c xem là ph  bi n nh t. Ch i có th  phát tri n t ố  ph n g c

ượ ấ ở ừ ươ ầ ộ ồ c nuôi c y 27oC (Tr n Thanh Vân, 1974). T  ph ng pháp này, m t ch i khi đ ban

ể ạ ầ ồ ồ ầ đ u có th  t o ra 3 ­ 4 ch i khác trong 10 tháng (Tr n Thanh Vân, 1974). Các ch i sinh

ụ ể ồ ừ ồ ẽ ạ ỗ ủ ng phát tri n thành ch i ng  trên tr c cây Phalaenopsis, t nách lá m i ch i s  t o ưỡ d ra

ồ ớ 2 ch i m i (Koch, 1974, Holters, 1983).

ươ ử ụ ồ ỉ ượ ứ ụ ề Ph ng pháp s  d ng ch i đ nh đ c  ng d ng thành công cho nhi u loài lan.

ố ớ ử ụ ư ơ ươ Tuy nhiên, đ i v i các loài lan đ n thân nh  Phalaenopsis, khi s  d ng ph ng pháp

ấ ồ ỉ ẽ ổ ươ ẹ ệ ươ ng cây m , do đó, hi n nay ph ng pháp nhân nuôi c y ch i đ nh s  làm t n th gi ngố

ượ ử ụ ổ ế ơ ử ụ s  d ng phát hoa đ c s  d ng ph  bi n h n.

ồ ừ 2.8.2 Tái sinh ch i t phát hoa Phalaenopsis

ườ ầ ồ ệ ệ Gavino Rotor là ng ố i đ u tiên trong vi c nhân gi ng vô tính in vitro lan h  đi p

ứ ạ ọ khi còn là nghiên c u sinh Lawrence McDaniels Đ i H c Cornell (Rotor, 1949). Ông đã

ồ ắ ắ ạ ỏ ộ ử ụ s  d ng phát hoa đã b  lá b c mang 4 ­ 6 ch i, c t phát hoa thành các đo n mang m t

ồ ằ ầ ắ ề ặ ử ữ ắ

ch i n m gi a cách hai đ u c t 7 ­ 8 cm. Sau đó kh  trùng b  m t và c t vô trùng  thành

ầ ạ ồ các đo n mang ch i cách hai đ u 1­ 2 cm.

ấ ạ ườ ạ ớ C y các đo n phát hoa vào môi tr ắ ng Knudson C làm r n v i agar, các đo n

ượ ắ ồ ướ ẳ phát hoa đ c c m th ng cho ch i h ng lên.

ươ ượ ế ệ ố ễ ấ Ph ủ ng pháp c a Rotor ít đ c chú ý đ n do t ỷ ệ  l nhi m cao và h  s  nhân th p.

ữ ư ề ạ ớ ự ứ Nh ng 10 năm sau đó nh ng nhà nghiên c u khác đã t o ra nhi u quy trình m i d a

ươ trên ph ng pháp này (Sagawa và Niimoto, 1960; Sagawa, 1961; Kotomori và

ừ ồ ệ Hình 2.5: Quy trình tái sinh cây con t phát hoa lan h  đi p

ươ ố ừ ươ ư ở Ph ng pháp nhân gi ng t phát hoa là ph ặ ng pháp đ c tr ng Phalaenopsis.

Ư ể ủ ươ ấ ề ệ ạ ạ ồ u đi m chính c a ph ng pháp này là t o ra cây con s ch b nh và đ ng nh t v  di

ề ể ạ ượ ề ề ạ ố ố ệ c. Ngoài ra, vi c nhân gi ng truy n, đi u mà gieo h t truy n th ng không th  đ t đ in

ừ ư ể ổ ươ ẹ ệ ớ vitro t ớ  phát hoa có  u đi m l n là không làm t n th ng cây m , so v i vi c nhân

ừ ọ ặ ưở ừ ẹ ươ ố gi ng t ồ  ng n ch i ho c lá tr ng thành t cây m . Tuy nhiên, ph ng pháp này có

ệ ố ế ể ấ ậ ươ ố ừ khuy t đi m là h  s  nhân th p. Do v y ph ng pháp nhân gi ng vô tính t phát hoa

ườ ượ ử ụ ể ạ ệ ồ ươ ệ th ng đ c s  d ng đ  t o ngu n nguyên li u mô in vitro cho các ph ng pháp hi u

ộ ố ươ ả ơ ự ế ừ ư ớ qu  h n sau này. M t s  ph ng pháp m i nh  phát sinh PLB tr c ti p t mô in vitro,

ẹ ạ ệ ố ẫ ồ ề ự i h  s  nhân cao đ u d a vào ngu n m u ạ t o mô s o và phát sinh phôi vô tính đem l in

ạ ự ự ấ ờ ộ ộ vitro t o thành nh  nuôi c y phát hoa (Tanaka và c ng s , 1977; Park và c ng s ,  2000,

ừ 2.8.3 Tái sinh PLB t mô lá Phalaenopsis

ự ứ ế ệ ố ộ M.Tanaka và các c ng s  đã ti n hành nghiên c u vi c nhân gi ng vô tính cây

ừ ậ ả ạ ọ ự ộ Phalaenopsis t mô lá t ạ ườ i tr ng đ i h c Osaka, Nh t B n (Tanaka và c ng s , 1975;

ệ ệ ầ ủ Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980, 1985). Nguyên li u cho các thí nghi m ban đ u c a

ấ ừ ưở ừ ạ ừ nhóm là mô lá l y t cây tr ng thành và t cây con in vitro t o thành t ạ  gieo h t. Tuy

ưở ả nhiên các lá tr ạ ng thành này không có kh  năng t o PLB, trong khi đó lá các cây con

ớ ả ạ ượ ư ậ ả ả ạ ố ổ ầ m i n y m m lai t o đ c PLB. Nh  v y, kh  năng t o PLB gi m xu ng khi tu i cây

ự ố ộ ươ ể ạ ừ gi ng tăng lên (Tanaka và c ng s , 1975). Theo ph ng pháp này, PLB có th  t o ra t

ấ ẫ ườ ẫ ạ ả ỗ ng MS, m i m u t o ra trung bình kho ng 3,8 nuôi c y m u lá in vitro trên môi tr PLB

ế ạ ặ ắ ủ ể ượ ẫ ệ ế ụ 1 đ n 7 PLB) t i m t c t c a m u lá. Các PLB này có th  đ c bi t hóa ti p t c ừ (t trên

ườ ỏ ổ ướ ừ ế ụ ượ ng l ng Vacin – Went b  sung 20% n c d a và ti p t c đ c tái sinh trên môi tr môi

ườ ể ạ ườ ươ ể tr ng gieo h t Phalaenopsis. Sau khi chuy n sang v ế ụ n  m cây ti p t c phát tri n

ườ ạ ượ ố ượ ở ồ ớ ố ng và n  hoa. Quy trình này t o đ c s  l ấ ề ng l n cây gi ng đ ng nh t v bình th m tặ

ưở 2.8.4 Tăng tr ng PLB thành cây con

ư ứ ề ế ằ ố ư ạ Cho đ n nay, ch a có nhi u công trình nghiên c u nh m t i  u hóa giai đo n

ưở ủ ế ả ỉ ưở ấ ổ ủ tăng tr ng PLB thành cây con, ch  y u ch  theo dõi  nh h ng c a các ch t b  sung

ố ộ ưở ỏ ự ế ấ ả ệ ứ ng ch ng t là quá trình s n xu t trong th c t đã khá hoàn thi n lên t c đ  tăng tr về

ứ ề ệ ử ụ ấ ấ ạ ố Nghiên c u v  vi c s  d ng các ch t ch ng nâu hóa trong giai đo n này, cho th y

ể ố ồ ườ ạ ổ ch i con phát tri n t i đa trong môi tr ng b  sung 2 g/l than ho t tính.

ự ứ ủ ả ộ ỏ ồ ưở Kh o sát c a Rahman A. và c ng s  ch ng t ch i non tăng tr ạ ng m nh trên

ườ ắ ổ ố ơ ị môi tr ng b  sung 50 ml/lít cao b p, t ủ t h n d ch khoai tây và đu đ .

ề ự ế ộ ấ ưở ủ ườ M t v n đ  th c t là quá trình tăng tr ng PLB c a cây con th ả ng x y ra

ổ ề ị ườ ặ ở ấ ề ơ ở ả ồ ệ ấ ố ng g p r t nhi u c  s  s n xu t gi ng lan h  đi p không  n đ nh, đi u này th trong

ướ ướ ố ộ ụ ề ạ ả ồ ồ n c. PLB có xu h ơ ng t o thành c m ch i nhi u h n là ch i, làm gi m t c đ  tăng

ưở ủ ộ ồ ườ ả ộ ợ ấ ề ấ ả tr ng riêng c a ch i, bu c ng i s n xu t ph i có thêm m t đ t c y chuy n không

ể ượ ả ế ằ ề ầ ố c gi ổ i quy t b ng cách b  sung IAA thay cho mong mu n. V n đ  này có th  đ NAA

ị ế ủ ồ ệ 2.9 Giá tr  kinh t c a lan h  đi p

ổ ế ở ồ ệ ỉ ồ ệ ữ ầ ở H  đi p không ch  ph  bi n Nam Mĩ, trong nh ng năm g n đây, h  đi p tr

ệ ạ ậ ồ ồ ị ở ấ thành lo i hoa tr ng ch u có giá tr  nh t trong ngành công nghi p tr ng hoa Hà Lan.

ỉ ở ướ ặ ệ ậ ả ữ Chúng còn là nh ng món quà xa x các n c Châu Á đ c bi t là Nh t B n. Ngoài ra

ỉ ượ ỹ ể ặ ướ ạ ậ ậ ẹ các loài hoa đ p, xa x  cũng đ c nh p vào M  đ  trang trí ch u ho c d i d ng quà

ồ ệ ộ ề ề ệ ộ ợ Lan h  đi p, là m t loài lan có đ  b n bông cao trong đi u ki n thích h p, cũng

ơ ữ ể ồ ễ ấ ậ ộ ợ ỉ là m t loài cây r t thích h p đ  tr ng trong nhà, d  ra hoa. H n n a, trong vài th p k

ề ể ườ ồ ả i tr ng đã gi m giá thành đáng ệ ồ ầ g n đây n n công ngh  tr ng lan phát tri n giúp ng kể

ữ ạ ả ợ ớ ườ ườ ố ớ đ i v i lo i lan này nên giá c  phù h p v i nh ng ng i mê hoa hay ng ớ ậ i m i t p

ồ ệ ấ ượ ư ồ ượ ở ề ơ ướ ồ ệ tr ng. H  đi p r t đ ộ c  a chu ng và đ ồ c tr ng nhi u n i. Tr c đây, h  đi p có

ượ ị ườ ạ ấ ộ giá khá cao, nên đ c xem là m t lo i hàng hoá cao c p trên th  tr ng. Trong 20 năm

ở ạ ệ ệ ạ ả ứ ạ ẩ ở tr  l i đây, công ngh  hi n đ i và các nghiên c u đã giúp cho lo i s n ph m này tr

ớ ườ ặ ệ ễ ổ ế nên ph  bi n v i ng i tiêu dùng, đ c bi t là trong các ngày l . Thêm vào đó, công

ổ ậ ề ủ ệ ề ạ ạ ạ ố ố ớ ngh  lai gi ng và gieo h t ngày càng t o nên nhi u ch ng lo i gi ng m i, n i b t v

ướ ề ườ ấ ớ màu hoa, kích th c hoa…Đi u này làm cho ng ơ i tiêu dùng r t thích thú v i thú ch i

ơ ố ị ườ ữ ạ ế ớ lan và t o nên nh ng c n s t hoa lan trên th  tr ng th  gi i.

ồ ệ ượ ở ọ ơ ế ớ ế ầ ở ứ ầ H  đi p đ ồ c tr ng m i n i trên th  gi i, h u h t là ậ ả  Đ c, Nh t b n, Ph n

ỹ ượ ở ướ Lan, Đài Loan, Thái Lan và M . Cây con đ ấ c nuôi c y mô các n ầ c Ph n Lan,

ấ ướ ớ ả ỹ Thái Lan, Đài Loan sau đó cây con l ạ ượ i đ ẩ c xu t kh u cho các n c khác v i c  M

ố ượ ị ườ ạ ị ể ồ đ  tr ng ra hoa. Hàng ngàn các gi ng đ ấ c lai và t o dòng r t có giá tr  trên th  tr ng.

ạ ượ ấ ồ ệ ấ ượ ề ố c r t nhi u gi ng h  đi p có ch t l ng hoa và ố Các nhà nhân gi ng đã gieo h t đ cây

ị ư ề ạ ắ ấ ấ ố ị gi ng r t có giá tr  nh  các tính tr ng qui đ nh màu s c hoa, và c u trúc hoa, nhi u

ề ầ ố ươ ễ ạ ơ ộ nhánh, nhi u vòi hoa, và g n đây là các gi ng có h ng th m. Cu c ch y đua di n ra

ế ạ ộ ệ ị ệ ề ế ẫ ả ố ầ h u h t t i Đài Loan, đi u này d n đ n m t h  qu  là các gi ng có giá tr  hi n nay có

ữ ể ỉ ị th  không còn giá tr  ch  trong vài năm n a.

ộ ố ố ồ ệ ạ ệ Hình 2.6: M t s  gi ng lan h  đi p t i Vi t Nam

Ậ ƯƠ Ệ Ệ V T LI U VÀ PH NG PHÁP THÍ NGHI M

ệ ừ ự ờ ạ ề ố Th i gian th c hi n t ế  tháng 2 ­ 2009 đ n tháng 7 ­ 2009 t i phòng di truy n gi ng

ệ ề ễ ệ ậ ọ ố ồ ỹ ỉ cây tr ng ­ Vi n Khoa h c K  thu t Nông nghi p mi n Nam, s  121 Nguy n B nh

ệ ượ ồ ệ ế ố ạ Thí nghi m đ c ti n hành trên gi ng lan h  đi p lai Phalaenopsis sp t ệ i Vi n

ề ệ ậ ọ ỹ Khoa h c K  thu t Nông nghi p mi n Nam.

ườ ấ ố ứ ­  Bình ch a môi tr ng nuôi c y, pipet,  ng đong.

ườ ẫ ấ ể ­  Bàn đ  môi tr ng và m u c y.

ụ ụ ấ ồ ướ ­  Các d ng c  thao tác: dao, kéo, pen, đèn c n, bình tia, bông gòn th m n c.

ấ ả ả ượ ấ Ghi chú: t t c  ph i đ c h p vô trùng.

ệ ể ệ ấ ố ­  Các k  đ  bình hay  ng nghi m nuôi c y.

ệ ộ ệ ộ ấ ừ ề ­  Máy đi u hòa nhi t đ : nhi t đ  phòng c y t ế  24oC đ n 25oC.

ượ ạ ị ỉ ệ ộ ế ­  Phòng sáng đ c trang b  2 máy l nh Panasonic ch nh nhi t đ  25oC, chi u sáng

ờ ộ ằ b ng đèn Compact 3U theo quang kì 16 gi sáng/8 gi ờ ố ườ i, c t ng đ  ánh sáng là

Ẩ ế ộ ộ ừ 2000 lux.  m đ  không khí trong phòng bi n đ ng t 50 ­ 70%.

ườ ườ ệ ườ Môi tr ấ ng nuôi c y: môi tr ng dùng trong thí nghi m là môi tr ng MS

BAP (6­benzyladenine), NAA ((cid:181) ­ naphthaleneacetic acid), TDZ (Thidiazuron)

ườ ướ ừ ườ ấ ượ ấ Các ch t khác: đ ng glucose, agar, n c d a. Môi tr ng nuôi c y đ ề c đi u

ể ạ ằ ỉ ặ ch nh b ng NaOH ho c HCl đ  đ t pH = 5,8.

ự ả ệ ả ưở ủ ồ ộ ướ ộ ạ ế 3.3.1 Thí nghi m 1: Kh o sát s   nh h ng c a n ng đ  n ủ c javel đ n đ  s ch c a

ụ ệ ệ ẫ ợ ồ ị ộ M c tiêu thí nghi m: xác đ nh n ng đ  javel thích h p cho vi c vô trùng m u

ẫ ạ ồ ệ ệ ằ ầ ạ ồ ố

ấ c y lan h  đi p nh m t o ngu n m u s ch b nh ban đ u cho quá trình nhân gi ng  ti pế

ậ ệ ủ ượ ắ ừ ắ ồ ệ ủ ệ V t li u thí nghi m: các m t ng  đ c c t t phát hoa c a lan h  đi p.

ẫ ấ ậ ấ ộ ồ ệ Hình 3.1: Phát hoa lan h  đi p, b  ph n l y m u c y

ườ ẫ ườ ạ Môi tr ng vào m u: MS + agar (8 g/lít) + đ ng (30 g/lít) + than ho t tính (2

ướ ừ g/lít)+ n c d a (10 ml/lít) + BAP (2 mg/lít), pH = 5,8.

ệ ố ượ ố ộ ế ể ẫ ệ B  trí thí nghi m: thí nghi m đ c b  trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên m t y u

ứ ấ ứ ệ ệ ẫ ỗ ố t , 4 nghi m th c, m i nghi m th c c y 20 m u.

ồ ộ N ng đ  Javel (%)

ậ ỷ ệ ẫ ố ử Quan sát và ghi nh n t ử  m u s ng: 10 ngày sau x  lý, 20 ngày sau x  lý, 30 l

ỷ ệ ễ ấ ẩ ­  T  l nhi m n m và vi khu n.

ễ ỷ ệ nhi m = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ x 100

ỷ ệ ẫ ẫ ố ố ẫ ổ T ng s  m u nhi m ễ % T  l ố ẫ ấ ổ T ng s  m u c y ế  m u ch t, m u s ng. ­  T  l

ế ế ố ẫ S  m u ch t ỷ ệ ẫ % T  l m u ch t = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ x 100

ổ ố ẫ ư T ng s  m u đ a vào

ỷ ệ ẫ ố ỷ ệ ẫ ế % T  l m u s ng = 100% ­ t m u ch t. l

Ả ệ ưở ủ ồ ấ ớ ề ệ ộ 3.3.2 Thí nghi m 2:  nh h ng c a n ng đ  BA,TDZ, đi u ki n nuôi c y t i quá

ạ ừ ồ ệ trình t o protocorm t lá cây h  đi p

ụ ệ ệ ề ấ ồ ộ ợ M c tiêu thí nghi m: tìm n ng đ  BA, TDZ và đi u ki n nuôi c y thích h p cho

ạ ừ ẫ ồ ệ quá trình t o protocorm t m u lá lan h  đi p in vitro.

ậ ệ ồ ệ ủ ệ ượ V t li u thí nghi m: lá c a lan h  đi p lai đ ấ c nuôi c y in vitro.

ẫ ấ ồ ệ ầ ẫ Hình 3.2: M u lá lan h  đi p ban đ u (a) và m u c y (b)

Sáng

3 6 9 15 3 6 9 15 5+3 3+5 2+7

ệ ố ượ ố ế ể ẫ ệ B  trí thí nghi m: thí nghi m đ c b  trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên hai y u

ầ ặ ạ ứ ệ ứ ấ ệ ẫ ỗ g m 22 nghi m th c, 3 l n l p l i, m i nghi m th c c y 30 m u. Trong đó, y u t ế ố ố ồ t A :

ế ố ệ ề ấ ộ ấ ề ồ ưở đi u ki n nuôi c y; y u t B: n ng đ  ch t đi u hòa sinh tr ng.

ườ ề ườ ườ Môi tr ng n n (MTN): môi tr ng MS + đ ng (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít),

ạ NAA (1 mg/lít), agar (8 g/lít), than ho t tính (2 g/lít), pH = 5,8.

ấ Quan sát và ghi nh n t ậ ỷ ệ ạ  l t o protocorm 80 ngày sau c y.

ố ẫ ạ ổ T ng s  m u t o protocorm

m u t o protocorm (%) = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ x 100 ố ẫ ấ ỷ ệ ẫ ạ ­  T  l ổ T ng s  m u c y

ừ ượ ạ ầ  khi protocorm đ u tiên hình thành đ c nhìn

ượ ạ c t o ra (%) = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ x 100

ườ ờ ­  Th i gian t o protocorm: tính t th y.ấ ố ố ổ T ng s  kh i protocorm ố ỷ ệ  kh i protocorm đ ­  T  l ố ẫ ấ ổ T ng s  m u c y ố ­  Đ ng kính kh i protocorm.

ề ố ­  Chi u cao kh i protocorm.

ự ả ả ưở ủ ồ ế ộ ưở 3.3.3 Thí nghiêm 3:Kh o sát s   nh h ng c a n ng đ  NAA đ n sinh tr ng, phát

ụ ệ ồ ợ ị ồ ộ M c tiêu thí nghi m: xác đ nh n ng đ  NAA và BAP thích h p cho cây lan h

ậ ệ ệ ẫ ấ V t li u thí nghi m: m u nuôi c y là cây lan Phalaenopsis in vitro, có 3 lá.

ệ ố ượ ố ể ẫ ệ B  trí thí nghi m: thí nghi m đ c b  trí theo ki u hoàn toàn ng u nhiên, 4

ầ ặ ạ ứ ệ ỗ ầ ặ ạ ấ ấ ẫ ỗ nghi m th c, 3 l n l p l i, m i l n l p l i c y 3 chai, m i chai c y 5 m u.

ườ ề ườ ướ ừ ạ Môi tr ng n n: MS + đ ng (30 g/lít) + n c d a (5 ml/lít) + than ho t tính (2

ỉ ừ ắ ầ ấ ẫ ấ ễ ầ ế ờ ngày b t đ u c y đ n ngày m u c y ra r  đ u

ề ừ ầ ễ ế Ch  tiêu theo dõi: ạ ễ ­  Th i gian t o r  (NSC): tính t tiên ễ ­  Chi u dài r  (mm): đo t ễ  đ u r  đ n chóp r .

ấ ố ễ ổ T ng s  cây có r ễ ỷ ệ  cây có r  (%) = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ x100 ­  T  l ố ổ T ng s  cây c y

ổ ố ễ ễ ổ T ng s  r ố ễ ­  S  r  trung bình (r /cây) = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ố T ng s  cây

ổ ố ố ố ổ ừ ố ế ồ T ng s  lá ­  S  lá trung bình (lá/cây) = ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ T ng s  cây ề ­  Chi u cao ch i: đo t ữ  g c đ n ch  v trên cùng.

ượ ế ở ấ ầ ỉ Các ch  tiêu đ c ti n hành theo dõi 20 ngày sau c y, 10 ngày theo dõi 1 l n.

ố ệ ậ ượ ử ề ề ầ ằ ầ ố c x  lý b ng ph n m m Microsoft Excel và ph n m m th ng kê S  li u thu th p đ MSTATC.

Ả ưở ủ ồ ộ ướ ẫ ấ ộ ạ ủ ế ệ 4.1 Thí nghi m 1:  nh h ng c a n ng đ  n c javel đ n đ  s ch c a m u c y

ử ẫ ộ ướ ỹ ậ ầ ủ ấ ọ Kh  m u là m t b ự c k  thu t đ u tiên c a m i quy trình nuôi c y mô th c

ạ ư ố ượ ấ ừ ề ệ ự ệ ậ v t, đây là giai đo n đ a đ i t ng nuôi c y t đi u ki n t ề  nhiên vào đi u ki n nuôi

ấ c y vô trùng.

ố ượ ự ậ ủ ế ể ầ ậ ấ Đ i t ư ộ ng nuôi c y có th  là h u h t các b  ph n khác nhau c a th c v t nh :

ưở ế ớ ườ ỉ phát hoa, đ nh sinh tr ả ng, thân, lá. Tùy theo kh  năng ti p xúc v i môi tr ng bên

ứ ề ẩ ậ ấ ộ ườ ể ng đ  nuôi ngoài mà b  ph n này ch a ít hay nhi u n m khu n. Trong khi môi tr c yấ

ự ậ ứ ườ ạ ấ ố ợ mô th c v t có ch a đ ng, mu i khoáng, vitamin. Thích h p cho các lo i n m và vi

ể ẩ khu n phát tri n.

ủ ấ ố ộ ơ ấ ẩ ớ ớ ế ề Do đó t c đ  phân bào c a n m, vi khu n l n h n r t nhi u so v i t ự  bào th c

ỉ ầ ễ ộ ị ử ấ ế ặ ẩ ộ n m ho c vi khu n, thì sau vài ngày đ n m t ậ v t, ch  c n b  nhi m m t vài bào t tu n,ầ

ườ ấ ẽ ủ ộ ạ ấ ề ặ ẩ ộ ề ặ toàn b  b  m t môi tr ng và mô c y s  ph  m t ho c nhi u lo i n m hay vi khu n.

ể ế ụ ả ỏ ể ệ ề ệ ấ Thí nghi m ph i b  đi vì trong đi u ki n này mô c y không th  ti p t c phát tri n và

ế ầ ố ớ ệ ậ ạ ồ ị ươ ử ch t d n. Vì v y, đ i v i lo i cây tr ng khác nhau, vi c xác đ nh ph ng pháp kh

ế ị ấ ợ ớ ự ủ ấ ế trùng thích h p có tính ch t quy t đ nh t i s  thành công c a quá trình nuôi c y mô t

bào.

ộ ố ấ ử ượ ử ụ ổ ế ư ấ M t s  ch t kh  trùng đ c s  d ng ph  bi n trong nuôi c y mô nh  : HgCl2,

ề ạ ệ ệ ả ướ ượ javel, Ca(0Cl)2 đ u mang l i hi u qu  cao. Trong thí nghi m này, n c javel đ c

ồ ệ ử ủ ẻ ấ ạ dùng làm ch t kh  trùng phát hoa c a lan h  đi p vì giá thành r , an toàn và mang l i

ệ ả hi u qu  cao.

ệ ượ ế ộ ớ ồ ờ Thí nghi m đ c ti n hành v i các n ng đ  javel khác nhau trong th i gian 30

ẫ ượ ế ể ệ ở ả ả ử phút, k t qu  kh  trùng m u đ c th  hi n b ng 4.1:

Ả ả ưở ủ ồ ế ỷ ệ ộ ẩ ủ ễ ẫ ấ B ng 4.1:  nh h ng c a n ng đ  javel đ n t l nhi m n m và vi khu n c a m u

Hóa ch tấ

ộ ử ồ N ng đ  kh

trùng (%)

Javel

ừ ế ả ấ ậ T  k t qu  thu đ ượ ở ả c b ng 4.1 nh n th y:

ồ ộ ớ ễ ộ ồ V i các n ng đ  javel khác nhau cho t ỷ ệ  l nhi m khác nhau, n ng đ  javel càng

ứ ộ ạ ễ ễ ể ấ ẫ ấ ị ẩ th p thì m c đ  t p nhi m n m và vi khu n càng cao. M u b  nhi m có th  là do thao

ẫ ấ ư ử ệ ả ấ ạ ặ ẫ ễ tác thí nghi m nh : r a m u không s ch, thao tác c y, ho c do b n thân m u c y d   bị

nhi m.ễ

Ở ử ằ ạ ờ  giai đo n 10 NSC, 20 NSC, 30 NSC: kh  trùng b ng javel 20% trong th i

ễ ế ấ ở ở ở ả gian 30 phút cho k t qu  nhi m cao nh t (40% 10 NSC, 55% 20 NSC, 70% 30

NSC).

ễ ở ử ằ ẫ Kh  trùng b ng javel 60% và javel 80% trong 30 phút không có m u nhi m

ắ ầ ư ễ ẫ ị ầ ở ễ 10 NSC nh ng sau đó thì m u b t đ u b  nhi m và t ỷ ệ  l nhi m tăng d n 20 NSC

ễ ễ ễ (javel 60% nhi m 15% , javel 80% nhi m 5%) và 30 NSC (javel 60% nhi m 20% và

ễ javel 80% nhi m 10%).

ử ễ ấ ấ ở X  lý javel 80% trong 30 phút cho t ỷ ệ  l nhi m th p nh t (10% 30 NSC).

Ả ả ưở ủ ồ ộ ỷ ệ ố ẫ B ng 4.2:  nh h ng c a n ng đ  javel đ n t ế ỷ ệ ế  l ch t và t ủ  s ng c a m u l

ộ

ồ N ng đ javel (%)

20

40

60

80

T  lỷ ệ ch tế (30NSC)

70

70

35

30

ố ớ ồ ị ấ ẩ ấ ấ ộ ơ ẫ Đ i v i n ng đ  javel th p h n 60%, m u sau khi c y b  n m và vi khu n phát

ủ ở ể ặ ạ ạ ị ử ấ ẩ ị tri n m nh, m t th ch b  che ph  b i các bào t n m (d ch vi khu n).

ử ờ ỷ ệ ẫ X  lý javel 20% và javel 40% trong th i gian 30 phút cho t ế  m u ch t (70%) l

ỷ ệ ẫ ố ằ và t m u s ng b ng nhau (30%). l

ử ẫ ỷ ệ ế ấ ỷ ệ ố ằ Kh  trùng m u b ng javel 80% cho t ấ  ch t th p nh t (30%) và t l s ng cao l

ẫ ố ể ố ả ấ ồ nh t (70%). M u s ng n y ch i, phát tri n t t.

ỗ ồ ượ ỷ ệ ẫ ố ẫ ộ Nhìn chung, m i n ng đ  javel khác nhau thì thu đ m u s ng, m u c t l

ế ộ ử ử ễ ằ ớ ồ ch t và t ỷ ệ  l nhi m khác nhau. V i 4 n ng đ  kh  trùng trên thì kh  trùng b ng javel

ả ố ệ ờ 80% trong th i gian 30 phút cho hi u qu  t ấ t nh t.

ề ử ứ ủ ớ ế ệ ả ị ễ So v i k t qu  nghiên c u c a Nguy n Th  Hu  năm 2007 v  kh  trùng phát

ể ử ụ ồ ệ ứ ử ớ ờ hoa lan h  đi p, có th  s  d ng HgCl2 0,1% v i hình th c kh  trùng kép và th i gian

ử ỷ ệ ẫ ế ả ầ kh  trùng hai l n là 6 phút cho t ồ ệ ố  m u phát hoa lan h  đi p s ng là 60%. K t qu l

ử ệ ế ằ ấ ả ộ ơ ồ này th p h n k t qu  thí nghi m khi x  lý b ng javel n ng đ  60% và 80% trong 30

ỉ ệ ố ầ ượ phút (t  l s ng l n l t là 65% và 70%).

ệ ử ụ ứ ớ ớ ồ ử ế ấ ả ộ Các k t qu  nghiên c u v i vi c s  d ng HgCl2 làm ch t kh  trùng v i n ng đ

ề ệ ặ ả ổ ươ ế ẫ ng t bào m u ấ th p đ u cho hi u qu  khá cao vì HgCl2 ít ho c không gây t n th c y.ấ

ấ ộ ộ ườ ậ ậ ấ ộ Tuy nhiên, HgCl2 là m t hoá ch t gây đ c cho ng ấ i và đ ng v t vì v y ch t này r t

ử ụ ế ặ ấ ạ h t ch  ho c c m s  d ng.

ẫ ấ ề ặ ử ử ệ ấ ờ ợ Do đó, th i gian và ch t kh  trùng phù h p cho vi c kh  trùng b  m t m u c y

ồ ệ ủ phát hoa c a lan h  đi p là javel 80% trong 30 phút.

ứ ấ ẫ ả ồ Hình 4.1: M u n y ch i và hình thành hoa th  c p (20 NSC)

Ả ưở ủ ồ ấ ớ ề ệ ộ ệ 4.2 Thí nghi m 2:  nh h ng c a n ng đ  BAP,TDZ, đi u ki n nuôi c y t i quá

ạ ừ trình t o protocorm t ồ ệ  lá cây h  đi p in vitro

ưở ủ ồ ấ ớ ỷ ệ ẫ ề ệ ộ Ả ng c a n ng đ  BAP, TDZ, đi u ki n nuôi c y t m u lá i t l ả B ng 4.3:  nh h hình

thành protocorm

A

B

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

CV (%)

Ftính

ự ộ ộ ự ị ệ Ghi chú: Ký t theo sau giá tr  trung bình khác nhau trên cùng m t c t có s  khác bi t

ố ị ử ượ ể ổ α = 0.01), các giá tr  x  lý đ c chuy n đ i theo ấ r t có ý nghĩa trong th ng kê (**:  công

ứ th c (x + 0,5)1/2

ứ ở ả ế ả ấ K t qu  nghiên c u b ng 4.2 cho th y:

ề ệ ấ ượ ẫ ạ Trong đi u ki n nuôi c y khác nhau thì l ng m u t o protocorm khác nhau.

ẫ ạ ứ ệ ệ ề ấ ố Khi nuôi c y trong đi u ki n có ánh sáng thì s  nghi m th c có m u t o

ơ ố ố ượ ẫ ạ ố i (9 NT) và s  l ng m u t o protocorm trong t i protocorm (8 NT) ít h n trong t trung

ơ ố ẫ ạ ề ệ ề ẫ bình 4,2 m u/NT nhi u h n s  m u t o protocorm trong đi u ki n có ánh sáng trung

ẫ bình 2,3 m u/NT.

ố ẫ ạ ứ ề ệ Nghi m th c 9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) cho s  m u t o protocorm nhi u

ấ ở ề ệ ố ượ ẫ ạ ơ ượ ề nh t. Trong đó, đi u ki n t i thì l ng m u t o protocorm (93,3%) nhi u h n l ng

ẫ ạ ề ệ m u t o protocorm khi nuôi trong đi u ki n có ánh sáng (66,7%).

ứ ứ ệ ệ ẫ ạ Nghi m th c 2 (6 mg BAP/lít, 1,67 m u t o protocorm) và nghi m th c 5 (3 mg

ẫ ạ ẫ ạ ượ ố TDZ/lít, 0,67 m u t o protocorm) có m u t o ra đ c protocorm khi nuôi trong t i

ạ ượ ư nh ng không t o đ c protocorm khi nuôi ngoài sáng.

ử ụ ồ ộ ố S  d ng n ng đ  BAP 15 mg/lít (nuôi trong t i, NT4) và TDZ 6 mg/lít (nuôi

ượ ỉ ệ ẫ ạ ằ ngoài sáng, NT6) thu đ m u t o protocorm b ng nhau (43,3%). c t  l

ả ứ ứ ệ ớ ườ ề ệ ấ Các nghi m th c không có ph n  ng v i môi tr ng nuôi c y và đi u ki n nuôi

ạ ồ ố ấ c y (không t o ra protocorm) g m: NT1 (BAP 3 mg/lít, nuôi trong t i và sáng), NT8

ố (TDZ 15 mg/lít, nuôi trong t i và sáng), NT2 (6 mg BAP/lít, nuôi trong sáng), NT5

(TDZ 3 mg/lít, nuôi trong sáng).

ư ậ ệ ố ề ả ố ẽ ế ẫ Nh  v y, khi nuôi m u trong đi u ki n t i (che sáng 100%) s  cho k t qu  t t

ơ h n khi nuôi ngoài sáng.

Ả ả ưở ủ ấ ưở ả ứ ủ ế ẫ B ng4.4: nh h ề ng c a ch t đi u hoà sinh tr ng BAP, TDZ đ n ph n  ng c a m u

NT

BAP 3 mg/l

BAP 6 mg/l

BAP 9 mg/l

BAP 15 mg/l

TDZ 3 mg/l

TDZ 6 mg/l

TDZ 9 mg/l

TDZ 15 mg/l

BAP 3 mg/l + TDZ 5mg l

BAP 5mg/l + TDZ 3mg/l

ự ộ ộ ự ị ệ 30,0 3,00 BAP 7 mg/l + TDZ 2 mg/l 10 CV (%) 10,38 Ftính 115,24** Ghi chú: Ký t theo sau giá tr  trung bình khác nhau trên cùng m t c t có s  khác bi t

α ố ị ử ượ ể ổ = 0.01), các giá tr  x  lý đ c chuy n đ i theo ấ r t có ý nghĩa trong th ng kê (**:  công

ứ th c (x + 0,5)1/2.

ử ụ ồ ộ ỷ ệ ẫ ạ S  d ng n ng đ  BAP và TDZ khác nhau thì t m u t o protocorm khác nhau. l

ố ẫ ứ ệ ổ Nghi m th c 9 b  sung BAP và TDZ (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) có s  m u

ấ ạ t o protocorm cao nh t (80%).

ỉ ử ụ ộ ố ứ ệ ề ấ ạ ưở ỷ ệ ạ M t s  nghi m th c ch  s  d ng 1 lo i ch t đi u hòa sinh tr ng cho t t o l

ạ ở ấ ẳ ẳ ứ ế ệ ả  nghi m th c 5 (3 mg TDZ/lít) cho k t qu ơ protorcom th p h n h n. Ch ng h n,  th pấ

ấ ậ ở ứ ứ ệ ệ nh t (3,3%). Th m chí hai nghi m th c 1 (3 mg BAP/lít) và nghi m th c 8 (15 mg

ạ ượ ề ệ ố ự c protocorm khi nuôi trong đi u ki n sáng và t i. S  sai khác TDZ/lít) không t o đ này

ứ ệ ớ ạ ấ r t có ý nghĩa so v i các nghi m th c còn l i.

ừ ữ ế ợ ữ ể ế ả ậ ấ ằ T  nh ng k t qu  trên, có th  nh n th y r ng k t h p gi a 3 mg BAP/lít và 5 mg

ườ ồ ệ ủ ằ ấ ả ạ TDZ/lít trong môi tr ng nuôi c y nh m tăng kh  năng t o protocorm c a lan h  đi p.

ưở ủ ệ ề Ả ng c a BAP, TDZ và đi u ki n nuôi c y t ấ ớ ỷ ệ ố i t s ng và t l ỷ ệ  l ả B ng 4.5:  nh h ch tế

ồ ệ ẫ ủ c a m u lá lan h  đi p in vitro

A

B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

ừ ế ả ả ệ ố ề ỷ ệ ẫ ố ấ T  k t qu  b ng 4.5 cho th y: Khi nuôi trong đi u ki n t i thì t m u s ng cao l

ơ h n khi nuôi ngoài sáng.

ệ ề ớ ố ỷ ệ ẫ ố V i đi u ki n trong t i: NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) t m u s ng là l

ố ẫ ạ ỉ 100% trong đó s  m u không t o protocorm ch  6,7%. NT5 (3 mg TDZ/lít) cho t ỷ ệ  l

ạ ấ ỷ ệ ẫ m u l ẫ m u không t o protocorm cao nh t (83,3%) và NT7 (9 mg TDZ/lít) cho t không

ấ ấ ỷ ệ ẫ ạ t o protocorm th p nh t (16,6%), NT8 (15 mg TDZ/l) cho t ấ ế  m u ch t cao nh t l

(66,7%).

ẫ ạ % M u không t o protocorm

iố

Trong t 70,0 63,3 33,3 23,3 83,3 16,7 16,6 33,3 6,7 40,0

33,3

ỷ ệ ẫ ạ Khi nuôi ngoài sáng: NT1 (3 mg BAP/lít) có t m u không t o protocorm cao l

ấ ỷ ệ ẫ ạ nh t (60%), NT3 (9 mg BAP/lít) và NT7 (9 mg TDZ/lít) cho t m u không t o l

ấ ấ ỷ ệ ẫ protocorm th p nh t (20%). NT2 (6 mg BAP/lít) và NT5 (3 mg TDZ/lít) có t m u l

ấ ỷ ệ ẫ ấ ế  m u ch t th p l ế ch t cao nh t (56,7%). NT9 (5 mg TDZ/lít và 3 mg BAP/lít) có t nh tấ

(6,7%).

Ả ả ưở ấ ớ ủ ệ ề ả B ng 4.6:  nh h ng c a BAP, TDZ và đi u ki n nuôi c y t i kh  năng hình thành

ừ ẫ ồ ệ protocorm t m u lá lan h  đi p in vitro

A

B

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

CV (%)

ự ộ ộ ự ị ệ theo sau giá tr  trung bình khác nhau trên cùng m t c t có s  khác bi t 8,93** Ftính Ghi chú: Ký t

α ố ị ử ượ ể ổ = 0.01), các giá tr  x  lý đ c chuy n đ i theo ấ r t có ý nghĩa trong th ng kê (**:  công

ứ th c (x + 0,5)1/2.

ố ố S  kh i protocorm ạ t o thành/LLL T iố sáng

0,0

gh

2,3

bc

7,3

de

5,0

hi

1,3

ab

8,3

ab

8,7

0,0

10,0

de

4,7

bcd

6,7

ề ấ ố ố ượ ệ Nhìn chung, đi u ki n nuôi c y trong t i cho s  l ơ ạ ng protocorm t o ra cao h n

ố ượ ạ ố ở ề ệ ố ộ ừ trong sáng. S  l ng kh i protocorm t o ra đi u ki n t i dao đ ng t ố  1,3 kh i

ầ ặ ạ ầ ặ ạ ế ố ở protocorm/l n l p l i (NT5) đ n 10 kh i protocorm/l n l p l i (NT9). Trong khi đó,

ệ ấ ố ượ ạ ừ ầ ặ ố ng này l ỉ i ch  có t 1 kh i protocorm/l n l p ề đi u ki n nuôi c y có ánh sáng thì s  l iạ l

ầ ặ ạ ế ố (NT11) đ n 7,7 kh i protocorm/l n l p l i (NT9).

ứ ệ ạ ượ ề Nghi m th c 9 (5 mg TDZ/l + 3 mg BAP/l) t o ra đ ố c nhi u kh i protocorm

ấ ố ượ ề ạ ố ố nh t. Khi nuôi trong t i thì l ng kh i protocorm t o ra (10 kh i protocorm/lll) nhi u

ề ệ ạ ố ơ ượ h n l ố ng kh i protocorm t o ra khi nuôi trong đi u ki n có ánh sáng (7,7 kh i

ự ệ ứ ệ ớ ố protocorm/lll), s  khác bi t này không có ý nghĩa th ng kê so v i nghi m th c 6 (6 mg

ứ ệ ố TDZ/lít) và nghi m th c 7 (9 mg TDZ/lít) khi nuôi trong t i. NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg

ở ề ự ệ ạ ệ ạ ấ ố  đi u ki n sáng đ t 7,7 kh i protocorm/lll, s  khác bi t này l i r t có ý BAP/lít)  nghĩa

ứ ứ ệ ệ ớ so v i nghi m th c 6 (6 mg TDZ/lít) và nghi m th c 7 (9 mg TDZ/lít) khi nuôi ngoài

sáng.

ứ ứ ệ ệ ố Nghi m th c 2 (6 mg BAP/lít, 2,3 kh i protocorm/lll) và nghi m th c 5 (3 mg

ạ ố ượ ố ố TDZ/lít; 1,3 kh i protocorm/lll) t o ra đ c kh i protocorm khi nuôi trong t ư i nh ng

ượ ố ạ không t o ra đ c kh i protocorm khi nuôi trong sáng.

ạ ượ ố NT1 (3 mg BAP/lít) và NT8 (15 mg TDZ/lít) không t o ra đ c kh i protocorm

ở ề ả ấ khi nuôi ệ  trong c  hai đi u ki n nuôi c y khác nhau.

ệ ế ạ ấ ố Trong quá trình ti n hành thí nghi m và quan sát th y kh i protocorm t o ra

ệ ố ạ ơ ủ ố ượ ề trong đi u ki n t i thì có màu xanh nh t h n màu c a kh i protocorm đ c nuôi trong

ệ ề ượ ạ ơ đi u ki n sáng và protocorm đ ớ c t o ra s m h n.

ả Ả ưở ấ ớ ủ ệ ề ướ ủ ng c a BAP, TDZ, đi u ki n nuôi c y t i kích th c c a B ng 4.7:  nh h protocorm

A

B

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

CV (%) 9,23 9,44 Ftính 7,74** 3,43**

ự ộ ộ ự ị ệ Ghi chú: Ký t theo sau giá tr  trung bình khác nhau trên cùng m t c t có s  khác bi t

ố ị ử ượ ể ổ ấ r t có ý nghĩa trong th ng kê (**: α = 0.01), các giá tr  x  lý đ c chuy n đ i theo

ứ công th c (x + 0,5)1/2.

ườ Đ ng kính protocorm:

ố ạ ườ ơ ớ Khi nuôi trong t i thì protcorm t o ra có đ ng kính l n h n protocorm nuôi

ngoài sáng.

ườ ớ ế ợ NT9 (5 mg TDZ/lít k t h p 3 mg BAP/lít) có đ ấ ng kính l n nh t (5,7 mm trong

ố t i, 4,7 mm ngoài sáng).

ố ạ ượ ườ ấ ớ Khi nuôi trong t i: NT9 t o đ c protocorm có đ ng kính l n nh t (5,7 mm)

ư ệ ố ự nh ng s  khác bi ớ t không có ý nghĩa th ng kê so v i NT7 (9 mg TDZ/lít). Ngoài NT1

ạ ượ (3 mg BAP/lít) và NT8 (15 mg TDZ/lít) không t o đ c protocorm thì NT11 (2 mg

ế ợ ườ ấ ỏ TDZ/lít k t h p 7 mg BAP/lít) có đ ng kính protocorm nh  nh t (1,3 mm).

Khi nuôi ngoài sáng: NT1 (3 mg BAP/lít), NT2 (6 mg BAP/lít), NT8 (15 mg

ạ ượ ạ ượ ố c protocorm. Trong s  các NT t o đ c protocorm thì TDZ/lít) không t o đ protocorm

ở ườ ấ ấ ế ợ  NT11 (2 mg TDZ/lít k t h p 7 mg BAP/lít) có đ ng kính th p nh t (1,2 mm).

ề ủ Chi u cao c a protocorm:

ườ Đ ng kính protocorm (mm)

Trong t iố

ừ ế ủ ề ệ ấ ả ố T  k t qu  thí nghi m ta th y: chi u cao c a protocorm trong t ơ i cao h n

protocorm trong sáng.

ệ ố ề ế ả Khi nuôi trong đi u ki n t i: NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) cho k t qu  cao

ệ ấ ố ớ ớ t này r t có ý nghĩa th ng kê so v i so v i NT11 (2 mg ấ nh t (2,67 mm), khác bi TDZ/lít

+ 7 mg BAP/lít), NT1 (3 mg BAP/lít), NT2 (6 mg BAP/lít), NT3 (9 mg BAP/lít), NT8

ư ự ệ ứ ệ ớ ạ (15 mg TDZ/lít) nh ng không có s  khác bi t so v i các nghi m th c còn l i.

ề ộ ừ ế Chi u cao protocorm dao đ ng t 1,42 mm (NT2) đ n 2,67 mm (NT9). Ngoài

ạ ượ ả ấ ế NT1, NT8 không t o đ ấ c protocorm thì NT2 (6 mg BAP/lít) cho k t qu  th p nh t

ự ệ ớ ư (1,42 mm) nh ng s  khác bi ố t này không có ý nghĩa th ng kê so v i NT3 (9 mg

BAP/lít), NT4 (15 mg BAP/lít), NT5 (3 mg TDZ/lít), NT10 (3 mg TDZ/lít + 5 mg

BAP/lít), NT11(2 mg TDZ/lít + 7 mg BAP/lít).

ế ả ấ Khi nuôi ngoài sáng: NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) cho k t qu  cao nh t

ự ệ ố ớ (2,17 mm), s  khác bi t này không có ý nghĩa th ng kê so v i NT3 (9 mg BAP/lít), NT4

ư ạ ự (15 mg BAP/lít), NT6 (6 mg TDZ/lít), NT7 (9 mg TDZ/lít) nh ng l i có s  khác bi ệ ấ t r t

ứ ệ ố ạ ớ có ý nghĩa th ng kê so v i các nghi m th c còn l i.

ủ ứ ề ệ ộ ừ ế Chi u cao protocorm c a các nghi m th c dao đ ng t 1 mm (NT10, NT11) đ n

2,17 mm (NT9). Ngoài NT1 (3 mg BAP/lit), NT2 (6 mg BAP/lít), NT8 (15 mg TDZ/lít)

ạ ượ không t o đ c protocorm thì NT10 (3 mg TDZ/lít + 5 mg BAP/lít), NT11 (2 mg

ả ấ ế ấ TDZ/lít + 7 mg BAP/lít) cho k t qu  th p nh t (1 mm).

ế ả ấ ườ ể ạ ợ ệ K t qu  thí nghi m cho th y môi tr ng thích h p đ  t o protocorm là: MS +

ườ đ ng (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) + TDZ (5 mg/lít)

ệ ố ề ạ + BAP (3 mg/lít) + than ho t tính (2 g/lít ) và nuôi trong đi u ki n t i, pH = 5,8.

ế ệ ệ ề ệ ả ấ ấ ấ ạ K t qu  thí nghi m cho th y hi u su t t o protocorm th p trong đi u ki n ánh

ạ ươ ự ư ố ủ ộ ự sáng m nh, t ng t nh  công b  c a Tanaka và Sakanishi (1980), Park và c ng s

ể ả ế ự ế ộ ả (2002). K t qu  này có th  gi i thích do ánh sáng tác đ ng lên s  hình thành hay bi n

ử ẫ ớ ứ ế ế ể tình các phân t ệ  tín hi u, d n t i  c ch  quá trình phân chia t bào. Đi n hình là nghiên

ự ụ ệ ấ ộ ộ ứ ủ c u c a Imaizumi và c ng s  cho th y tín hi u tác đ ng lên th  quan ánh sáng xanh

ủ ể ả ạ ở (Chryptochrom) có th  làm gi m ho t tính c a auxin rêu (Physcomytrella patens).

ệ ố ề ậ ị ả ủ ạ ẫ Chính vì v y trong đi u ki n t ứ ắ i, ho t tính c a auxin không b  gi m đi. Ph u th c c t

ượ ừ ạ ngang lá phát sinh protocorm đ c hình thành t mô h  bì phân chia và dày lên. Sau đó

ạ ở ưở ế ạ ơ ả x y ra quá trình phân bào m nh t o s  kh i protocorm và quá trình tăng tr ng t bào

ễ ạ ướ di n ra m nh giúp protocorm tăng kích th c.

ồ ạ ượ ạ ủ ế ụ Theo Vuyl Stake (1989) tác d ng kích thích t o ch i đ t đ ệ c ch  y u vào vi c

ấ ẫ ườ ổ ồ ộ ng b  sung n ng đ  cytokinin cao. Cytokinin có tác nuôi c y các m u trên môi tr d ngụ

ế ử ụ ự ạ ư ự ẽ ả ồ ồ ộ

kích thích s  t o ch i nh ng n u s  d ng n ng đ  quá cao s  làm gi m s  phát sinh  và

ưở ủ ủ ế ạ ồ ổ ị sinh tr ồ ị ng c a ch i, hình d ng c a ch i b  thay đ i và bi n d  soma tăng.

ể ử ụ ộ ố ườ ể ạ ừ ẫ Ngoài ra, ta còn có th  s  d ng m t s  môi tr ng khác đ  t o protocorm t m u

ồ ệ ư ướ ừ lá lan h  đi p nh : MS + n c d a (10 ml/lít) + saccharose (3%) + agar (6,5 g/lít) +

ạ ố ị than ho t tính (1 g/lít) + d ch chu i xanh (100 g/lít) + NAA (0,2 mg/lít) + BAP (1

ộ ố ạ ố ớ ư ễ ệ ị ứ mg/lít), pH = 5,8 (Nguy n Th  Hu , 2007). Đ i v i m t s  lo i cây khác nh  cây d a

ụ ườ ạ ợ Long Ph ng thì môi tr ng thích h p cho t o protocorm là: MS + agar (7,5 g/lít) +

ạ ồ BAP (4 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) (Ph m Ánh H ng, 2006).

ượ ạ ệ ố ề Hình 4.2: Protocorm đ c t o ra trong đi u ki n t i (80 NSC)

ề ệ ạ Hình 4.3: Protocorm t o ra trong đi u ki n sáng (80 NSC)

Ả ưở ủ ồ ế ộ ưở ệ 4.3 Thí nghi m 3:  nh h ng c a n ng đ  NAA đ n sinh tr ể ủ ng, phát tri n c a

ồ ệ cây lan h  đi p in vitro

ố ủ ệ ạ ễ ạ ấ ỉ Vi c t o cây hoàn ch nh thân, lá, r  là giai đo n cu i c a quá trình nuôi c y in

ằ ấ ưở ả vitro. Các nhà nuôi c y mô cho r ng, nhóm kích thích sinh tr ng auxin có kh  năng

ệ ử ự ễ ậ ố kích thích s  hình thành r . Do đó, trong kĩ thu t nhân gi ng vô tính in vitro thì vi c s

ự ạ ễ ử ụ ệ ể ế ả ọ ụ d ng auxin đ  kích thích s  t o r  là vô cùng quan tr ng. K t qu  thí nghi m s  d ng

ồ ệ ượ ể ủ ằ ộ ồ n ng đ  NAA (auxin) nh m kích thích quá trình phát tri n c a cây lan h  đi p đ c

ở ả trình bày b ng 4.8.

Ả ả ưở ạ ễ ủ ủ ồ ồ ệ ế ả ộ B ng 4.8:  nh h ng c a n ng đ  NAA đ n kh  năng t o r  c a cây lan h  đi p in

vitro

Ngày sau c yấ

20 NSC

30 NSC

40 NSC

CV (%) Ftính

ự ộ ộ ự ị ệ Ghi chú: Ký t theo sau giá tr  trung bình khác nhau trên cùng m t c t có s  khác bi t

α ố ấ r t có ý nghĩa trong th ng kê (**: = 0.01).

ừ ế ệ ả ậ ấ ấ ễ T  k t qu  thí nghi m thu đ ượ ở ả c b ng 4.8 nh n th y: sau 7 ngày nuôi c y thì r

ệ ở ấ ứ ệ ắ ầ ầ đ u tiên b t đ u xu t hi n các nghi m th c : NT2 (0,5 mg NAA/lít), NT3 (1 mg

NAA/lít), NT4 (1,5 mg NAA/lít).

ạ Giai đo n 20 NSC và 30 NSC:

ễ ề ề ễ ầ ổ Chi u dài r  trung bình/cây: chi u dài r  tăng d n. NT3 có b  sung 1 mg

ễ ấ ở ở ổ NAA/lít cho r  dài nh t (1,5 cm 20 NSC, 2,1 cm 30 NSC). NT1 (Đ/C) không b

ả ấ ế ấ ở ở sung NAA cho k t qu  th p nh t (1 cm 20 NSC; 1,5 cm 30 NSC).

ố ễ ễ ở ế ấ ả ổ S  r  trung bình/cây: NT3 b  sung 1 mg NAA/lít cho k t qu  cao nh t (2 r

ễ ở ổ ổ 20 NSC; 2,2 r 30 NSC). NT1 không b  sung NAA và NT4 b  sung 1,5 mg NAA/lít

ả ấ ễ ở ế ấ cho k t qu  th p nh t (1,1 r 20 NSC).

Ở ạ giai đo n 30 NSC: NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT3 (1 mg NAA/lít) có t ỷ ệ  l

ễ ề ấ cây ra r  nhi u nh t (86,7%).

ạ Giai đo n 40 NSC:

ễ ế ề ấ ả Chi u dài r  trung bình/cây: NT3 (1 mg NAA/lít) cho k t qu  cao nh t (3,1

ễ ệ ấ ứ ệ ớ ạ ấ cm/r ) và khác bi t r t có ý nghĩa v i các nghi m th c còn l i r t có ý nghĩa. NT1 (0

ả ấ ự ư ễ ế ấ ệ mg NAA/lít) cho k t qu  th p nh t (2,1 cm/r ) nh ng s  khác bi t này không có ý

ề ặ ố ớ nghĩa v  m t th ng kê so v i NT4 (1,5 mg NAA/lít).

ố ễ ồ ộ S  r  trung bình/cây: khi tăng n ng đ  NAA (0 mg NAA/lít; 0,5 mg NAA/lít;1

ố ễ ả ố ế ầ mg NAA/lít) thì s  r  trung bình/cây tăng d n và NT3 (1 mg BAP/lít) cho k t qu  t t

ự ễ ấ ệ ứ ệ ấ ố ớ nh t (2,4 r /cây), s  khác bi t này r t có ý nghĩa th ng kê so v i các nghi m th c còn

ớ ố ứ ễ ế ả ơ ạ l i. NT4 (1,5 mg NAA/lít; 1,45 r /cây) cho k t qu  cao h n so v i đ i ch ng (1,32

ự ệ ố ễ r /cây) và s  khác bi t này không có ý nghĩa th ng kê.

ạ ễ ở ồ ệ ễ ầ ạ ấ Ph n trăm cây có r : cây lan h  đi p in vitro t o r 40 NSC đ t 100% khi c y

ườ ổ vào môi tr ng b  sung 0,5 mg NAA/lít và 1 mg NAA/lít. NT1 (0 mg NAA/lít) cho

ả ấ ấ ế k t qu  th p nh t (73,33%).

Ả ả ưở ế ố ồ ệ ủ ủ B ng 4.9:  nh h ng c a NAA đ n s  lá c a lan h  đi p in vitro

NT

1 2

3 4

CV (%)

ự ệ ộ ộ ữ ứ ệ ns Ftính 1,62 Ghi chú: ns: s  khác bi t gi a các nghi m th c trên cùng m t c t không có ý nghĩa

ố th ng kê.

ế ậ ả ở ả ấ K t qu  thu th p trình bày b ng 4.9 cho th y:

ớ ố ề ướ ạ ố ầ Giai đo n 20 NSC: v i s  lá ban đ u là 3 lá, s  lá trên cây có chi u h ng tăng

ộ ồ ừ ế ụ ế ồ ầ d n khi n ng đ  NAA tăng t 0 mg NAA/lít đ n 1 mg NAA/lít. Khi ti p t c tăng n ng

ề ấ ả ố ố ộ đ  lên 1,5 mg NAA/lít thì s  lá gi m. NT3 (1 mg NAA/lít) cho s  lá nhi u nh t (3,6

ả ấ ế ấ lá/cây). NT1 (ĐC) cho k t qu  th p nh t (3,2 lá/cây).

ạ ạ ố ừ ở Giai đo n 30 NSC: giai đo n này s  lá tăng thêm t ế  0,4 lá/cây đ n 0,8 lá/cây

ứ ệ ở ứ ệ ệ ố các nghi m th c. S  lá trung bình/cây ấ  nghi m th c 2 cao nh t (4,2 lá/cây), nghi m

ứ ấ ố th c 4 có s  lá trung bình trên cây ít nh t (3,6 lá/cây).

ế ủ ấ NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT3 (1 mg NAA/lít) cho k t q a cao nh t (4,4

ả ấ ự ư ế ấ ệ lá/cây). NT4 (1,5 mg NAA/lít) cho k t qu  th p nh t (4,13 lá/cây) nh ng s  khác bi t

ứ ữ ứ ệ ệ ố ớ ạ gi a hai nghi m th c này không có ý nghĩa th ng kê so v i các nghi m th c còn l i.

Ở ấ ả ứ ệ ể ườ ậ t c  các nghi m th c, lá phát tri n bình th t ng và có màu xanh đ m.

ưở ủ ế ướ ồ ệ ề ả Ả ng c a NAA đ n kích th ủ c lá và chi u cao c a cây lan h  đi p B ng 4.10:  nh h in

vitro

Ngày sau c yấ

20 NSC

30 NSC

40 NSC

CV (%)

Ftính

ự ị ệ ố ự theo sau giá tr  trung bình khác nhau có s  khác bi t trong th ng kê α α Ghi chú: Ký t (*: = 0,05; **: = 0,01).

ề ỉ ề Xét v  ch  tiêu chi u dài lá:

ầ ừ ề ạ ấ ả ế B ng 4.10 cho th y, giai đo n 20 NSC: chi u dài lá tăng d n t 1,6 cm đ n 2

ộ ừ Ở ồ ề ộ ồ cm khi tăng n ng đ  NAA t ế  0 mg đ n 1 mg. n ng đ  1,5 mg NAA/lít thì chi u dài

ắ ầ ệ ề ả ấ ứ lá b t đ u gi m. NT3 (1 mg NAA/lít) có chi u dài lá dài nh t (2 cm/lá). Nghi m th c

ả ấ ứ ế ấ ố đ i ch ng (0 mg NAA/lt1i) cho k t qu  th p nh t (1,6 cm/lá).

Ở ố ộ ạ ưở ề ừ ế giai đo n 30 NSC: t c đ  tăng tr ng chi u dài lá t 0,24 cm đ n 0,44 cm (so

ở ầ ừ ề ề ờ v i chi u dài lá 20 NSC). Chi u dài lá tăng d n t ế  1,84 cm (ĐC) đ n 2,44 cm (NT3).

Ở ả ắ ứ ệ ế ạ ấ ạ ệ  giai đo n 40 NSC: k t qu  tr c nghi m phân h ng cho th y nghi m th c 3

ự ư ề ấ ớ ệ (1,5 mg NAA/lít) có chi u dài lá trung bình/cây l n nh t (3,1 cm/lá) nh ng s  khá bi t

ố ớ này không có ý nghĩa th ng kê so v i NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT4 (1,5 mg

ứ ố ả ấ ứ ế ệ ấ

NAA/lít). Nghi m th c đ i ch ng (NT1) cho k t qu  th p nh t (2,1 cm/lá) và khác  bi tế

ứ ệ ớ ố ạ ấ r t có ý nghĩa th ng kê so v i các nghi m th c còn l i.

ề ộ ề ỉ Xét v  ch  tiêu chi u r ng lá:

Ở ề ộ ầ ừ ạ ế ả giai đo n 20 NSC: chi u r ng lá tăng d n t 0,74 cm/lá đ n 1 cm/lá (b ng

4.10).

ả ấ ế ế ả ấ ấ NT3 (1 mg NAA/lít) cho k t qu  cao nh t (1 cm/lá). NT1 cho k t qu  th p nh t

(0,74 cm/lá).

Ở ề ộ ạ ộ ừ giai đo n 30 NSC: chi u r ng lá dao đ ng t ế  0,92 cm/lá đ n 1,22 cm/lá.

ở ố ộ ứ ệ ưở ứ ệ ẳ ơ nghi m th c 3 có t c đ  tăng tr ng cao h n h n các nghi m th c ề ộ Chi u r ng lá  còn

ớ ạ l i (0,22 cm/lá so v i 20 NSC).

Ở ứ ế ệ ấ ả ạ giai đo n 40 NSC: nghi m th c 3 (1 mg NAA/lít) cho k t qu  cao nh t (1,5

ệ ứ ệ ớ ố ự cm/lá), s  khác bi t này không có ý nghĩa th ng kê so v i nghi m th c 2 (0,5 mg

ư ạ ự ế ứ ệ ố NAA/lít) nh ng l i có s  khác bi ớ t có ý nghĩa th ng kê so v i nghi m th c 1 (ĐC) và

ứ ệ nghi m th c 4 (1,5 mg NAA/lít).

ề ỉ ề Xét v  ch  tiêu chi u cao cây:

Ở ố ộ ạ ưở ề ở ệ giai đo n 20 NSC và 30 NSC: t c đ  tăng tr ng chi u cao cây các nghi m

ứ ừ ế ổ ườ th c t 0,2 cm/cây đ n 1,17 cm/cây. Khi b  sung 1 mg NAA/lít vào môi tr ng nuôi

ồ ệ ứ ệ ề ẳ ớ ơ ạ ể ấ c y lan h  đi p thì chi u cao cây phát tri n h n h n so v i các nghi m th c còn l i

ở ả ấ ứ ệ ế ấ ở (2,55 cm/cây 30 NSC). Nghi m th c 1 (ĐC) cho k t qu  th p nh t (1,36 cm/cây 30

NSC).

Ở ế ấ ạ ả ạ giai đo n 40 NSC: k t qu  phân h ng cho th y NT3 (1,5 mg NAA/lít) có

ự ề ấ ệ ố chi u cao cây cao nh t (2,83 cm/cây), s  khác bi t này không có ý nghĩa th ng kê so

ư ệ ấ ớ v i NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT4 (1,5 mg NAA/lít) nh ng khác bi t r t có ý nghĩa so

ứ ố ế ủ ứ ứ ệ ệ ấ ấ ớ v i nghi m th c đ i ch ng. Nghi m th c 1 (ĐC) cho k t q a th p nh t (1,6 cm/cây)

ư ự ệ ớ ệ nh ng không có s  khác bi ứ t v i nghi m th c 2 (2,2 cm/cây).

ừ ữ ả ượ ấ ườ ể ế T  nh ng k t qu  thu đ ậ c, chúng tôi nh n th y môi tr ợ ng thích h p đ  cho

ồ ệ ưở ể ố ườ cây lan h  đi p in vitro sinh tr ng và phát tri n t t là MS + đ ng (30 g/lít) + agar (8

ướ ừ g/lít) + n c d a (5 ml/lít) + NAA (1 mg/lít).

ậ ế 5.1 K t lu n

ứ ư ệ ế ậ Qua các thí nghi m nghiên c u trên, chúng tôi đ a ra k t lu n:

ể ử ồ ệ ẫ ồ ợ ộ ­ N ng đ  javel thích h p đ  kh  trùng m u phát hoa lan h  đi p là javel 80%

ươ ễ ấ ỷ ệ ố trong 30 phút. Ph ng pháp này cho t ỷ ệ  l nhi m th p (20%) và t s ng cao l

(70%).

ườ ự ợ ừ ẫ ệ ­ Môi tr ng thích h p cho s  phát sinh protocorm t ồ  m u lá lan H  Đi p là: môi

ườ ườ tr ng MS + đ ng (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8

ạ g/lít) + than ho t tính (2 g/lít) + TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít), pH = 5,8.

ườ ồ ệ ể ợ ưở ể ­ Môi tr ng thích h p đ  cho cây lan h  đi p in vitro sinh tr ng và phát tri n

ườ ướ ừ ố t t là MS + đ ng (30 g/lít)+ agar (8 g/lít) + n c d a (5 ml/lít) + NAA (1

mg/lít).

ị ề 5.2 Đ  ngh

ả ạ ượ ụ ồ ệ ạ ố ệ ế ­ Áp d ng k t qu  đ t đ c vào nhân nhanh gi ng lan h  đi p t ờ ồ i Vi n đ ng th i

ả ủ ệ ệ ể ườ ổ ế ế ằ ơ ị ki m nghi m hi u qu  c a các môi tr ng nh m ph  bi n đ n các đ n v  khác.

ế ụ ồ ệ ộ ố ử ứ ệ ố ườ ­ Ti p t c nghiên c u th  nghi m nhân gi ng h  đi p trên m t s  môi tr ng

ồ ị ế ư ướ ừ ể ượ ờ khác nhau đ ng th i thêm các d ch chi ố t nh : chu i xanh, n c d a đ  có đ c

ố ư ấ ệ ố h  s  nhân t i  u nh t.

ộ ố ấ ế ả ưở ự ­ Ti n hành kh o sát thêm m t s  ch t kích thích sinh tr ng khác cho s  phát

ồ ệ ư sinh protocorm và tái sinh cây lan h  đi p nh  kinetin, IBA, 2,4­D.

Ệ Ế Ệ TÀI LI U TI NG VI T

ự ậ ả ế ệ ầ ọ ố ồ Lê Tr n Bình, 1997. Công ngh  sinh h c th c v t trong c i ti n gi ng cây tr ng. Giáo

ấ ả ệ ệ ọ trình cao h c Nông Nghi p, nhà xu t b n Nông nghi p năm 1997, trang 62 ­ 79.

ầ ợ ệ ấ ả ậ ậ ọ ỹ Tr n H p, 1990. Phong Lan Vi t Nam, t p 2. Nhà xu t b n Khoa h c và K  thu t Hà

ộ N i năm 1990, trang 54.

ự ế ạ ự ự ể ồ ộ ơ ị Lê Th  Ánh H ng và c ng s , 2000. T o s  hình thành tr c ti p các c  quan th  và tái

ộ ố ố ệ ằ ạ ươ ứ ắ ỏ sinh m t s  gi ng cây, hoa s ch b nh b ng ph ng pháp nghiên c u c t lát m ng

ả ưở ứ ủ ế ế ả ả ế t bào và  nh h ng c a TDZ đ n kh  năng tái sinh cây, K t qu  nghiên c u

ọ khoa h c 1999­2000, trang 163 ­ 164.

ấ ả ệ ồ Phan Thúc Huân, 1997. Hoa lan nuôi tr ng và kinh doanh. Nhà xu t b n Nông Nghi p

năm 1997, trang 6­18, 173.

ự ậ ấ ả ươ ấ ậ ạ ọ D ng Công Kiên. 2002. Nuôi c y mô th c v t. T p 1, 2, 3. Nhà xu t b n Đ i H c

ố ồ ố Qu c Gia thành ph  H  Chí Minh.

ậ ồ ấ ả ễ ả ỹ Nguy n Xuân Linh, 2002. Giáo trình k  thu t tr ng hoa cây c nh. Nhà xu t b n Nông

ệ Nghi p năm 2002, trang 95 ­ 97.

ấ ấ ế ự ậ ọ ự Tr n Văn Minh,1999. Nuôi c y mô t bào th c v t. Trung tâm khoa h c t nhiên và

ố ọ ệ ớ ệ qu c gia. Vi n sinh h c nhi t đ i, trang 4 ­ 8.

ấ ả ố ồ ệ ễ ồ Nguy n Công Nghi p, 1998. Tr ng hoa lan. Nhà xu t b n thành ph  H  Chí Minh

năm 1998, trang 229 ­ 239.

ự ứ ự ễ ạ ộ ố Nguy n Quang Th ch và c ng s , 2003. Nghiên c u xây d ng quy trình nhân gi ng và

ệ ồ ộ ồ ọ ị nuôi tr ng phong lan Phalaenopsis (lan H  Đi p). Báo cáo khoa h c, H i ngh

ố CNSH toàn qu c năm 2003, trang 850 ­ 855.

ệ ễ ầ ọ ỳ ị ị ị ỹ Nguy n Thi n T ch, Đoàn Th  Hoa, Tr n Sĩ Dũng, Hu nh Th  Ng c Nhân, 2003. K

ấ ả ố ồ ậ ồ thu t nuôi tr ng hoa lan. Nhà xu t b n thành ph  H  Chí Minh năm 2003, trang

46­135.

ệ ự ậ ạ ươ ấ ả ạ ọ ố Bùi Trang Vi t, 2002. Sinh lý th c v t đ i c ng. Nhà xu t b n đ i h c qu c gia TP.

ồ H  Chí Minh.

ấ ả ệ ệ ọ ồ ỗ ị Đ  Năng V nh, 2002. Công ngh  sinh h c cây tr ng. Nhà xu t b n Nông nghi p năm

2002, trang 96 ­ 97.

ữ ễ ươ ự ậ ệ ậ ọ ể Nguy n Văn Uy n, 1995. Nh ng ph ng pháp công ngh  sinh h c th c v t. T p 2.

ấ ả ệ ồ Nhà xu t b n nông nghi p TP. H  Chí Minh.

ẫ ử ướ ễ ằ ỳ ị Ngô Đ ng Phong, Hu nh Th  Thùy Trang, Nguy n Duy Năng. 2003. H ng d n s

ề ầ ươ ầ ơ ứ ệ ụ d ng ph n m m MSTATC trong ph ng pháp nghiên c u nông nghi p. Ph n c

ệ ọ ườ ạ ọ ả b n. Tài li u dành cho sinh viên khoa Nông H c – tr ng đ i h c Nông Lâm Tp.

ồ H  Chí Minh.

Ệ Ế ƯỚ TÀI LI U TI NG N C NGOÀI

Ammirato, 1983. In: Evans et al­1983, P: 82 ­ 123.

Barna K.S and Wakhlu A.K, 1995. Effect of thidiazuron on micropropagation of rose.

In vitro cell. Dev. Biol 31, P: 44 ­ 46.

Bui Van Le, N.T Do My, C. Gendy, J. Vidal and K. Tran Thanh Van, 1997. Somatic

embryogenesis and plant regeneration on thin cell layer of a C4 species Digitaria

sanguinalis (L.) Scop. Plant Cell Tiss. Org Cult. 49, P: 201 ­ 208.

Bui Van Le, N.T. Do My, C. Gendy, J. Vidal and K. Tran Thanh Van, 1998.

Transformation of a C4 monocot, the Digitaria sanguinalis (Large crabgrass)

using somatic embryogenesis induced on Thin Cell Layer. Abstracts. IX Inter

Congr Plant Tiss and Cell Cult. Jerusalem, Israel, P: 191.

Ernst R, 1994. Effect of thidiazuron on in vitro propagation of Phalaenopsis

Doritaenopsis (Orchidaceace). Plant Cell Tiss Org Cult 39, P: 273 ­ 275.

Intuwong O. and Y. Sagawa, 1974. Clonal propagation of Phalaenopsis by shoot­tip

culture. Am. Orchid soc. Bul, 43, P: 893 ­ 895.

Michio Tanaka and Yoshihiro Sakanishi, 1972. Clonal propagation of Phalaenopsis

through tissue culture. College of Agriculture, University of Osaka­Prefecture

Morru­ umemachi, Sakai, Osaka 591­ Japan.

Misson và cs, 1983. Meded. Fac. Landbouwwet. Rijksuniv. Gent 48. P: 1151 ­ 1157.

R.J.Griesbach, 2002. Development of Phalaenopsis Orchids for the Mass­Market. P:

458.

R.L.M.Pierik, 1999. In vitro culture of higher plants. Kluwer academic publishers,

1998. P:69 ­ 71.

Tran Thanh Van, 1973. Direct flower neoformation from superficial tissue of small

explant of Nicotiana tabacum. Planta 115. P: 87 ­ 92.

Tran Thanh Van and Trinh, 1990. Organogenic differentation in Bhojwani SS (Ed).

Plant tissue culture: Application and limitations. Development in crop sciences

19. P: 34 ­ 53.

ừ T  Internet

Clone your phalaenopsis by keiki paste. http://www.orchidshome.com/Orchid_tips/orchid_tips.html

Orchids Asia. The horticultural information pages on orchids of the Asian region.

http://www.orchidsasia.com/

OrchidMania Grassrotts Support for AIDS Prevention – Relief and orchid

Conservation.

http://www.orchids.org/culture/FAQs.html

ố ồ ệ ọ Trung tâm công ngh  sinh h c thành ph  H  Chí Minh.

http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=3&id=61

ộ ố ụ ụ ệ ả Ph  l c 1. M t s  hình  nh thí nghi m

ễ ấ ẫ Hình 4.5: M u nhi m n m

ố ệ ả ử ụ ụ ế ệ ệ ạ ố ắ Ph  l c 2. K t qu  x  lý th ng kê và tr c nghi m phân h ng s  li u thí nghi m

Ả ưở ủ ồ ấ ớ ề ệ ộ ệ 2.1 Thí nghi m 2:  nh h ng c a n ng đ  BAP, TDZ, đi u ki n nuôi c y t i quá

ạ ừ ệ trình t o protocorm t ồ  lá cây lan H  Đi p in vitro

ả ử ế ạ ố ượ ẫ ạ K t qu  x  lý th ng kê và phân h ng l ng m u t o protocorm

Data file: ? &k0S? &k2GANHTAN? &k0S Title:

Function: FACTOR

Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design

Data case no. 1 to 66.

Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lll) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: a) with values from 1 to 2 Factor B (Var 3: b) with values from 1 to 1

Variable 5: pro

Grand Mean = 1.751

1 2 3 5

Total ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ * 1 * 1.999 65.964 * 2 * 1.503 49.602 ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ * * 1 0.707 4.243 * * 2 1.085 6.508 * * 3 2.201 13.207 * * 4 1.937 11.621 * * 5 0.880 5.278 * * 6 2.465 14.791 *

* 7 2.665 15.991 * * 8 0.707 4.243 * * 9 2.901 17.404 * * 10 1.981 11.884 * * 11 1.733 10.397 ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ * 1 1 0.707 2.121 * 1 2 1.462 4.387 * 1 3 2.544 7.633 * 1 4 2.196 6.588 *

1 5 1.052 3.157 * 1 6 2.735 8.204 * 1 7 2.849 8.547 * 1 8 0.707 2.121 * 1 9 3.135 9.405 * 1 10 2.187 6.561 * 1 11 2.413 7.240 * 2 1 0.707 2.121 * 2 2 0.707 2.121 * 2

3 1.858 5.573 * 2 4 1.678 5.033 * 2 5 0.707 2.121 * 2 6 2.196 6.588 * 2 7 2.481 7.444 * 2 8 0.707 2.121 * 2 9 2.666 7.999 * 2 10 1.774 5.323 * 2 11 1.052 3.157 ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­

A N A L Y S I S

K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­ 2 Factor A 1 4.056 4.056 122.8710 0.0000 4 Factor B 10 38.043 3.804 115.2422 0.0000 6 AB 10 2.090 0.209 6.3307 0.0000 ­7 Error 44 1.453 0.033 ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­ Total

65 45.642 ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ ­­

Coefficient of Variation: 10.38%

s_ for means group 2: y

s_ for means group 4: y

s_ for means group 6: y

ế ạ ả ươ K t qu  phân h ng t ng tác AB:

Data File : ? &k0S? &k2GANHTAN? &k0S Title :

Case Range : 84 ­ 105 Variable 5 : pro Function : ? &k0S? &k2GRANGE? &k0S

Error Mean Square = 0.03000 Error Degrees of Freedom = 44 No. of observations to calculate a mean = 3

Least Significant Difference Test LSD value = 0.3807 at alpha = 0.010 ? &k2S Original Order Ranked Order

Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean

1 2 3 4 5 6 7 8