CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
13/11/2015
TS. Trần Hồng Diễm PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc Trường Đại học KHTN - Đại học Quốc Gia Tp. HCM
Nội dung
!
• Chẩn đoán là gì ?!
• Phân biệt chẩn đoán và tiên lượng!
• Chẩn đoán phân tử!
• Phương pháp dùng trong chẩn đoán phân tử!
A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch!
’B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid!
Diagnosis (Chẩn đoán)
• là quá trình xác định bản chất hay nguyên nhân gây
bệnh từ những dấu hiệu hay triệu chứng, kể cả hoàn
cảnh người bệnh!
Diagnosis vs. prognosis
'diagnosis' chẩn đoán! • dia means 'apart’!
• gignoskein means 'come to know’!
-> literally means 'recognizing’!
prognosis’ tiên lượng !
• pro means 'before’!
• gignoskein means 'come to know’ !
-> literally means 'foreknowing'!
Joseph Bell!
Sherlock Holmes!
Arthur Conan Doyle !
Chẩn đoán phân tử
• Là kỹ thuật phân tích các marker sinh học trong genome và proteome – mã hoá di truyền của 1 cá nhân và tế bào của người này biểu hiện gen của họ qua các protein – bằng cách áp dụng sinh học phân tử vào kiểm tra y học.!
• Kỹ thuật này được dùng để chẩn đoán và kiểm soát bệnh, phát hiện
nguy cơ và quyết định liệu pháp tốt nhất cho từng bệnh nhân!
Chẩn đoán phân tử (8)
SỬ DỤNG:!
• THÔNG TIN trình tự chuyên biệt ! trong! • ĐẠI PHÂN TỬ! cho! • Phát hiện nguy cơ! • Chẩn đoán! • Tiên lượng! • Dự đoán đáp ứng với liệu pháp điều trị! • Kiểm soát đáp ứng điều trị!
ĐẠI PHÂN TỬ
Myoglobin
• Peptide/protein!
Cellulose
• Polysaccharide!
• Polynucleotide /nucleic acid!
Nucleic acid
Chẩn đoán phân tử (8)
-> Need for Molecular tests
Recurrence monitoring
Drug selection
Hàng năm, Mỹ chi trả cho genetic testing và Molecular diagnostics từ $3-4 billion (thống kê 2006-2009)
Disease detection
Disease predisposition
Key questions
Pre-natal testing
“Is the baby healthy? “
“Has the disease returned?”
“What diseases is this patient at risk for?”
“Does this patient have a disease?”
“What drugs should I prescribe?”
(cid:115) In the final scenario, we assumed that significant changes occur in testing technologies and that
there would be a much higher rate of adoption for both cancer and non-cancer tests to both
identify diseases and manage treatment courses. All but the last scenario assume that the infectious
disease market is relatively mature and do not expect substantial growth over the next 10 years.
Based on these scenarios, we project spending on genetic testing and molecular diagnostics will reach
between $15 billion and $25 billion by 2021 as shown in Figure 2.4:
Illustrative growth scenarios for molecular diagnostic and genetic testing spending, 2010 – 2021
$30
$25
$20
s r a l l o D
High
$15
Medium
f o s n o i l l i
Low
$10
B
$5
$0
2010
2011
2012
2013
2014
2015
2016
2017
2018
2019
2020
2021
Biểu đồ mô tả dự đoán chi phí cho chẩn đoán phân tử và các kiểm Figure 2.4; Source: UnitedHealth Center for Health Reform & Modernization, 2012 tra di truyền ngày càng tăng, 2010-2021
Finally, it is worth noting that although spending on genetic testing and molecular diagnostics is relevant in its own right, the more important question is what broader effects the use of such tests Source: UnitedHealth Center for Health Reform & Modernization, 2012! may have on the quality and costs of health care — particularly since, according to one estimate, clinical laboratory tests influence about 70 percent of health care decisions.34 While history suggests
medical advances have often contributed to higher overall spending by making more complex and
costly tests and treatments available, they also have the potential to improve health outcomes and
the appropriateness of care — for example, by fostering the more targeted use of therapies for those
patients who will benefit most from them.35
We, therefore, now turn to the question of how consumers and their physicians think about the promise
of new genetic science and their views on what the future might hold.
18
Chẩn đoán phân tử (8)
• Một hệ thống tốt có 3 đặc điểm !
– Nhạy!
– Đặc hiệu!
– Chuyên biệt!
• Nhạy: tất cả các test có thể phát hiện 1 lượng rất nhỏ mục tiêu
thậm chí trong sự hiện diện của các phân tử khác !
• Đặc hiệu: test cho ra 1 kết quả dương tính với phân tử mục tiêu
Đặc điểm của hệ thống phát hiện !
duy nhất
• Đơn giản: test có thể tiến hành 1 cách hiệu quả và ít tốn kém trên
1 quy trình cơ bản!
Chẩn đoán phân tử (8)
A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid
A. Phương pháp chẩn đoán miễn dịch
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Radioimmunoassay! Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)! Western Blotting! Immunoprecipitation! Immunofluorescence! Flow Cytometry and Fluorescence! Alternatives to Antigen-Antibody Reactions! Immunoelectron Microscopy!
Phân tử mục ?êu được phát hiện bởi kháng thể đơn dòng
• Polypeptide hormones (chorionic gonadotropin, growth
hormone)!
• Tumor markers (Prostate-specific antigen)!
• Cytokines (interleukins 1-8)!
• Drug monitoring (cyclosporin)!
• Miscellaneous targets (Vitamin B12)!
• Infectious diseases (Chlamydia, Herpes, Rubella,
Hepatitis B, Legionella, HIV)!
1. Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay)
• là 1 kỹ thuật rất nhạy để đo nồng độ kháng nguyên bằng việc
sử dụng kháng thể!
• Trong kỹ thuật này:! Ø 1 lượng đã biết kháng nguyên được gắn phóng xạ (thường là
đồng vị phóng xạ gamma của iodine vào tyrosine) ! Ø trộn với 1 lượng đã biết kháng thể gắn kháng nguyên đó!
Ø thêm kháng nguyên ‘lạnh’ vào (không đánh dấu)! Ø đo lượng kháng nguyên thay thế bởi kháng nguyên ‘lạnh’ sau
phản ứng cạnh tranh!
15
Ag + Ag* + Ab ! AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab*
Miễn dịch phóng xạ -‐ Nguyên lí
• Sử dụng phản ứng miễn dịch [Antigen – Antibody reaction] để phân
tích 1 cơ chất!
!
– Ag* và Ag không gắn với Ab được rửa !
– Sau bước rửa, hoạt tính phóng xạ của phức hợp gắn được đo! – Nồng độ kháng nguyên ‘lạnh’ tương quan tỉ lệ nghịch với hoạt tính!
Ag + Ag* + Ab ! AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab* [Ag : kháng nguyên ‘lạnh’ ; Ag* kháng nguyên được đánh dấu phóng xạ]!
!
phóng xạ (HTPX)! Ví dụ:! Ứng với [Ag*Ab] ban đầu biết trước đo HTPX là 5000, nếu:! - mẫu bệnh phẩm có Ag cần phát hiện (‘kháng nguyên lạnh) -> cạnh tranh với Ag* hình thành phức hợp AgAb, như vậy nồng độ phức hợp gắn Ag*Ab sẽ giảm -> đo HTPX Ag*Ab ~ 2000! - mẫu bệnh phẩm không chứa Ag cần phát hiện -> không có chất cạnh tranh với Ag* -> HTPX Ag*Ab đo được vẫn ~ 5000!
!
Quy trình cơ bản của PP miễn dịch phóng xạ
• Trong chẩn đoán dị ứng, 1 phương pháp miễn dịch phóng xạ
gọi là RAST test (radioallergosorbent test) được dùng để phát
hiện chất gây dị ứng!
Khác với
Skin test
Patch test
Vd: 1 miếng T.R.U.E PATCH có thể phát hiện 29 chất gây dị ứng khác nhau
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Niken sunfat Wool alcohols Neomycin sulphate Kali dicromat Hỗn hợp caine Hương thơm hỗn hợp Nhựa thông Nhựa epoxy Hỗn hợp Quinoline Nhựa thơm Peru Ethylenediaminedihyrocloride Cobalt chloride P-tertButylphenolformaldehyderesin Hỗn hợp Paraben Hỗn hợp Carba Hỗn hợp cao su đen Cl+Me-Isothiazolinene (Kathon CG) Quaternium-15 Mercaptobenzothiazole P-Phenylenediamine Formaldehyde Mercapto hỗn hợp Thimerosal Thiuram hỗn hợp Diazolidinyl urea (Germall II) Imidazolidinyl urea (Germal 115) Budesonide TixocortolPivalate Hydrocortisone-17-butyrate
mg/cm2 0.2 1 0.23 0.0023 0.63 0.43 0.85 0.05 0,19 0,80 0,050 0,020 0,050 1,0 0,25 0,075 0,0040 0,10 0,075 0,090 0,18 0,075 0,0080 0,025 0,55 0,60 0,0010 0,0030 0,020
mg/patch 0.16 0.81 0.19 0.019 0.51 0.35 0.69 0.041 0,154 0,65 0,041 0,016 0,041 0,80 0,20 0,060 0,0032 0,081 0,061 0,073 0,15 0,060 0,0065 0,020 0,45 0,49 0,00081 0,0024 0,016
Miễn dịch phóng xạ (8)
’Ưu điểm
• Thuận tiện !
• Nhanh (thường ≤ 2 ngày)!
• Nhạy (phát hiện chất < ng/ml)!
• Thực hiện với số lượng mẫu lớn ( ngàn mẫu /ngày)!
• Đặc hiệu!
’Nhược điểm
• Dùng chất đồng vị phóng xạ!
• Tốn kém!
2. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
• Phương pháp miễn dịch định lượng trong đó phản ứng
Ag- Ab được phân tích dựa vào đo hoạt tính enzyme!
• ELISA test, là kiểm tra sàng lọc đầu tiên sử dụng phổ
biến cho HIV!
22
• Có độ nhạy cao !
Tại sao là ......? Enzyme Linked Immunosorbent Assay
1. Antigen of interest is absorbed on to plastic surface (‘sorbent’)!
2. Antigen is recognised by specific antibody (‘immuno’)!
3. This antibody is recognised by second antibody (‘immuno’)
which has enzyme attached (‘enzyme-linked’)!
4. Substrate reacts with enzyme to produce product, usually
coloured. !
23
ELISA-‐Nguyên lí
• Sử dụng 1 enzyme để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa
Ag và Ab!
• Enzyme sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm
có màu -> cho thấy sự hiện diện của mối gắn kết Ag-Ab!
• Có thể dùng để phát hiện sự hiện diện của kháng
nguyên hoặc kháng thể, tuỳ vào cách thiết kế xét
24
nghiệm!
Secondary antibody
y m e
E n z
Coloured product
Primary antibody
Substrate
25
Different antigens in sample
Quy trình cơ bản của ELISA
26
Enzymes dùng trong ELISA
• Horseradish peroxidase (được dùng phổ biến nhất)!
• Alkaline Phosphatase!
• β-galactosidase!
• Lactoperoxidase!
27
• Tetra Methyl benzidine!
to detect Ab (HIV, HCV)
to detect Ag ( Tumor Markers, Hormones )
to detect Ag ( Free Testosterone)
Comparison between Indirect Sandwich & Competitive ELISA
28
ELISA (8)
’ Ưu điểm
• Cho độ nhạy và đặc hiệu cao!
• Nhanh chóng!
• Không sử dụng chất phóng xạ độc hai!
• Có thể dùng rộng rãi trong nhiều phân tích khác nhau
29
!
ELISA (8)
’Nhược điểm
• Cần phải có kháng thể đặc hiệu -> tốn kém!
• Rất đặc hiệu cho 1 kháng nguyên cụ thể, sẽ không phát
hiện được kháng nguyên nào khác !
• Hoạt tính enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi thành phần
huyết tương -> kết quả có thể không chính xác tuyệt đối!
• có thể cho kết quả dương tính giả / âm tính giả , đặc biệt
trong trường hợp kháng nguyên bị đột biến/ biến đổi !
ELISA -‐ Ứng dụng
• Phát hiện kháng thể kháng Mycobacterium trong bệnh lao! • Phát hiện rotavirus trong phân!
• Phát hiện marker viêm gan B trong huyết thanh!
• Phát hiện kháng thể kháng HIV trong máu! • Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm để phát hiện chất
có tiềm năng gây dị ứng trong thực phẩm (trứng, sữa, đậu
phụng, hạt hạnh nhân,…)!
B. Phương pháp chẩn đoán sử dụng nucleic acid
phổ biến!
1. PCR!
2. Real-Time PCR!
3. Isothermal amplification!
4. Hybridization!
5. Sequencing!
1. Polymerase chain reac?on (PCR)
• Trong đó DNA được khuyếch đại để phát hiện sự hiện diện của yếu
tố gây bệnh hoặc gen quan tâm!
’Ưu điểm
• Nhanh!
’Nhược điểm
• Độ đặc hiệu kém ! • Độ nhạy thấp !
• Độ phân giải kém, chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR! • Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm ! • Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư )!
PCR -‐ Ứng dụng
Phát hiện tác nhân VSV gây bệnh • Tác nhân không thể nuôi cấy thường qui! • Tác nhân virus (HBV, HCV, SXH…)!
• Tác nhân vi khuẩn (Chlamydia, Legionella,…)! • Tác nhân VK nuôi cấy chậm ( M. tuberculosis)!
• Tác nhân VK nuôi cấy thất bại (SL ít, hay đã bị điều trị
kháng sinh trước đó) !
2. Real-‐Time PCR
• là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực
tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt!
• Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản
ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ
nhiệt - Real time)!
• Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt
dựa trên cường độ phát huỳnh quang.!
Thời điểm phát hiện ln hiệu
THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU
Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu nền. - Ct (Threshold cycle): là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng. -Động học RealtimePCR Phân tích tiến trình phản ứng trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ computer
Máy Real-‐Time PCR
3. Bộ phận khuyếch đại!
Real-Time Detection !
1. Đèn Halogen- tungsten!
2b. Kính lọc phát sáng!
5. CCD phát hiện 350,000 pixels!
2a. Kính lọc kích thích!
4. Đĩa mẫu!
Cycler!
iCycler from BioRad!
1
10 102 103 104 105 106
1
10 102 103 104 105 106
Cycle 11
Cycle 13
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
Cycle 31
Cycle 33
Cycle 34
Cycle 36
Cycle 39
Cycle 41
1
10 102 103 104 105 106
Cycle 11
Cycle 13
Cycle 15
Cycle 19
Cycle 23
Cycle 26
Cycle 29
C.41
Cycle 31
Mẫu chưa biết [C]
C.39
Cycle 33
C.36
Standard curve
Cycle 34
C.34
Cycle 36
C.33
r e b m u n e l c y C
Cycle 39
C.31
Cycle 41
C.29
1
10
102
103
104
105
106
DNA concentration (copies/ml)
Real-‐Time PCR Seang Thresholds
• Giá trị Ct sau đó được dùng để tính toán lượng DNA
• Một khi threshold (ngưỡng) được thiết lập, các giá trị Ct được tính tự động nhờ phần mềm!
Real-‐Time PCR (8)
Ưu điểm • Đơn giản, nhanh chóng, dễ phân tích kết quả !
• Tránh được ngoại nhiễm vì không cần phân tích sau PCR! • Có thể định lượng trong phạm vi lớn !
• Độ nhạy cao hơn so với PCR ! • Độ đặc hiệu cao hơn so với PCR !
• Thích hợp cho lâm sàng!
Real-‐Time PCR -‐ Ứng dụng (8)
• Giúp phát hiện tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm!
(vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm)! • Giúp định lượng tác nhân gây bênh trong mẫu bệnh phẩm!
• Theo dõi điều trị
Vd: Xác định số lượng virus (HIV, HBV, HCV...)!
• Tiên đoán mức độ nghiêm trọng và tiên đoán kết quả
Vd: Xác định số lượng khởi đầu của các tác nhân gây bệnh khẩn cấp trong mẫu bệnh (sốt xuất huyết, H5N1, H1N1..)! • Ứng dụng trong ung thư học lâm sàng
- Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư !
- So sánh kết quả định lượng trước và sau điều trị giúp đánh giá
mức độ tồn lưu ác tính của bệnh.!
