Simple cloning

Tp. Hồ Chí Minh 24-9-2014

• Ori: vùng tự tái bản • ampR or bla (beta-

lactamase) : gen kháng ampiciline • lacZ’: beta-

galactosidase gene • MCS: multi cloning site • lacI: lac repressor gene

Vector pUC

• bla: mã hóa beta-lactamase, enzyme thủy

phân vòng beta-lacta của ampiciline

Vai trò của các gene

• lacZ’: mã hóa beta-galactosidase, enzyme thủy phân các đường đôi bao gồm X-gal tạo màu xanh

Vai trò của các gene

(c) IPTG: isopropyl --D-thiogalactoside

Cấu trúc của…

Cắt vector và DNA

Nối bằng ligase được…

… hay…

… và cuối cùng là…

… DNA tái tổ hợp (recombinant).

• Hóa biến nạp (competence cell + thermal

shock)

• Điện biến nạp (electroporation)

Chuyển tất cả cấu trúc vào E.coli

Operon lacZ và IPTG

Operon lacZ và IPTG

Blue + White Systems

Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp + ampiciline + IPTG + XGal

Khẳng định dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp

– Dùng enzyme cắt và điện di – Colony PCR (dùng primer chuyên biệt)

1. Điểm khởi đầu nhân đôi (an origin of replication) 2. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 3. Những trình tự nhận biết duy nhất của các RE

(suitable single restriction sites) 4. Kích thước phù hợp (suitable size) 5. Chỉ thị nhận biết đoạn DNA chèn 6. Nhiều bản sao trong tế bào vật chủ 7. Tàn tật , không có khả năng chuyển sang tế bào vi khuẩn khác (loại bỏ những trình tự tham gia trong quá trình tiếp hợp)

Yêu cầu cần có của Vector

Vector nhân tạo đầu tiên, pBR322

• Chứa vùng polylinkers hay multicloning sites • Chứa đoạn DNA ngoại lai từ 3 -10 kb

Polycloning vector

Nhóm pUC

Nhóm pUC

Nhóm pGEM

Nhóm pBluescript

• Lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào:

– Số lượng DNA tái tổ hợp – Kiểu DNA tái tổ hợp – Vật chủ

• Hóa biến nạp (calcium chloride) • Điện biến nạp (electroporation)

Biến nạp (transformation)

• Tế bào mang DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp

được nhân lên.

• Chọn vật chủ rất quan trọng như chọn vector.

Tế bào chủ (host)

Tính chất của tế bào chủ

1. Hiệu quả biến nạp

- Khả năng tiếp nhận DNA, (chưa hiểu rõ). - Hiện diện hệ thống phân hủy DNA nội sinh.  sử dụng các dòng E. coli đột biến làm giảm khả

năng phân hủy DNA ngoại sinh.

2. Sự bền vững của plasmid trong tế bào vật chủ

- Hệ thống tái tổ hợp của tế bào vật chủ  Sử dụng các dòng đột biến hạn chế sự tái tổ hợp

3. Dị tật: hạn chế khả năng sống sót khi phát tán

ra bên ngoài

4. Chứa cấu trúc lacZ’ hữu dụng cho chọn lọc 5. Các marker khác

Tính chất của tế bào chủ

• Xuất phát từ E. coli dòng K • Kiểu gene: endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA (nalR)

relA1D(lacZYA-argF)U169 F80lacZDM15 - endA1: ức chế 1 endonuclease cắt DNA chuyên biệt. -hsdR17 ức chế hệ thống hạn chế của tế bào chủ, DNA được bảo vệ bởi sự methyl hóa

DH5, tế bào chủ cho pUC vector

1) Tránh vector tự nối lại bằng

e s a t a h p s o h p e n

i l

a k l A

Ex: gene ccdB (control of cell death)

1) Hoặc vector chứa gene gây chết tế bào vật chủ khi tự nối

- Tạo vector có DNA chèn theo chiều mong

muốn  thuận lợi cho việc biểu hiện protein

 Sử dụng hệ thống vector chứa multicloning

site (MCS) hoặc polylinker

2) Nhân dòng cưỡng bức

- Tạo dòng với sản phẩm PCR đầu bằng hiệu quả thấp

 Thêm trình tự nhận biết của RE vào primer và tạo dòng bằng hệ thống polylinker.

 Hoặc thêm A vào đầu 3’ sản phẩm PCR và

tạo dòng bằng hệ thống TA vector

3) Nhân dòng sản phẩm PCR

Vector chứa RS của topoisomerase

5) Hệ thống recombinase

Linkers – Các đoạn nối

Adaptors – Các đoạn chuyển đổi

Cassette

M13, vòng đời

Bộ gene M13 và vector M13

Multicloning sites trong lacZ’ gene

• pBlueScripIIKS2+

Vector có nguồn gốc từ M13

phage lamda

Bacteriophage lamda

Nếu loại bỏ vẫn không ảnh hưởng đến sinh sản và làm tan tế bào chủ của phage

Bacteriophage lamda

Chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vào.

Bacteriophage lamda

Chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vào.

Bacteriophage lamda

Vector cải tiến từ phage 

• Dùng tạo dòng các đoạn DNA kích thước lớn • Thành phần

– Marker kháng kháng sinh – Trình tự ori – Đoạn DNA mang đầu cos của phage lamda • Kích thước nhỏ, chứa đoạn DNA eukaryote

khoảng 45 kb.

Cosmid = plasmid + đầu cos

Tạo dòng bằng cosmid

Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) vectors

• Yếu tố F (Fertility factor): plasmid, di chuyển

sang tế bào mới không hiện diện yếu tố F nhờ tiên mao giới tính (sex pilus).

• Có khả năng chèn vào chromosome tế bào chủ • Mang DNA ngoại lai lớn (300 kb) • Chuyển vào E. coli bằng xung điện • Số bản sao thấp 1-2. • Ổn định trong E. coli

Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) vectors

• parA, parB, parC : kiểm

soát số bản sao

• oriS và repE: cần thiết

cho sự tái bản

Yeast Artificial Chromosomes (YAC) vectors

• Dựa trên cấu trúc NST của nấm men • Có thể nhận DNA 2000 kb