Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp

Chia sẻ: Vi Đinh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

161
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung "Bài giảng Chương 3: Công nghệ DNA tái tổ hợp" trình bày những kiến thức về lịch sử hình thành, quy trình tiến hành, kỹ thuật và phương pháp căn bản, ứng dụng công nghệ gene. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp

3/3/2015 Lịch sử hình thành • 1972 – 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 nguồn vật liệu di truyền khác nhau. (Berg, Boyer và Cohen) • 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen, Công nghệ DNA tái tổ hợp Henlinski, Boyer). Tên gọi: • Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Nguyễn Vũ Phong • Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay công nghệ gene (Genetic technology) • Thao tác gene (Gene manipulation) • Tạo dòng phân tử (Molecular cloning) • Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering): thao tác với những phần lớn hơn của bộ gene. QUY TRÌNH TIẾN HÀNH 1. Enzyme • Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho 1.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE) • Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế - 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bào cho - Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. • Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn Restriction enzyme.swf • Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằng enzyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh • Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (E. coli, nấm men) • Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng tế bào mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm 1. Enzyme 1. Enzyme 1.2. Enzyme nối (Ligase) 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) - Trình tự nhận biết: gồm 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom) Hình thành cầu phosphodiester - Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) . gắn các nucleotid kề cận hay chụm cầu với nhau - Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau. - EcoRI: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự tìm ra (I: đầu tiên) 1
3/3/2015 1. Enzyme 1. Enzyme 1.3. Enzyme phiên mã ngược 1.4. Các enzyme khác (reverse transcriptase) • Tổng hợp sợi DNA bổ sung Enzyme Chức năng c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng phản ứng thủy tổng hợp phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Nuclase BAL31 Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exon • c-DNA có thể tổng hợp nuclease) thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease dòng c-DNA 3’-5’ Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus cDNA.swf 2. Các vector chuyển gene 2. Các vector chuyển gene Yêu cầu tối thiểu đối với vector chuyển gene. Plasmid: - DNA vòng tròn - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) - Sao chép độc lập trong tế bào để tự sao chép mà tồn tại độc lập - Có khả năng mang một số gene - Trình tự nhận biết cho RE tạo vết có khả năng biểu hiện thành cắt để chèn gene lạ protein - Trình tự điều hòa (promoter) tạo Vector: điều kiện thuận lợi phiên mã gene - Phân tử DNA có khả năng tự tái bản lạ - Tồn tại độc lập trong tế bào - Đảm bảo sự di truyền bền vững - Mang được gene mong muốn của DNA tái tổ hợp - Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết các gene lạ. 2. Các vector chuyển gene 2. Các vector chuyển gene Các loại vector chuyển gene Ứng dụng của vector chuyển gene Vector Đặc điểm Khả năng Ứng dụng - Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA (nhiều bản sao) chèn Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote - Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn DNA Phage λ Tự động xâm nhiễm và sinh 15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene - Chuyển gene sản trong TB vi khuẩn - Sản xuất RNA Cosmid Plasmid + đoạn cos của 45kb Lập thư viện gene - Sản xuất protein từ gene được tạo dòng. phage λ Hệ thống vector chuyển gen được hoàn thiện không ngừng. Phage DNA mạch đơn Xác định trình tự nu M13 Sản xuất mẫu dò Gây đột biến điểm định hướng BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb YAC Vòng tròn 2 micrometre cải 100-2000kb tiến MAC NST nhân tạo động vật có vú >2000kb 2
3/3/2015 2. Các vector chuyển gene 3. Hệ thống tế bào chủ Plasmid Ti (Host) - 200Kb Mục đích: - Agrobacterium tumefaciens - Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng. - Chuyển gen ở thực vật - Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote - Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào - Sản xuất protein tái tổ hợp. 3. Hệ thống tế bào chủ 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) (Host) 3.1. Escherichia coli (E.coli) 3.3. Hệ thống tế bào thực vật - Dễ nuôi cấy và nhân dòng 3.4. Hệ thống tế bào động vật - Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau. - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Vi khuẩn Gram-, hình que, - Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) - Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney 3.2. Saccharomyces cerevisiae - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) - Eukaryote đơn bào - Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người - Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh khối - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans - Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh - Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học. - Sản xuất protein tái tổ hợp dễ dàng - Sinh vật an toàn Kỹ thuật và phương pháp căn bản Kỹ thuật và phương pháp căn bản 1. Lai nucleic acid 2. Thu nhận gene Đặc tính biến tính và hồi tính có thể lai giữa DNA-DNA, DNA-RNA, - Thu nhận DNA từ bộ RNA-RNA gene * Shotgun: toàn bộ DNA của sinh vật được cắt đoạn nhỏ bằng cơ học hay RE và gắn vào vector tạo dòng * Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA) Southern Blot.swf 3
3/3/2015 Kỹ thuật và phương pháp căn bản Kỹ thuật và phương pháp căn bản 2. Thu nhận gene 2. Thu nhận gene - Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học - Lập ngân hàng c-DNA * Tạo gene từ các mRNA thông tin nhờ enzyme phiên mã ngược Ưu điểm - Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (không chứa đoạn intron) Kỹ thuật và phương pháp căn bản Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3. Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le 3. Tạo plasmid tái tổ hợp a) Dùng đầu so le b) Dùng các đoạn nối (linkers) Kỹ thuật và phương pháp căn bản Kỹ thuật và phương pháp căn bản 3. Tạo plasmid tái tổ hợp 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Dùng đầu so le a) Hóa biến nạp b) Dùng các đoạn nối (linkers) c) Dùng enzyme terminal transferase 4
3/3/2015 Kỹ thuật và phương pháp căn bản Kỹ thuật và phương pháp căn bản 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào b) Điện biến nạp c) Vi tiêm Kỹ thuật và phương pháp căn bản 4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào Tạo cây chuyển gene d) Bắn gene DNA coated Cell’s DNA golden particles Plant cell Gene gun A plant cell with the new gene Transgenic plant Cell division Kỹ thuật và phương pháp căn bản Kỹ thuật và phương pháp căn bản 5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene 5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp b) Sự biểu hiện của gene thành protein Screening.swf 5
3/3/2015 Phản ứng tạo chuỗi nucleotide Polymerase Chain Reaction, PCR (Polymerase Chain Reaction, PCR) PCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau. 1985, Kary Mullis 1. Nguyên tắc 1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94 oC 2. Bắt cặp: lai giữa primers và DNA đơn. Nhiệt độ khoảng 50 oC 3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và dNTPs: 72 oC. Lặp lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di 2. Thành phần phản ứng - Primer - Polymerase chịu nhiệt - dNTP - Dung dịch đệm PCR.swf - Mẫu - Dung dịch đệm Sequencing Sequencing 1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert 1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert 2. Phương pháp didesoxy của F. Sanger Ứng dụng công nghệ gene Ứng dụng công nghệ gene 2. Công nghệ protein tái tổ hợp 1. Khai thác DNA các bộ gene - Sản xuất r-protein 1.1. Genomics: STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent - Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng - Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng. 1 Insulin Tiểu đường 2001 1.2. Proteomics 2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung 2002 - Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến thư, .. đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng 3 Interferon beta Xơ cứng 2003 (function) 4 Hormon tăng tưởng người Thiểu năng tăng trưởng 2003 - Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh. 1.3. Human Genome Projet 5 Erythropoetin Thiếu máu 2004 1.4. Các ngành học khác 6 T-PA (tissu plasminogen Nhồi máu cơ tim 2005 - Cellomics activator) - Metabolomics 7 G-CSF (granulocyte – Chemotherapy-induced 2006 COLONY Stimulating Factor neutropenia - Ionomics 6
3/3/2015 Ứng dụng công nghệ gene Ứng dụng công nghệ gene 4. Vi sinh vật chuyển gene 3. Chẩn đoán phân tử - Genomics vi sinh vật: giải trình tự hơn 200 loài vsv. - Dựa trên phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, chính xác, đơn giản - Sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp. - DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt giữa 2 cá thể, 2 dòng hoặc 2 giống khác nhau. - Công nghệ bề mặt tế bào nấm men. - Biomarker: dấu chuẩn sinh học - DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền - Microarray và Biochips: Ứng dụng công nghệ gene Ứng dụng công nghệ gene 5. Thực vật chuyển gene 6. Động vật chuyển gene - Cải thiện giống cây trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, - Động vật mang gene người làm mô hình thí nghiệm (bệnh di truyền, ung thư,, thoái hóa cơ, viêm khớp,…) - Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa - Sản xuất protein tái tổ hợp - Tạo sắc tố ở các thực vật chuyển gene - Chăn nuôi gene (gene farming) - Biến đổi chất lượng thực phẩm cây trồng - Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu - Sản xuất dầu nhờn công nghiệp - Sản xuất plastid Ứng dụng công nghệ gene 7. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism) * Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân * Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị Pharmacogenomics: (Dược học bộ gene) Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân Gene therapy: * Chuyển gen lành thay thế gene sai hỏng * Thay thế gene 7