Bài giảng công nghệ gen và tế bào

CAO ĐẲNG ĐỨC TRÍ BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM

Bài giảng công nghệ gen và tế bào

CBGD: ThS. NGÔ THÁI BÍCH VÂN

SỐ LƢỢNG KIẾN THỨC: 3 TÍN CHỈ ( 45 TIẾT) MỤC TIÊU MÔN HỌC:

Cung cấp cho sinh viên các khái niệm cơ bản về gene, các phƣơng pháp để thu nhận

DNA, RNA và một số kĩ thuật thao tác trên DNA. Đồng thời giới thiệu những ứng dụng của công nghệ gene trong y dƣợc và nông nghiệp. Bên cạnh đó, môn học này trang bị cho sinh viên khái niệm về tế bào gốc, một đối tƣợng đang đƣợc quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu tế bào. NHIỆM VỤ SINH VIÊN

-Đến lớp học và thảo luận. -Tham gia làm bài tập -Tham dự kiểm tra giữa kì và thi kết thúc học phần

CÁCH ĐÁNH GIÁ: Chuyên cần: 10 % Bài tập : 10 % Kiểm tra giữa kì: 30% Kiểm tra cuối kì: 50%

CHƢƠNG TRÌNH M N HỌC

Chƣơng 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN (3 tiết)

1.1. C c đại ph n tử sinh học 1.2. Học thuyết trung t m của Sinh học ph n tử

Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID. CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN (3 tiết) 2.1. C c phương ph p t ch chiết nucleic acid 2.2. C c phương ph p định t nh v định lượng cơ bản

Chƣơng 3 CÁC ENZYME TH NG DỤNG TRONG C NG NGHỆ GEN (2 tiết)

3.1. C c enzyme giới hạn (RE) 3.2. C c enzyme th ng dụng kh c

Chƣơng 4

CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO D NG (4 tiết)

4.1.Các vector 4.2.Sự tạo d ng

CHƢƠNG TRÌNH M N HỌC

Chƣơng 5: PHƢƠNG PHÁP PCR (4 tiết)

5.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 5.2. Thực nghiệm 5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 5.4.Các hạn chế của phương pháp PCR

Chƣơng 6: CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEIC ACID (4 tiết)

6.1. Phương pháp Maxam-Gilbert 6.2. Phương pháp của Sanger

Bài tập (2 tiết) Thi giữa kì.

Chƣơng 7: CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN VÀO TẾ BÀO (4 tiết)

7.1. Các phương pháp biến nạp 7.2. Các phương pháp tải nạp nhờ vector là virus. 7.3. Kĩ thuật tái tổ hợp tương đồng 7.4. Phương pháp tiêm DNA vào trứng thụ tinh.

CHƢƠNG TRÌNH M N HỌC

Chƣơng 8: C NG NGHỆ GEN TRONG Y DƢỢC (4 tiết)

8.1.Chẩn đo n phân tử 8.2. Liệu pháp gen

Chƣơng 9: C NG NGHỆ GEN TRONG N NG NGHIỆP (4 tiết)

9.1. Công nghệ gen trong chăn nuôi 9.2. Công nghệ gen trong trồng trọt

Chƣơng 10: TẾ BÀO GỐC VÀ VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC SINH HỌC (8 tiết)

10.1. Khái niệm tế bào gốc 10.2. Ứng dụng của công nghệ tế bào gốc trong trị liệu 10.3. Các vấn đề của đạo đức sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Slide b i giảng • Hồ Huỳnh Th y Dương, Sinh học ph n tử, NXB

Gi o dục

• B i Ch Bửu v Nguyễn Thị Lang, Di truyền ph n

tử, NXB N ng nghiệp

• Trần Thị X , Nguyễn Thị Lan, Cơ sở di truyền v

c ng nghệ gen, NXB Khoa học v kỹ thuật

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

1. CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC

1.1. AXIT NUCLEIC Là vật chất mạng thông tin di truyền của c c hệ thống sống, l một polymer

hình th nh từ c c monomer là nucleotide.

Nucleotide gồm: nhóm phosphate + đường ribose (5C) + base hữu cơ. Liên kết giữa các nucleotide là liên kết phosphodisester (giữa nhóm đường và

phosphate).

Các base: purine (Adenin và Guanine); pyrimidine (Thymine , Cytosin và

Uracil)

1.1. AXIT NUCLEIC Deoxyribonucleic acid (DNA) -

Chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch đơn, liên kết nhau bằng liên kết hidro.

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

- 5’-P 3’- OH Qui ước: - Hướng 2 mạch đơn ngược nhau => hai mạch đối song song.

Mỗi mạch đơn l một tr nh tự c định hướng

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Deoxyribonucleic acid (DNA)

Sự kh c nhau giữa DNA của Prokaryote v Eukaryote?

Ribonucleic acid (RNA) - Sự kh c nhau giữa RNA v DNA?

1. Ph n tử RNA l mạch đơn

2. Đường pentose của RNA l ribose thay v deoxyribose.

3. Thymine được thay thế bằng Uracil.

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

RNA thông tin (mRNA):

DNA đến bộ máy giải mã thành các protein tương ứng.

Đ ng vai trò trung gian chuyển thông tin di truyền trên phân tử

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

RNA vận chuyển (tRNA)

Vận chuyển các amino acid cần thiết đến bộ máy dịch mã để tổng hợp protein từ mRNA tương ứng. Cấu trúc: dạng cỏ ba lá, ổn định nhờ các liên kết bổ sung.

Hai vị trí không liên kết: có vai trò quan trọng - Trình tự anticodon - Vị trí gắn amino acid (nối CHT với amino acid đặc trưng)

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Chiếm lượng lớn RNA trong tế b o (khoảng 80 %) l một th nh phần của bộ m y dịch mã. Gồm 1 tiểu đơn vị nhỏ v 1 tiểu đơn vị lớn .

RNA ribosome (rRNA)

1.2. Protein Cấu trúc: - Đơn vị cơ sở : amino acid - Có 20 loại amino acid chính. - Phân loại amino acid(aa): do nhánh bên R qui định

aa có tính kiềm aa có tính axit aa trung tính kị nước aa trung tích phân cực

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

- Các aa liên kết nhau = liên kết peptide

Mức độ tổ chức của protein: 4 mức độ.

Bậc 1: chuỗi polypeptide Bậc 2: sự uốn c c phần của chuỗi polypeptide cấu tr c đều đặn trong kh ng gian (xoắn alpha, phiến beta). Bậc 3: sự kết hợp của cấu tr c protein bậc 2 (dạng 3 chiều) Bậc 4: kết hợp nhiều chuỗi polypeptide  ph n tử protein

Chức năng của protein trong tế b o?

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

1.3. Lipid

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

- Nh n tố h nh th nh c c m ng sinh học. - Đơn vị cấu tr c: acid béo (mạch hidrocacbon + nh m carboxyl có tính acid) - L ph n tử lưỡng cực.

1.4. Polysaccharide

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

- Tham gia cấu tạo tế b o v l nguồn dự trữ năng lượng chủ yếu. - Đơn vị cấu tr c: c c đường đơn giản, liên kết với nhau = nối glycosidic. - Ở tế b o động vật, nguồn dự trữ: glycogen. - Ở tế b o thực vật, nguồn dự trữ: tinh bột.

Sự kết hợp chặt chẽ giữa c c đại ph n tử

Cấu tạo m ng tế b o

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

II./ CẤU TRÚC CỦA GEN

- C c gen cấu tr c hay cistron, thường gọi tắt l gen, mang th ng tin cho tổng hợp c c chuỗi polypeptid hoặc c c RNA cấu tr c. C c gen điều ho đặc trưng của prokaryote do đ cũng thuộc loại n y

1./ Phân loại gen:

- C c v ng điều ho đặc th ở prokaryote

- C c gen mang th ng tin cho tổng hợp RNA vận chuyển (gen tRNA), RNA ribosom (gen rRNA)

- Các vùng đệm (spacer) giữa các gen.

- C c v ng mã ho c c t n hiệu khởi đầu v kết th c phiên mã

2./ Tổ chức phức tạp của bộ gen

a./ Cấu trúc phân đoạn của gen ở sinh vật nhân chuẩn (Exon-Intron)

b./ Cấu trúc gen ở sinh vật nhân sơ (procaryote)

Một phần bản đồ Gen không hoàn chỉnh bao gồm các operon ở vi khuẩn

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

2. HỌC THUYẾT TRUNG TÂM - F.Crick (1956)

PROTEIN

DNA

RNA

SAO MÃ

PHIÊN MÃ

DỊCH MÃ

• Quá trình sao chép (replication)

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

V ng promoter ở Prokaryote

Trình tự kết th c không phụ thuộc nh n tố Rho

Nh n tố Rho

• Quá trình phiên mã (transcription)

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Giai đoạn khởi động dịch mã

• Quá trình dịch mã (translation)

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Giai đoạn kéo d i

• Quá trình dịch mã (translation)

Chƣơng 1 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Giai đoạn kết th c

• Quá trình dịch mã (translation)

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

1. Một số thiết bị thông dụng PIPETMAN Các loại kích cỡ: 1-10 µl 10 -100 µl (hoặc 10 – 200 µl) 100 – 1000 µl 1000 – 5000 µl

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

1. Một số thiết bị thông dụng (tt)

Týp (đầu côn)

Các loại týp tƣơng ứng với từng loại pipetman.

Eppendorf Đƣợc làm bằng nhựa chịu nhiệt Có các loại: 0,5 ml; 1,5 ml; 2 ml

Hấp khử trùng đƣợc.

MÁY LI TÂM

Phƣơng pháp li tâm: phân tách các phần tử dựa vào khối lƣợng

của chúng

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

2. PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC

Mục đích: thu nhận lƣợng lớn acid nucleic

Yêu cầu: DNA nguyên vẹn, nồng độ cao.

Lƣu ý: cần tiến hành tách chiết ở điều kiện nhiệt độ thấp.

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

•TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

• Phƣơng pháp tách chiết DNA

Các bƣớc cơ bản: 3 bƣớc

1. Phá màng tế bào và (màng nhân)

2. Loại bỏ protein

3. Tủa DNA

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

Phƣơng pháp vật lý: sóng siêu âm

Phƣơng pháp cơ học: xay, nghiền

Phƣơng pháp hóa học: các chất tẩy, các proteinase (protein

Phá màng tế bào:

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

• Các chất tẩy: Trixton X 100

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

• Dung dịch Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10%

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

Chƣơng 2:

CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC –

Loại bỏ protein

CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

- Sử dụng các hóa chất có khả năng biến tính protein

- Thƣờng sử dụng dung dịch phenol (pH=8):chloroform

Biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid

- Qua ly tâm, tách DNA và protein thành 2 lớp.

Tủa DNA: Mục đích: - Thu nhận DNA dƣới dạng cô đặc. - Bảo vệ DNA tránh sự phân hủy của enzyme. Có 2 phƣơng pháp tủa thông dụng:

Tủa trong ETHANOL Cần bổ sung muối (Na+) Tủa trong ISOPROPANOL Không cần bổ sung muối

Vethanol : V DNA= 2-2,5:1 Visopropanol : V DNA= 0,8-1:1

DNA sẽ thu nhận lại bằng li tâm. Sau đ , cần quá trình rửa tủa

Quá trình tủa cần thực hiện ở nhiệt độ thấp để tăng hiệu suất.

DNA bằng Ethanol 70 % loại bỏ muối (hoặc các dấu vết của isopropanol) còn lại trên DNA

KẾT QUẢ TỦA DNA

3. Phƣơng pháp tách chiết RNA toàn phần

• RNA không bền , dễ bị phân hủy bởi enzyme ribonuclease (Rnase).

• Rnase có mặt khắp nơi, có hoạt tính cao, bền nhiệt, rất khó phân

hủy.

Tách chiết RNA đ i hỏi những điều kiện nghiêm ngặt hơn.

- Dung dịch Trizol (gồm: SDS, guanidinium thiocyanate, phenol

pH=4) phá màng, ức chế hoạt động của Rnase.

Qui trình tách chiết RNA: tƣơng tự tách chiết DNA

- Protein đƣợc loại bỏ qua xử lí phenol:chloroform và li tâm.

- Tủa RNA: tƣơng tự nhƣ tủa DNA.

Chƣơng 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ

4. Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế

ĐỊNH LƢỢNG CƠ BẢN

Mục đích: định lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid.

Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại

(λ=260 nm) của các base.

Qui ƣớc:

1 đơn vị OD 260 = 50 µg/ml DNA sợi đ i

= 40 µg/ml DNA sợi đơn hoặc RNA

4.Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế (tt)

Kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid

xác định giá trị OD ở 280 nm

xác định giá trị OD ở 260 nm

OD260/ OD280= 1,8 – 2

dung dịch nucleic acid sạch.

Công thức tính nồng độ DNA sợi đ i

C= n* giá trị OD* 50 (µg/ml)

n: độ pha loãng dung dịch DNA

5.Phƣơng pháp điện di

Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid.

Các phân tử tích điện âm dƣới tác động của điện trƣờng,

chúng sẽ di chuyển về cực (+)

Tính linh động của phân tử dựa vào các yếu tố:

- Khối lƣợng phân tử

- Cấu hình của phân tử

- Nồng độ của chất cấu thành gel.

5.Phƣơng pháp điện di (tt) Thiết bị điện di

Loại gel: Gel agarose: loại gel thông dụng nhất, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc khoảng 0,5-20 kb.

Agarose – polysaccharide Nồng độ agarose và thời gian điện di

Khả năng phân tách các phần tử vật chất (độ phân giải)

• Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia UV

nhờ Ethidium bromide (EtBr)

• Ethidium bromide (EtBr) Chất phát huỳnh quang. Khi nhận kích thích của ánh sáng tử ngoại (UV), phát ra ánh sáng nhìn thấy đƣợc

Sự gắn xen EtBr vào DNA

• Yếu tố đánh dấu trọng lƣợng phân tử

(molecular weight marker-MWM):

Tập hợp nhiều trình tự DNA có kích

thƣớc đã biết (thang DNA).

Tùy thuộc vào kích thƣớc của đoạn gene

mục tiêu, sử dụng nhiều loại thang khác

nhau.

Thang DNA λ-Hind III

Gel polyacrylamide: Phân tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ dƣới 1000 bp. Đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu:

- Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ

Ví dụ: Kết quả điện di

Chương 3 CÁC ENZYME THÔNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ GEN

I. Các enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE) Tên gọi:

- Chữ đầu viết hoa (in nghiêng) là chữ đầu tên giống vi khuẩn từ

đó enzyme được li trích.

vi khuẩn nói trên.

- Hai chữ kế (in nghiêng) không viết hoa tương ứng với loài của

- Chỉ số la mã chỉ thứ tự enzyme được phát hiện. Một số trường hợp có thêm chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng.

Ví dụ: enzyme EcoRI

Escherichia

coli

Ry13 Enzyme đầu tiên

I. Các enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE) (tt)

Phân loại:

mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định.

- Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng phân cắt DNA

Gồm 3 loại:

Loại 1: phân cắt tại vị trí cách trình tự nhận biết một khoảng từ

1000-5000 Nu

Loại 3: phân cắt tại vị trí cách trình tự nhận biết khoảng 20 Nu.

Loại 2: phân cắt ngay tại vị trí nhận biết.

1. Các loại enzyme giới hạn loại 2

Trình tự nhận biết:

- Mỗi enzyme nhận biết một trình tự nucleotide đặc hiệu.

- Gồm 4 – 8 nucleotide. Một số enzyme có trình tự nhận biết không

- Có cấu trúc palindrome: trình tự trên 2 mạch hoàn toàn giống nhau

khi đọc cùng một chiều.

chuyên biệt (những Nu có thể thay thế được kí hiệu là N)

Ví dụ: trình tự nhận biết của enzyme BamHI là

5’ G G A T C C 3’

3’ C C T A G G 5’

trình tự nhận biết của enzyme

1. Các loại enzyme giới hạn loại 2 (tt) Các kiểu cắt của enzyme giới hạn loại 2 - Cắt tạo đầu bằng (blunt ends): cắt hai mạch DNA tại cùng một

điểm, tạo 2 đầu bằng.

Ví dụ:

mạch DNA, tạo 2 đầu dính (đầu so le).

- Cắt tạo đầu dính (cohesive ends): cắt tại vị trí lệch nhau trên hai

Ví dụ:

EcoRI

A A T T C G G C T T A A

2. Thiết lập phản ứng cắt Thành phần phản ứng cắt:

- DNA cần phân cắt. - Dung dịch đệm. - Enzyme - Dung dịch BSA (bovine serum albumin) - Nước cất 2 lần đã hấp khử trùng

Lưu ý:

- Venzyme ≤ 1/10 tổng thể tích phản ứng. - Sử dụng dung dịch đệm (buffer) phù hợp với enzyme. - Ủ phản ứng cắt ở nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme. - Bổ sung enzyme vào sau cùng.