CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)
1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
BM-CNSHTV
BM CNSH TV – Khoa CNSH
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA
BM-CNSHTV
Khái niệm
Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật
tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA.
BM-CNSHTV
Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau
Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật đã được giải mã trình tự
BM-CNSHTV
Các phương pháp xác định trình tự
Maxam-Gilbert (1977)
Sanger (1977)
Xác định trình tự tự động
Xác định trình tự thế hệ mới
BM-CNSHTV
Phương pháp Maxam-Gilbert
• Là phương pháp phân giải hóa học
Walter Gilbert
• Sử dụng hóa chất để biến đổi DNA ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau
BM-CNSHTV
Các loại hóa chất sử dụng
Dimethyl sulfat methyl hóa G. Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G. Hydrazin gây biến đổi tại C và T. Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến
đổi tại C.
Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch.
BM-CNSHTV
Base specificity
Chemical used for base alteration
Chemical used for altered base removal
Chemical used for strand cleavage
G
Dimethylsulphate
Piperidine
Piperidine
A+G
Acid
Acid
Piperidine
C+T
Hydrazine
Piperidine
Piperidine
C
Hydrazine + alkali
Piperidine
Piperidine
A>C
Alkali
Piperidine
Piperidine
BM-CNSHTV
J2 nucleic acid sequencing
Maxam and Gilbert chemical method
DNA labeled at one end with 32P
G
C
T
G
C
T
A
Base modification
G
C
T
G
C
T
A
CH3
Release or displace- ment of reacted bases
G
C
T
C
T
A
Strand scission
G
C
T
C
T
A
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
Hạn chế của phương pháp Maxam- Gilbert
• Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt. • Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác.
• Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến hành xác định trỡnh tự.
• Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn,
khoảng 250 bp
BM-CNSHTV
Phương pháp Sanger
• Còn gọi là phương pháp kết thúc mạch (chain termination method) hay phuong pháp dideoxyribonucleotide (dideoxyribonucleotide method)
BM-CNSHTV
Phương pháp Sanger
(chain termination or dideoxy method)
•Phương pháp enzyme
•Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung. Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu.
•DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại
• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)
BM-CNSHTV
Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’
Cho phép kéo dài mạch ở đầu 3’
BM-CNSHTV
Sự kéo dài mạch DNA
BM-CNSHTV
Sự kéo dài mạch DNA khi xuất hiện ddNTP
BM-CNSHTV
Các bước thực hiện
1. Chuẩn bị DNA khuôn sợi đơn 2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng 3. Thực hiện phản ứng 4. Điện di kết quả
Thu nhận kết quả giải trình tự DNA
BM-CNSHTV
Thành phần phản ứng
Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống
chứa các thành phần như sau: − DNA khuôn mạch đơn − Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh
dấu phóng xạ)
− dNTPs − ddNTP (mỗi ống phản ứng bổ sung 1 trong 4 loại ddNTP là ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)
− DNA polymerase − Dung dịch đệm thích hợp
BM-CNSHTV
DNA khuôn và mồi
DNA khuôn mạch đơn chưa biết trình tự
Mồi
Chia thành 4 ống phản ứng
Bổ sung DNA polymerase
Các đoạn kết thúc bằng ddG
Các đoạn kết thúc bằng ddC
Các đoạn kết thúc bằng ddT
Phân tách mạch mới được tổng hợp ra khỏi mạch khuôn
Lớn nhất
Nhỏ nhất
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
VD bản gel điện di xác định trình tự theo phương pháp Sanger
BM-CNSHTV
Bài tập tại lớp
Cho biết thông tin về trình tự DNA thông qua bản gel điện di bên
BM-CNSHTV
Ưu điểm của phương pháp Sanger
• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô
lớn.
• Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng hoá của các chất hoá học, không có phản ứng phụ.
• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng DNA mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của DNA cấu trúc bậc 2.
• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài,
khoảng 300 ~ 400 bp.
BM-CNSHTV
Bài tập về nhà
Giả sử đoạn DNA cần xác định trình tự có
trình tự như sau:
3’ ATTCTCAATGCTATGCTA 5’ Nêu các bước tiến hành xác định trình tự
theo phương pháp Sanger.
BM-CNSHTV
Xác định trình tự DNA tự động
Nguyên lý: • Hoạt động trên cơ sở của phương pháp Sanger. Nhưng :
• Quá trình tổng hợp DNA thực hiện nhờ kỹ thuật PCR • Các chất đánh dấu phát huỳnh quang được đưa vào mạch DNA
tổng hợp mới nhờ sử dụng các mồi được gắn chất đánh dấu phát huỳnh quang ở đầu 5’ hoặc các ddNTP được gắn chất phát huỳnh quang.
• Hệ thống xác định trình tự DNA phát hiện sự phát huỳnh quang từ 4 chất nhuộm khác nhau được sử dụng để phân biệt A, C, G và T trong các phản ứng kéo dài. Mỗi chất nhuộm hấp thu ánh sáng ở các bước sóng ở bước sóng khác nhau. Có 4 màu và do đó 4 loại base có thể được phát hiện và phân biệt được với nhau. Máy cũng như hệ thống phần mềm sẽ thu nhận thông tin về màu sắc và từ đó chuyển đổi sang thông tin về trình tự của DNA.
• Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số
liệu
BM-CNSHTV
Các bước tiến hành
• Chuẩn bị DNA khuôn • Nhân DNA bằng PCR • Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự
sequencer, chạy máy
• Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do
máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên hai mạch và đồ thị.
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
Bigdye terminator
Sequencing với BigDye terminator
BM-CNSHTV
Điện di gel
BM-CNSHTV
Điện di mao quản
BM-CNSHTV
Điện di gel Applied Biosystems PRISM 377 (Gel, 34-96 lanes)
Điện di mao quản Applied Biosystems PRISM 3700 (Capillary, 96 capillaries)
BM-CNSHTV
Sequencing (Sanger) – kết quả
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
Xác định trình tự thế hệ mới
BM-CNSHTV
Pyrosequencing
với một enzym
Pyrosequencing là một phương pháp xác định trình tự DNA dựa trên nguyên lý đọc trình tự qua "tổng hợp“ dựa vào khả năng phát hiện sự giải phóng pyrophosphate mỗi khi một nucleotide được gắn vào mạch. - Nguyên tắc: Pyrosequencing là dựa trên khả năng phát hiện hoạt phát quang tính của DNA polymerase (chemiluminescent.) - Về bản chất, phương pháp cho phép đọc trình tự của một sợi đơn của DNA bằng cách tổng hợp sợi bổ sung dọc theo nó, và phát hiện những bazơ đã thực sự được gắn vào ở mỗi bước. Các mẫu DNA được cố định, và các dung dịch của A, C, G, và T nucleotide được thêm vào và bỏ đi sau mỗi phản ứng một cách tuần tự.
BM-CNSHTV
Việc thêm một nucleotid vào đầu cuối của sợi là có thể nhận biết bởi nó được kèm theo sự giải phóng một phân tử pyrophosphate, là phân tử sau đó được chuyển hóa thành tín hiệu phát sáng nhờ enzyme sulfurylase. Ánh sáng sản xuất bởi phản ứng xúc tác luciferase-được phát hiện bởi một máy ảnh và phân tích trong một chương trình Mỗi dNTP được thêm vào riêng rẽ một cách tuần tự. nucleotidase enzyme (apyrase ) cũng có trong thành phần phản ứng nên những dNTP không được gắn vào mạch sẽ được phân hủy trước khi các dNTP tiếp theo được bổ sung.
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
Hiện nay, một hạn chế của phương pháp là độ dài của mỗi lần đọc chỉ xung quanh 300-500 nucleotide, Điều này có thể làm cho quá trình lắp ráp bộ gen khó khăn hơn, đặc biệt là cho các hệ gen có chứa một lượng lớn ADN lặp đi lặp lại. Đến năm 2007, pyrosequencing là phổ biến nhất là sử dụng cho resequencing hoặc đọc trình tự của bộ gen mà hệ gen của loài họ hàng gần gũi đã hoàn tất.
BM-CNSHTV
