Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 3 - Nguyễn Thị Phương Thảo (tt)

1

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN

Nội dung

1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng

Kü thuËt chuyÓn gen lµ kü thuËt ® a mét hay nhiÒu gen l¹ ®· ® îc thiÕt kÕ ë d¹ng ADN t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ cña ®éng vËt lµm cho gen l¹ cã thÓ tån t¹i ë d¹ng plasmit t¸i tæ hîp hoÆc g¾n vµo bé gen tÕ bµo chñ. Trong tÕ bµo chñ, c¸c gen nµy ho¹t ®éng tæng hîp nªn c¸c protein ®Æc tr ng dÉn tíi viÖc xuÊt hiÖn c¸c ®Æc tÝnh míi cña c¬ thÓ chuyÓn gen. ®èi víi c¸c thÓ nh©n chuÈn, viÖc chuyÓn gen ® îc xem lµ thµnh c«ng khi gen chuyÓn vµo ® îc tæ hîp vµo genom cña tÕ bµo chñ, ®Æc tÝnh cña gen chuyÓn n¹p ® îc duy tr× æn ®inh qua c¸c thÕ hÖ con ch¸u

Ph ¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp : -ChuyÓn gen nhê phèt ph¸t canxi -ChuyÓn gen nhê xung ®iÖn -ChuyÓn gen nhê vi tiªm -ChuyÓn gen nhê liposom Ph ¬ng ph¸p chuyÓn gen gi¸n tiÕp: nhê virus

Nguyên lý:  c¸c DNA ngo¹i lai ® îc trén víi CaCl2 sau ®ã ® îc

chuyÓn vµo mét dung dÞch chøa ion phosphat. Mét phøc hîp ®ång ng ng kÕt (coprecipitate) gi÷a canxi phosphat vµ DNA sÏ ® îc h×nh thµnh, phøc hîp nµy sÏ ® îc c¸c tÕ bµo ®éng vËt cã vó tiÕp nhËn khi nu«i cÊy, kÕt qu¶ lµ cã sù thÓ hiÖn gen ngo¹i lai trong tÕ bµo.

 Kü thuËt nµy cã thÓ sö dông ®Ó ® a bÊt k× DNA vµo tÕ

bµo ®éng vËt cã vó víi môc ®Ých c¸c test thÓ hiÖn chuyÓn n¹p hay biÕn n¹p l©u dµi. C¸c DNA chuyÓn n¹p mang mét gen chØ thÞ chän läc (nh gen aminoglycoside phosphatransferase) ®Ó gióp cho viÖc thanh läc c¸c tÕ bµo kh«ng tiÕp nhËn DNA.

 Khi cã mét nång ®é tÕ bµo cao vµ t¹o ra mét ®iÖn thÕ cao trong mét thêi gian rÊt ng¾n, lóc ®ã trªn mµng tÕ bµo xuÊt hiÖn c¸c lç nhá, DNA cã thÓ ®i s©u vµo trong tÕ bµo vµ ë mét sè tÕ bµo chóng cã thÓ t ¬ng t¸c víi genome cña tÕ bµo.

 M¸y electroporation th êng ® îc l¾p ®Æt mét c«ng

suÊt æn ®Þnh (vµ c¶ thêi gian g©y xung æn ®Þnh) víi c¸c ®iÖn thÕ biÕn ®æi tõ 500-1500 v/cm. §èi víi hÇu hÕt tÕ bµo, sù thiÕt lËp nh vËy ®¶m b¶o 20-50% sè tÕ bµo cßn sèng sau khi thùc nghiÖm chuyÓn DNA.

 Qu¸ tr×nh chuyÓn gen nhê electroporation ® îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é phßng cßn c¸c tÕ bµo ® îc gi÷ liªn tôc trong ®¸ ®Ó kÐo dµi thêi gian më lç c¸c tÕ bµo.

dông cô vi tiªm víi kim tiªm rÊt m¶nh.

 Tiªm trùc tiÕp ADN ngo¹i lai vµo nh©n tÕ bµo ®éng vËt nhê

vµo mét trong nh÷ng nh©n con cña trøng ®· thô tinh tr íc khi c¸c nh©n con kÕt hîp víi nhau ®Ó t¹o ra hîp tö l ìng béi.

 ViÖc chuyÓn gen vµo tÕ bµo ®éng vËt tèt nhÊt lµ chuyÓn

ra ph«i kh¶m: chØ cã mét sè tÕ bµo cã gen chuyÓn vµo.

 NÕu tiÕn hµnh chuyÓn gen ë c¸c giai ®o¹n muén cã thÓ t¹o

 B»ng c¸ch chuyÓn gen vµo giai ®o¹n tiÒn nh©n, gen chuyÓn vµo sÏ ® îc truyÒn cho c¸c thÕ hÖ ph«i tiÕp theo vµ cã thÓ di truyÒn cho con ch¸u.

ThiÕt bÞ chuyÓn gen b»ng vi tiªm

Ph ¬ng ph¸p nµy cho kÕt qu¶ rÊt cao nh ng sè l îng tÕ bµo ® îc xö lý nhá do ph¶i thao t¸c trªn tõng tÕ bµo. Ph ¬ng ph¸p nµy th êng dïng ®Ó ® a ADN vµo hîp tö hoÆc c¸c tÕ bµo ph«i sím.

Gene injected into the male pronuclei

Nguyªn lý thiÕt kÕ vect¬ chuyÓn gen liposom  Ph ¬ng ph¸p dùa trªn sù t ¬ng t¸c ion cña DNA vµ thÓ liposome t¹o ra mét thÓ phøc hîp, phøc hîp nµy cã thÓ phãng thÝch c¸c DNA chøc n¨ng vµo tÕ bµo nu«i cÊy

 Liposom cÊu t¹o tõ c¸c líp mµng lipid t¹o d¹ng tói, bªn trong chøa n íc, kÝch th íc kho¶ng 10 nm ®Õn 1000 nm. Liposom th êng cã mét líp lipid mang ®iÖn tÝch d ¬ng (lipofectamin) vµ c¸c ph©n tö lipid trung tÝnh - nªn nã cã ®iÖn tÝch d ¬ng (+). Liposom cã thÓ kÕt hîp víi c¸c ph©n tö, hoÆc c¸c chÊt mang ®iÖn tÝch ©m (-) t¹o thµnh phøc hîp æn ®Þnh.

 ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt lµ t¹o c¸c phøc hîp liposom - DNA. Ph©n tö DNA cã ®iÖn tÝch ©m (-) cã thÓ kÕt hîp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hîp æn ®Þnh, ® îc sö dông lµm vect¬ chuyÓn gen.

S¬ ®å cÊu tróc vµ ho¹t

®éng cña vect¬ liposom

ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt lµ t¹o c¸c phøc hîp liposom - DNA. Ph©n tö DNA cã ®iÖn tÝch ©m (-) cã thÓ kÕt hîp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hîp æn ®Þnh, ® îc sö dông lµm vect¬ chuyÓn gen.

C¬ chÕ ho¹t ®éng cña vect¬ liposom  Vect¬ liposom cã kh¶ n¨ng tiÕp xóc víi mµng tÕ bµo cña c¸c tÕ bµo ®Ých vµ chui qua mµng tÕ bµo, khi ®ã líp c¸c ph©n tö lipid bÞ ph©n huû lµm cho c¸c gen môc tiªu ® îc ® a vµo trong tÕ bµo.

 Gen môc tiªu cã thÓ ® îc ® a vµo trong nh©n, tån t¹i trong nh©n nh nh÷ng ®¬n vÞ gen ®éc lËp. Trong nh©n c¸c gen môc tiªu cã thÓ cã qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp lµm cho gen nµy ® îc g¾n vµo bé gen cña tÕ bµo chñ.

Sơ đồ chuyển gen nhờ virus vector

Khi x©m nhiÔm vµo tÕ bµo, virus cã kh¶ n¨ng chuyÓn bé gen cña nã vµo tÕ bµo chñ. Mét sè nhãm virus cã thÓ g¾n bé gen hoÆc mét sè gen cña chóng vµo bé gen tÕ bµo chñ, t¹o thµnh mét thÓ thèng nhÊt. C¸c gen virus g¾n víi bé gen cña tÕ bµo chñ cã thÓ tån t¹i l©u dµi cïng víi qu¸ tr×nh ph©n chia cña tÕ bµo chñ, t¹o nªn c¸c provirus.

S¬ ®å chuyÓn gen nhê virus

 Tạo giống

-Nhiều sinh vật với các đặc điểm ưư việt

 Chất lượng thực phẩm

-Các thực phẩm khỏe mạnh hơn được sản xuất nhanh hơn

 Kháng bệnh

-Kháng lại sự lây nhiễm của vi khuẩn

 Tạo các sản phẩm mới -Dê sản xuất tơ nhện

 Các test kiểm tra tính an

toàn hóa học -Sinh vật sản xuất các enzyme mới

www.carleton.c a

 Cấy ghép phủ tạng (Xenotransplantation)

 Bổ sung dinh dưỡng (Nutrition supplements)

 Trị liệu gen ở người (Human Gene Therapy)

 Mô hình nghiên cưứ mới -Chuột chuyển gen

-Sinh vật mới với nhiều đặc điểm mong muốn

www.meddean.luc.ed u

 Thúc đẩy tiến hóa

Một số ví dụ về động vật chuyển gen

 N¨m 1988 Ward vµ céng sù ®· chuyÓn 2 gen m· ho¸ cho 2 enzym cña vi khuÈn vµo cõu ®Ó biÕn ®æi Serine thµnh Cystein nh»m t¨ng s¶n l îng len do Serine k×m h·m qu¸ tr×nh tæng hîp len.

 ViÖn nghiªn cøu n«ng nghiÖp quèc gia Ph¸p (INRA) ®· t¹o ra gièng bß tiÕt s÷a chua (yaourt) do chuyÓn gen lªn men s÷a chua tõ vi khuÈn vµo bé m¸y di truyÒn cña bß s÷a. Con bß nµy tªn lµ BuBu do Danny Lactaire t¹o thµnh c«ng.

 ChuyÓn gen kh¸ng virut nh interferon, gen kh¸ng influenza

vµo lîn, gà vµ cõu.

 ChuyÓn gen kh¸ng ®«ng l¹nh vèn m· ho¸ cho mét ph©n tö protein gi÷ cho m¸u khái bÞ ®«ng l¹nh. Protein nµy (AFPs) ® îc De Vries ph¸t hiÖn tõ 1969 ë c¸ sèng ë vïng ®«ng l¹nh  (- 20 0C). Ng êi ta ®ang nghiªn cøu thiÕt kÕ gen nµy ®Ó chuyÓn

vµo c¸, mét sè ®éng vËt vµ kÓ c¶ c©y trång.

Gia súc chuyển gen

Bò sữa mang các thêm các bản copy của hai loại gen sinh casein có khả năng sản xuất tăng 13% protein sữa

EnviroPig TM

Lơn biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt

Phytic acid trong thức ăn của lợn được phân giải, giải phóng P

P được hấp thu bởi lơn

Thường thì phức hợp phytic acid/P đi qua lơn và thải ra ngoài ở dạng phân

Phân lơn là chất gây ô nhiễm môi trường , thúc đẩy sự phát triẻn rêu ở ao hồ gây chết cá

Figure 1. Phytase produced in the salivary glands and secreted in the saliva increases the digestion of phosphorus contained in feed grains.

http://www.nature.com/news/2005/050221/images/nbt0305

Cá chuyển gen

Tilapia

Salmon/trout

Catfish

Tốc độ sinh trưởng tăng lần do chuyển gen sinh hocmon sinh trưởng

http://www.nature.com/nbt/journal/v19/n6/images/nbt0601_500a_I1.jpg

Cá chuyển gen antifreeze protein

Antifreeze promoter from pout

As water temperature drops the GH gene is turned on

The fish continue to grow when normally they would not

http://pubs.acs.org/hotartcl/chemtech/99/jun/fletcher.html

Animal Bioreactor “Pharming”

1997, Tracy the sheep, the first transgenic animal to produce a recombinant protein drug in her milk

alpha-1-antitrypsin (A AT) treatment for emphysema & cystic fibrosis

Created by PPL Therapeutics & The Roslin Institute

http://nolswf.bbc.net.uk/science/genes/gene_safari/pharm/a_pharming.shtml

 B»ng c¸ch chuyÓn gen vµo ®éng vËt lÊy s÷a cã thÓ thu ® îc s÷a cã

mang c¸c protein là s¶n phÈm của gen chuyÓn n¹p:

 Gen t¹o Lysostaphin: kh¸ng khuÈn g©y bÖnh viªm vó ë tr©u bß.  Gen s¶n xuÊt Factor IX (ng êi): yÕu tè ®«ng m¸u  ChuyÓn gen 1-PI cña ng êi víi promotor  lactoglobulin vµo cõu vµ cho kÕt qu¶ rÊt kh¶ quan, hµm l îng 1- PI ®¹t ® îc 35g/lÝt s÷a, chiÕm 50% tæng l îng s÷a.

 ChuyÓn gen cho dª Alpine ®Ó s¶n xuÊt s÷a chøa protein ®Æc hiÖu

®iÒu trÞ ung th cã tªn lµ BR96.

albumin cao

s¶n xuÊt

trong

s÷a

 ChuyÓn gen t¹o albumin cña m¸u ng êi vµo cõu ®Ó s¶n xuÊt albumin- thµnh phÇn chÝnh cÊu t¹o nªn m¸u tõ s÷a cõu. ViÖc s¶n xuÊt ®¹i trµ albumin ng êi trong s÷a cõu sÏ ® îc ph¸t triÓn m¹nh khi ph ¬ng ph¸p nh©n b¶n ®éng vËt ®· ® îc hoµn thiÖn. ë Mü ®ang kÕt hîp kü thuËt nh©n b¶n ®éng vËt víi kü thuËt gen ®Ó t¹o (80 kg c¸c bß ra albumin/bß/n¨m).

S¬ ®å chuyÓn gen ®Ó s¶n xuÊt Factor VIII trong s÷a lîn

 Tr êng ®¹i häc Cambridge ®· t¹o ra lîn chuyÓn gen kh¸ng thÓ cña ng êi, cã tim ® îc bao bäc bëi protein ng êi nªn cã thÓ ghÐp cho ng êi mµ kh«ng g©y ph¶n øng ®µo th¶i.

 Ca ghÐp tim lîn cho ng êi ®Çu tiªn thùc hiÖn cho

thÊy sau 1 n¨m ghÐp qu¶ tim lîn trong c¬ thÓ ng êi vÉn lµm viÖc b×nh th êng.

 HiÖn t¹i c¸c nhµ khoa häc Mü ®· cã 500 con lîn

cã thÓ cung cÊp phñ t¹ng ghÐp.

 Mét thµnh c«ng rÊt ®¸ng chó ý lµ chuyÓn gen vµo

muçi ®Ó chèng l¹i bÖnh sèt rÐt víi 2 h íng: ◦ T¹o muçi cã kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng víi ký sinh trïng sèt rÐt,

ký sinh trïng kh«ng thÓ sèng l©u trong c¬ thÓ muçi, chóng sÏ bÞ diÖt tr íc khi truyÒn bÖnh cho ng êi.

◦ T¹o muçi mÉn c¶m víi ký sinh trïng sèt rÐt, muçi sÏ bÞ diÖt

bëi chÝnh ký sinh trïng nµy tr íc khi truyÒn bÖnh cho ng êi.

Webster and Peter

Transgenic male kids carrying silk gene

Transgene -> Gene coding for a growth hormone

ANDi, the first transgenic primate born in January, 2000

224 unfertilized rhesus eggs were infected with a GFP virus

~Half of the fertilized eggs grew and divided

40 were implanted into twenty surrogate mothers

five males were born,two were stillborn

ANDi was the only live monkey carrying the GFP gene

http://www.ohsu.edu/unparchive/2001/011001andi.shtml

Alba, the EGFP (enhanced GFP) bunny

Created in 2000 as a transgenic artwork

http://www.ekac.org/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor

Transgenic Pigs Pass on the Transgene

http://news.aol.com/story/_a/glowing-pig-passes-genes-to-piglets/20080109143909990001?ncid=NWS00010000000001

GloFish, originally developed in Singapore as a way to monitor water pollution

The normally black-and-silver zebrafish was turned green or red by inserting various versions of the GFP gene

Glofish are on sale throughout the US except in California

Glofish retail for about $5 per fish. Normal zebrafish cost around one tenth of the price

http://www.nus.edu.sg/corporate/research/gallery/research12.htm

p27 knockout mouse

p27 knockout mouse is bigger than the control

This is not due to obesity, but the skeletal structure is increased in size (everything about the mouse is larger)

http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/saibouE.html

normal

knockout

GDF8 (Myostatin) knockout mouse

Over twice the muscle mass of a wildtype mouse

http://www.bbc.co.uk/science/genes/gene_safari/wild_west/bigger_and_better02.shtml

Naturally Occurring GDF8 Mutants

http://www.canada.com/victoriatimescolonist/story.html?id=67f15c17-2717-4022-bb76-1b982456e793&k=94653 http://www.bbc.co.uk/science/genes/gene_safari/wild_west/bigger_and_better02.shtml

FGF5 knockout mouse has long, angora-like hair

http://www.med.uni-jena.de/ivm/deutsch/method/method_7.htm

Nội dung

1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng

 Vacxin sèng nh îc ®éc: lµ c¸c dßng virut kh«ng ®éc cã trong tù nhiªn hoÆc c¸c dßng g©y bÖnh yÕu ® îc t¹o ra do nu«i cÊy nh©n t¹o liªn tôc nhiÒu thÕ hÖ.

 Vacxin bÊt ho¹t: lµ c¸c dßng virut bÞ chÕt do xö lý

c¸c t¸c nh©n ho¸, lý kh¸c nhau.

 Vacxin t¸i tæ hîp: T¸c nh©n kh¸ng nguyªn ë ®©y chÝnh lµ c¸c protein/glicoprotein ®Æc hiÖu cña virut ® îc s¶n xuÊt th«ng qua c«ng nghÖ AND t¸i tæ hîp

 T¸c nh©n kh¸ng nguyªn cña c¸c virus g©y bÖnh lµ protein/glycoprotein cña vá virut nªn cã thÓ sö dông chóng lµm vacxin

 §Ó tæng hîp c¸c ph©n tö protein/glycoprotein nµy, cÇn t¸ch vµ nh©n dßng c¸c gen m· hãa chóng tõ genom cña virus vµ gµi vµo c¸c vect¬ thÝch hîp.

 C¸c vect¬ t¸i tæ hîp mang gen cña virus sÏ ® îc ® a vµo c¸c tÕ bµo (vi khuÈn, nÊm men…) ®Ó s¶n xuÊt ra c¸c protein/glycoprotein kh¸ng nguyªn lµm vacxin. §©y lµ vacxin t¸i tæ hîp.

Reverse Transcription

RNA

DNA

PCR

Cloning

DNA encoding gene of interest

Expression plasmid

Vaccine vector

 S¶n xuÊt vacxin t¸i tæ hîp kh¸ng bÖnh lë måm long mãng. Virut FMDV (Foot ADN Mouth Disease Virut) g©y bÖnh gåm mét ph©n tö ARN ® îc bäc bëi vá protein. Vá protein chøa 4 tiÓu phÇn VP1, VP2, VP3 vµ VP4 trong ®ã VP1 ®ãng vai trß kÝch thÝch t¹o kh¸ng thÓ.

 C¸c nhµ khoa häc cña h·ng Gentech ®· t¸ch ® îc gen m· ho¸ VP1, ® a nã vµo E.coli th«ng qua plasmit pBR322 vµ buéc nã s¶n xuÊt VP1 trong tÕ bµo E.coli. Kh¸ng nguyªn lµ protein VP1 t¸i tæ hîp rÊt æn ®Þnh vµ cßn gi÷ ® îc hiÖu qu¶ t¸c dông ë 100 0C.

 Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh lë måm long mãng  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh xanh l ìi cõu (bß)  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh b¹ch cÇu bß  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh Newcastle  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh cóm gia cÇm  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh Marek  …

 Cã thÓ sö dông vect¬ virus ®Ó nh©n dßng c¸c kh¸ng

nguyªn vacxin

 Tiªu chuÈn cña vect¬ virus:  Kh«ng g©y bÖnh cho ®éng vËt ® îc xö lý  G©y ® îc miÔn dÞch  Kh«ng truyÒn ngang cho ng êi  Cã kh¶ n¨ng nhËn ®o¹n AND ngo¹i lai lín  Nh©n nhanh dÔ dµng trong tÕ bµo chñ  Trong thùc tÕ kh«ng cã lo¹i virus nµo tháa m·n c¸c ®iÒu kiÖn trªn. HiÖn nay dïng lµm vect¬ 1 sè virus: baculovirus, virus ®Ëu, virus pox, virus Herper…

 Kh¸ng thÓ: lµ c¸c protein ® îc c¬ thÓ ng êi hoÆc ®éng vËt cã

x ¬ng sèng s¶n sinh ra ®Ó chèng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn t ¬ng øng. C¸c kh¸ng thÓ nµy lµ c¸c kh¸ng thÓ ®a dßng v× khi x©m nhiªm vµo c¬ thÓ, c¸c ph©n tö kh¸ng nguyªn kÝch thÝch tÕ bµo s¶n xuÊt rÊt nhiÒu ph©n tö kh¸ng thÓ kh¸c nhau.

 Kh¸ng thÓ ®¬n dßng: lµ tËp hîp cña c¸c ph©n tö kh¸ng thÓ ®ång nhÊt vÒ cÊu tróc vµ tÝnh chÊt. Chóng ® îc t¹o ra bëi dßng tÕ bµo lai gi÷a tÕ bµo ung th myeloma vµ tÕ bµo lympho cña hÖ miÔn dÞch cña ®éng vËt hoÆc cña ng êi.

Kháng thể và kháng nguyên bị các tế bào bạch cầu bao vây

 §Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng tr íc hÕt ng êi ta ph¶i

t¸ch ® îc c¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng t¹o kh¸ng thÓ, sau ®ã cho lai c¸c tÕ bµo nµy víi tÕ bµo ung th b»ng ph ¬ng ph¸p dung hîp.

 Sö dông m«i tr êng nu«i cÊy chän läc ®Ó t¸ch ra c¸c tÕ bµo lai. TÕ bµo lai cã 2 ®Æc ®iÓm: ph©n chia liªn tôc do mang ®Æc tÝnh cña tÕ bµo ung th ®ång thêi l¹i cã ®Æc tÝnh s¶n sinh kh¸ng thÓ.

 Sö dông ph ¬ng ph¸p pha lo·ng ®Ó thu ® îc tõng tÕ bµo lai riªng rÏ. Nu«i cÊy riªng c¸c tÕ bµo nµy cho ph¸t triÓn thµnh dßng vµ s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®Æc tr ng.

 KÕt qu¶ ta sÏ thu ® îc c¸c kh¸ng thÓ ®¬n dßng s¶n sinh ra

tõ c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau.

 T¹o c¸c tÕ bµo sinh kh¸ng thÓ: tiªm kh¸ng nguyªn vµo chuét ®Ó g©y ph¶n øng miÔn dÞch trong c¬ thÓ chuét. C¸c kh¸ng nguyªn nµy sÏ kÝch thÝch tÕ bµo tuþ chuét s¶n xuÊt kh¸ng thÓ.

 T¹o c¸c tÕ bµo lai: t¸ch tÕ bµo tuþ chuét cã kh¶ n¨ng sinh kh¸ng thÓ vµ cã ®Æc tÝnh kh¸ng ® îc hçn hîp HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine). Trén chóng víi c¸c tÕ bµo u tuû (myeloma) tÕ bµo nµy kh«ng kh¸ng ® îc HAT. Bæ sung PEG (Polyethylene Glycol) vµo dÞch huyÒn phï chøa hçn hîp hai lo¹i tÕ bµo trªn ®Ó dung hîp tÕ bµo, t¹o tÕ bµo lai.

 Nu«i cÊy vµ chän läc c¸c tÕ bµo lai: nu«i cÊy hçn hîp tÕ bµo trªn m«i tr êng chøa HAT. TÕ bµo tuþ chuét ph¸t triÓn b×nh th êng sau 1-2 tuÇn nu«i cÊy råi chÕt. TÕ bµo myeloma kh«ng kh¸ng ® îc HAT kh«ng sinh tr ëng ® îc vµ chÕt ngay sau khi nu«i cÊy. ChØ cã c¸c tÕ bµo lai ph¸t triÓn b×nh th êng v× chóng cã hai ®Æc ®iÓm: ph©n chia v« h¹n vµ kh¸ng ® îc HAT.

 T¸ch dßng tÕ bµo lai: nu«i cÊy riªng tõng tÕ bµo lai, chän läc tÕ bµo cã kh¶ n¨ng sinh kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu víi kh¸ng nguyªn ®· ® a vµo chuét vµ nh©n dßng tÕ bµo nµy ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng.

kh¸ng thÓ tinh khiÕt vµ cã tÝnh ®Æc hiÖu cao.

 Ph ¬ng ph¸p s¶n xuÊt mang tÝnh c«ng nghiÖp, lµ

g©y bÖnh.

 X¸c ®Þnh sù hiÖn diÖn chÝnh x¸c cña virut, vi khuÈn

trªn bÒ mÆt tÕ bµo.

 Cã thÓ ph¸t hiÖn ® îc nhiÒu kh¸ng nguyªn ch a biÕt

 Dïng kh¸ng thÓ ®¬n dßng ®Æc hiÖu cã thÓ chèng l¹i kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu cña tÕ bµo lympho T qua ®ã øc chÕ ph¶n øng th¶i lo¹i khi ghÐp c¬ quan

 Cã thÓ chÈn ®o¸n ® îc khèi u qua viÖc x¸c ®Þnh hµm l îng hocmon vµ ®¸nh gi¸ ho¹t ®éng cña tuyÕn néi tiÕt hoÆc c¸c protein ®Æc hiÖu cho sù h×nh thµnh khèi u. ThÝ dô nh : hµm l îng phetoprotein cã nhiÒu ë bÖnh nh©n ung th gan vµ ung th tiÒn liÖt tuyÕn hoÆc protein HCG (human chorionic Gonadotropin) cã mÆt ë nhiÒu bÖnh nh©n ung th kh¸c.

 §Þnh h íng thuèc: cã thÓ g¾n kh¸ng thÓ ®¬n dßng víi thuèc nh»m ®Þnh h íng cho thuèc chøa bÖnh tíi trùc tiÕp n¬i cÇn ch÷a trÞ (n¬i cã protein ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ ®¬n dßng).

S¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng ë chuét

Nội dung

1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng

69

duy nhất, đặc trưng cho loài

 Mỗi sinh vật hưa một số trình tự DNA

70

 Chẩn đoán phân tử giúp cho việc phát hiện được các trình tự DNA đặc hiệu cho loài này.

Teân ñaày ñuû

Mark er

RFLP ALP AFLP RAPD

Restriction fragment length polymorphism (Söï ña hình caùc ñoaïn do caét bôûi RE) Amplicon length polymorphism (Söï ña hình ñoaïn khueách ñaïi) Amplified fragment length polymorphism (Söï ña hình caùc ñoaïn khueách ñaïi) Random amplified polymorphic DNA (Söï ña hình ñoaïn DNA khueách ñaïi ngaãu

nhieân)

DNA amplification fingerprinting (In daáu di truyeàn khueách ñaïi DNA) Simple sequence repeat (microsatellite) (Laëp ñoaïn ñôn) Arbitrary primer-PCR (PCR moài tuøy choïn) Single strand conformation polymorphism (Söï ña daïng caáu hình maïch ñôn) Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite) (DNA

DAF SSR AP-PCR SSCP MRDH- DNA

laëp laïi trung bình, phaân taùn vaø bieán dò cao)

SNP

Single nucleotide polymorphism (Söï ña hình ñôn nucleotide)

Chaån ñoaùn phaân töû goàm caùc kó thuaät chuû yeáu :

 – Lai phaân töû nucleic acid : Nhaèm xaùc ñònh söï

hieän dieän cuûa trình töï nucleotide ñaëc hieäu cuûa moät ñoaïn gen hay DNA.

 – PCR : Duøng primer (moài) ñaëc hieäu ñeå khueách

ñaïi soá löôïng 1 ñoaïn gen.

 – RFLP (Restriction fragment length

polymorphism) : Döïa vaøo veät treân baûn ñieän di do caùc ñoaïn DNA di chuyeån taïo ra.

Một số ví dụ

Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh (HIV)

Một số ví dụ

Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm

Một số ví dụ

Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm

Một số ví dụ

Ứng dụng PCR trong gi¸m ®Þnh h×nh sù

Một số ví dụ

Nội dung

1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng

 Khởi động năm 1988, nhận tài trợ 3 tỷ $ năm

1990 từ US Department of Energy.

 Mục tiêu chính là giải trình tự toàn bộ hệ gen

của người trong 15 naêm, keát thuùc vaøo 2005

 Năm 2003: hoàn tất việc giải mã.  Có thông tin đầy đủ cho mỗi NST  Danh sách đầy đủ các gen trên mỗi NST

a) Xây dựng bản đồ hệ gen người có độ phân giải

cao

b) Xây dựng bản đồ vật lý của tất cả các nhiễm sắc thể của người và một số sinh vật model điẻn hình khác

c) Phát triển năng lực thu thập, dự trữ, phân

phát và phân tích các dữ liệu thu dược

d) Sáng tạo các công nghệ phù hợp để đạt được

các mục tiêu trên

e) Vaïch ra nhöõng vaán ñeà ñaïo ñöùc, luaät phaùp vaø xaõ hoäi (the ethical, legal, and social issues - ELSI) coù theå naûy sinh töø döï aùn.

 Public

◦ Human Genome Project ◦ Academic Laboratories (from around the world)

• Commerial/private • Celera Genomics • Rockville, MD • J Craig Venter

◦ Most contributions

from 6 laboratories (US, UK, Japan)

ScienceVol 291, 16 February 2001

NatureVol 409, 15 February 2001

 Nhoùm nghieân cöùu chuû yeáu laø ôû NIH (Hoa Kyø) phoái hôïp vôùi caùc nöôùc Anh, Phaùp, Ñöùc, Trung Quoác vaø Nhaät Baûn goïi laø nhoùm Consortium (Lieân hieäp caùc phoøng thí nghieäm) vaø sau naøy F.Collins chuû trì. Taát caû coù 18 cô quan khoa hoïc lôùn treân toaøn theá giôùi tröïc tieáp tham gia döï aùn.

 James Watson, ngöôøi phaùt minh moâ hình chuoãi xoaén keùp DNA Watson- Crick naêm 1953, laø ngöôøi chuû trì ñaàu tieân cuûa chöông trình ôû caùc Vieän söùc khoûe Quoác gia Hoa Kyø NIH (National Institutes of Health) ñeán naêm 1992 töø chöùc.

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN

84

 Nhoùm thöù hai Celera Genomics do Craig Venter chuû trì, ra ñôøi chaäm hôn nhöng ñaït keát quaû nhanh vôùi chi phí thaáp. Naêm 1967, Craig Venter laøm y taù quaân y ôû Vieät Nam, trôû veà Hoa Kyø oâng thaáy caàn soáng gaáp. Naêm 1998, nhôø coâng ty Applied Biosystems vaø soá voán 300 trieäu ñoâ-la (USD) oâng laäp coâng ty tö Celera Genomics (Celera nghóa laø taêng toác).

 – Ngaøy 26/6/2000 : Coâng boá baûn thaûo haønh ñoäng

(working draft) cuûa nguyeân boä gen ngöôøi (> 90% vôùi soá base phaân tích gaáp 3 – 4 laàn boä gen).

 – Thaùng 2/2001 : Caùc phaân tích cuûa baûn thaûo haønh

ñoäng ñöôïc coâng boá.

 – Ngaøy 14/4/2003 : Döï aùn boä gen ngöôøi hoaøn thaønh vaø tuyeân boá keát thuùc sôùm 2 naêm ôû Hoäi nghò khoa hoïc cuûa NIH kæ nieäm 50 naêm chuoãi xoaén keùp DNA.

 Vieäc laäp baûn ñoà (mapping) cuoái cuøng caån troïng hôn gaáp 300 laàn so vôùi coâng boá naêm 2000, caùc loã troáng (400 gaps) ñöôïc laáp kín vaø caùc nhaø khoa hoïc Mó chæ tieâu toán 2,7 tæ USD. Ñaây laø söï kieän troïng ñaïi nhö yù kieán cuûa caùc nhaø khoa hoïc : “Ñaây laø ngaøy chuùng ta hoaøn taát laàn xuaát baûn ñaàu tieân “Cuoán saùch cuûa söï soáng (the Book of Life).” hay “Trong nhieàu theá kæ tôùi, ngaøy hoâm nay seõ ñöôïc nhôù ñeán nhö moät coät moác lòch söû”.



Caùc ñoät phaù kó thuaät goùp phaàn hoaøn thaønh döï aùn coù giaù trò to lôùn trong taát caû caùc lónh vöïc sinh hoïc.

 Naêm 2000, Chöông trình boä gen ngöôøi ñaõ ñaït nhöõng keát quaû ngoaïn muïc, Toång thoáng Hoa Kyø Bill Clinton ñaõ tröïc tieáp giaøn xeáp ñeå ñaïi dieän nhoùm “Consortium” laø Francis Collins vaø Craig Venter hôïp taùc nhau coâng boá keát quaû.

 Ngaøy 26/6/2000, döôùi söï chuû trì cuûa Toång thoáng Hoa Kyø Bill

Clinton vaø Thuû töôùng Anh Tony Blair, Fr. Collins vaø C.Venter laàn ñaàu tieân coâng boá veà giaûi trình töï boä gen ngöôøi gaàn xong (99%). Thaønh töïu naøy laø moät kì coâng vó ñaïi cuûa loaøi ngöôøi. Do nhöõng keát quaû coâng boá ñaàu tieân naøy coøn haøng traêm loã troáng (gaps) vaø nhieàu sai soùt neân noù ñöôïc goïi laø baûn phaùt thaûo (the Draft), nhöng noù seõ giuùp ñònh höôùng khai thaùc neân coøn goïi laø baûn phaùt thaûo haønh ñoäng (the Working Draft).

Thaùng 2/2001 hai nhoùm coâng boá nhöõng keát quaû phaân tích

chi tieát hôn caùc soá lieäu :

protein vaø 12.000 gen khaùc.

 – Nhoùm Consortium cho raèng soá gen khoaûng 30.000 ñeán

40.000.

 – Nhoùm Venter xaùc ñònh chaéc chaén 26.588 gen maõ hoùa

töông töï ôû chuoät.

 – Nhoùm Consortium xaùc ñònh ñöôïc 113 gen cuûa vi khuaån gaén vaøo boä gen ngöôøi, khoâng phaûi do thöøa keá trong tieán hoùa.

 – Venter cho raèng coù 300 gen cuûa ngöôøi khoâng tìm thaáy

 Ñieàu ñaùng kinh ngaïc laø soá gen ngöôøi khoaûng 35.000, ít hôn raát nhieàu so vôùi döï kieán tröôùc ñaây laø 50.000 ÑEÁN 140.000 gen, vaø noù chæ khoaûng gaáp 2 laàn nhieàu hôn soá gen cuûa tuyeán truøng Caenorhabditis elegans (19.099 gen).

 Tuy soá löôïng gen caàn chænh lyù laïi, töø phaùt hieän khieâm toán vaø gôïi

toø moø naøy, caùc nhaø khoa hoïc cho raèng chìa khoùa di truyeàn cho söï phöùc taïp cuûa con ngöôøi khoâng do soá löôïng gen, maø ôû choã caùc phaàn cuûa gen ñöôïc söû duïng nhö theá naøo ñeå taïo neân caùc saûn phaåm khaùc nhau trong gheùp noái caùc phaàn cuûa gen theo löïa choïn (Alternative Splicing). Söï phöùc taïp ñöôïc gia taêng töø nhieàu nguoàn khaùc laø haøng nghìn bieán ñoåi hoùa hoïc sau dòch maõ (Post- translational chemical modification) taùc ñoäng ñeán caùc protein vaø chöông trình cuûa caùc cô cheá ñieàu hoøa kieåm soaùt caùc quaù trình ñoù.

 Ñeå xaây döïng baûn phaùt thaûo haønh ñoäng, 16 Trung taâm

giaûi kyù töï chuoãi ñaõ phaân tích hôn 22,1 tyû base cuûa trình töï khôûi ñaàu, goàm caùc ñoaïn truøng laép toång coäng 3,9 tyû base vaø cung caáp 7 laàn phuû kín boä gen ngöôøi (coù theå hieåu laø giaûi kyù töï chuoãi gaáp 7 laàn boä gen ngöôøi). Hôn 30% ñaït chaát löôïng cao, laø nhöõng trình töï cho keát quaû cuoái cuøng, vôùi ñoä phuû kín 8 ñeán 10 laàn, ñoä caån troïng 99,99% vaø moät soá choã troáng.

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN

96

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN

97

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN

98

Thôøi ñaïi sau boä gen (PostGenomics Era) ñaõ baét

ñaàu vôùi caùc daáu hieäu :

– Söû duïng caùc coâng cuï vaø coâng ngheä ñeå khai thaùc boä

gen ngöôøi.

– Sinh hoïc phaùt trieån ôû möùc cao hôn nhö Sinh hoïc

caùc heä thoáng (the Systems Biology).

– Söï phaùt trieån haøng loaït caùc coâng ngheä then choát

(key tehnologies) môùi nhö Tinsinh hoïc (Bioinformatics), Biochip vaø microarrays, Coâng ngheä sinh hoïc nano (Nanobiotechnology),…

ñoäng cuûa thuoác ôû caáp ñoä teá baøo nhôø söï gaén keát vôùi coâng ngheä thoâng tin (IT). Söû duïng caùc thuaät toaùn (algorithm) ñeå phaân tích töï ñoäng hoùa hình thaùi hoïc cuûa caùc teá baøo seõ cung caáp caùc keát quaû ñònh löôïng giuùp cho taàm soaùt dung löôïng cao (high content screening).

 – Cellomics : nghieân cöùu chöùc naêng teá baøo vaø taùc

chaát. .

 Metabolomis : coâng ngheä gen ñieàu khieån trao ñoåi

ion trong teá baøo.

 Ionomics : caùc gen chi phoái söï ñieàu hoøa taát caû caùc

 Töø naêm 1999, söï phaùt trieån cuûa Genomics vaø Proteomics daãn ñeán Coâng ngheä microarray (Microarray technology) vaø ñeán naêm 2002 saûn phaåm ñaàu tieân coù maët treân thò tröôøng. Xuaát phaùt töø nhu caàu thöïc teá chaån ñoaùn, caùc haõng döôïc phaåm cuõng nhö caùc trung taâm nghieân cöùu lôùn ñaõ cho ra ñôøi nhieàu saûn phaåm duøng cho phaùt hieän nhanh (nhö xaùc ñònh SNP) coù theå ôû daïng chip (boï ñieän töû), daïng bi (bead) coù töø tính (hình 4.9) hay caùc microarray (hình 4.10) vaø coù theå ôû nhieàu daïng khaùc hoaëc laø söï keát hôïp cuûa caùc daïng treân. Töïu chung, nhaèm taïo thuaän lôïi nhaát cho chaån ñoaùn nhanh, nhaïy vaø chính xaùc caùc SNP ñang quan taâm.

Hình 4.9. Caùc vieân bi coù gaén maãu doø lai vôùi RNA/DNA muïc tieâu

Hình 4.10. Microarray vôùi caùc daõy chaám, phía treân laø chuøm tia saùng cuûa ñaàu doø (detector) khueách ñaïi caùc ñoám saùng ñeå ñoïc keát quaû