Bài giảng Kỹ thuật thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật: Chương 1 - Terpenoid

CHƯƠNG 1: TERPENOID

1.1 Khái niệm 1.2 Phân loại và HTSH 1.3 Chiết xuất các HC terpenoid 1.4 Phân tích các HC terpenoid

1.1 Khái niệm

- Terpenoid hay isoprenoid là nhóm các HCTN, là dẫn xuất của isoprene. - Cấu tạo: isopren C5H8 = 1 đơn vị - Đuôi –noid: tương tự

1.2 Phân loại và hoạt tính sinh học

• Terpenoid được chia thành 6 nhóm: có 2 đơn vị isoprene , C10H16 - Monoterpene: - Sensquiterpene: có 3 đơn vị isoprene , C15H24 có 4 đơn vị isoprene , C20H32 - Diterpene: có 6 đơn vị isoprene , C30H48 - Triterpene: có 8 đơn vị isoprene , C40H64 - Tetraterpene: có nhiều đơn vị isoprene , (C5H8)n - Polyterpene: Nhóm 1: hay gặp trong TN và có nhiều UD (tinh dầu) Nhóm tetraterpene: có trong gấc, cà chua, đu đủ (vàng đỏ), hoặc lựu, rau rền… (tím đỏ) Nhóm Polyterpene: nhựa cao su

Bên cạnh đó có thể gặp: Hemiterpene: C5H8 Sesterterpene: C25H40 Tetraterpene: C40H64 Terpenoid có thể tồn tại dưới dạng chứa oxy: (dẫn xuất) - Alcohol - Aldehyde - Keton Epocid - Acid

SINH TỔNG HỢP TERPENE

IPP- Isopentyl pyrophosphate

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15)

- Có mặt trong nhiều loại tinh dầu: đặc biệt là rau thơm- xả, khuynh

diệp

- Quan trọng nhất là nhóm Monoterpene: Menthol (bạc hà), Eugenol, Thymol, Camphor (long não), Cineol (có trong vỏ cam, chanh, bưởi)

Các chất này đã và đang được sử dụng rộng rãi.

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15)

- Nhóm Monoterpene mạch vòng:

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15) - Nhóm Monoterpene mạch vòng:

β-Mircen (nguyệt quế, hoa houblon)

Camphor

- Nhóm Monoterpene dị biệt:

Pyrethrin – trong hoa cúc trừ sâu ở Kenia (Chrysanthemum cinerariaefolium)

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15) - Nhóm Monoterpene có trong thực vật tự nhiên:

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15) - Nhóm Monoterpene có trong thực vật tự nhiên:

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15) - Nhóm Monoterpene có trong thực vật tự nhiên:

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15)

- Trong nhóm Sesquiterpene: + Artemisinin: hạ nhiệt, giảm sốt, trị sốt rét, trong cây thanh hao hoa vàng (Ngải hoa vàng, Artemisia annua) + Zingibenol: có trong gừng (tinh dầu – dễ bay hơi, nhựa dầu- dạng sệt) + Alpha-bisabolol, Chamazulen: trong hoa cúc thơm, chống viêm + sát trùng nhẹ

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15)

1.2.1 Monoterpene và sesquiterpene (C10 &C15)

+ Gossypol: có trong hạt cây bông Gossypium, làm thay đổi sự trưởng thành của tinh trùng chống thụ thai cho nam giới. Đồng phân (-) chống thụ thai, đồng phân (+) gây ra độc tính và có hoạt tính chống ung thư + vi khuẩn

1.2.2 Triterpene (C30)

- Có nhiều ứng dụng trong y học - Là hoạt chất chính của nhân sâm (…), tam thất, cam thảo, rau má… (chứa nhiều saponin triterpene)

Cam thảo

- Sapo = xà phòng: phân tử có 1 đầu ưa

nước, 1 đầu kỵ nước  tạo bọt

- Saponin: vị đắng, dễ gây kích ứng niêm mạc, độc khi tiêm vào máu, tan trong nước, ethanol, methanol; ít tan trong ete, aceton, hexane

Rau má

1.2.2 Triterpene (C30)

- Thủy phân Saponin bằng axit tạo ra

đường và các alglycol (sapogerin, có cấu tạo triterpenoid hoặc steroid)

- Thủy phân Saponin bằng axit loãng và đun nóng thu được các genin trong đó có nhiều axit terpenic

1.2.3 Tetraterpene (C40)

- Carotenoid là 1 nhóm tetraterpene tiêu biểu (caroten và xanthophyl) - (β-carotene=2 phân tử vit.A, α-carotene = 1 phân tử vit.A) - Có trong trứng, gấc, đu đủ, cam vàng… (TV màu vàng, đỏ) - Xanthophyl: có trong cá hồi - Các chất này có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, phòng và trị ung thư

(đb UT đường tiêu hóa, tiền liệt tuyến)

- Được sử dụng rộng rãi để SX các sp bổ sung dinh dưỡng có tác dụng

chống lão hóa, tăng cường miễn dịch…

1.2.3 Tetraterpene (C40)

1.2.3 Tetraterpene (C40) - Lycopen (trong cà chua, gấc, đu đủ…): chất màu thuộc nhóm

carotenoid không có hoạt tính vit.A

- Lutein: là một xanthophyl, màu vàng, có trong lá cây cải xoăn, rau

chân vịt… trứng gà, mỡ động vật, điểm vàng đáy mắt (có đồng phân là zeaxanthin). Tan trong mỡ, dầu không tan trong nước

- Astaxathin: carotenoid thuộc nhóm xanthophyll (còn tên là LÁ VÀNG), có trong vi tảo, nấm men, cá, tôm, chim ….không có hoạt tính vit.A, có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, tốt cho tim mạch, thần kinh, chống ung thư

1.2.3 Tetraterpene (C40)

- Trong tự nhiên có một số loại VSV có thể sản sinh ra các chất này (gen mã hóa sinh tổng hợp các chất này giống hay khác nhau ở thực vật và VSV)

- Tìm hiểu thêm về các dạng CT hóa học, sự phân bố và ứng dụng. (tiểu luận)

1.3 Chiết xuất các hợp chất terpenoid 1.3.1 Monoterpene và sesquiterpene

- Tương tự như chiết xuất tinh dầu + chiết bằng cất kéo hơi nước: Ở nhiệt độ sôi của nước, cuốn theo các hợp chất bay hơi. + chiết bằng dung môi hữu cơ: ete dầu mỏ, chloroform, dichlometan, benzene…. Sau đó chưng cất để thu tinh dầu NGUYÊN TẮC

SƠ ĐỒ CHUNG

Thử hoạt tính SH các phân đoạn

Thử nghiệm hoạt tính SH các phân đoạn

chung

1.3 Chiết xuất các hợp chất terpenoid

1.3 Chiết xuất các hợp chất terpenoid 1.3.1 Monoterpene và sesquiterpene

NGUYÊN TẮC: + Các dung môi không phân cực dùng để chiết xuất các HC không phân cực + Các DM có độ phân cực thấp chiết xuất các HC có độ phân cực thấp + Các DM có độ phân cực cao  chiết xuất các HC có độ phân cực cao Chú ý: - Tinh dầu không phân cực (nhờ sự bay hơi và tính tan trong nước nên có

thể cất kéo bằng hơi nước)

- Trong một nhóm chất không thể tồn tại HC vừa phân cực vừa không p.c.,

chỉ có thể là phân cực mạnh và phân cực yếu

1.3.2 Triterpene

- Tương tự như chiết Saponin nói chung - Saponin tồn tại dưới dạng liên kết với glycoside và phân cực + chiết bằng nước nóng (trực tiếp hoặc dùng bộ chiết Soxhlet) + chiết bằng cồn EtOH (nồng độ 30-80%) + Phương pháp tổng quát: Chiết bằng Dichlorometan và sau đó chiết bằng MeOH  thu được cao chiết (sau khi loại dung môi)  chiết lại trong hệ dung môi n-butanol và nước

? Nếu chiết bằng MeOH được không? ? Tại sao dùng Dichlorometan

1.3.2 Triterpene

? Nếu chiết bằng MeOH được không? ? Tại sao dùng Dichlorometan

BTVN: Tra cứu bộ chiết Soxhlet

1.3.3 Tetraterpene

- Hợp chất phổ biến trong tự nhiên - Dung môi thường dùng: không phân cực Acetone, acetone:n-hexan (4:6), n-hexan:isopropanol (3:2) + theo Lin & Chen: EtOH:n-hexan (4:3)  hiệu quả tách chiết carotenoid từ cà chua tốt nhất + Tách lutein và zeaxanthin từ hoa cúc vạn thọ: dùng n-hexane và diethyl ether

1.4 Phân tích các hợp chất terpenoid

? Sự khác nhau giữa phân tích định tính và định lượng Phương pháp nào xác định dịch chiết chứa HC mong muốn

Phương pháp phân tích thích hợp với TINH DẦU: GC hoặc GC-MS (Gas-chromatography mass spectrometry) + Đối với các HC terpenoid: diterpene, triterpene, tetraterpene phương pháp phân tích thích hợp TLC, HPLC + Phân tích định tính bằng PƯHH đặc trưng

Viết tắt

MS- Mass spectrometry TLC- Thin Layer Chromatography HPLC- High performance liquid chromatography LPLC – Low… MPLC – Medium…

Phương pháp tách chiết:

Tính chất vật lý terpenoid: • Terpenoids là chất lỏng không màu • Hòa tan trong dung môi hữu cơ và không hòa tan trong nước. • Hầu hết các terpenoid đều hoạt động quang học. • Dễ bay hơi trong tự nhiên. • Điểm sôi 150 - 180oC

Tính chất hóa học: • Chúng là các hợp chất chưa bão hòa. • Chúng phản ứng kết hợp với hydro, halogen, axit halogen để tạo thành các sản phẩm như NOCl, NOBr và hydrat. • Chúng trải qua quá trình trùng hợp và khử hydro trong vòng. • Khi phân hủy nhiệt, terpenoid cho isopren là một trong những sản phẩm.

Phân tách terpenoid: I. Tách dầu từ thực vật + Phương pháp cuốn hơi nước + Chiết bằng dung môi + Ngâm chiết + Hấp phụ vào chất béo tinh khiết II. Tách terpenoid từ tinh dầu + Phương pháp hóa học + Phương pháp vật lý

Phương pháp cuốn hơi nước

Hơi nước và dầu

Nước lạnh

Nước nóng

Ngưng tụ

Phân tách

Dầu tinh khiết

Nước và dầu

Cấp hơi

Nước hoa

Phương pháp chiết bằng dung môi

• Các dung môi như hexane và ethanol được sử dụng để cô lập tinh dầu. • Nó được sử dụng cho các bộ phận của cây có lượng tinh dầu thấp. • Nguyên liệu thực vật được xử lý bằng dung môi, nó tạo ra hỗn hợp thơm gọi là “cao”. • Sau đó, nó trộn với rượu, các hạt dầu được giải phóng. • Sau đó, cho đi qua một bình ngưng rồi tách ra. • Dầu này được sử dụng trong ngành công nghiệp nước hoa hoặc cho các mục đích hương liệu

Dung môi

Phương pháp ngâm chiết

Ưu điểm: Thu được nhiều tinh chất thực vật hơn. • Nguyên liệu thực vật được chuyển đổi thành bột thô vừa phải. • Nguyên liệu thực vật được đặt trong bình kín. • Thêm dung môi vào. • Hỗn hợp để trong 1 tuần, sau đó chất lỏng được lọc. • Cặn rắn được ép để thu hồi phần chất lỏng còn lại. • Chất lỏng lọc và ép lại được trộn lẫn

Thực vật được cắt nhỏ, trộn dung môi

Phương pháp hấp phụ/ ngấm kiệt

Chất béo được làm ấm đến 50 độ C trên đĩa thủy tinh. Sau đó, chất béo được phủ bằng cánh hoa và nó được giữ

trong vài ngày cho đến khi nó bão hòa với tinh dầu.

Sau đó, những cánh hoa cũ được thay thế bằng những cánh

hoa tươi, quá trình lặp đi lặp lại.

 Sau khi loại bỏ cánh hoa, chất béo được xử lý bằng ethanol

khi đó tất cả dầu có trong chất béo được hòa tan trong ethanol.  Tiến hành chưng cất cồn sau đó: chưng cất từng phần dưới áp

suất thấp để loại bỏ dung môi.

Gần đây chất béo được thay thế bằng than dừa, do ổn định

hơn và khả năng hấp phụ cao hơn.

Hấp phụ cánh hoa hồng

LỌC TÁCH TERPENOID từ TINH DẦU

1/ Phương pháp hóa học + Tinh dầu chứa terpenoid hydrocarbon + nitrosyl clorua trong cloroform tạo thành chất kết tinh. + Tinh dầu chứa rượu + Terpenoid chứa aldehyde và ketone được xử lý bằng NaHSO3, phenyl hydrazine hoặc semicarbazone. Sau khi tách, được phân hủy để lấy terpenoid.

LỌC TÁCH TERPENOID từ TINH DẦU

2/ Phương pháp vật lý + Sắc ký + Chưng cất phân đoạn

Chưng cất phân đoạn Một bình Erlenmeyer được sử dụng làm bình nhận. Ở đây, đầu chưng cất và cột phân đoạn được kết hợp thành một mảnh

5. Phản ứng hóa học đặc trưng (phân tích định tính)

Dùng để định tính Nếu 2/3 số phản ứng dương tính thì có thể kết luận

Cho vài gam nguyên liệu tán nhỏ cho vào nước

5.1 Phản ứng tạo bọt - Phản ứng sơ bộ: Ktra mức độ dương tính + Bọt bền trong 15 phút ++ Bọt bền trong 30 phút +++ Bọt bền trong 60 phút - Phản ứng tiếp theo

5. Phản ứng hóa học đặc trưng (phân tích định tính) 5.1 Phản ứng tạo bọt - Phản ứng sơ bộ: Ktra mức độ dương tính - Phản ứng tiếp theo: 0,5g nguyên liệu  tán nhỏ thêm 5ml H2O đun cách thủy 15 phút Lọc + lấy 2 ống nghiệm sạch: Ống 1: thêm 5 mL HCl 0.1N (pH1.0) Ống 2: them 5mL NaOH 0.1N (pH13) + cho vào mỗi ống 10 giọt dịch chiết, lắc mạnh trong 60 giây Nếu: có bọt bền và cùng một chiều cao thì đó là Saponin triterpene Nếu ống 2 có bọt cao hơn thì đó là Saponin steroid

5. Phản ứng hóa học đặc trưng (phân tích định tính)

5.2 Phản ứng Salkowsky theo kỹ thuật Sapiro () Lấy 5 ml dịch dược liệu 1% chiết trong dung dịch chloroform vào ống nghiệm Đổ từ từ theo thành ống 1-2 mL H2SO4 đặc. Lắc nhẹ thoạt tiên phần trên khối dịch sau đó toàn khối. Dung dịch có màu đỏ, da cam hoặc đỏ tím là sự có mặt của Saponin

PHỤ LỤC

Hoa hoc cac hop chat tu nhien nguyen ngoc tuan