Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào

Chia sẻ: Anh Bình | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

61
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

"Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật - Kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào" trình bày khái niệm bảo quản đông lạnh; vai trò của bảo quản động lạnh; nguyên tắc trong bảo quản đông lạnh tế bào; quy trình bảo quản đông lạnh tế bào...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN TẾ BÀO GỐC NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KĨ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO CRYOPRESERVATION Lê Thị Ngân Hà ltnha@hcmus.edu.vn TPHCM 03/2018
…"I want to live and live longer and I think that in the future they may find a cure for my cancer and wake me up," the 14-year-old wrote to a British judge before her recent death. She said "being cryopreserved gives me a chance to be cured and woken up — even in hundreds of years' time.”…
o Tái lưu thông máu o Thuốc hỗ trợ bảo vệ tế bào o Thay máu và dịch lỏng trong cơ thể bằng chất chống đông o Giảm nhiệt với tốc độ 0,5/giờ đến nhiệt độ nito lỏng o Bảo quản trong các tủ đông hình trụ.
Lịch sử now 1987 Tạm dừng các bảo quản trứng. 1970s Phát triển các nghiên cứu về đông lạnh tinh trùng người. 1959 Lovelock, Bishop: DMSO – red blood cell 1953 Sherman: đông lạnh tinh trùng người – rã đông 1949 Polge: glycerol – tinh trùng gà 1866 Mantagazza: ngân hàng tinh trùng cho tinh trùng người đông lạnh 1776 Spallanzani: tinh trùng người vẫn di chuyển khi gặp nhiệt độ thấp
Bảo quản đông lạnh là gì? Bảo quản: là quy trình sinh học nhằm đảm bảo •nh ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn củ a các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi. Bảo quản lạnh là việc sử dụng nhiệt độ rất thấp để bảo vệ tế bào và mô sống còn nguyên vẹn trong một thời gian dài
Vì sao phải bảo quản đông lạnh tế bào? Ngân Thuận hàng tế lợi bảo bào tồn gen Giảm rủi ro Tiết kiệm nhiễm thời gian nguyên vật liệu Ngăn cản sự biệt hoá Thuận / lão lợi phân hoá loại, tạo dòng Thuận Dòng tế lợi vận bào quý chuyển hiếm
Đáp ứng của tế bào với các stress khi đông lạnh Tác nhân stress Phản ứng của tế bào Giảm nhiệt độ Biến đổi lớp màng lipid, khử polymer hoá bộ xương tế bào Tăng nồng độ các chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu Tăng nồng độ ion Phản ứng trực tiếp trên màng bào gồm tính tan của màng protein Khử nước Mất ổn định lớp đôi phospholipid Kết tủa muối Không rõ Hình thành bọt khí Tổn thương cơ học lên màng và bộ xương tế bào Thay đổi pH Biến tính protein Tế bào bị chèn xếp khít lại Tổn thương màng Tính nhớt của môi trường tăng Quá trình khuếch tán/thẩm thấu bị hạn chế
NGUYÊN TẮC Giảm thiểu sự hình thành tinh thể băng trong tế bào (1) Đông lạnh “chậm” (2) Sử dụng chất bảo quản đông lạnh (3) rữ các tế bào ở mức nhiệt độ thấp nhất có thể để giảm thiểu tác động của nồng độ muối cao lên sự biến đổi protein trong TB. (4) tan băng nhanh chóng để giảm thiểu sự phát triển của tinh thể băng (tái kết tinh)
Nhiệt độ CPA Quy trình Tốc độ làm lạnh Yếu tố ảnh hưởng đến TB
Tae Hoon Jang, Cryopreservation and its clinical applications, 2017
CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH – CRYOPROTECTANTS AGENT CPA Là các loại hoá chất tan được trong nước, có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào, được sử dụng với mục đích giúp tế bào ngăn ngừa các tổn thương tế bào do đông lạnh. Nguyên tắc: (1) Thay thế nước trong tế bào à giảm hình thành tinh thể đá nội bào à giảm tổn thương do tinh thể đá gây ra. (2) Hạn chế tăng nồng độ các chất hoà tan nội bào (3) Kết lên màng bào tương à bảo vệ tế bào. Hoạt động: “khử nước” trong quá trình đông lạnh, “bù nước” trong quá trình giải đông VD: DMSO, glycerol, glycols, một vài amino acid (proline), … Non-permeating Permeating Sucrose, dextran
Ảnh hưởng của CPA lên Tế bào Nồng độ?
QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO CHUẨN BỊ TẾ BÀO BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN LÀM LẠNH LƯU TRỮ GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI NUÔI TĂNG SINH
CHUẨN BỊ Thiết bị Dụng cụ – hoá chất Kính hiển vi đảo ngược Dụng cụ nuôI cấy tế bào phù hợp • Tủ thao tác an toàn sinh h Trypsin/EDTA 0,25% ọc cấp II • Máy ly tâm PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-) • Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% Môi trường đông lạnh tế bào CO2) Ống bảo quản đông lạnh (cryovial) • Tủ mát 2-80C 1,5-2 ml • Tủ âm 00C đến -200C Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô • Bình chứa nito lỏng trùng Bể ổn nhiệt Môi trường giải đông
CHUẨN BỊ
CHUẨN BỊ TẾ BÀO ü Tình trạng tế bào: pha log ü Số lượng tế bào? ü Nhiễm? ü Xác định tỷ lệ tế bào sống chết ü Dán nhãn cryotube
BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN Thành phần môi trường đông lạnh tế bào: ✓ môi trường cơ bản: RPMI, DMEM/F12, IMDM… ✓ huyết thanh thai bò (FBS): 40-50% ✓ CPA: dimethylsulphoxide (DMSO): 5-10%
LÀM LẠNH Đông lạnh Đông lạnh Đông lạnh Đông lạnh chậm nhanh 3 cực nhanh insitu bước Đông lạnh 4 Chuyển TB Đông lạnh theo -20 trực tiếp khi tế bào chương -80 vào -196 vẫn giữ trình, giảm -196 trạng thái nhiệt theo tăng sinh set up trên lúc nuôi cấy máy.
LƯU TRỮ Thời gian lưu trữ: Bất kỳ một gián đoạn nào trong thời gian trữ đông đều ảnh hưởng đến khả năng sống của Tb sau giải đông. Nhiệt độ lưu trữ: Nhiệt độ Thời gian 4 độ Vài giờ -20 độ Vài ngày -80 độ Vài tháng -196 độ Vài thế kỷ
GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI Thao tác? NUÔI TĂNG SINH MTGĐ: môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM...) bổ sung 20- 30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm Kiểm tra sống/chết Thu + MTGĐ Ly tâm 5p cặn TB Tốc độ thấp