Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

ThS. Phan Lữ Chính Nhân

THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép)

Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi)

Tách tế bào bằng enzym (ủ…)

Trypsin ấm

Trypsin lạnh

Collagenas e

Nuôi mẫu mô sơ cấp

NUÔI SƠ CẤP

Ly tâm

Cấy chuyền

Tái huyền phù

Thu nhận tế bào mới

DÒNG TẾ BÀO

Thu mảnh mô thứ cấp

Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp

KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH

KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP

MÔ SƠ CẤP

TẾ BÀO ĐƠN

Là việc nuôi cấy các mảnh mô in vitro. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô trung tâm.

Là việc nuôi cấy các tế bào đơn đƣợc tách ra từ mảnh mô. Trong quá trình nuôi, từng mỗi tế bào sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới.

NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú)

Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột

Nuôi cấy chọn lọc tế bào Tua (DC) từ tủy xương chuột

NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN (thu từ máu cuống rốn)

Quy trình nuôi cấy sơ cấp

Thu nhận mẫu

Xử lí mẫu

Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn

Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô

Nuôi cấy

Thu nhận mẫu

• Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kì mô

sống nào của cơ thể.

• Trƣớc hết phải làm sạch mô tại vị trí lấy mẫu bằng cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm.

• Tùy loại mẫu mô cũng nhƣ thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.

Bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu

Xử lí mẫu đối với nuôi cấy huyền phù tế bào đơn

Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau

nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau.

Biện pháp:

– (1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối. – (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên.

Cắt nhuyễn

Biện pháp cơ học

Ép nhuyễn

Tách bằng màng lọc

Phương pháp cắt nhuyễn

Sử dụng lục sơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mô. Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch

trong

Phương pháp ép nhuyễn

Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame ép chặt mảnh mô để thu tế bào đơn đối với những mô có liên kết yếu.

Phương pháp tách bằng màng lọc

lỗ

thƣớc

Tách bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): trên kích màng từ 70–100 µm, chỉ cho những tế bào thƣớc đơn có kích tƣơng ứng qua màng.

Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym

• Quy trình trypsin ấm • Quy trình trypsin lạnh

Quy trình trypsin ấm

Quy trình trypsin lạnh

Cắt mẫu mô [2 – 3mm], rửa nhiều lần với PBS vô trùng

Thêm môi trƣờng, sục nhẹ nhành cho đến khi mô rời ra

Nếu các mảnh mô chƣa rời ra có thể thêm môi trƣờng để dễ huyền phù hoặc dùng màng lọc

Thu dịch huyền phù tế bào, xác định mật độ, tiến hành nuôi

Thay PBS bằng trypsin 0.25% ủ ống chứa mẫu mô trong 36,50C, 20 – 30 phút

Ủ trong 40C, 6- 18 giờ Loại bỏ trypsin

Tách tế bào bằng phương pháp khác

• Phƣơng pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng • Phƣơng pháp tách tế bào dựa vào marker bề

mặt

Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng

Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào

Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô

Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi

Mảnh mô nổi

Cố định mảnh mô

Mảnh mô sống

Thành công

Phương pháp cố định mảnh mô

• Lammel • Huyết thanh • Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi

Nuôi cấy

Sau khi cố định mảnh mô, bổ sung môi trường nuôi cấy

(1) Ly tâm thu tế bào đơn (2) Tái huyền phù trong môi trường nuôi (3) Cho vào bình nuôi cấy

(1)ủ trong tủ nuôi cấy, 370C (2) Thay môi trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào

Cấy chuyền

• Hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy cũ. • Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám dính). • Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi. • Pha loãng các tế bào bằng môi trƣờng mới.

Cấy chuyền tế bào bám dính

Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi Rửa bề mặt bình nuôi với PBS (free Ca2+ Rửa bề mặt bình nuôi với PBS (free Ca2+ Mg2+) Mg2+)

Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA 0.25% (1- Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA 0.25% (1- 2ml/bình) 2ml/bình) Ủ trong tủ ấm 370C Ủ trong tủ ấm 370C

Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung một lượng môi trường có chứa huyết thanh một lượng môi trường có chứa huyết thanh Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 3000 Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút vòng/phút

Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ đề Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ đề nghị là 1:4 nghị là 1:4

Cấy chuyền tế bào huyền phù

Nuôi cấy tế bào trong các flask nuôi cấy hay các spinner có thể đƣợc duy trì bằng cách pha loãng tƣơng đƣơng của huyền phù tế bào bằng môi trƣờng tƣơi: (1) Giữ flask thẳng đứng, dùng pipette huyền phù vài lần để tách cụm các tế bào. (2) Hoặc tách một lƣợng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trƣờng

Spinner bioreactor

THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép)

Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi)

Tách tế bào bằng enzym (ủ…)

Trypsin ấm

Trypsin lạnh

Collagenas e

Nuôi mẫu mô sơ cấp

NUÔI SƠ CẤP

Ly tâm

Cấy chuyền

Tái huyền phù

Thu nhận tế bào mới

DÒNG TẾ BÀO

Thu mảnh mô thứ cấp

Nuôi sơ cấp

Nuôi mô

Cấy chuyền

Thu nhận cơ quan

Cấy chuyền

Cắt nhỏ Thành tế bào đơn

34

Nuôi sơ cấp

Cell line

35

Tách rời tế bào

Tách bằng Tách bằng enzym enzym

Tách bằng tác Tách bằng tác nhân khác nhân khác (EDTA) (EDTA)

Trypsin Trypsin

Collagenase Collagenase

Papain Papain

Elastas Elastas

Trypsin ấm Trypsin ấm

Trypsin lạnh Trypsin lạnh

Tách bằng enzyme

Trypsin:

Chymotrypsin

Collagenase

Papain

Elastase

• pH

• pH6-9, tối ưu 8-9 • Nồng độ dùng: 0,01%-0,5%

• pH 7-9, thích hợp 8-9 • Cắt liên kết

4,5-8,5

peptide tạo bởi –COOH acid amin thơm với – NH2

• Tính đặc hiệu

• Phân huỷ elastin • Sử dụng kết hợp với enzyme khác

• Ca2+ được xem như chất bảo vệ Trypsin • Bị kìm hãm bởi FBS hoặc Di-Isopropyl- Fluorophosphat(DFP)

kém hơn trypsin

• Bị ức chế bởi • Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá

DFB

• Hoạt động tốt: pH7-8, < 450C • Cắt liên kết peptide dạng poly-L prolin; gồm 4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên biệt ít làm hư hại tế bào

•

• Không đặc hiệu cho loại protein: Cắt liên kết –COOH của lysin/arginin và –NH2  có thể gây hư hai cho tế bào

MỘT SỐ ENZYME PHÂN CẮT THƯỜNG DÙNG

TẠO DÒNG TẾ BÀO

KHÁI NIỆM- ĐẶC TÍNH

MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP

XÂY DỰNG ĐƢỜNG CONG TĂNG TRƢỞNG VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN

39

40

41

Tiêu chí lựa chọn dòng tế bào cho thí nghiệm

• Loài • Đặc điểm chức năng • Hữu hạn hay liên tục • Bình thường hay chuyển dạng • Điều kiện và đặc tính tăng trưởng

Mô

Douglas C. McFarland Methods in Cell Science 22: 63–66 (2000).

Phân tách

Tế bào đơn

Nuôi sơ cấp

Pha loãng tới hạn Tách tế bào tự động Vòng nhẫn

43

Clone phát triển

Giếng tế bào gốc

1 n ầ

l g n ã o L a h p

i

ỗ u h C

Chuỗi pha Loãng lần 2

45

Nhuộm crystal violet

47

VÒNG NHẪN (Cloning ring)

48

Phân lập Clones (Huyền phù)

50

Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào ADSC

Bước 1: Xử lí sơ bộ mẫu

• Nếu mỡ hút, cho trực tiếp

vào bình dạng phễu

• Nếu dạng khối mỡ nguyên thì phải cắt nhuyễn rồi cho vào bình dạng phễu

100mL mỡ

Bước 2: Rửa mẫu bằng WB1 (2 lần)

• Thêm 50mL WB1

• Ly tâm 400g trong 5 phút

100mL mỡ + 50mL WB1

Sau ly tâm

loại bỏ dịch rửa

Bước 3 : Phân tách mẫu

• Cho toàn bộ 30mL (SE+WB3)

vào, ủ ở 370 C, 30 phút • Lắc đều sau mỗi 5 phút

370C

Trước khi ủ

Sau khi ủ 30 phút

Ly tâm 800g trong 10 phút

Phần mỡ vàng óng chiếm > 70%

Trƣớc ly tâm

Sau ly tâm

Loại bỏ dịch nổi và mô mỡ thừa,thu cặn tế bào

Dịch nổi + mỡ thừa

Cặn tế bào

Bước 4: Rửa tế bào với WB3

Thêm 30mL WB3 vào, lắc đều Ly tâm 800g 5 phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào

Thu cặn tế bào sau ly tâm

Sau ly tâm

Cặn tế bào

Nuôi cấy

Cặn tế bào

Mục đích khác

Tế bào thu từ mô mỡ được nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh

Sau 48 giờ

Sau 96 giờ

Ứng dụng trị loét chân do tiểu đường

Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh

Bước 1: xử lí sơ bộ mẫu

Chọn chuột thai khoảng 14 ngày tuổi

Giết chuột thai đột ngột bằng cách kéo giãn cột sống

Sát khuẩn chuột thai bằng cồn 960C

Mổ khoang bụng, và thu nhận hai nhánh tử cung chứa thai chuột

Ngay lập tức chuyển hai nhánh tử cung vào PBS 5X đã đƣợc làm ấm ở 37oC.

Bước 2: thu nhận tế bào

Loại bỏ tử cung, màng phôi và mỡ bám xung quanh thai chuột.

Cho thai chuột vào becher rửa bằng PBS 10X khoảng 3 – 4 phút.

Chuyển thai chuột sang đĩa Petri, và thu nhận đầu chuột thai.

Rửa sạch đầu chuột thai bằng PBS 5X khoảng 2 – 3 phút trong becher

Chuyển đầu chuột thai sang đĩa Petri, mổ hộp sọ nhẹ nhàng để thu nhận não chuột.

Cắt nhuyễn mô não và chuyển não chuột vào ống ly tâm 15ml. Sau đó, huyền phù hóa liên tục mô cắt nhuyễn bằng Pipet pasteur

Tiến hành lọc dung dịch huyền phù với màng lọc tế bào đơn

Thu nhận dung dịch chứa tế bào đơn và đem li tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút

Đổ bỏ hoàn toàn dịch phía trên, thu cặn dưới đáy Facol chứa tế bào đơn

Nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh

a)

b)

c)

d)

Nuôi cấy sơ cấp tế bào tủy răng

Tế bào sơ cấp (nuôi tế bào rời)

d4

d5

d7

d2

Tế bào sơ cấp (nuôi mảnh mô)

d2

d7

d12

d21

d19

d15

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người

Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người