Bài giảng Kỹ thuật đông lạnh tế bào động vật

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

Thêm vào BST

Báo xấu

273
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Kỹ thuật đông lạnh tế bào động vật nêu lên mục đích của đông lạnh tế bào động vật; các bước bảo quản tế bào bằng phương pháp đông lạnh; các biến đổi trong quá trình đông lạnh; kĩ thuật đông lạnh tế bào; quy trình đông lạnh tế bào.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Kỹ thuật đông lạnh tế bào động vật

Tradigrada Wood frog
- Đông lạnh (ĐL) là gì? - Mục đích của ĐL? - Đối tượng được đông lạnh - Các biến đổi của tế bào trong quá trình ĐL - Những thuận, bất lợi của pp ĐL - Quá trình đông lạnh / giải đông - Kĩ thuật đông lạnh / giải đông -…
08/05/2015 KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Đặng Thị Tùng Loan dttloan@hcmus.edu.vn PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc
LƯỢC SỬ 1776 : Spallanzani, bảo quản tinh trùng người ở nhiệt độ thấp. 1866 : Mantagazza, trữ tinh trùng người bằng đông lạnh. 1949 : Polge và cs, glycerol trong bảo quản tinh trùng bằng phương pháp đông lạnh. 1940 – 1950 : Chang, đông lạnh trứng và phôi thỏ 1953 : Sherman, đông lạnh TT thành đá khô  giải đông  thụ tinh bình thường. 1957 : Lin, Sherman và Willet, trứng chuột có thể sống sau khi được trữ trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -50C. 1958 : Sherman và Lin, IVF thành công từ trứng chuột sau khi được trữ trong môi trường chứa glycerol ở nhiệt độ -100C -200C, không có tế bào trứng sống sót.
LƯỢC SỬ 1960 – 1970 : Mazur, tốc độ làm lạnh và làm ấm tối ưu; Mazur, Leibo, Whittingham, đông lạnh phôi chuột (chậm, DMSO) 1984 : Zeilmarker, đông lạnh phôi người 1980s : Luyet, thủy tinh hóa trong đông lạnh trứng và phôi; Rall, TTH + CPA cao
ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO Trữ ở nhiệt độ ở mức nitơ lỏng (-196oC) Tế bào ở dạng huyền phù (+chất bảo quản lạnh - cryoprotectant) Tế bào dừng phân chia và các hoạt động trao đổi chất (trạng thái tiềm sinh)  Mô, tế bào soma, tế bào sinh dục, phôi, …
MỤC ĐÍCH Ổn định nguồn bảo quản (1) Giảm thiểu sự biến đổi KG, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định DT (2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào (TB) (3) Ngăn cản quá trình biệt hoá TB (4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết TB (5) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái Hạn chế rủi ro, tốn kém do nguyên nhân kĩ thuật (1) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng TB cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức (2) Giảm chi phí nuôi cấy (3) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng TB khác nhau trong in vitro Ứng dụng thực tế (1) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng (2) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen (3) Thuận lợi cho vận chuyển (4) Thuận lợi cho việc thương mại hoá
CÁC BƯỚC BẢO QUẢN TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng) Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm Trữ ở nhiệt độ -196oC Làm ấm và giải đông Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi tái nuôi cấy
SINH HỌC ĐÔNG LẠNH
CÁC BIẾN ĐỔI TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH 1. Sự hình thành tinh thể nước đá 2. Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh 3. Tốc độ khử nước 4. Thể tích của tế bào 5. Hoạt động của enzyme 6. Sự tủa muối và pH của dung dịch 7. Sự hình thành bọt khí
1. SỰ HÌNH THÀNH TINH THỂ NƯỚC ĐÁ 4 yếu tố quyết định kiểu hình tinh thể nước đá  Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi trạng thái  Tốc độ làm lạnh  Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch  Nồng độ dung dịch Bên trong và bên ngoài tế bào
ĐỘ THẨM THẤU CỦA MÔI TRƯỜNG ĐÔNG LẠNH * Sự hình thành đá * Nồng độ chất hòa tan tăng * Độ thẩm thấu?
TỐC ĐỘ KHỬ NƯỚC * Tính thấm nước của màng tế bào (Lp) * Năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước (E) * Tỉ lệ diện tích bề mặt (SA) / thể tích của tế bào (V) * Loại chất bảo quản lạnh * Tốc độ làm lạnh (B)
SỰ GIẢM THỂ TÍCH CỦA TẾ BÀO - Tính thấm nước của màng tế bào và năng lượng hoạt hóa của tính thấm - Tốc độ làm lạnh - Thực tế và tính toán?
HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME * Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng. * Giảm: - Từ 37C  7C: giảm 8 lần - Từ 20C ↓: giảm 2-3 lần theo Q10 - ↓↓: Tác hại đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein Vai trò của các polyol VD: G6PH (0C)
ĐỘ pH DUNG DỊCH  Cân bằng acid-base + Chất bảo vệ lạnh Glycerol: tính base yếu DMSO: tính base mạnh Propanediol, methanol + Nồng độ chất bảo vệ lạnh  Sự phù hợp về nhiệt độ và pH
SỰ HÌNH THÀNH BỌT KHÍ Khi nhiệt độ hạ, tinh thể đá tạo các lỗ rò rỉ Khi giải đông, hình thành bọt khí. Kích thước bọt khí: 25-100 µm, tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh Số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh Ảnh hưởng của hệ đệm bicarbonate
THUYẾT HAI YẾU TỐ Quy trình đông lạnh- giải đông tối ưu Tổn thương Sức sống Tổn thương đá nội bào “dung dịch” Tốc độ làm lạnh
ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH ĐÔNG LẠNH ĐẾN TẾ BÀO Hiện tượng Phản ứng của tế bào Giảm nhiệt độ Biến đổi lipid màng Giải trùng hợp bộ xương tế bào Tăng nồng độ chất hòa tan Co thẩm thấu Tăng nồng độ ion Tác động trực tiếp lên màng tế bào, làm hòa tan protein màng Khử nước Mất ổn định lớp đôi lipid Kết tủa muối Thay đổi pH dung dịch, ảnh hưởng hoạt động của các protein Sự hình thành bọt khí Tổn thương cơ học đối màng và bộ xương tế bào Dung dịch trở nên quá nhớt Hạn chế quá trình khuếch tán, thẩm thấu Thay đổi pH Biến tính protein Tế bào bị đặc lại Tổn thương màng
PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH Đông lạnh chậm chương trình (programmed slow freezing method) Đông lạnh nhanh ba bước (stepwise freezing method) Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa) (vitrification)