SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

(Monoclonal antibodies-Mab)

Định nghĩa

Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro

Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein)

:

George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984

Tương tác KN-KT không chuyên biệt

Tương tác KN-KT chuyên biệt

Kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng

Đòi hỏi kỹ thuật cao

Giới hạn về số lượng

Không giới hạn về số lượng

Dễ sản xuất

Kháng thể đơn dòng

1

4

epitope

2

3

Huyết thanh

Kháng thể đa dòng

Kháng thể đơn dòng

8 bước tạo MAb

• Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag • Gây đáp ứng miễn dịch • Thu TB lách và TB myeloma • Dung hợp TB lách với TB myeloma • Sàng lọc, dòng hóa hybridoma • Nhân sinh khối MAb bằng phương pháp

in vitro hay in vivo

• Tinh chế MAb • Thu nhận, kiểm tra MAb

(1a) Chọn động vật gây nhiễm

• Động vật thường được sử dụng để tạo

hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ…

• Mouse là mô hình lý tưởng nhất: đáp ứng miễn dịch mạnh tổng hợp kháng thể nhanh

• 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản

xuất MAb: BALB/c và C57BL/6

BALB/c C57BL/6

• Lai cùng dòng • Chuột cái • 6-8 tuần tuổi • “sạch tuyệt đối”

Lai taïo 1967 taïi Ñöùc Lai taïo 1982 taïi Myõ

Rat

Hamster

Hệ thống chuồng chuột sạch

(1b) Chọn Ag

• Quyết định sự thành công của quy trình

• Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản

phẩm tạo thành

• Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm

(MAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)

Antigen

• Được nhận diện bởi MAb mục tiêu

• Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh

• Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật protein tái tổ hợp.

• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó

Các vị trí tiêm Ag

Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch)

Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)

Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)

Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ)

Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)

(2) Gây đáp ứng MD

Nguyên tắc 1

Phải gây ĐƯMD khác loài

Sử dụng động vật gây nhiễm là mouse thì phải dùng kháng nguyên có nguồn gốc từ rat hay hamster để gây đáp ứng miễn dịch

(2) Gây đáp ứng MD

Nguyên tắc 2

Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả năng dung hợp của nó với tế bào lách

- Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay X63/Ag.8653

- Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn

dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3

(2) Gây đáp ứng MD

Nguyên tắc 3

Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm

• CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương

dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum

• IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương

dầu

• ALUM (Aluminum hydroxide gel)

Với kháng nguyên là protein

Tiêm 10-100g/1 chuột/1 lần Tá dược thường được sử dụng là CFA

Với kháng nguyên là tế bào

Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần Tá dược thường được sử dụng là ALUM

Quy trình gây ĐƯMD ở mouse

Ngày

Thao tác

Tá dược Vị trí tiêm

Tiêm mũi cơ bản

0

CFA

s.c.

Tiêm nhắc lại lần 1

14

IFA

s.c.

Tiêm nhắc lại lần 2

28

IFA

s.c.

Thu serum

36

42

IFA

s.c.

Nghỉ trước khi dung hợp (hay tiêm nhắc lần 3)

Tiêm nhắc lại lần cuối

52

i.v.

55

Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh

Quy trình gây ĐƯMD ở rat

Ngaøy

THAO TAÙC

Chất bổ trợ Vò trí tieâm

0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p.

21 Tiêm nhắc lần 1 IFA i.p.

42 Tiêm nhắc lần 2 IFA i.p.

52 Kiểm tra serum

53 ELISA

63 Tiêm nhắc lần 3

IFA

i.p.

73 Kiểm tra serum

74 ELISA

84 Tiêm nhắc lần 4 IFA i.p.

94 Kiểm tra serum

95 ELISA

98 Tiêm nhắc lần cuối i.v.

101-110 Thu lách

Xác định hiệu giá kháng thể

Pha loãng huyết thanh theo từng bậc

(1)

Chứng âm

Huyết thanh ban đầu

Bổ sung một lượng nhất định KN vào mỗi tube

(2)

Chứng âm

Huyết thanh ban đầu

Ủ - xác định độ pha loãng cao nhất vẫn cho phản ứng (trong trường hợp này là 1/16)

(3)

Chọn lọc hybridoma

Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT)

Tổng hợp nucleotide

Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT)

Môi trường chọn lọc HAT

Hybridoma

Myeloma

de novo

de novo

Salvage (HGPRT+)

Salvage (HGPRT+)

Salvage (HGPRT-)

Chết

Sống

Chết

B cell de novo

Môi trường chọn lọc HAT

Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường:

– Con đường De novo cần hoạt động của enzyme

dihydrofolate reductase (DHFR)

– Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine

– Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR  tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage

– Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage

Dung hợp tế bào lách với myeloma

Chuột

Dầu khoáng

Chuột đã được gây MD

Plasmacytoma (Bào tương ung thư)

Không sản xuất Ig

Myeloma

Lympho B

Có bộ máy tiết Ig

“Bất tử” trong in vitro

Sản xuất Ig

Không tồn tại lâu dài trong in vitro

Dung hợp

Hybridoma

Sản xuất Ig

Có bộ máy tiết Ig

“Bất tử” trong in vitro

Kiểm tra myeloma

8 - Azaguanine

Myeloma Cells

Immortal Tumor Of Lymphocytes +

Myeloma Cells HGPRT-

(4) Các kĩ thuật dung hợp tế bào

• Kết dính tự nhiên • Hóa chất (PEG) • Các yếu tố vật lý (xung điện,

sóng siêu âm) • Virus (Sendai) • Vi tiêm

Buồng dung hợp

Máy tạo xung điện

Tế bào trong buồng dung hợp

(5a) Sàng lọc hybridoma

Lympho B

Hybridoma

Myeloma

Sàng lọc

Ag

Dòng hóa

Dung hợp

Hybridoma sản xuất

Ig mục tiêu

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA

Western Blotting

Immunoflorescent essay

(5b) Dòng hóa Hybridoma

(6) Nhân sinh khối MAb

(6a) Sản xuất MAb in vitro

• Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển

nhân tạo (bioreactor, bình Roux…)

• MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào

(supenatant cell culture)

• Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp

(0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)

• Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ

thống bioreactor

Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào

(6b) Sản xuất MAb in vivo

• Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ

(ascites)

• MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid)

• Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1-

15mg/mL nước báng)

• Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệm

Mồi chuột bằng pristane

Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)

Thu thập nước báng (ascites fluid)

Pristane

• 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane • Tách chiết từ dầu gan cá mập • Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu

bệnh viêm khớp mãn tính ở người

• Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu

bệnh tự miễn

• Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong

khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb

(7) Tinh chế protein

• Sắc ký ái lực (affinity chromatography)

• Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

• Lọc gel (gel filtration)

• Sắc ký cao áp

• Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic

Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC

(High pressure liquid chromatography)

Sắc ký ái lực

Mab trong liệu pháp chữa trị ung thư

NK cells, Mf

ADCC

Tế bào khối u

Mab kháng Ag ung thư

Bổ thể

Ag ung thư

MAC

Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot)

Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vitro

KTĐD gắn quantum dot phát huỳnh quang trong nhận diện thụ thể bề mặt tế bào ung thư đại tràng

Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vivo

Mouse MAb Chimeric MAb Humanized

MAb

Chimeric MAb: vùng Fab từ chuột, vùng Fc từ người

Mouse Mab: toàn bộ phân tử kháng thể có nguồn gốc từ chuột

Humanized MAb: 3 vùng hypervariable từ chuột, các vùng còn lại từ người