• Kháng thể là protein được hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện và trung hòa những tác nhân xâm nhiễm ngoại lai như vi khuẩn, virus, tế bào,…Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó. • Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody - mab) là kháng thể được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất.
• Kháng thể đa dòng là kháng thể bắt nguồn từ
nhiều dòng tế bào khác nhau.
Kháng thể đơn dòng
Kháng thể đa dòng
• Đòi hỏi kĩ thuật
cao
• Tương tác KN-KT
chuyên biệt
• Không giới hạn số
• Dễ sản xuất • Tương tác KN-KT không chuyên biệt • Giới hạn số lượng • Tiết kiệm thời gian
lượng
• Tốn thời gian
George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984
Chọn động vật gây nhiễm, chọn kháng nguyên (Ag)
Gây đáp ứng miễn dịch
Dung hợp, tạo tế bào lai hybridoma
Sàng lọc, dòng hóa và tăng sinh hybridoma
Thu nhận, tinh chế và kiểm tra MAb
• Được nhận diện bởi MAb mục tiêu • Có tính gây đáp ứng miễn dịch
(antigenic) mạnh
• Có cấu trúc càng giống với kháng nguyên tự nhiên càng tốt. Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật protein tái tổ hợp
• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó.
• Quyết định sự thành công của
quy trình
• Quyết định hiệu quả ứng dụng
của sản phẩm tạo thành
• Quyết định quy trình sản xuất
sản phẩm
(mab gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)
Rat
Rabbit
Hamster
✓ Lai cùng dòng ✓ Chuột cái ✓ 6-8 tuần tuổi ✓ “sạch tuyệt
đối”
C57BL/6 Mỹ, 1982
BALB/C Đức, 1967
Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm khoang bụng)
Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)
Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)
Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm tĩnh mạch)
Intramuscular (i.m): into a muscle (tiêm cơ)
Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài
Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD
Phải đi kèm tá dược (adjuvant)
▪ Với kháng nguyên là protein ▪ Tiêm 10-100 μg/chuột/ lần ▪ Tá dược thường được sử dụng là
CFA (Complete Freund’s Adjuvant)
▪ Với kháng nguyên là tế bào ▪ Tiêm 0,5 - 5x107 tb/chuột/lần ▪ Tá dược thường được sử dụng là ALUM (Aluminum hydroxide gel)
Ngày
Thao tác
Tá dược
Vị trí tiêm
Tiêm mũi cơ bản
0
CFA
s.c.
Tiêm nhắc lại lần 1
14
IFA
s.c.
Tiêm nhắc lại lần 2
28
IFA
s.c.
Thu serum
36
42 Nghỉ trước khi dung hợp (hay tiêm nhắc
IFA
s.c.
lần 3)
Tiêm nhắc lần cuối
52
i.v.
55
Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh
Tiêm mũi cơ bản
0
CFA
i.p.
Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm
Tiêm nhắc lần 1 21 IFA i.p.
Tiêm nhắc lần 2 42 IFA i.p.
Kiểm tra serum 52
ELISA 53
Tiêm nhắc lần 3 63 IFA i.p.
ELISA
74
Kiểm tra serum 73
Tiêm nhắc lần 4 84 IFA i.p.
Kiểm tra serum 94
98
Tiêm nhắc lần cuối
I,v,
ELISA 95
101-110 Thu lách
HYBRIDOMA
• Được Köhler và Milsten (1975) khám phá khi nuôi cấy liên
tục những tế bào tiết kháng thể.
• Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy
myeloma -oma = tumor (khối u) • Môi trường chọn lọc HAT - hypoxanthine, aminopterin,
thymidine
• HGPRT - hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase • TK – Thymidine kinase
Cell line
Ig produced
P3-X63Ag8 (Ag8)
γ1, κ
NS1/1-Ag4.1 (NS1)
κ (not secreted)
Sp2/0-Ag14 (Sp2/0)
None
X63-Ag8.653 (Ag8.653) none
Y3-Ag1.2.3 (Y3) - rat
κ
•Kết dính tự nhiên •Hóa chất (PEG) •Các yếu tố vật lý (xung điện, sóng siêu âm) •Virus (sendai) •Vi tiêm
• Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường: • Con đường de novo cần hoạt động của enzyme dihydrofolate
reductase (DHFR)
• Con đường salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine
• Thành phần môi trường HAT gồm Hypoxanthine, Aminopterin và
Thymidine
Cơ chế chọn lọc
• Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển nhân tạo (Bioreactor, bình roux…. • mAb được tiết bào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supernantant cell culture) • Nhược điểm: Nồng độ Mab thu được tương đối thấp (0.01 – 0,5 mg/ml dịch nuôi cấy) • Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor.
• Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites) • mAb được tiết vào dịch báng (fluid ascites) • Ưu điểm: Nồng độ Mab thu được khá cao (1-15 mg/ml nước bang) • Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệm
• 2,6,10,14 – tetramethylpentadecane • Tách chiêt từ dầu gan cá mập • Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở người. • Gây ra bệnh lao da ở chuột. Là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn • Là yếu tố quan trọng trong kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb
• Sắc kí ái lực (affinity chromatography) • Sắc kí trao đổi ion (ion exchange chromatography) • Lọc gel (gel filtration) • Sắc kí cao áp • Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic
