Bài thuyết trình: Các phương pháp phân tích vi sinh vật

CAÙC PHÖÔNG PHAÙP  CAÙC PHÖÔNG PHAÙP  PHAÂN TÍCH VI SINH  PHAÂN TÍCH VI SINH  VAÄT  VAÄT

Phöông phaùp nuoâi caáy 1.1. Phöông phaùp nuoâi caáy Phöông phaùp treân cô sôû kyõ thuaät  2.2. Phöông phaùp treân cô sôû kyõ thuaät  sinh hoïc phaân töû sinh hoïc phaân töû Phöông phaùp treân cô sôû mieãn dòch  3.3. Phöông phaùp treân cô sôû mieãn dòch  hoïchoïc

PHAÂN TÍCH VSV BAÈNG  PHAÂN TÍCH VSV BAÈNG  PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY • Phöông phaùp ñoå ñóa (pour plate)

• Phöông phaùp caáy beà maët

(spread)

• Phöông phaùp MPN (most probable

number)

• Phöông phaùp nuoâi caáy kî khí

PHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓA PHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓA

• Muïc ñích söû duïng trong ñònh löôïng VSV • Kyõ thuaät

– Moâi tröôøng agar ñöôïc ñun chaûy vaø

laøm nguoäi ñeán 45±1oC

– Caáy tối ña 1ml dòch maãu hay dòch pha

loaõng vaøo ñóa petri troáng voâ truøng (Þ 9 – 10cm)

– Ñoå 10-15ml moâi tröôøng vaøo ñóa – Laéc ngöôïc vaø xuoâi chieàu kim ñoàng hoà – Ñaët ñóa leân maët phaúng ngang cho moâi

tröôøng ñoâng ñaëc

– UÛõ ngöôïc ñóa, trong ñieàu kieän vaø thôøi

gian xaùc ñònh

PHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓA PHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓA

• Öu ñieåm

– Caáy ñöôïc theå tích maãu lôùn (1ml)

– Xaùc ñònh ñöôïc caùc VSV caàn dinh döôõng

tieáp xaùc töø nhieàu phía

– Cho pheùp ñeám ñöôïc maät ñoä VSV cao,

khoaûng 150 - 300 khuaån laïc

nhaïy nhieät

- Khoâng xaùc ñònh ñöôïc hình daïng khuaån

laïc nhaát ñònh

- Khoù laøm thuaàn moät doøng VSV

Nhöôïc ñieåm - Khoâng ñònh löôïng ñöôïc nhöõng VSV quaù

PHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ PHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ MAËTMAËT

• Moâi tröôøng phaûi ñöôïc chuaån bò treân

ñóa tröôùc 1­2 ngaøy ñeå khoâ maët

• Phöông phaùp

– Caáy 0,1 – 0,3ml vaøo ñóa moâi tröôøng

(ñóa Þ 90mm)

Caáy toái ña 1ml vaøo ñóa moâi tröôøng (ñóa Þ 140mm)

– Traûi ñeàu maãu leân beà maët moâi tröôøng baèng que trang tam giaùc

– Ñeå ôû nhieät ñoä phoøng 15-20 phuùt

cho khoâ maët

– Laät ngöôïc ñóa ñeå uû

PHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ PHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ MAËTMAËT

• Öu ñieåm

– Ñònh löôïng ñöôïc caùc VSV nhaïy nhieät

– Coù theå nhaän daïng ñöïôc daïng

khuaån laïc ñaëc tröng

– Deã daøng laøm thuaàn chuûng VSV

muïc tieâu

Nhöôïc ñieåm - Chæ caáy ñöïôc theå tích maãu nhoû (neáu duøng ñóa thoâng thöôøng Þ90- 100mm)

- Chæ cho pheùp ñeám ñöôïc soá löôïng

khuaån laïc thaáp

PHÖÔNG PHAÙP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

• Khaùi nieäm

– Coøn goïi laø phöông phaùp pha loaõng tôùi

haïn

– Giaù trò keát quaû nhaän ñöôïc laø soá löôïng VSV muïc tieâu coù xaùc suaát cao nhaát theo nguyeân taéc thoáng keâ

– Giaù trò MPN laø giaù trò coù xaùc xuaát cao

nhaát

• Heä thoáng MPN

– Goàm 3 hoaëc 5 laàn laëp laïi ôû moãi noàng

ñoä

– Laëp laïi ôû 3 noàng ñoä pha loaõng lieân tieáp – Choïn caùc ñoä pha loaõng sao cho trong heä

thoáng coù caû oáng döông tính vaø oáng aâm

tính

– Keát quaû MPN coù ñoä chính xaùc cao nhaát

khi soá oáng döông tính vaø aâm tính trong

heä thoáng töông ñöông nhau

PHÖÔNG PHAÙP MPN

Chia theo soá löôïng oáng trong heä thoáng

- Heä thoáng 9 oáng: moãi ñoä pha loaõng laëp laïi 3 laàn

- Heä thoáng 15 oáng: moãi ñoä pha loaõng laëp laïi 5 laàn

Nguyeân taéc

- Döïa treân keát quaû ñònh tính VSV muïc tieâu ôû caùc laàn laëp laïi treân cuøng moät ñoä pha loaõng vaø ôû caùc ñoä pha loaõng khaùc nhau

- Vi sinh vaät muïc tieâu phaûi coù nhöõng bieåu hieän ñaëc tröng treân moâi tröôøng nuoâi caáy loûng nhö

Söï taïo hôi: Coliforms, E. coli …

Ñaëc ñieåm

Söï ñoåi maøu: S. aureus

Cho pheùp ñònh löôïng ñöôïc maät ñoä VSV thaáp trong

theå tích maãu lôùn

HEÄ THOÁNG MPN HEÄ THOÁNG MPN

• Heä thoáng 9 oáng

Heä thoáng 15 Heä thoáng 15 oáng oáng

10ml moâi  tröôøng noàng  ñoä thöôøng  (ñôn)

HEÄ THOÁNG MPN HEÄ THOÁNG MPN

10ml moâi tröôøng  noàng ñoä ñôn  (thöôøng)

10ml moâi  tröôøng noàng  ñoä ñoâi

ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP  ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP  MPNMPN

1ml

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

1ml

10­1

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

1ml

10ml LSB 10­2

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

10­3

ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN(tt) ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN(tt)

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

1.1 1.2 1.5

Endo/EMB 2.2 2.3

10ml EC 2.2

3.3

1.1 1.2

Indol

Keát quaû 2,0,0  = 4,5 MPN/g

2,0,0 4,5  MPN/g

Coâng thöùc tính chæ soá MPN Coâng thöùc tính chæ soá MPN

g

j

MPN

g

/

(cid:0) (cid:0)

g

m

)

t (

mt j

j

j

j

j

• Trong ñoù:

– ∑ gj : soá löôïng oáng döông tính trong

daõy daõ choïn

– ∑ tjmj :Khoái löôïng maãu trong daõy

ñaõ choïn

– ∑ (tj-gj)mj Khoái löôïng maãu trong taát

caû caùc maãu aâm tính.

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

Ớ Ạ Ớ Ạ

Ậ Ậ

GI GI

I H N TIN C Y I H N TIN C Y

Trong ñoù:: Trong ñoù

: soá löôïng oáng döông tính trong daõy ∑ ∑ ggjj : soá löôïng oáng döông tính trong daõy

daõ choïn daõ choïn

:Khoái löôïng maãu trong daõy ñaõ choïn ∑ ∑ ttjjmmj j :Khoái löôïng maãu trong daõy ñaõ choïn Khoái löôïng maãu trong taát caû ∑ ∑ (t(tjj-g-gjj)m)mjj Khoái löôïng maãu trong taát caû

caùc maãu aâm tính. caùc maãu aâm tính.

t: Số ống trong hệ thống

t: Số ống trong hệ thống

CHÆ SOÁ MPN CÔ BAÛN CHÆ SOÁ MPN CÔ BAÛN

• Laø chæ soá tra ñöôïc töø baûng keát quaû MPN

ừ

c o ù  s o á  lö ô ïn g  m a ã u  t r o n g  t n g  d a õ y   la ë p  la ïi n h ö  s a u :

• ­ D a õ y  1 : • ­ D a õ y  2 :  • ­ D a õ y  3

1 g  h o a ë c  1 m l m a ã u 0 , 1 g  h o a ë c  0 , 1 m l 0 , 0 1 g  h o a ë c  0 , 0 1 m l

COÂNG THÖÙC CHUYEÅN COÂNG THÖÙC CHUYEÅN ÑOÅI KEÁT QUAÛ MPN ÑOÅI KEÁT QUAÛ MPN

• Cs =   M x F/V0 x Vs

ấ ủ ể ả ậ ớ Cs: là kh  năng l n nh t c a vi sinh v t có trong th  tích

Vs

0

ỉ ố ừ ả ố ớ ộ ơ ả M : ch  s  MPN tra t b ng đ i v i đ  pha loãng c  b n V

ươ ớ ộ ứ F : ngh ch đ o h  s  pha loãng t ng  ng v i đ  pha

ả ấ ủ ấ ệ ố ị loãng th p nh t c a  dãy

ể ẩ ượ ị ậ ộ ể ể ọ Vs: Th  tích chu n đ c ch n đ  bi u th  m t đ  vi sinh

ế

ế

ả

• N u tính k t qu  là MPN/g thì V

s = 1

ế

ế

ả • N u tính k t qu  là MPN/100g thì V

s = 100

v tậ

0 = 10)

•

ơ ả ậ ộ ể V0: Th  tích m t đ  pha loãng c   b n ( V

PHÖÔNG PHAÙP MAØNG PHÖÔNG PHAÙP MAØNG LOÏCLOÏC

• Kích thöôùc loå loïc 0,47µm hay

0,22µm

• Ñöôøng kính vaø hình daïng maøng loïc phuï thöïc vaøo ñöôøng kính pheåu loïc

• Ñöôøng kính maøng thöôøng laø

45mm

THIEÁT BÒ LOÏC NHIEÀU PHEÅU THIEÁT BÒ LOÏC NHIEÀU PHEÅU (MULTIFOLDER) (MULTIFOLDER)

CAÙC BOÄ PHAÄN CUÛA THIEÁT BÒ LOÏC CAÙC BOÄ PHAÄN CUÛA THIEÁT BÒ LOÏC VSVVSV

PHÖÔNG PHAÙP LOÏC VSV PHÖÔNG PHAÙP LOÏC VSV

• Pheåu loïc, giaù ñôû maøng loïc

phaûi ñöôïc voâ truøng sau moãi laàn loïc

• Maät ñoä VSV trong dòch loïc thích

hôïp:

<150 khuaån laïc/maøng • Theå tích dòch loïc trong 1 laàn: 50

-100ml

• Neáu theå tích dòch loïc nhoû hôn thì

phaûi pha loaõng baèng dd pha loaõng hay nöôùc caát voâ truøng

PHÖÔNG PHAÙP MAØNG PHÖÔNG PHAÙP MAØNG LOÏCLOÏC

• Öu ñieåm

– Xaùc ñònh ñöôïc maät ñoä VSV cuï theå trong moät theå tích maãu lôùn: 10ml, 100ml … Nhöôïc ñieåm

- Khoâng thích hôïp cho vieäc phaân tích caùc maãu thöïc phaåm raén

KHUAÅN LAÏC VSV TREÂN KHUAÅN LAÏC VSV TREÂN MAØNG LOÏC MAØNG LOÏC

1A 1B 2A 2B

2C 1C 1D

E. coli treân moâi tröôøng ID Coli agar

2C . Coliforms treân moâi tröôøng ID Coli agar

PHÖÔNG PHAÙP MAØNG PHÖÔNG PHAÙP MAØNG PETRI-FILM PETRI-FILM

• Caûi bieân töø phöông phaùp ñeám

khuaån laïc treân ñóa

• Thích hôïp cho vieäc phaân tích

maãu taïi hieän tröôøng

• Khoâng phaûi baûo quaûn hay

vaän chuyeån maãu

Nhöôïc ñieåm

- Chæ aùp duïng haïn cheá ôû moät soá chæ tieâu deå nuoâi caáy - Chæ caáy ñöôïc theå tích maãu

nhoû

PHÖÔNG PHAÙP ÑÓA PETRI PHÖÔNG PHAÙP ÑÓA PETRI FILMFILM

Ñaët maãu leân maøng Petrifilm

Daøn ñeàu maãu treân maøng

UÛ Petrifilm, ñeám tröïc tieáp hoaëc phaân laäp

Xanh: E. coli

Ñoû: Coliforms

Chromogenic Substrates Chromogenic Substrates

Different colors with indolyl substrates

M

a

g

e

m

5

-I

o

B

o-6-c

d

C

o

I

-

I

n

3

(

d

G

5

-i

n

r

o

-

Salmon (6-Chloro-3indolyl) nta (5-Bro hloro-3-in

d

l

e

B

d

y

e

l

r

o

n

o l y l

olyl)

4

(

-

c

N

h

-

l

o

r

o

M e

t

-

3

h

y

- i

n

l

-

d

3

o

-

l

i

y

n

l )

d

o

l

y

l

)

Ạ Ạ

Ả Ứ Ả Ứ

PH N  NG ENZYME T O MÀU PH N  NG ENZYME T O MÀU ß­D­Galactosidase –95 % of Coliforms ß­D­Glucuronidase

–94­97 % of E.coli

Tryptophanase

ả ứ

–99 % E.coli có ph n  ng Indole

ươ

d

ng tính

CƠ CHẾ TẠO MÀU

INDOLYL INDOLYL

CARBO HYDRATE

Không màu

ENZYME

+

02

Có màu

O - CARBOHYDRATE

PHẢN ỨNG CHUNG CỦA CƠ CHẤT TẠO MÀU

X

Y

Z

N H ENZYME

X

OH

Y

Z

+ CARBOHYDRATE

N

H

OXY HÓA

X

O

H N

Y

Z

Z

Y

N H

O

X

HIỆN MÀU

COLIFORMS 6-CHLORO-3-INDOLYL-ß-D-GALACTOPYRANOSIDE (SALMON-GAL)

GALACTOSIDASE = ENZYME

GALACTOSIDE =CARBOHYDRATE

INDOLE INDOLE

COLORLESS

COLORLESS

+ O 2

CHLOROINDIGO

E.coli 5-Bromo-4-CHLORO-3-INDOXYL-ß-D-GLUCURONIDE (X-GLUC)

GLUCURONIDASE = ENZYME

GLUCURONIDE =CARBOHYDRATE

INDOLE INDOLE

COLORLESS

COLORLESS

+ O 2

BROMOCHLOROINDIGO

E. coli VÀ Coliforms X-GLUC và Salmon-GAL

Không màu

Glucuronide           và    Galactoside =Carbohydrate

Indolyl Indolyl

Glucuronidase  và Galactosidase = Enzyme

Không màu

+

O22

Chloroindigo

Bromochloroindigo

E.coli

Coliforms and E.coli

E.coli

Ế Ế

Ủ Ạ Ả Ứ PH N  NG T O K T T A,  Ủ Ả Ứ Ạ PH N  NG T O K T T A,  Ỳ PHÁT HU NH QUANG Ỳ PHÁT HU NH QUANG Phosphatidylinositol phosphalipase

– Listeria monocytogenes

Lecithinase

– Bacillus cereus

ắ

 Acid phosphatase phân c t MUP

ướ

(4­methylumbelliferylphosphate) t o ạ 4­methylumbellferone phát hu nh ỳ quang d

i tia UV –Clostridium perfringens

ể ể

ườ ườ

Bi u hi n c a  Bi u hi n c a

ng ALOA  ng ALOA

ệ ủ L. monocytogenes ệ ủ L. monocytogenes trên môi tr  trên môi tr và Eggyolk và Eggyolk

ạ

ở

Ho t tính enzym  phosphatidylinositol  phosphatidylinositol  phosphalipase  phosphalipase

L. monocytogenes

ALOA

EGGYOLK EGGYOLK

35

Clostridium perfringens phát huỳnh quan trong môi trường TSC agar có bổ sung MUP

Pseudomonas phát huỳnh quan trong môi trường Pseudomonas agar có Hecxadecyltrimethyl Hecxadecyltrimethyl ammonium bromide(cetrimide) ammonium bromide(cetrimide)

PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP QUANG ATP

Mg2+

• Nguyeân taéc E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + O2

E – LH2 AMP + PPi (1) Oxyluciferin + AMP + CO2 +

hv (2)

Phaûn öùng treân coù theå vieát laïi nhö

sau:

E + LH2 + ATP +O2

Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +PPi

E : luciferase LH2 :luciferin  Aùnh saùng phaùt ra coù böôùc soùng 562nm, coù maøu vaøng.

PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP QUANG ATP

• ATP chuû yeáu hieän dieän ôû teá

baøo VSV soáng

• Ñònh löôïng VSV thoâng qua soá löôïng ATP cuûa VSV trong maãu • Soá löôïng ATP phuï thuoäc vaøo

ñieàu kieän dinh döôõng, traïng thaùi teá baøo

• Khoâng phaân bieät ñöôïc caùc

doøng, loaøi hay nhoùm VSV khaùc nhau

PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP

• Öu ñieåm

– Cho pheùp ñònh löôïng ñöôïc toång soá

vsv trong maãu

– Cho keát quaû ñònh löôïng nhanh – Thích hôïp cho vieäc giaùm saùt veä sinh treân daây chuyeàn saûn xuaát

PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP QUANG ATP

• Nhöôïc ñieåm

– Khoâng phaân bieät ñöôïc ATP cuûa VSV

vaø cuûa maãu

– Khoâng phaân bieät ñöôïc caùc doøng,

loaøi hay nhoùm VSV khaùc nhau

– Caàn thieát bò tinh vi, coù ñoä nhaïy vaø

ñoä chính xaùc cao

– Caùc hoaù chaát khoù baûo quaûn, nhaïy

caûm vôùi aùnh saùng

PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP

PHÖÔNG PHAÙP ELISA (enzym linked PHÖÔNG PHAÙP ELISA (enzym linked immunosorbent assay immunosorbent assay

• Thieát laäp treân nguyeân taéc cuûa phaûn öùng

khaùng nguyeân – khaùng theå

• Khaùng nguyeân: ñoái töôïng caàn phaân tích

trong maãu

• Khaùng theå: coá ñònh trong gieáng (well) vaø

trong trong kít

– ELISA thöôøng (thuaän) – ELISA caïnh tranh

• Coù hai loaïi phöông phaùt ELISA

PHÖÔNG PHAÙP ELISA PHÖÔNG PHAÙP ELISA (enzym linked immunosorbent (enzym linked immunosorbent assay) assay)

• Boä kít cuûa phaûn öùng ELISA

thuaän + Coù 2 khaùng theå trong moät phaûn öùng

- Khaùng theå sô caáp: coá ñònh trong

gieáng

- Khaùng theå thöù caáp töï do coù

gaén enzym taïo maøu + Cô chaát taïo maøu vôùi enzym + Chaát röûa + Chaát döøng phaûn öùng enzym

NGUYEÂN TAÉC PHAÛN ÖÙNG NGUYEÂN TAÉC PHAÛN ÖÙNG ELISA THUAÄN ELISA THUAÄN

Cô chaát

Khaùng theå thu khaùng nguyeân

“Sandwich”

Khaùng nguyeân

Phaùt quang

Khaùng theå mang enzyme ñaùnh daáu

ÑAËC ÑIEÅM ÑAËC ÑIEÅM

• Cöôøng ñoä maøu tæ leä thuaän vôùi

haøm löôïng khaùng nguyeân

• Khoù phaùt hieän ñöôïc haøm löôïng

khaùng nguyeân thaáp

PHÖÔNG PHAÙP ELISA (Enzym PHÖÔNG PHAÙP ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) Linked Immunosorbent Assay)

• Boä kít cuûa phaûn öùng ELISA caïnh

tranh + Coù 2 khaùng theå

- Khaùng theå sô caáp: coá ñònh trong gieáng laø

khaùng nguyeân cuûa khaùng theå sô caáp

- Khaùng theå thöù caáp töï do: coù khaû naêng lieân keát mieãn dòch vôùi khaùng theå sô caáp vaø chaát caàn phaùt hieän, khoâng mang enzym + Chaát caïnh tranh coù mang enzym + Cô chaát taïo maøu vôùi enzym + Chaát röûa  + Chaát döøng phaûn öùng enzym

SÔ ÑOÀ PHAÛN ÖÙNG ELISA CAÏNH SÔ ÑOÀ PHAÛN ÖÙNG ELISA CAÏNH TRANH TRANH 4

1

Söï taïo sandwich xaõy ra

2 7 5

Röûa

Gieáng coù khaùng theå sô caáp Maãu vaø chaát caïnh tranh

3

6

Döøng phaûn öùng, so maøu

Khaùng theå thöù caáo ñöôïc cho vaøo Hieä n maø u

ÖU, NHÖÔÏC ÑIEÅM CUÛA ELISA ÖU, NHÖÔÏC ÑIEÅM CUÛA ELISA

• Öu ñieåm

– Nhanh, nhaïy – Deã daøng töï ñoäng hoaù – Coù theå thöïc hieän moät luùc nhieàu maãu

Nhöôïc ñieåm – Tæ leä keát quaû döông tính giaû cao, caàn phaûi khaúng ñònh laïi khi kết quả ELISA dương tính

– Moãi ñoái töôïng phaân tích phaûi coù moät

boä kít rieâng

– Hoaù chaát deã hoûng, thôøi gian baûo

quaûn ngaén

ươ ươPh Ph

ng pháp Lateral Flow Test  ng pháp Lateral Flow Test

(LFT) (LFT)

antibody

bacterium

gold particle

membrane

Phương pháp Lateral Flow Test Phương pháp Lateral Flow Test (LFT) (LFT)

-Antigen

-Antigen

50

DUÏNG MAÃU DOØ MAÃU DOØ

PHÖÔNG PHAÙP SÖÛ DUÏNG PHÖÔNG PHAÙP SÖÛ

• Nguyeân taéc

– Treân cô sôû phöông phaùp lai phaân

töû

– Coù theå phaùt hieän ñoái töôïng baèng

DNA hay RNA

– Möùc ñoä chuyeân bieät cuûa phöông phaùp phuïthuoäc vaøo söï chuyeân bieät cuûa maãu doø (probes)

– Maãu doø coù theå laø maïch RNA hay

DNA

ằ ằ

ắ ắ

ẫ

ệ ệ Nguyên t c phát hi n VSV b ng  Nguyên t c phát hi n VSV b ng  ẫm u dò m u dò

ị D ch t

ăng sinh

ị

ế

ẩ

D ch chi

t DNA vi khu n

ệ

ẫ

M u dò phát hi n

Phát hi nệ

ẫ

ặ

Đ t m u

C  ố định m uẫ

ế

ẩ T  bào vi khu n

ể

Chuy n lên màng

ẫ

ớ

Lai v i m u dò

ử

R a màng

ỳ

ệ ớ Phát hi n v i  ể Kính hi n vi  hu nh quang

PhPh

nươnươ g pháp GenTrap g pháp GenTrap

Maãu doø

Maãu doø

RNA muïc tieâu

phaùt hieän

thu giöõ

Que thöû

Cô chaát phaùt quang